Αφηρημένο

Ιστορικό

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μικρά, μη-κωδικοποίησης RNAs (ριβονουκλεϊκό οξέα) που ρυθμίζουν τη μετάφραση. Αρκετές miRNAs δειχθεί ότι μεταβάλλεται στην ολόκληρο καρκινικό ιστό σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό όταν ποσοτικοποιούνται με μικροσυστοιχίας. Με βάση την προηγούμενη τέτοιες ενδείξεις της διαφορικής έκφρασης, επιλέξαμε να μελετήσουμε την λειτουργική σημασία των miRNAs

miR-30a

και

-191

μεταβολές στον ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα.

Μεθοδολογία /κύρια Ευρήματα

Η λειτουργική σημασία των miRNAs

miR-30a

και

-191

μελετήθηκε με τη δημιουργία σταθερών επιμολύνσεων του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα Α549 κυτταρική γραμμή και την απαθανάτισε βρογχικών επιθηλιακών κυττάρων σειρά BEAS-2B με μέτρια υπερέκφραση του

miR-30a

ή

-191

χρησιμοποιώντας ένα σύστημα λεντοϊού. Σε σύγκριση με τους αντίστοιχους ελέγχους, οι δύο κυτταρικές σειρές που υπερεκφράζουν

miR-30a

ή

-191

δεν καταδεικνύουν οποιεσδήποτε σημαντικές αλλαγές στην κατανομή του κυτταρικού κύκλου, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, σχηματισμό προσκολλημένα αποικία, μαλακό αποικία άγαρ σχηματισμός, σχηματισμός ξενομοσχεύματος σε ένα υποδόριο SCID μοντέλο ποντικού, και φάρμακο ευαισθησία σε δοξορουβικίνη και σισπλατίνη. Υπάρχει μια μέτρια αύξηση στην μετανάστευση των κυττάρων σε κυτταρικές σειρές που υπερεκφράζουν

miR-30a

σε σύγκριση με τους ελέγχους τους.

Συμπεράσματα /Σημασία

Η υπερέκφραση του

miR-30a

ή

-191

δεν οδηγεί σε μία μεταβολή σε κυτταρικές γραμμές BEAS-2Β του κυτταρικού κύκλου, του πολλαπλασιασμού, σχηματισμός ξενομοσχεύματος, και χημειοευαισθησία των Α549 και. Χρησιμοποιώντας τα δεδομένα μικροσυστοιχιών από όλη την όγκους για να επιλέξετε συγκεκριμένα miRNAs για τη λειτουργική μελέτη μπορεί να είναι μια μη ιδανική στρατηγική

Παράθεση:. Patnaik SK, KANNISTO Ε, Yendamuri S (2010) Η υπερέκφραση του microRNA

miR-30a

ή

miR-191

στο Α549 καρκίνο του πνεύμονα ή BEAS-2B Κανονική πνεύμονα Lines δεν μεταβάλλει φαινότυπο. PLoS ONE 5 (2): e9219. doi: 10.1371 /journal.pone.0009219

Επιμέλεια: Μιχαήλ Β Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 11 Δεκεμβρίου 2009? Αποδεκτές: 24 Ιαν 2010? Δημοσιεύθηκε: 15 Φεβρουαρίου, 2010

