PLoS One: Τα microRNAs ιστών ως προγνωστικοί παράγοντες της αποτελέσματα σε ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου Αντιμετωπίζεται με την Πρώτη Γραμμή καπεσιταβίνη και οξαλιπλατίνη με ή χωρίς Bevacizumab

Ιανουάριος 25th, 2017 elhealth του καρκίνου άρθρα

Αφηρημένο

Σκοπός

Ελέγξαμε την υπόθεση ότι η έκφραση των microRNAs (miRNAs) σε καρκινικό ιστό μπορούν να προβλέψουν την αποτελεσματικότητα του bevacizumab προστίθεται στην καπεσιταβίνη και οξαλιπλατίνη (CAPEOX) σε ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου (mCRC)

Πειραματικός Σχεδιασμός

Οι ασθενείς με mCRC που έλαβαν θεραπεία με πρώτη γραμμή CAPEOX και bevacizumab (CAPEOXBEV):. προσυμπτωματικού ελέγχου (n = 212) και την επικύρωση (n = 121) ομάδες, ή CAPEOX μόνη της : ομάδα ελέγχου (n = 127), εντοπίστηκαν εκ των υστέρων και αρχειακό δείγματα πρωτογενούς όγκου συλλέχθηκαν. Η έκφραση της 754 miRNAs αναλύθηκε στην κοόρτη διαλογή χρησιμοποιώντας αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) συστοιχίες και τα επίπεδα έκφρασης που σχετίζονται με το χρόνο έως την εξέλιξη της νόσου (ΤΤΡ) και τη συνολική επιβίωση (OS). Σημαντικές miRNAs από τη μελέτη ελέγχου αναλύθηκαν σε όλες τις τρεις ομάδες που χρησιμοποιούν έθιμο συστοιχίες PCR.

In situ υβριδισμού

(ISH) έγινε για επιλεγμένες miRNAs.

Αποτελέσματα

Στη μελέτη διαλογής, 26 miRNAs συσχετίζονταν σημαντικά με αποτέλεσμα σε αναλύσεις πολλών μεταβλητών. Είκοσι δύο miRNAs επιλέχθηκαν για περαιτέρω μελέτη. Υψηλότερες miR-664-3p έκφρασης και κάτω miR-455-5p έκφραση ήταν προβλεπτική βελτιωμένο αποτέλεσμα στις ομάδες CAPEOXBEV και έδειξε σημαντική αλληλεπίδραση με bevacizumab αποτελεσματικότητα. Τα αποτελέσματα ήταν ισχυρότερα για το OS. Αμφότερα τα miRNAs έδειξε υψηλή έκφραση σε στρωματικά κύτταρα. Υψηλότερη έκφραση του miR-196b-5P και miR-592 προέβλεψε βελτιωμένη έκβαση ανεξαρτήτως της bevacizumab θεραπείας, με παρόμοιες εκτιμήσεις επίδραση και στις τρεις ομάδες.

Συμπεράσματα

Έχουμε εντοπίσει δυνητικά πρόβλεψης miRNAs για bevacizumab αποτελεσματικότητα και επιπλέον miRNAs που θα μπορούσαν να σχετίζονται με την αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας ή την πρόγνωση σε ασθενείς με mCRC. Τα ευρήματά μας χρειάζεται περαιτέρω επικύρωση σε μεγάλες ομάδες, κατά προτίμηση από ολοκλήρωσε τυχαιοποιημένες μελέτες

Παράθεση:. Boisen MK, Dehlendorff C, D Linnemann, Nielsen BS, Larsen JS, Østerlind K, et al. Τα microRNAs (2014) ιστού ως προγνωστικοί παράγοντες της αποτελέσματα σε ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου Αντιμετωπίζεται με την Πρώτη Γραμμή καπεσιταβίνη και οξαλιπλατίνη με ή χωρίς μπεβασιζουμάμπη. PLoS ONE 9 (10): e109430. doi: 10.1371 /journal.pone.0109430

Επιμέλεια: Ratna B. Ray, πανεπιστήμιο του Saint Louis, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 7 Ιουλίου του 2014? Αποδεκτές: 22, Αύγ 2014? Δημοσιεύθηκε: 15 Οκτωβρίου, 2014

Copyright: © 2014 Boisen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι, για τις εγκεκριμένες λόγους, ορισμένοι περιορισμοί πρόσβασης ισχύει για τα στοιχεία στα οποία βασίστηκαν τα συμπεράσματα. Τα στοιχεία είναι διαθέσιμα από το Access /Επιτροπή Δεοντολογίας Θεσμικών δεδομένων του Τμήματος Ογκολογίας του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Χέρλεβ για τους ερευνητές που πληρούν τα κριτήρια για την πρόσβαση σε εμπιστευτικά δεδομένα. αιτήματα τα δεδομένα θα πρέπει να αποσταλούν με τον καθηγητή Julia Σ Johansen σε [email protected]

