Αφηρημένο

Τρέχει ομοζυγωτίας (ROH) αντιπροσωπεύει όλο το μήκος της ομοζυγώτες για μια μακρά γονιδιωματική απόσταση. Στην ογκολογία, είναι γνωστό ως η απώλεια ετεροζυγωτίας (ΑΕ), εάν προσδιορίζονται αποκλειστικά σε καρκινικές κυτταρικές και όχι σε συμφωνημένα κύτταρο ελέγχου. Μελέτες έχουν εντοπιστεί αρκετές περιοχές του γονιδιώματος που δείχνουν συνεπή ROH σε διάφορα είδη καρκίνου. Να ερευνήσουν κατά πόσο αυτή η συνέπεια μπορεί να παρατηρηθεί σε ευρύτερο φάσμα, τόσο σε περισσότερους τύπους καρκίνου και στην ευρύτερη περιοχές του γονιδιώματος, ερευνήσαμε τα πρότυπα ROH στο Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου 60 καρκίνου του πίνακα κυτταρική σειρά (NCI-60) και HapMap Καυκάσου οικογένειες υγιή τρίο. Χρησιμοποιώντας τα αποτελέσματα από Affymetrix 500 συστοιχίες K SNP, αναφέρουμε ένα γονιδίωμα ευρύ σημαντική συσχέτιση των περιοχών ROH μεταξύ των δειγμάτων NCI-60 και HapMap, με πολύ υψηλότερο επίπεδο ROH (11 φορές) στις καρκινικές κυτταρικές γραμμές. Η ανάλυση δείχνει ότι πιο σοβαρή ROH βρεθεί σε καρκινικά κύτταρα φαίνεται να είναι η επέκταση των υφιστάμενων ROH σε υγιή κατάσταση. Στο τρίο HapMap, ο ενήλικας υποομάδα είχε μια ελαφρά αλλά σημαντικά υψηλότερο επίπεδο (1,02 φορές) του ROH από ό, τι ο νεαρός υποομάδα. Για αρκετές περιοχές ROH παρατηρήσαμε τη συνύπαρξη των εύθραυστων περιοχών (ΠΣΕ). Ωστόσο, FRA σχετικά με το ευρύ επίπεδο γονιδιώματος δεν δείχνουν μια σαφή σχέση με τις περιφέρειες ROH

Παράθεση:. Ruan Χ, Kocher J-PA, Pommier Υ, Liu H, Reinhold WC (2012) Μάζα ομοζυγώτες συσσώρευση στο NCI-60 κυττάρων του καρκίνου γραμμές σε σύγκριση με το HapMap τρίο, και σχέση με εύθραυστη θέση Τοποθεσία. PLoS ONE 7 (2): e31628. doi: 10.1371 /journal.pone.0031628

Επιμέλεια: Patrick Tan, Duke-Εθνικό Πανεπιστήμιο της Σιγκαπούρης Πτυχιούχος Ιατρικής Σχολής, Σιγκαπούρη

Ελήφθη: 1 Ιουνίου, 2011? Αποδεκτές: 15, Γενάρη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 9 Φεβρουαρίου 2012 |

Copyright: © 2012 Ruan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το εσωτερικό ερευνητικό πρόγραμμα των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας, το Κέντρο Έρευνας για τον Καρκίνο, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, καθώς επίσης και από το Εθνικό Ίδρυμα Επιστημών ABI: 0845523 και το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας R01LM009959A1. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

σε διπλοειδή οργανισμούς, SNPs κατηγοριοποιούνται σε ετεροζυγώτες και ομοζυγώτες σύμφωνα με τη διαφορά /ταυτότητα μεταξύ πατρική και μητρική αλληλόμορφα. Απώλεια ετεροζυγωτίας (ΑΕ) [1] σε ένα κύτταρο αντιπροσωπεύει τις συνθήκες απώλειας της κανονικής λειτουργίας ενός αλληλόμορφου όταν το άλλο αλληλόμορφο έχει ήδη αδρανοποιηθεί. ΑΕ μπορεί να προκαλέσει απώλεια ογκοκατασταλτικό γονίδιο της λειτουργίας, η οποία συνδέεται με την ογκογένεση [2].

Γονιδιωματική περιοχές που πλήττονται από ΑΕ συχνά παρουσιάζουν ένα εκτεταμένο μήκος του ομόζυγη SNPs, που σχηματίζει περιοχές με χαμηλή ποικιλομορφία μεταξύ των δύο αντίγραφα του DNA . Μελέτες σε

Ε. coli

[3],

Trypanosoma brucei

[4] και το ποντίκι [5] δείχνουν τη σημασία της εκτεταμένης σειράς ομοιότητα /διαφορετικότητα στην προώθηση /πρόληψη ομόλογο ανασυνδυασμό. Αυτό ανασυνδυασμό, αν συμβεί κατά τη διάρκεια της μιτωτικής διαδικασίας, ίσως σχετίζεται με την επακόλουθη ΑΕ [6] και επηρεάζει την σταθερότητα του γονιδιώματος [7], [8]. Μελέτη Μπακολόντ, M.D. [9] δείχνει ότι ασθενείς με καρκίνο του παχέος έχουν μέσο μήκος των πανομοιότυπων ανά περιοχή καθόδου δύο φορές το μήκος του υγιούς πληθυσμού. Με βάση τα δεδομένα του παχέος καρκίνο, αργότερα πρότεινε ένα μοντέλο δραστηριότητα γονίδιο καρκίνου (CGAM) [10], σε μια προσπάθεια να εξηγήσει πώς προδιάθεση autozygosity επιρροές του καρκίνου. Ομοίως, μια μελέτη από Assie, G

et al.