Copyright: © 2010 Patnaik et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίζεται από ερευνητικές επιχορηγήσεις από το Ίδρυμα Χειρουργικής θώρακος για την έρευνα και την Εκπαίδευση και τον Καρκίνο και του Ομίλου Λευχαιμία Β? SY υποστηρίζεται από μια υποτροφία από το Ίδρυμα Buswell. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η σημασία των μη-κωδικοποίησης RNAs στη ρύθμιση των κυτταρικών διαδικασιών έχει έρθει για να εκτιμηθεί περισσότερο [1]. Τα καλύτερα μελετημένα μη-κωδικοποιητικές RNAs είναι microRNAs (miRNAs), 18-25 nt μήκους μικρό RNA που ρυθμίζουν επιγενετικώς μετάφραση μέσω σύνδεσης με μία συμπληρωματική αλληλουχία «σπόροι» κοινή για «στόχος» τους mRNA [2]. Δεδομένου ότι αυτή η συμπληρωματικότητα δεν χρειάζεται να είναι τέλεια, μια ενιαία miRNA μπορεί να ρυθμίζει την έκφραση αρκετών εκατοντάδων γονιδίων ταυτόχρονα [3]. Η έκρηξη της τεχνολογίας των μικροσυστοιχιών έχει οδηγήσει στην εφαρμογή της στον τομέα της γονιδιωματικής miRNA. Ως εκ τούτου, πριν από γινόταν γνωστή η λειτουργία ενός σημαντικού ποσοστού των miRNAs, miRNA προφίλ των πολλών φυσιολογικών και μη φυσιολογικών ανθρώπινων ιστών έχουν διενεργηθεί [4]. Η διακριτή διαφορά μεταξύ των δεδομένων που λαμβάνονται μεταξύ miRNA προφίλ και mRNA προφίλ είναι προς το μέγεθος της διαφορικής έκφρασης παρατηρήθηκε στις ομάδες σύγκρισης. Ενώ αρκετές φορές αλλαγές που παρατηρούνται συνήθως στην έκφραση του mRNA χρησιμοποιώντας αυτές τις τεχνολογίες, οι αλλαγές φορές με πειράματα miRNA είναι πιο μέτρια και είναι τυπικά στην περιοχή 1- έως 2-φορές. Ως εκ τούτου, τα πειράματα για να μελετήσουν τη βιολογική σημασία αυτών των μέτριες μεταβολές φορές είναι σημαντικό να αξιολογηθεί η σημασία αυτών των αλλαγών. Με βάση προηγουμένως δημοσιευμένα δεδομένα μικροσυστοιχιών miRNA καταδεικνύουν διαφορές στην έκφραση σε ανθρώπινους καρκίνους σε σύγκριση με το αντίστοιχο φυσιολογικό ιστό, δύο miRNAs επιλέχθηκαν σε αυτή τη μελέτη για τέτοια βιολογικά πειράματα. Αυτές οι δύο miRNAs επιλέχθηκαν λόγω της συνεπούς μεταβολές στην έκφραση τους μεταξύ φυσιολογικού και καρκινικού ιστού των διαφόρων οργάνων, ένας βιο-πληροφορικής ανάλυση των προβλεπόμενων στόχων τους, που πρότεινε σημαντικούς ρόλους στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και της μετανάστευσης και λίγο δημοσίευσε την εργασία επί λειτουργικούς ρόλους τους στον καρκίνο του πνεύμονα .

miR-30α

βρίσκεται στο ανθρώπινο χρωμόσωμα 6q.13 και παράγεται από μια ιντρονική μεταγραφική μονάδα που παράγει τρεις miRNAs:

miR-30a

,

-30C

και

-30e

[5]. Δύο ώριμες μορφές του γονιδίου υπάρχουν –

miR-30a-3ρ

και

miR-30a-5P

. Αρκετές μελέτες έχουν εντοπιστεί αλλαγές στο

miR-30a

έκφραση στον καρκίνο του ανθρώπου. Calin et al. έδειξε μια ρύθμιση προς τα κάτω των

miR-30a

στη χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία (ΧΛΛ) των ασθενών [6]. Παρομοίως,

miR-30a

ρυθμίζεται προς τα κάτω στον καρκίνο του πνεύμονα [7], καρκίνος του παχέος εντέρου [8], παγκρεατικό καρκίνο [9], μεταστατικό ηπατοκυτταρικό καρκίνο (σε σύγκριση με πρωτογενή) [10] και στην οξεία μυελοειδή λευχαιμία (AML) ασθενείς με κατά (11q23) μετατόπιση (σε σύγκριση με άλλους ασθενείς AML) [11].

MiR-30α

είναι σημαντική για την ανάπτυξη του προμετωπιαίου φλοιού μέσω της ρύθμισης των νευροτροφικού παράγοντα που λαμβάνεται από εγκέφαλο (BDNF) [12] και σε σπονδυλωτά ηπατοχολική ανάπτυξη [13]. Άλλες επιβεβαιωθεί πειραματικά στόχους του

miR-30a

είναι αδενυλικής κινάσης (AK1) και η πρωτεΐνη GW182 (Tnrc6a), ένα συστατικό της παρεμβολής RNA φίμωση συγκρότημα [13].

MiR -191

βρίσκεται στο ανθρώπινο χρωμόσωμα 3p21.31 και παράγεται από μια ιντρονική μεταγραφική μονάδα που μπορούν να παράγουν δύο miRNAs:

miR-191

και

-425

[5]. Μόνο μία ώριμη μορφή του

miR-191

είναι γνωστό ότι υπάρχουν.

MiR-191

έκφραση πάνω ρυθμισμένα σε παγκρεατικά [14], του παχέος εντέρου, του πνεύμονα και του προστάτη [7] καρκίνους. Είναι, επίσης, πάνω ρυθμισμένα σε ασθενείς με μη φυσιολογική AML καρυότυποι [11], και ρυθμισμένα προς τα κάτω σε ασθενείς με CLL [6].

MiR-191

έκφρασης επίσης μεταβάλλεται σε πνεύμονες εκτίθενται στον καπνό των τσιγάρων [15]. Δεν στόχοι του mRNA της

miR-191

έχουν επιβεβαιωθεί πειραματικά.