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από μια επιχορήγηση χωρίς περιορισμό από την Roche Δανία (www.roche.dk), η Ίδρυμα Χέρλεβ Νοσοκομείο Έρευνας (www.herlevhospital.dk), και μια επιχορήγηση απόδειξη της έννοιας από το Τεχνικό Πανεπιστήμιο της Δανίας (www.dtu.dk). Όλες οι επιδοτήσεις που δόθηκαν σε MKB μόνη της, ή τόσο MKB και JSJ. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και τους συγγραφείς αυτού του χειρογράφου έχουν τα ακόλουθα ανταγωνιστικά ενδιαφέροντα: BVJ: Roche, σύμβουλος /συμβουλευτικό ρόλο? SEN: Roche, σύμβουλος /συμβουλευτικό ρόλο? PP: Roche, σύμβουλος /συμβουλευτικό ρόλο? JSJ: Roche, αμοιβές και τη χρηματοδότηση της έρευνας? MKB: Roche, η χρηματοδότηση της έρευνας. JSJ και MKB είναι συν-εφευρέτες σε ένα δίπλωμα ευρεσιτεχνίας εφαρμογή που σχετίζονται με τις προαναφερθείσες miRNAs. Πληροφορίες αίτηση διπλώματος ευρεσιτεχνίας: Όνομα «microRNAs για την πρόβλεψη της αποτελεσματικότητας της θεραπείας και την πρόγνωση των ασθενών με καρκίνο»? αριθμός εφαρμογών «PCT /DK2013 /050015». BSN απασχολείται από μια εμπορική εταιρεία (Bioneer). Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η κύρια αιτία θνησιμότητας σχετίζονται με τον καρκίνο σε όλο τον κόσμο [1]. Οι περισσότεροι θάνατοι συμβαίνουν ως αποτέλεσμα της ανάπτυξης της μεταστατικής CRC (mCRC). Πρότυπο φροντίδας για τους ασθενείς με mCRC που δεν μπορούν να υποβληθούν σε ριζική εκτομή των μεταστάσεων είναι η χημειοθεραπεία σύστημα με ή χωρίς ένα παράγοντα στόχο [2]. Bevacizumab είναι ένα μονοκλωνικό αντίσωμα που συνδέεται με το συνδέτη »αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF-A) και με τον τρόπο αυτό αναστέλλει την ικανότητα των καρκίνων να παράγει νέα αιμοφόρα αγγεία από υπάρχοντα αγγεία, μια διαδικασία που ονομάζεται αγγειογένεση. Bevacizumab έχει αποδειχθεί η αποτελεσματικότητα σε ασθενείς με mCRC όταν χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με την κλασική χημειοθεραπεία, αλλά το όφελος είναι μικρό όταν χρησιμοποιείται μη επιλεκτικότητα και bevacizumab προσθέτει σημαντική τοξικότητα και το κόστος για τη θεραπεία [3] – [7]. Ως εκ τούτου, η αναγνώριση της πρόβλεψης βιοδεικτών για τη bevacizumab έχει γίνει ένας σημαντικός στόχος της έρευνας βιοδεικτών σε ασθενείς με mCRC. Λόγω ευρεία υιοθέτηση της ως προτύπου πρώτης ή δεύτερης γραμμής θεραπεία [8], η δυνατότητα να εξατομικεύσει τη θεραπεία bevacizumab θα έχει μεγάλη επίδραση στην κλινική πρακτική. Πολυάριθμες μελέτες έχουν διερευνήσει δυναμικό βιοδείκτες στην μορφή RNA, DNA, ή πρωτεΐνη [9], [10]. Κανένας έχει γίνει σε κλινική. Επί του παρόντος, δεν είναι εμπορικά διαθέσιμα τεστ μπορεί να εντοπίσει τους ασθενείς που θα ωφεληθούν από bevacizumab.

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μικρές, μεγάλες ~ 22 νουκλεοτίδια, μη-κωδικοποίησης RNA που εμπλέκονται στη μετα-μεταγραφική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Έχουν έντονα διερευνηθεί ως βιοδείκτες σε ασθενείς με καρκίνο επειδή τα επίπεδα έκφρασης τους απορυθμίζεται σε καρκινικά κύτταρα, μπορούν να επηρεάσουν τη συμπεριφορά του καρκίνου, και είναι σχετικά ανθεκτικά σε αποικοδόμηση σε κοινώς χρησιμοποιούμενα μέσα δειγματοληψίας [11] – [16]. Αρκετές μελέτες έχουν εντοπίσει απορύθμιση της miRNAs στον ιστό του όγκου CRC και σε δείγματα αίματος από ασθενείς με CRC? και μερικά από τα προσδιορισθέντα miRNAs σχετίζονταν επίσης με προγνωστικούς παράγοντες όπως το βάθος της εισβολής, το στάδιο, και μεταστάσεις λεμφαδένα [17]. Επιπλέον, σημαντικό μοριακά χαρακτηριστικά σε CRC όπως μικρο-δορυφόρος αστάθεια (MSI) και

BRAF

κατάστασης μεταλλάξεων έχουν δειχθεί ότι σχετίζονται με διακριτά πρότυπα έκφρασης miRNA [18]. Ως εκ τούτου, υπάρχει μια ισχυρή λογική για τη διερεύνηση της πιθανής χρησιμότητας της έκφρασης miRNA ως προγνωστική ή προγνωστικός βιοδείκτη σε ασθενείς με CRC. Μέχρι σήμερα, δεν υπάρχει δημοσιευμένη μελέτη διερεύνησε την προγνωστική αξία της έκφρασης των miRNAs για bevacizumab αποτελεσματικότητα με ολοκληρωμένο τρόπο.

Εμείς ως στόχο να προσδιορίσει miRNAs που ήταν προγνωστική της έκβασης σε ασθενείς με mCRC που έλαβαν θεραπεία με καπεσιταβίνη πρώτη γραμμή και οξαλιπλατίνη με και χωρίς bevacizumab (CAPEOXBEV /CAPEOX) και να προσδιορίσει ποια από αυτά τα miRNAs θα μπορούσε να είναι προγνωστική για την επίδραση της bevacizumab-εκτός από την χημειοθεραπεία.