[11] διερευνηθεί του μαστού, του προστάτη, του κεφαλιού και του λαιμού καρκινώματα και βρήκε 16 κοινές θέσεις που έχουν αυξηθεί σημαντικά η συχνότητα βλαστική ομοζυγωτία.

Από αυτές προηγούμενα έργα, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι 1) ΑΕ σχετίζεται με ασθένειες και 2) στον καρκίνο μπορεί να υπάρξει παράταση της βλαστικής σειράς ομόζυγη περιοχής. Αυτό έχει δειχθεί πληθυσμός σοφό σε κάποιο τύπο καρκίνου, και σε ορισμένες θέσεις σε τρεις διαφορετικούς τύπους καρκινώματος. Ερώτημα παραμένει εάν το φαινόμενο αυτό μπορεί να επεκταθούν σε πολλούς καρκίνους σε όλη την κλίμακα του γονιδιώματος. Είμαστε υποθέτοντας ότι η αύξηση του μεγέθους των ομόζυγη περιφερειών καρκίνου προκύπτει από την επέκταση των περιοχών που βρέθηκαν στην βλαστική. Είμαστε επίσης υποθέτοντας ότι η γονιδιωματική θέση ομόζυγων περιοχές δεν κατανέμονται εξίσου σε όλη του γονιδιώματος (συντηρημένη μεταξύ των ατόμων) και ως εκ τούτου θα μπορούσε να εξαρτάται από τις τοπικές ιδιότητες του γονιδιακού DNA. Τέλος, έχουμε ως δεδομένο ότι ομόζυγη περιοχές βλαστικής σειράς που επεκτείνεται δραματικά σε καρκίνο θα μπορούσαν να έχουν τη φυσική τάση να δαπανήσει κατά τη γήρανση. Σε αυτό το χειρόγραφο θα αναφερθούμε σε αυτές τις περιοχές ως ομόζυγο τρέχει ομοζυγωτίας (ROH).

Έχουμε εκτελέσει ένα ευρύ σύγκριση γονιδίωμα θέση ROH και το μήκος σε καρκινικές κυτταρικές σειρές από την βιβλιοθήκη NCI-60, καθώς και σε δείγματα βλαστικής σειράς από νέους και ενήλικες τα άτομα που προέρχονται από 30 οικογένειες τρίο HapMap Καυκάσου. Πρέπει επίσης να διερευνηθεί εάν υπάρχει σχέση μεταξύ της εγγύτητας ROH θέσεις και εύθραυστες περιοχές (FRA) που υφίστανται πιο συχνά επισκευές βλαβών του DNA. Επιπλέον διερευνήσαμε παρόμοια σχέση μεταξύ ROH και microRNA (miRNA) περιοχές που έχουν αποδειχθεί ότι σχετίζονται με τις περιοχές FRA [12].

Υλικά και Μέθοδοι

NCI-60 Cancer Cell Line και HapMap δείγματα

Η NCI-60 αναπτύχθηκε ως ένα αντικαρκινικό πάνελ οθόνης του φαρμάκου από το Εθνικό Ινστιτούτο των ΗΠΑ Καρκίνου (NCI), Αναπτυξιακή Therapeutics Program (DTP, https://dtp.nci.nih.gov/) [ ,,,0],13]. Περιέχει 60 Καυκάσιος κυτταρικές σειρές όγκων από τον εγκέφαλο (BR), του κεντρικού νευρικού συστήματος (CNS), του παχέος εντέρου (CO), του πνεύμονα (LC), λευκών αιμοσφαιρίων (LE), μελανοκυττάρων (ΜΕ), ωοθήκη (OV), προστάτη (PR ) και νεφρική (RE). Λεπτομερείς πληροφορίες σχετικά με το NCI-60 είναι διαθέσιμο στην ιστοσελίδα CellMiner (https://discover.nci.nih.gov). Για την προετοιμασία κυτταρικές σειρές για Affymetrix 500 ανάλυση της σειράς K SNP, κατεψυγμένα αποθέματα του NCI-60 ελήφθησαν από το Αναπτυξιακό Πρόγραμμα Θεραπευτικής NCI (NCI DTP). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14], και στη συνέχεια αποψύχθηκαν, τοποθετούνται σε RPMI 1640 (Lonza Walkersville, Inc.) που περιείχε 5% ορό εμβρύου μόσχου (Atlantic Biologicals) και 2 mM γλουταμίνη (Invitrogen Corporation). Για συμβατότητα με άλλες μελέτες προφίλ μας, χρησιμοποιήσαμε την ίδια παρτίδα του ορού που χρησιμοποιείται από DTP, και οι διαδικασίες έγιναν ή εποπτεύεται από τον ίδιο ερευνητή (ΑΚΚ). Η κυτταρική σειρά παχέος εντέρου ΗΤ29 αφαιρέθηκε λόγω μόλυνσης. Τα αποτελέσματα των δύο επαναλήψεις σε κυτταρική σειρά ωοθηκών OVCAR-3 συγχωνεύθηκαν και αντιφατικά αποτελέσματα που να άγνωστη. Μετά τον αποκλεισμό και να συγχωνεύσει, SNP δεδομένων σειρά από 59 κυτταρικές σειρές καρκίνου χρησιμοποιήθηκαν σε τελική ανάλυση. Η NCI-60 Affymetrix 500 K SNP δεδομένων συστοιχία είναι διαθέσιμη στο κοινό από Gene Expression Omnibus (GSE32264).