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε αξιολογήσει τις φαινοτυπικές αλλαγές που παρατηρούνται με συστατική υπερέκφραση του

miR-30a

και

-191

, σε πνευμονικό αδενοκαρκίνωμα κυτταρική γραμμή (Α549) [16] και ένα αθανατοποιημένο βρογχικών επιθηλιακών κυττάρων (BEAS-2Β) [17]. Η Α549 κυτταρική γραμμή επελέγη λόγω της ύπαρξης ενός μεγάλου ποσού των πειραματικών δεδομένων για τη χρήση του σε διάφορες δοκιμασίες. Η κυτταρική σειρά BEAS-2Β επιλέχθηκε επειδή είναι η αθανατοποιημένη κυτταρική γραμμή που βρίσκεται πλησιέστερα στο φυσιολογικό βρογχικό επιθήλιο. Καθώς οι επιπτώσεις της υπερέκφραση ενός microRNA είναι συγκεκριμένο πλαίσιο, συγκρίναμε τις μεταβολές στο φαινότυπο των κακοήθων και μη-κακοήθων κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Όλες οι in vivo μελέτες εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση του Ινστιτούτου Καρκίνου Roswell Park.

Cell Culture

Α549 ανθρώπινο καρκίνωμα βρογχιολοκυψελιδικό πνεύμονα και BEAS-2Β κανονική βρογχικών επιθηλιακών κυττάρων γραμμές ήταν λαμβάνεται από ATCC® (Manassas, VA). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν, αντίστοιχα, σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (ϋΜΕΜ +? Invitrogen®, Carlsbad, CA) με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (ΡΑΑ Laboratories®, Αυστρία) και LHC-9 μέσο (Invitrogen®) στους 37 ° C σε 5% CO

2. Σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα καλλιεργήθηκαν υπό την παρουσία 2 μg /ml πουρομυκίνη (Roche®, Indianapolis, ΙΝ).

Δημιουργία σταθερά επιμολυσμένες κυτταρικές σειρές

μονόκλωνα ολιγονουκλεοτίδια DNA με ανθρώπινη

προ-miR-30a

ή

-191

(ένταξη miRBase αναγνωριστικά MI0000088 και MI0000465, αντίστοιχα) σειρές και με προβόλους θέση ενζύμου περιορισμού ελήφθησαν από Ολοκληρωμένη DNA Technologies® (Coralville, ΙΑ). Συμπληρωματικές ακολουθίες ανοπτήθηκαν και το προκύπτον δίκλωνο DNA προσδέθηκε με Xho Ι /Not Ι-πέψη φορέα pLemiR ™ (Open Biosystems®, Huntsville, AL). Α549 κύτταρα στη συνέχεια μολύνθηκαν με πλασμίδια με τη χρήση του συστήματος Trans-λεντοϊών ™ GIPZ συσκευασίας (Open Biosystems? Huntsville, AL) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα TLA-HEK293TTM επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας Σύλληψη-In ™ με 37,5 μg DNA πλασμιδίου σε μέσο ελεύθερο ορού για 4 ώρες. Το μέσο στη συνέχεια αντικαταστάθηκε με μέσο που περιείχε ορό για 36 ώρες. Media συλλέχθηκαν, φυγοκεντρήθηκαν για να απομακρυνθούν τα κυτταρικά υπολείμματα και χρησιμοποιείται για την επιμόλυνση Α549 και BEAS-2Β κύτταρα. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την προσθήκη του ιού, τα επιμολυσμένα κύτταρα επιλέχθηκαν για την προσθήκη 2 μg /ml πουρομυκίνη για μέσο ανάπτυξης.

Real Time RT-PCR (qPCR) για ποσοτικοποίηση των Μικρών RNAs

Σύνολο RNA (20 ng), που απομονώθηκε από κύτταρα χρησιμοποιώντας συνολικού κιτ PureLink ™ Micro-to-Midi απομόνωση RNA (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας TaqMan ™ αντίστροφη κιτ μεταγραφής (Applied Biosystems®, Foster City, CA) και RNA-ειδικούς εκκινητές που παρέχονται με προσδιορισμούς TaqMan ™ microRNA (Applied Biosystems®) σε 15 μΐ, με ανόπτηση στους 16 ° C για 30 λεπτά που ακολουθείται από επέκταση στους 42 ° C για 30 λεπτά. 1,33 μΐ της αντίδρασης RT χρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια με 1 μL ειδικούς εκκινητές είτε για