Μέθοδοι

σχεδιασμός μελέτης

μελέτη ελέγχου χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση συστοιχίας πραγματοποιήθηκε σε δείγματα πρωτογενούς CRC ιστών από ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με CAPEOXBEV (ομάδα ελέγχου) για τον εντοπισμό υποψήφιων miRNAs με τα επίπεδα έκφρασης που σχετίζονται με την έκβαση. Στη συνέχεια, τα επίπεδα έκφρασης των καθορισμένων υποψήφια miRNAs μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας μια πιο ακριβής μέθοδος με δύο προσδιορισμών, σε τρεις ομάδες: μια υποομάδα της κλάσης ελέγχου? μια ομάδα επικύρωσης, η οποία ήταν μια ανεξάρτητη ομάδα των ασθενών που έλαβαν θεραπεία με CAPEOXBEV? και μια ομάδα ελέγχου, που αποτελείται από ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με μόνη CAPEOX.

Οι ασθενείς, εξόρυξη δεδομένων, και τέλος τα σημεία

Οι (microRNAs ιστών Bevacizumab σε καρκίνο του παχέος εντέρου) BETmiRC μελέτη περιλάμβανε αναδρομικά ασθενείς με mCRC θεραπεία με την πρώτη γραμμή CAPEOXBEV σε 10 δανικά νοσοκομεία 2006-2011, και ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με την πρώτη γραμμή CAPEOX σε Χέρλεβ νοσοκομείο ή σε μια τυχαιοποιημένη μελέτη 2003-2006 [19], πριν από bevacizumab εγκρίθηκε, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20] .Το τέλος πόντοι χρόνος έως την εξέλιξη της νόσου (TTP) και τη συνολική επιβίωση (OS) μετρήθηκαν από την έναρξη της θεραπείας με την εξέλιξη της νόσου ή θανάτου από οποιαδήποτε αιτία, αντίστοιχα (λεπτομερή ορισμό στο S1 αρχείου). Vital κατάσταση ενημερώθηκε 5 Ιουλίου 2013.

δείγματα ιστών

φορμόλη-σταθερό μπλοκ (FFPE) ιστού εμπεδωθεί με παραφίνη που περιέχει δείγματα από πρωτογενείς όγκους ανακτήθηκαν από το Εθνικό Παθολογίας Μητρώο. συμπεριλήφθηκαν επίσης δείγματα ελέγχου από ασθενείς εκτομή για φλεγμονώδη νόσο του εντέρου. Ένας έμπειρος γαστρο-εντερικές παθολόγο (DL) επιλεγμένων μπλοκ που ιστό για να ανακτήσετε και σκόραρε από το μπλοκ για το ποσοστό των καρκινικών κυττάρων. Τρία 10-μm τομές κόπηκαν από κάθε μπλοκ χωρίς μικρό- ή μακρο-ανατομή και οι τομές τοποθετήθηκαν σε αποστειρωμένους σωλήνες Eppendorf. Όλα τα δείγματα ιστού συλλέχθηκαν πριν από οποιαδήποτε συστηματική θεραπεία ή ακτινοθεραπεία.

miRNA ανάλυση έκφρασης

RNA καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας το miRNeasy FFPE Kit (Qiagen, Hilden, Germany) χρησιμοποιώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η σειρά καθαρισμού τυχαιοποιήθηκαν για τα δείγματα ομάδα επικύρωσης και ελέγχου. Το μη ανθρώπινο miRNA ATH-miR-159a προστέθηκε σε κάθε δείγμα πριν από τη σύνθεση cDNA ως ακίδα-έλεγχο.

Χρησιμοποιήθηκε η σειρά A TaqMan Ανθρωπίνων microRNA και Β κάρτες Σετ v3.0 (Applied Biosystems) για την ποσοτικοποίηση της έκφρασης των 754 ανθρώπινα miRNAs με απλούς προσδιορισμούς σε μελέτη ελέγχου. Σε μεταγενέστερη μελέτη του μειωμένου screening-, validation-, και οι ομάδες ελέγχου, η έκφραση των miRNAs μετρήθηκε χρησιμοποιώντας TaqMan Προσαρμοσμένη LDA κάρτες (Applied Biosystems) profiling 22 επιλεγμένα miRNAs εις διπλούν, με 8 δείγματα σε κάθε κάρτα. Οι 22 miRNAs επιλέχθηκαν από τη μελέτη προσυμπτωματικού ελέγχου και οι μικρο-fluidic κάρτες προ-ρυθμιστεί από τον κατασκευαστή σύμφωνα με τις προδιαγραφές μας. Τα δείγματα αναλύθηκαν σε τυχαία σειρά στις κάρτες συνήθειας LDA.

Οι οδηγίες και τα αντιδραστήρια από τον κατασκευαστή χρησιμοποιήθηκαν σε όλα τα στάδια (https://www.products.appliedbiosystems.com). Όλες οι μελέτες Καθαρισμός- RNA και έκφρασης των miRNAs έγιναν από AROS Εφαρμοσμένη Βιοτεχνολογία (Aarhus, Δανία). Η εταιρεία τυφλώθηκε σε όλες τις κλινικές πληροφορίες.

Mirna

in situ υβριδισμού

Σε situ υβριδισμού

(ISH) πραγματοποιήθηκε με τη χρήση διπλής-FAM ( καρβοξυφθοριεσκίνη) που φέρουν κλειδωμένο νουκλεϊκών οξέων (LNA [21]) ανιχνευτές (Exiqon, Vedbæk, Δανία) για miR-185-5p, miR-455-5p, miR-592, miR-664-3p, miR-21-5p, και miR-126-3p, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22]. Όλες οι μελέτες ISH πραγματοποιήθηκαν από Bioneer (Hørsholm, Δανία).