RNU6B

,

miR-30a

, ή

miR-191

(Applied Biosystems®, Foster City, CA) σε φρεάτια εις τριπλούν για 44-κύκλος PCR σε θερμοκυκλοποιητή 7900HT (Applied Biosystems®). Το στάδιο μετουσίωσης στους 95 ° C ήταν για 15 s, και η ανόπτηση και επέκταση βήμα στους 60 ° C ήταν για 1 λεπτό. SDS λογισμικό (Applied Biosystems®, Foster City, CA) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό του κύκλου κατωφλίου (Ct) τιμές του φθορισμού μετράται κατά τη διάρκεια της PCR. Prism λογισμικό 5.0b (GraphPad®? La Jolla, CA) χρησιμοποιήθηκε για τη στατιστική ανάλυση και τα γραφήματα

Διαδρομή Εμπλουτισμός Ανάλυση

Το διαθέσιμες στο κοινό λογισμικό miRgator (http: //genome.ewha.. ac.kr/miRGator/miRGator.html) χρησιμοποιήθηκε για να εκτελέσει την ανάλυση της οδού εμπλουτισμού. Τα συγκεκριμένα miRNAs που επελέγησαν ήταν

miR-191

και –

30α-5P

. Ο αλγόριθμος επιλογής στόχος επιλέχθηκε ήταν Miranda [3]

Δοκιμασία Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού

δοκιμασίες πολλαπλασιασμού κυττάρων πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας την κυτταρική Titer 96® κιτ. (Promega? Madison, WI), το οποίο χρησιμοποιεί την μετατροπή της MTS (3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -5- (3-καρβοξυμεθοξυφαινυλ) -2- (4-σουλφοφαινυλ) -2Η-τετραζόλιο, εσωτερικό άλας) προς φορμαζάνη για να μετρηθεί η βιωσιμότητα των κυττάρων. Εν συντομία, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία 96 φρεατίων σε 4000 κύτταρα σε 100 μλ ανά φρεάτιο. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε τετραπλούν σε διάφορα χρονικά σημεία για 150 ώρες. Στα συλλεγέντα κύτταρα, 20 μL του αντιδραστηρίου δοκιμασίας προστέθηκε και βιώσιμα κύτταρα μετρήθηκαν με απορρόφηση στα 450 nm 1 ώρα αργότερα σε ένα Multiskan Plus (ΜΤΧ Lab Systems? Βιέννη, VA) αναγνώστη πλάκας. Οι τιμές απορρόφησης κανονικοποιήθηκαν προς έλεγχο των μέσων ενημέρωσης.

Προσκολλητικά Σχηματισμού Αποικίας

Τα κύτταρα σε καλλιέργεια τρυψινοποιήθηκαν και καλλιεργήθηκαν εις διπλούν σε πλάκες 6-φρεατίων σε 200 και κύτταρα ανά φρεάτιο για Α549 και 500 κύτταρα ανά φρεάτιο για BEAS-2B παράγωγα κυτταρική γραμμή αντίστοιχα. Τα κύτταρα αφέθηκαν να αναπτυχθούν στους 37 ° C, 5% CO2 με αλλαγές μέσων κάθε 3-4 ημέρες έως ότου οι αποικίες ήταν ορατές με το μάτι. Το μέσο αναρροφήθηκε και τα κύτταρα βάφτηκαν με 0.2% μπλε του μεθυλενίου σε 40% μεθανόλη για 30 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν και πλάκες σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Epson Perfection V700 Photo σαρωτή ως διαφάνεια. Ο ποσοτικός προσδιορισμός των αποικιών έγινε χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ (Έρευνα Υπηρεσίες Branch, Εθνικό Ινστιτούτο Ψυχικής Υγείας, Bethesda).

αποικίας μαλακού άγαρ Δοκιμασία Σχηματισμού

Βάση άγαρ /media mix προστέθηκε 6-καλά πλάκες (τελική συγκέντρωση 0.7% άγαρ, 1x + DMEM, 10% FBS, 2 μg /ml πουρομυκίνη) για να επικαλύψει την πλάκα και αφήνεται να πολυμεριστεί. Κύτταρα αιωρημάτων έγιναν σε 100 κύτταρα /ml σε μίγμα μέσων /άγαρ (τελική συγκέντρωση 0,35% άγαρ, 1x + DMEM, 10% FBS, 2 μg /ml πουρομυκίνη). 1,5 ml του κυτταρικού εναιωρήματος επιστρώθηκε στην κορυφή του άγαρ βάσης σε κάθε φρεάτιο και αφέθηκε να πολυμεριστεί. 2 ml πλήρους μέσου προστέθηκαν στην κορυφή του άγαρ άπαξ πολυμερίζονται. Οι πλάκες τοποθετήθηκαν σε 37 ° C, 5% CO2, και επικάλυψη μέσα αλλάζονταν κάθε 3-4 ημέρες. Οι καλλιέργειες αναπτύχθηκαν μέχρι λίγες αποικίες ήταν ορατές με το μάτι, 2 mg /ml μπλε θειαζολύλιο τετραζολίου σε PBS προστέθηκε στα κύτταρα και επιστράφηκαν στον επωαστήρα έως ότου χρωματίστηκαν αποικίες. Μόλις αποικίες βάφονται μπλε, ο λεκές αφαιρείται από τα φρεάτια και πάρθηκαν εικόνες χρησιμοποιώντας Cannon Powershot A590IS κάμερα.

In Vitro Scratch Δοκιμασία

Για την εκτίμηση των διαφορών στην κυτταρική μετανάστευση, ένα in-vitro δοκιμασία μηδέν έγινε. Cross-τρίχες καταρτίστηκαν στο κάτω μέρος των πλακών 6-φρεατίων για τον προσανατολισμό για την απεικόνιση. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν εις τριπλούν φρεάτια σε υψηλή πυκνότητα για να φθάσει το 100% συρροή 24 ώρες αργότερα. Μια γρατσουνιά έγινε στη συνέχεια, ακριβώς δίπλα στην κάθετη γραμμή που χαράσσεται στην πλάκα χρησιμοποιώντας μέτρια και συνεπής πίεση χρησιμοποιώντας μια άκρη 10 μL και το καπάκι πλάκα ως μια ευθεία άκρη. Γρατσουνιές απεικονίστηκαν αμέσως σε ένα μικροσκόπιο Axio Παρατηρητής (Zeiss? Maple Grove, MN) σε 5x μεγέθυνση και τον προσανατολισμό των cross-τρίχες σημείωσε. Τα κύτταρα στη συνέχεια επέστρεψε στους 37 ° C, 5% CO2 και απεικονίζεται σε διάφορα χρονικά σημεία έως ότου έκλεισαν όλες οι γρατζουνιές.

Ξενομοσχεύματος Δοκιμασία Σχηματισμού

Όλα τα in vivo μελέτες εγκρίθηκαν από το Φροντίδα Ζώων Θεσμικών και Χρήση Επιτροπή του Roswell Park Cancer Institute. υπερεκφράζουν Α549 κυτταρικές γραμμές (6,0 χ 105 κύτταρα) ελέγχου και ενέθηκαν υποδορίως ανάμεσα στις ωμοπλάτες του ηλικίας 4-5 εβδομάδων ποντίκια SCID (5 ποντίκια σε κάθε ομάδα). Οι όγκοι παρακολουθήθηκαν 2-3 φορές την εβδομάδα με μετρήσεις καλίμπρας μέχρι το μεγαλύτερο όγκος ήταν 2 cm σε μακρύτερη κατεύθυνση, στο οποίο σημείο θανατώθηκαν όλα τα ποντίκια. Οι όγκοι αποκόπηκαν και ζυγίστηκαν.

Κύκλου Κυττάρου Ανάλυση

κύτταρα αναπτύσσονται προς 70% -90% συρροή αποσπάσθηκαν με θρυψινοποίηση, μονιμοποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη στους 4 ° C για 1-2 ημέρες, πλύθηκαν με PBS, και επωάζονται σε πυκνότητα 1-2 × 10

6 κύτταρα /ml με 0,3 μΜ 4,6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλης διυδροχλωρίδιο (DAPI? ΜΡ Biochemicals®, Solon, ΟΗ) σε PBS σε θερμοκρασία δωματίου θερμοκρασία στο σκοτάδι για 100 λεπτά. Μετά την πλύση μια φορά με PBS, ϋΑΡΙ φθορισμός από τα κύτταρα προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας ένα LSR II (BD Biosciences®, San Jose, CA) όργανο εξοπλισμένο με ένα 408 nm δίοδο ιώδες λέιζερ και ένα φίλτρο εκπομπής 450/50 nm.

Drug ευαισθησία της δοκιμασίας

Μετά τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 50% -60% συρροή σε πλάκες 96 φρεατίων (5 φρεάτια ανά κυτταρική σειρά), το μέσο αντικαταστάθηκε με το εν λόγω περιέχον 1 μg /ml υδροχλωρική δοξορουβικίνη (Enzo ζωή Sciences®, Farmingdale, ΝΥ) ή σισπλατίνη (Calbiochem®, San Diego, CA). Μετά από 1,5-2 ημέρες καλλιέργειας, βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε όπως περιγράφεται για την δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων και σε σύγκριση με εκείνα που δεν είχαν εκτεθεί στα φάρμακα.

Αποτελέσματα

δημιουργία σταθερών κυτταρικών σειρών με υπερ-έκφραση του miR-30a και -191

σταθερές κυτταρικές σειρές που υπερεκφράζουν

miR-30a

και

-191

παρήχθησαν χρησιμοποιώντας ένα λεντοϊού σύστημα, όπως περιγράφεται παραπάνω.