Η στατιστική ανάλυση

Όχι υπολογισμό του μεγέθους του δείγματος έγινε πριν από την έναρξη της μελέτης. Έχουμε στόχο για το μεγαλύτερο μέγεθος του δείγματος είναι δυνατό και ίσα μεγέθη από τις τρεις ομάδες

αναλύει την έκφραση των miRNAs -.. Διαλογής μελέτη

όριο Πρώτες κύκλου (C

t) για κάθε miRNA ελέγχθηκε για ακραίες τιμές και τα δεδομένα διορθώθηκαν χρησιμοποιώντας τιμές ακίδα-in. Σε μια μονοπαραγοντική μέθοδο επιλογής, η έκφραση του κάθε miRNA σχετιζόταν με ΤΤΡ και λειτουργικό σύστημα χρησιμοποιώντας ένα (CPH) μοντέλο αναλογικών κινδύνων κατά Cox [23], [24]. Υποψήφιος miRNAs συμπεριλήφθηκαν σε ένα πολυπαραγοντικό μοντέλο CPH προσαρμογή για την ηλικία, το φύλο, ιστολογία, τον αριθμό των μεταστατικών σημείων, κύρια θέση του όγκου, και προηγούμενη επικουρική θεραπεία, η οποία είχε απλοποιηθεί χρησιμοποιώντας ένα πίσω διαδικασία αποβολής με βάση το κριτήριο του Akaike του [25]. Η ανάλυση επαναλαμβάνεται για τα σύνολα δεδομένων ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας quantile- και σημαίνουν κανονικοποίηση. Τέλος, επιλέχθηκαν 22 miRNAs για περαιτέρω μελέτη βασίζεται κυρίως στις επιδόσεις τους στα πολυπαραγοντική ανάλυση. Ο αριθμός των miRNAs να συμπεριλάβει στη δεύτερη μελέτη επιλέχθηκε πραγματισμό, δεδομένου ότι επιτρέπει για διπλές μετρήσεις σχετικά με το έθιμο πλατφόρμα

αναλύει την έκφραση των miRNAs -.. Screening-, validation-, και οι ομάδες ελέγχου

η μέση C

t από τις διπλές μετρήσεις υπολογίστηκε και μετατρέπεται σε 40-C

t. Εάν μία από τις δύο μετρήσεις ήταν απροσδιόριστο, το C

t του άλλου μέτρησης χρησιμοποιήθηκε. Σε κάθε μία από τις τρεις ομάδες, η έκφραση των miRNAs 22 σχετιζόταν με ΤΤΡ και OS χρησιμοποιώντας μοντέλα CPH με προσαρμογή για την ηλικία, το φύλο, κύρια θέση του όγκου, πριν από επικουρική θεραπεία, και τον αριθμό των μεταστατικών σημείων. Τα αποτελέσματα αναφέρονται ως λόγοι κινδύνου (HR) για κάθε αύξηση ενδοτεταρτημοριακό εύρος σε επίπεδο έκφρασης με διαστήματα εμπιστοσύνης 95% (CI) .Η πιθανή αλληλεπίδραση μεταξύ του επιπέδου έκφρασης των miRNAs και bevacizumab επίδραση της θεραπείας ελέγχθηκε σε τρεις ομάδες σε συνδυασμό με τη δοκιμασία του λόγου πιθανοτήτων .

Από αποτέλεσμα για τους ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με bevacizumab διέφεραν σε μεγάλο βαθμό ανάλογα με την κύρια θέση του όγκου [20], θα πραγματοποιηθεί, επίσης, αναλύει την αλληλεπίδραση για το εγγύς και άπω πρωτογενείς καρκίνους ξεχωριστά.

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική και υπάρχουν τυπικές διορθώσεις για πολλαπλές συγκρίσεις έγιναν. Η στατιστικών πακέτων R [26] (www.r-project.org) και GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc) χρησιμοποιήθηκαν για όλες τις αναλύσεις.

Target πρόβλεψη

in silico

προέβλεψε στόχους γονίδιο για την επιλεγμένη miRNAs προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το εργαλείο ανοικτής πρόσβασης DIANA-μΤ-CDS (https://www.microrna.gr/microT-CDS) [27].

Ηθική

Η μελέτη εγκρίθηκε από την Περιφερειακή επιστημονική Επιτροπή Δεοντολογίας της Περιφέρειας Πρωτεύουσας της Δανίας (https://www.regionh.dk/vek, αριθμός έγκρισης: H-1-2010-081). Δεδομένου ότι αυτή η αναδρομική μελέτη δεν θα έχει καμία επίδραση στη θεραπεία και δεδομένου ότι οι περισσότεροι από τους συμμετέχοντες είχαν αποβιώσει, γραπτή συγκατάθεση δεν λαμβάνονται, και αυτό εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας.

Αναφορά των αποτελεσμάτων παρασκευάστηκε σύμφωνα με το κατευθυντήριες γραμμές ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ [28], [29].

Περαιτέρω λεπτομέρειες περιγράφονται στο S1 αρχείου.

Αποτελέσματα

έκφραση miRNA μετρήθηκε σε 460 δείγματα FFPE. Ο αριθμός των δειγμάτων σε κάθε ομάδα ήταν:. Διαλογής ομάδα = 212, μειωμένη ομάδα ελέγχου = 155, επικύρωση ομάδα = 121, και ομάδα ελέγχου = 127 (Σχήμα S1 στο S1 αρχείου)

Οι ασθενείς που περιλαμβάνονται στο μειωμένο screening- και την επικύρωση των miRNAs ομάδες διέφεραν από τους ασθενείς δεν περιλαμβάνονται. Θα ήταν πιο πιθανό να έχουν: εκτομή πρωτοπαθούς όγκου, ένα ενιαίο μεταστατική εντόπιση, την κατάσταση απόδοσης 0 και προηγούμενη επικουρική θεραπεία. Βίωσαν επίσης ένα μεγαλύτερο TTP και OS (Πίνακας 1). Οι ασθενείς στην ομάδα ελέγχου ήταν παρόμοιες στους ασθενείς που δεν περιλαμβάνονται εκτός από αυτούς που είναι πιο πιθανό να είχε ο κύριος όγκος εκτομή.

Προβολή μελέτη

Εννέα δείγματα προσδιορίστηκαν ως ακραίες τιμές βασίζεται σε ένα χαμηλό αριθμό miRNAs ανιχνεύθηκαν και αυτές εξαιρέθηκαν, αφήνοντας 203 δείγματα για υπολογισμούς έκβαση. Είκοσι-έξι miRNAs συνδέθηκαν με TTP ή OS σε πολυπαραγοντική ανάλυση με τη χρήση raw-, ποσοστημόριο-κανονικοποιημένη, ή μέση-κανονικοποιημένα δεδομένα έκφρασης (Πίνακας S1 στο S1 αρχείου). Είκοσι δύο από αυτούς επιλέχθηκαν για περαιτέρω μελέτη: miR-1, miR-15a-5P, miR-17-3p, miR-22-3p, miR-29b-3ρ, miR-145-3p, miR-155-5p , miR-185-5p, miR-193b-5P, miR-196b-5P, miR-204-5p, miR-214-5p, miR-338-3p, miR-382-5p, miR-449Α, miR-455 . -5p, miR-497-5p, miR-501-5p, miR-545-3p, miR-552-3p, miR-592 και miR-664-3p

Εστιασμένη πίνακα miRNA – miRNAs που συνδέονται με την TTP

Έντεκα miRNAs συσχετίστηκε σημαντικά με τον TTP είτε στο screening- ή η ομάδα επικύρωσης, αλλά όχι και στις δύο ομάδες και δεν υπάρχουν σημαντικές αλληλεπιδράσεις δεν βρέθηκε μεταξύ της έκφρασης των miRNAs και bevacizumab αποτέλεσμα (Πίνακας 2).

Kaplan-Meier για TTP σύμφωνα με τεταρτημόρια του miR-664-3p- και miR-455-5p έκφρασης φαίνονται στο σχήμα S2 και S3 σε S1 αρχείου

Εστιασμένη πίνακα miRNA -. miRNAs που συνδέονται με το OS

Δώδεκα miRNAs συσχετίστηκαν σε σημαντικό βαθμό με το OS σε ένα ή περισσότερα από τα screening-, validation- και ελέγχουν ομάδες (Πίνακας 3). Υψηλότερη έκφραση του miR-664-3p συσχετίστηκε με μεγαλύτερο OS στις ομάδες ελέγχου και επικύρωσης χρησιμοποιώντας πρώτες έκφραση: HR 0,64 (CI 0,48 – 0,86) και 0,60 (CI 0,44 – 0,82)? και κανονικοποιημένη έκφραση: HR 0,66 (CI 0,49 – 0,91) και 0,55 (CI 0,39 – 0,79). Καμία συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του miR-664-3p και OS βρέθηκε στην ομάδα ελέγχου. Μια σημαντική αλληλεπίδραση μεταξύ miR-664-3p έκφρασης και bevacizumab αποτέλεσμα παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας τόσο raw- και ομαλοποιημένη έκφραση (

= 0,02 και

= 0,02). Οι Kaplan-Meier οικοπέδων για OS σύμφωνα με τεταρτημόρια του miR-664-3p έκφραση φαίνεται στο Σχήμα 1.

Οι Kaplan-Meier για παρουσιάζεται για ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με CAPEOXBEV χρήση πρώτων (Α) ή μέση-ομαλοποιηθεί (Β ) έκφρασης και ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με CAPEOX και μόνο με τη χρήση των πρώτων (C) και μέση-ομαλοποιηθεί D) έκφρασης (. Οι αναλογίες κινδύνου (HR) είναι οι μη προσαρμοσμένες και διαστήματα εμπιστοσύνης (CI) υπολογίζεται χρησιμοποιώντας bootstrapping. Τα διαστήματα έκφραση εμφανίζεται στην πάνω δεξιά γωνία είναι 40-C

t, τόσο υψηλότερες τιμές αντιστοιχούν σε υψηλότερη έκφραση. Μαύρη γραμμή = χαμηλότερο τεταρτημόριο? κόκκινη γραμμή = δεύτερο τεταρτημόριο? πράσινη γραμμή = τρίτο τεταρτημόριο? μπλε γραμμή = υψηλότερο τεταρτημόριο

Ανώτατη miR-455-5p έκφραση σχετίστηκε με μικρότερη OS στη συνδυασμένη bevacizumab επεξεργασμένο ομάδα όταν χρησιμοποιούν κανονικοποιημένη έκφραση:. HR 1,24 (CI 1,06 – 1,45) , αλλά όχι στην κοόρτη ελέγχου. Υπήρξε σημαντική αλληλεπίδραση με bevacizumab επίδραση (

= 0,02). Οι Kaplan-Meier οικοπέδων για OS σύμφωνα με τεταρτημόρια του miR-455-5p έκφραση που φαίνεται στο Σχήμα 2.