MiR-30α

ήταν υπερεκφράζεται ~ 2 φορές και περίπου 3 φορές σε δύο Α549 (Α-30α) και BEAS-2Β (Β-30α) αντίστοιχα, σε σύγκριση με τους μάρτυρες (Α0 και Β0 αντίστοιχα). Σε σύγκριση με τους μάρτυρες,

miR-191

ήταν υπερεκφράζεται ~ 2 φορές και περίπου 7 φορές το Α549 (Α-191) και BEAS-2Β (Β-191), αντίστοιχα (Σχήμα 1). Η υπερέκφραση αυτή επιβεβαιώθηκε και από την απεικόνιση του RFP που περιέχουν κύτταρα από μικροσκόπιο.

Η έκφραση είναι κανονικοποιημένη για τον έλεγχο κυτταρικές σειρές (A0 ή B0).

Η

Διαδρομή Εμπλουτισμός Ανάλυση

πρόβλεψη στόχου από τον αλγόριθμο Miranda εντοπίστηκαν 731 στόχους για

miR-30a-5P

και 570 στόχους για

miR-191

. Οι δέκα οδοί που προσδιορίζονται από την ανάλυση εμπλουτισμού οδού περιλαμβάνεται οδούς που επηρεάζουν μεταξύ άλλων κυτταρικού κύκλου, του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, αντίσταση στο φάρμακο και κυτταρική κινητικότητα, (Πίνακας 1).

Η

υπερέκφραση του

ΜΙΚ 30α

ή

-191

δεν μεταβάλλει μέτρα της διάδοσης τόσο in vitro όσο και in vivo σε Α-549 και BEAS-2Β κυττάρων Lines

ανάλυση εμπλουτισμό Διαδρομή πρότεινε ότι

miR -30a

και

-191

επηρεάζεται του κυτταρικού κύκλου και του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Να εξετάσει την επίδραση της υπερέκφρασης του

miR-30a

και

-191

για Α549 και BEAS-2Β, καμπύλες ανάπτυξης χαράχθηκαν με βάση τις μετρήσεις της βιωσιμότητας των κυττάρων σε διαφορετικά χρονικά σημεία πάνω από ένα 150- ωρη περίοδο. Δεν παρατηρήθηκε διαφορά στην καμπύλες ανάπτυξης παρατηρήθηκαν σε Α-30α και Α-191 σε σύγκριση με Α0 και σε Β-30α και Β-191 σε σύγκριση με B0 (Σχήμα 2Α, 2Β). Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές συγκρίθηκε επίσης με τη χρήση σχηματισμό προσκολλημένα αποικιών. Δεν παρατηρήθηκε διαφορά είτε σε αριθμό ή το μέγεθος των προσκολλημένων αποικιών σε κυτταρικές σειρές που υπερεκφράζουν

miR-30a

ή

-191

σε σύγκριση με την αντίστοιχη κυτταρική γραμμή ελέγχου (Σχήμα 2C).

Α, Β. καμπύλες πολλαπλασιασμός κυττάρων για κυτταρικές γραμμές Α0, A-30α και Α-191 (Α) και B0, Β-30α και Β-191 (Β) που αποδεικνύουν καμία αλλαγή στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. πλάκες μπλε χρωματισμένο κυτταρικής καλλιέργειας Γ μεθυλενίου επιδεικνύοντας καμία διαφορά στο σχηματισμό προσκολλημένη αποικία Α-30α και A-191 σε σύγκριση με Α0 και σε Β-30α και Β-191 σε σύγκριση με B0. σχηματισμό Δ ξενομοσχεύματος σε ποντίκια SCID με Α549 δεν μεταβάλλεται από την υπερέκφραση του

miR-30a

ή

-191

.

Η

Anchorage ανεξαρτησία είναι ένα από τα τα κύρια χαρακτηριστικά του μετασχηματισμού. Επιδιώξαμε να προσδιοριστεί η επίδραση της υπερέκφρασης του

miR-30a

ή

-191

για αγκύρωση ανάπτυξη ανεξάρτητη των Α549 και κύτταρα BEAS-2Β με τη χρήση της δοκιμασία μαλακού άγαρ αποικίας, όπως περιγράφεται παραπάνω. Όλες οι γραμμές που σχηματίζονται πολύ λίγοι αποικίες που ήταν ορατές με μικροσκοπία με μόνο 2-3 αποικίες ορατές με γυμνό μάτι. Δεν παρατηρήθηκαν διαφορές μετά από χρώση ή με μικροσκοπία (δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

σχηματισμός Ξενομοσχεύματος πιστεύεται ότι αντιπροσωπεύει ένα βιολογικώς σχετικό μέτρο της επιθετικότητας του όγκου. Εκτιμήσαμε την επίδραση της υπερέκφρασης του

miR-30a

ή

-191

στο σχηματισμό ξενομοσχευμάτων σε SCID ποντίκια από τα κύτταρα Α549. Σε σύγκριση με την κυτταρική γραμμή ελέγχου (Α0), A-30α και Α-191 δεν σχηματίζουν μεγαλύτερα ξενομοσχεύματα (Σχήμα 2D). Η αύξηση του όγκου του όγκου συναρτήσει του χρόνου είναι επίσης δεν διαφέρει σε αυτές τις κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με τον έλεγχο (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Καθώς η κυτταρική σειρά BEAS-2Β είναι μη ογκογόνα, δεν είχαμε εκτιμήσει σχηματισμός ξενομοσχεύματος χρησιμοποιώντας B0, Β-30α ή Β-191.

Η Επίδραση της υπερ-έκφραση του

miR-30a

ή

-191

για τη μετανάστευση των κυττάρων και κυτταρικού κύκλου Κατανομή των A-549 και BEAS-2Β Γραμμές κυττάρων

η αυξημένη κυτταρική μετανάστευση αποτελεί ένα σημαντικό μηχανισμό που θεωρείται ότι αυξάνει το μεταστατικό δυναμικό των καρκινικών κυττάρων . Αυτό μπορεί να είναι ανεξάρτητη από τα ποσοστά πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Συνεπώς, μελετήσαμε την επίδραση του

miR-30a

ή

-191

σε κυτταρικές μετανάστευση των Α549 και κυτταρικές σειρές BEAS-2Β με τη χρήση της δοκιμασίας μηδέν όπως περιγράφεται παραπάνω. Υπάρχει μία μέτρια αύξηση στη μετανάστευση των Α-30α και Β-30α σε σύγκριση με Α0 και Β0 αντίστοιχα. Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην απόσταση μετανάστευσης μεταξύ των κυτταρικών σειρών που υπερεκφράζουν

miR-191

σε σύγκριση με τις αντίστοιχες κυτταρικές γραμμές ελέγχου (Σχήμα 3Α).

A. Κυττάρων μετανάστευση των Α-30α και Β-30α είναι αυξημένη σε σύγκριση με τους μάρτυρες? καμία επίδραση της υπερέκφρασης του

miR-191

έχει δει. B. Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου σταθερών επιμολύνσεων αποδεικνύοντας καμία διαφορά μεταξύ των κυττάρων που υπερεκφράζουν

miR-30a

και

-191

σύγκριση με τους μάρτυρες.

Η

Η εξέταση των οι προβλεπόμενες στόχοι του

miR-30a

και

-191

και οι κυτταρικές διεργασίες επηρεάζονται από τους δείχνει μια στατιστικά σημαντική εμπλουτισμό των οδών που περιλαμβάνουν τον κυτταρικό κύκλο. Ως εκ τούτου, μελετήθηκε η επίδραση της υπερέκφρασης του

miR-30a

ή

-191

για την κατανομή του κυτταρικού κύκλου. Η κυτταρομετρία ροής μετά από χρώση με DAPI χρησιμοποιήθηκε για να εκτελέσει την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου όλες τις κυτταρικές σειρές. Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, κυτταρικές σειρές που υπερεκφράζουν

miR-30a

ή

-191

δεν δείχνουν σημαντικές αλλαγές στην κατανομή του κυτταρικού κύκλου (Σχήμα 3Β).

Πάνω -έκφραση

miR-30a

ή

-191

δεν μεταβάλλει χημειοευαισθησία με δοξορουβικίνη ή cisplatin

Η δοξορουβικίνη και σισπλατίνη χρησιμοποιούνται συνήθως χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. Α549 είναι μετρίως ευαίσθητο σε σισπλατίνη και δοξορουβικίνη (https://dtp.nci.nih.gov), που επιτρέπει την εκτίμηση τόσο αυξημένη και μειωμένη ευαισθησία σε αυτά τα φάρμακα. Η υπερέκφραση του

miR-30a

ή

-191

δεν μεταβάλλει την χημειοευαισθησία των Α549 και BEAS-2Β είτε φάρμακο (Σχήμα 4).

ευαισθησία των κυττάρων Α549 ( Α, Β) και BEAS-2Β κύτταρα (C, D) στη δοξορουβικίνη και σισπλατίνη. Γκρι δείχνει κύτταρα ελέγχου.