Ανώτατη miR-592 έκφρασης συσχετίστηκε με μεγαλύτερο OS στις ομάδες screening- και την επικύρωση χρησιμοποιώντας πρώτες έκφραση:. HR 0,69 (CI 0,69 – 0,92) και 0,76 (CI 0.60- 0.95)? και στην ομάδα με επικύρωση κανονικοποιημένη έκφραση: HR 0,76 (CI 0,63 – 0,93), με μια παρόμοια τάση στην ομάδα ελέγχου χρησιμοποιώντας κανονικοποιημένη έκφραση: HR 0,77 (CI 0,59 – 1,00). Υψηλότερες miR-592 έκφρασης συσχετίστηκε επίσης με μεγαλύτερο OS στην ομάδα ελέγχου κατά τη χρήση κανονικοποιημένη έκφραση:. HR 0,71 (CI 0,53 – 0,96)

υψηλότερη έκφραση του miR-196b-5P συσχετίστηκε με μεγαλύτερο λειτουργικό σύστημα χρησιμοποιώντας raw- και ομαλοποιημένη έκφραση τόσο στη συνδυασμένη bevacizumab επεξεργασμένο ομάδα: HR 0,77 (CI 0,66 – 0,90) και 0,79 (CI 0,64 – 0,97)? και στην ομάδα ελέγχου:. HR 0,78 (CI 0,62 – 0,98) και 0,73 (CI 0,58 – 0,93)

Εστιασμένη πίνακα miRNA – κύρια θέση του όγκου και η δεύτερη το αποτέλεσμα γραμμή

Σε αναλύσεις στρωματοποιημένη για κύρια θέση του όγκου, μια σημαντική αλληλεπίδραση με bevacizumab αποτέλεσμα παρατηρήθηκε για miR-664-3p έκφραση στην ομάδα σιγμοειδές κόλον και του ορθού και για τις δύο ΤΤΡ χρησιμοποιώντας πρώτες έκφρασης και για το OS χρησιμοποιώντας raw- και ομαλοποιημένη έκφραση. Τα επίπεδα έκφρασης όλων των miRNAs σύμφωνα με την κύρια θέση του όγκου φαίνεται στο Σχήμα S4 στο S1 αρχείου.

Σε ασθενείς που συνέχισαν bevacizumab στη δεύτερη γραμμή, υψηλή έκφραση του miR-664-3p συσχετίστηκε με μεγαλύτερο TTP (HR 0.30,

= 0.04) και υψηλή έκφραση του miR-455-5p συνδέθηκε με μια τάση προς μικρότερη TTP (HR 2.72,

= 0,09), ενώ δεν ενώσεις αυτές παρατηρήθηκαν σε ασθενείς που έκαναν να μην συνεχίσει bevacizumab (Σχήμα S5 στο S1 αρχείου).

mirna

in situ υβριδισμού

ένα έντονο σήμα miR-664-3p ISH, κυρίως με κυτταροπλασματικό εντοπισμό, ήταν δει σε υποπληθυσμούς λεμφοκυττάρων που διηθούν όγκο, ινοβλάστες, ενδοθηλιακά κύτταρα και βρίσκεται στο επεμβατική σύνορα (Σχήμα 3). Ένα ασθενές σήμα miR-664-3p ISH παρατηρήθηκε σε επιθηλιακά κύτταρα του όγκου, αλλά ένα παρόμοιο χρώση παρατηρήθηκε με τον ανιχνευτή σκαρφάλωμα, υποδηλώνοντας μη ειδική πρόσδεση του ανιχνευτή σε αυτά τα κύτταρα. MiR-455-5p σήμα ISH βρέθηκε σε ορισμένες λεμφοκύτταρα όπως στρωματικά κύτταρα στα μισά από τα δείγματα, ενώ καρκινικά επιθηλιακά κύτταρα ήταν αρνητικά (Σχήμα S6 σε S1 File). Δεν υπάρχει σήμα ISH αποκτήθηκε με τις έρευνες εναντίον miR-185, miR-449Α ή miR-592. Θετική ανιχνευτές ελέγχου για miR-21-5p και miR-126-3p έδειξε μέτρια έως έντονη χρώση σε ινοβλάστες και τα ενδοθηλιακά κύτταρα, αντίστοιχα, σε όλες τις περιπτώσεις.

Παραδείγματα

Πίνακες Α και Β επίδειξη miR-664-3p ISH σε διηθητικά λεμφοκύτταρα (Α) και ινοβλαστών (Β). Διαδοχικές τομές χρωματίστηκαν με LNA ανιχνευτές εναντίον miR-664-3p, miR-126-3p και μια ακολουθία αγωνίζομαι. MiR-664-3p σήμα ISH παρατηρείται σε διηθητικά λεμφοκύτταρα (Α, βέλη? Β, κόκκινο βέλος) και σε ινοβλάστες (Β, μαύρα βέλη), ενώ κανένα σήμα ISH λαμβάνεται με καθετήρα αγωνίζομαι. Ένα ισχυρό σήμα ISH παρατηρείται σε ενδοθηλιακά κύτταρα με τον θετικό ανιχνευτή ελέγχου miR-126-3p. Η «Α» στο πάνελ Β δείχνει μια αρτηρία.

Target πρόβλεψη

Πίνακας S2 στο αρχείο S1 δείχνει τις 20 υψηλότερη κατάταξη προβλέπεται στόχους γονίδιο για miR-196b-5P, ΜΙΚ 455-5p, miR-592 και miR-664-3p, και οι αναφορές δημοσιεύονται άρθρα σχετικά με το επίπεδο της λειτουργίας και της έκφρασης αυτών των miRNAs στον καρκίνο.

Συζήτηση

Αυτή είναι η πρώτη ολοκληρωμένη μελέτη των miRNAs ως προγνωστικοί βιοδείκτες για τη bevacizumab αποτελεσματικότητα στην CRC. Από τις 22 miRNAs που επιλέγονται από τη μελέτη διαλογής, miR-664-3p και miR-455-5p έδειξε το μεγαλύτερο δυναμικό ως προγνωστικοί βιοδείκτες για τη bevacizumab αποτελεσματικότητα.