Η

Συζήτηση

αλλαγές miRNA είναι κοινώς δει σε καρκινικό ιστό σε σύγκριση με το κανονικό τους ομολόγους τους. Το μέγεθος αυτών των αλλαγών είναι μέτρια και λειτουργική σημασία τους σε άγνωστα. Μία από τις δυσκολίες στη μελέτη των miRNAs είναι ότι ένα miRNA έχει αρκετές εκατοντάδες προβλέψει στόχους και αυτά τα βιο-πληροφορικής προβλέψεις δεν είναι πολύ ακριβή. Επίσης, ο ρόλος των miRNAs σε ένα κύτταρο εξαρτάται από τη γενετική σύσταση και την μεταγραφικό ενός κυττάρου σε κάθε δεδομένη στιγμή και αυτή η πολυπλοκότητα δεν συλλαμβάνεται απλά με αναγκαστική υπερ-έκφραση τους. Ωστόσο, τα φαινοτυπικά αλλοιώσεις δευτερογενώς προς αναγκαστική υπερέκφραση μπορεί να παρέχει ενδείξεις για την κατανόηση της συμβολής τους στην κακοήθη φαινότυπο. Σε αυτή τη μελέτη, δημιουργούνται σταθερές επιμολύνσεις που συντακτικά υπερεκφράζουν

miR-30a

ή

-191

και δεν δείχνουν σημαντικές αλλαγές στο φαινότυπο στις διάφορες δοκιμασίες που πραγματοποιήθηκαν. Ένας αριθμός πιθανών εξηγήσεων μπορεί να εξηγήσει αυτή την έλλειψη μεταβολής του φαινοτύπου. Πρώτον, είναι πιθανό ότι το επίπεδο της έκφρασης των miRNAs επιτευχθεί δεν είναι αρκετή για να δημιουργήσει μια διαφορά. Ακόμη και αν οι αλλαγές φορές φαίνεται από τα πειράματα μικροσυστοιχιών είναι συνήθως μέτρια, τέτοια πειράματα μπορεί να υποεκτιμούν την πραγματική αλλαγές στα κακοήθη επιθηλιακά κύτταρα, λόγω της αραίωσης των αλλαγών σε κακοήθη επιθηλιακά κύτταρα από στρωματικά κύτταρα που αποτελούν ένα σημαντικό ποσοστό των παθολογικών δειγμάτων. Επίσης, το μέγεθος των αλλαγών φαίνεται από μικροσυστοιχίες είναι συχνά μικρότερη από τις αντίστοιχες αλλαγές δει με RT-PCR. Επομένως, οι πραγματικές αλλαγές σε κακοήθη κύτταρα μπορεί να είναι περισσότερο από εκείνη που επιτυγχάνεται στο σύστημα μοντέλο μας. Αντιστρόφως, είναι πιθανό ότι οι αλλαγές που παρατηρούνται σε μικροσυστοιχίες miRNA υπερεκτίμηση ψευδώς αλλαγές. Για παράδειγμα, σε μία μελέτη με Peltier et al [18], η οποία αξιολογείται προσεκτικά αρκετές υποψήφιες miRNAs για τη σταθερότητα της έκφρασης σε πέντε τύπους καρκίνου και κανονικούς ιστούς με RT-PCR,

miR-191

ήταν τόσο σταθερώς εξέφρασαν ώστε προτάθηκε ως ένα γονίδιο που πρόκειται να χρησιμοποιηθεί για την κανονικοποίηση. Αυτό συνηγορεί υπέρ ενός ρόλου για

miR-191

στην καρκινογένεση. Ως εκ τούτου, η επιλογή miRNAs με βάση τα δεδομένα μικροσυστοιχιών μπορεί να μην είναι μια καλή στρατηγική. Τρίτον, όλα τα miRNAs μπορεί να μην είναι σε θέση να οδηγήσει σε φαινοτυπικές αλλαγές στις δικές τους? επίδρασή τους μπορεί να είναι συγκεκριμένο πλαίσιο και μπορεί να χρειαστεί να γίνουν σε συνδυασμό με αλλοιώσεις της έκφρασης είτε άλλες miRNAs ή mRNAs να αλλάξει το φαινότυπο.

Εν ολίγοις, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η υπερβολική έκφραση του

miR-30a

ή

-191

δεν οδηγεί σε μία μεταβολή της του κυτταρικού κύκλου, του πολλαπλασιασμού, σχηματισμός ξενομόσχευμα και χημειοευαισθησία των Α549 και κυτταρικές σειρές BEAS-2Β. Χρησιμοποιώντας τα δεδομένα μικροσυστοιχιών από όλη την όγκους για να επιλέξετε συγκεκριμένα miRNAs για τη λειτουργική μελέτη μπορεί να είναι μια υπο-βέλτιστη στρατηγική. Είναι σημαντικό για την επιβεβαίωση της λειτουργικής σημασίας των αλλαγών παρατηρήθηκαν σε δεδομένα έκφρασης miRNA σε συγκεκριμένους τύπους όγκων να καθοριστούν οι βιολογικοί ρόλοι των συγκεκριμένων miRNAs.