Η σχέση μεταξύ miR-664-3p και OS διέφεραν σημαντικά μεταξύ των ασθενών που έλαβαν θεραπεία με μπεβασιζουμάμπη και οι ασθενείς που έλαβαν μόνο χημειοθεραπεία: αύξηση miR-664-3p έκφραση σε πρωτογενή ιστό CRC συσχετίστηκε με μεγαλύτερο λειτουργικό σύστημα και στις δύο ομάδες των ασθενών που έλαβαν θεραπεία με μπεβασιζουμάμπη σε συνδυασμό με CAPEOX αλλά όχι στην ομάδα που έλαβαν μόνο χημειοθεραπεία. Αύξηση miR-664-3p έκφραση συσχετίστηκε επίσης με μεγαλύτερο TTP σε ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με bevacizumab, αλλά η δοκιμή αλληλεπίδρασης ήταν σημαντική μόνο στην υποομάδα των ασθενών με σιγμοειδές παχέος εντέρου και του ορθού πρωτογενείς όγκους. Έχουμε προηγουμένως υπέθεσαν ότι αυτό το υπο-ομάδα ασθενών θα μπορούσε να είναι πιο πιθανό να επωφεληθούν από τη θεραπεία με bevacizumab από ασθενείς με πιο κοντινό πρωτογενείς όγκους [20]. MiR-664-3p έκφραση ήταν επίσης υψηλότερη σε αυτούς τους ασθενείς από ό, τι σε ασθενείς με πιο κοντινό πρωτογενείς όγκους (Σχήμα S4 στο File S1). Στη μικρή ομάδα ασθενών με διαθέσιμα στοιχεία δεύτερη γραμμή αποτέλεσμα, υψηλής miR-664-3p έκφραση συσχετίστηκε επίσης με μεγαλύτερο TTP μόνο σε ασθενείς που συνέχισαν bevacizumab, υποστηρίζει μια σύνδεση μεταξύ του miR-664-3p έκφρασης και bevacizumab αποτελεσματικότητα.

Παρατηρήσαμε υψηλή έκφραση του miR-664-3p σε στρωματικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των ενδοθηλιακών κυττάρων, η οποία είναι σύμφωνη με ένα ρόλο για miR-664-3p στην αγγειογένεση. Πολύ λίγα στοιχεία έχουν δημοσιευθεί σχετικά με αυτό το miRNA (Πίνακας S2 στο αρχείο S1). Είναι ενδιαφέρον, μεταξύ των κορυφαίων προβλέψει στόχους του miR-664-3p είναι ΝΕΥΡΟΛΙΓΙΝΩΝ 1 (NLGN1), MDGA2 και gephyrin, τα οποία είναι όλα εμπλέκονται στην ίδια synaptogenic διαδικασίας στο νευρικό σύστημα [30], [31]. Πρόσφατα, ΝΕΥΡΟΛΙΓΙΝΩΝ και δεσμευτική neurexin εταίρο της έχει αποδειχθεί ότι εκφράζεται ευρέως στο αγγειακό σύστημα και που εμπλέκονται στην αγγειογένεση [30]. Η υπερέκφραση του ΝΕΥΡΟΛΙΓΙΝΩΝ 1 σε ενδοθηλιακά κύτταρα που αναπτύσσονται σε ένα περιβάλλον αυξημένης ογκογονική αγγειογένεση και knockdown του neurexin μειωμένη παράγοντα ανάπτυξης ινοβλαστών 2-επαγόμενη αγγειογένεση [32]. Σε ένα μοντέλο έμβρυο ζέβρα ψάρια της αγγειογένεσης, την αναστολή του VEGF-A ή ΝΕΥΡΟΛΙΓΙΝΩΝ προκάλεσε παρόμοια μεγέθη των αγγειακών ελαττωμάτων, αλλά η αναστολή και των δύο είχε ως αποτέλεσμα μια περισσότερο από προσθετικό αντι-αγγειογενετική δράση [33]. Υποθετικά, ο αντίκτυπος των miR-664-3p έκφραση για το αποτέλεσμα μπορεί έτσι να εξηγείται από αρνητική ρύθμιση του συστήματος ΝΕΥΡΟΛΙΓΙΝΩΝ και το προκύπτον συνέργεια με τον VEGF-A αναστολή από bevacizumab.

Αύξηση miR-455-5p έκφραση ήταν που συνδέονται με μικρότερη OS στη συνδυασμένη ομάδα αντιμετωπίζεται bevacizumab, ενώ καμία τέτοια συσχέτιση που παρατηρήθηκε στην ομάδα που έλαβαν μόνο χημειοθεραπεία. Ταυτοποιήσαμε υψηλή έκφραση αυτού του miRNA σε λεμφοκύτταρα όπως τα κύτταρα που βρίσκονται στο στρώμα γύρω από τα καρκινικά κύτταρα. MiR-455-5p έχει αναφερθεί να απορυθμίζεται σε καρκίνο? Ωστόσο, δεν έχουν επικυρωθεί στόχοι έχουν εντοπιστεί (Πίνακας S2 σε S1 αρχείου).

Η αύξηση της έκφρασης των δύο miR-196b-5P και miR-592 συσχετίστηκε με μεγαλύτερο λειτουργικό σύστημα και στις τρεις ομάδες, με παρόμοια εκτιμήσεις αποτέλεσμα. Και οι δύο αυτές miRNAs δειχθεί ότι ρυθμίζεται προς τα κάτω σε CRCs με ανεπάρκεια επιδιόρθωσης αταίριαστων βάσεων (dMMR) [34]. Υψηλότερες έκφραση miR-592 έχει δειχθεί ότι σχετίζεται με βελτιωμένη OS σε ασθενείς που λαμβάνουν διάσωσης αντι-ΕΟΡΚ θεραπεία και υψηλότερα έκφραση miR-196b-5P έχει συνδεθεί με απόκριση σε Νεο-επικουρική 5-FU και ακτινοθεραπεία σε ασθενείς με τοπικά προχωρημένο ορθού καρκίνο [35], [36]. έκφραση MiR-592 έχει αναφερθεί να είναι υψηλότερη σε αριστερής πλευράς σε σύγκριση με δεξιάς CRCs [37], που βρήκαμε επίσης στη μελέτη μας. Δεν μπορέσαμε να λεκιάζει τομές ιστού μας για miR-592, αλλά η έκφραση τόσο του miR-592 και miR-196b-5P έχει προηγουμένως αποδειχθεί ότι είναι 2.5 με 3.7 φορές υψηλότερη σε CRC επιθήλιο ό, τι στην CRC στρώμα [38]. Η λειτουργία του miR-592 δεν έχει περιγραφεί. MiR-196b-5P είναι απορυθμίζεται σε πολλές κακοήθειες, έχει σχέση με την πρόγνωση του καρκίνου, και στοχεύει c-myc, ERG, MEIS1, FAS, ABL1, BCL-2 και αρκετά γονίδια ΗΟΧ (Πίνακας S2 σε S1 αρχείου).

υπάρχουν σημαντικοί περιορισμοί να εξετάσει σχετικά με τα αποτελέσματά μας. Μελετήσαμε αναδρομικά προσδιορίζονται ομάδες από διαφορετικές χρονικές περιόδους, γεγονός που αυξάνει τον κίνδυνο μεροληψίας, δεδομένου ότι οι διαφορές εκτός από τις θεραπείες που χρησιμοποιούνται θα μπορούσαν να υπάρχουν μεταξύ των κλάσεων. Χρησιμοποιήσαμε μέσο έκφρασης για την εξομάλυνση, αλλά δεδομένου ότι τα miRNAs που χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό της μέσης σχετίζονταν με αποτέλεσμα, αυτή δεν είναι η βέλτιστη. Ακόμα κι αν η σύνδεση με αποτέλεσμα για κάποια από τα miRNAs εντοπίστηκε σε δύο ή τρεις ανεξάρτητες ομάδες, η προβλεπτική ισχύ που σχετίζονται με bevacizumab παραμένει un-επικυρωθεί. Εμείς δεν διόρθωσε για πολλαπλές δοκιμές, αλλά miR-664-3p θα εξακολουθούσε να σχετίζεται σημαντικά με OS στην ομάδα επικύρωσης, ακόμα και μετά από διόρθωση για τις 22 miRNAs δοκιμαστεί. Επίσης, οι εκτιμήσεις επίδραση ήταν παρόμοια στις ομάδες, υποδεικνύοντας μια μη τυχαία σύνδεση. Μεταξύ των θετικών στοιχείων της μελέτης μας είναι το μεγάλο μέγεθος του δείγματος, η αρχική ολοκληρωμένη μελέτη ελέγχου, η χρήση τριών ανεξάρτητων ομάδες, και τυχαιοποίηση των Καθαρισμός- και miRNA Για την ανάλυση της έκφρασης.

Εν κατακλείδι, αυτή είναι η πρώτη μελέτη να εξετάσει τη δυνατότητα έκφρασης των miRNAs σε πρωτογενείς όγκους να προβλέψει όφελος της bevacizumab σε ασθενείς με mCRC. Έχουμε εντοπίσει miR-664-3p και miR-455-5p όσο το δυνατόν πρόβλεψης βιοδείκτες για bevacizumab. MiR-592 και miR-196b-5P ήταν πρόβλεψης των αποτελεσμάτων με και χωρίς μπεβασιζουμάμπη και αυτές θα μπορούσαν να είναι προγνωστικοί βιοδείκτες ή βιοδεικτών που σχετίζονται με την αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας. Τα ευρήματα αυτά χρειάζονται επικύρωση σε ανεξάρτητες ομάδες – κατά προτίμηση από τυχαιοποιημένες μελέτες και να χρησιμοποιούν σταθερά την ομαλοποίηση miRNA -πριν μπορούν να εφαρμοστούν στη διαδικασία λήψης κλινικών αποφάσεων. Διευκρίνιση των κυτταρικών προέλευση και βιολογικές λειτουργίες αυτών των miRNAs είναι δικαιολογημένη.

Υποστήριξη Πληροφορίες

αρχείου S1.

Αυτό το αρχείο περιέχει συμπληρωματικές μέθοδοι, συμπληρωματικό πίνακα S1 και S2, και συμπληρωματική Εικόνα S1-S6

doi:. 10.1371 /journal.pone.0109430.s001

(PDF)

Ευχαριστίες

θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε: Jørgen Hansen, MD από το Τμήμα Ογκολογίας στο Aalborg Νοσοκομείο, τη Δανία για βοήθεια σχετικά με την απόκτηση των στοιχείων των ασθενών? Mel Heeran, PhD για την άριστη τεχνική βοήθεια με την τομή των δειγμάτων ιστού FFPE? Jakob Ζ Johansen, MD για την εισαγωγή κλινικών δεδομένων στη βάση δεδομένων BETmiRC? Mogens Kruhøffer, PhD, από το AROS Εφαρμοσμένη Βιοτεχνολογία A /S, Δανία για βοήθεια σχετικά με το miRNA αναλύσεις, και η δανική CancerBiobank (DCB) για βιολογικό υλικό και για τα δεδομένα σχετικά με το χειρισμό και την αποθήκευση.

Χρόνιες ασθένειες