Η Διεθνής HapMap Project είναι ένα προσπάθεια muti-χώρας για τον εντοπισμό και κατάλογο γενετικές ομοιότητες και διαφορές στον άνθρωπο (http : //HapMap.ncbi.nlm.nih.gov/). Μόνο HapMap δείγματα με ευρωπαϊκή προέλευση χρησιμοποιήθηκαν για να ελαχιστοποιηθεί η εθνοτική διαφορά με τα δείγματα NCI-60. Ένα σύνολο 59 κυτταρικών σειρών καρκίνου και 30 κανονικές οικογένειες τρίο HapMap CEU (30 παιδιά (νέους) 60 γονείς (ενηλίκων)) γονότυπου με τη συστοιχία K SNP Affymetrix 500 αναλύθηκαν. κλήσεις γονότυπο έγιναν χρησιμοποιώντας Affymetrix εξουσία εργαλείο (APT) (Linux, έκδοση 1.12.0) χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο BRLMM (https://media.affymetrix.com/support/technical/whitepapers/brlmm_whitepaper.pdf) στο προεπιλεγμένο επίπεδο εμπιστοσύνης ( & lt? = 0.5). Η μέση «NOCALL» ποσοστό είναι 4,2% κατά το NCI-60 και 0,5% το HapMap δείγματα.

Εντοπίστε Τρέχει ομοζυγωτίας (ROH), η συχνότητα ROH (ROHF) και Ημίζυγα συχνότητα διαγραφή (HDF)

Οι υπάρχουσες μελέτες προσδιορίζουν κυρίως ROH με τη μετακίνηση ενός παραθύρου σταθερού μεγέθους μαζί SNP γονοτύπων και την ανίχνευση μεγάλη έκταση της ομοζυγώτες. Μειονεκτήματα αυτού του συστήματος είναι: 1) Δεν υπάρχει τυποποιημένα κριτήρια για την κλήση ROH, 2) διαφορετικές ρυθμίσεις για το μέγεθος του παραθύρου, ομόζυγο SNP αριθμό, διαμονή για το λάθος του γονότυπου ή ομοζυγώτες τεντώσει το όριο μήκους μπορεί να επηρεάσει σημαντικά το αποτέλεσμα [15]. Για να αποφευχθεί η προκατάληψη που μπορεί να προκύψουν από ακατάλληλο επιλεγμένα κριτήρια, ROH στην παρούσα μελέτη ήταν κυρίως ανιχνεύεται με βασικό Hidden Markov Model-διαδικασίας (HMM) προτείνει Beroukhim R.

et al.

[16]. Ενώ ακόμα αυθαίρετη, HMM είναι λιγότερο ευαίσθητη σε διάσπαρτες ετεροζυγώτες στο ότι παρακολουθεί την αλλαγή κατάστασης μεταξύ των χαμηλών και των υψηλών ποσοστών ετεροζυγωτία. Αν και HMM ήταν κατά κύριο λόγο χρησιμοποιείται για την ανίχνευση ΑΕ, αρχή λειτουργίας του το καθιστά ισχύει για την ανίχνευση ROH. Με τον εντοπισμό της θέσης όπου η μετάβαση πιθανότητα είναι υψηλότερη από ένα συγκεκριμένο όριο, HMM διαφοροποιεί ROH από την κανονική περιοχές ετεροζυγωτία. που διατίθεται στο λογισμικό dChip διαδικασία Basic-HMM (Έκδοση 2010/01) [17] χρησιμοποιήθηκε για να εκτελέσει την ανάλυση με τις προεπιλεγμένες ρυθμίσεις. build 19 χρησιμοποιήθηκαν SNPs σχολιασμούς από ανθρώπινο γονιδίωμα. Εκτός από τον αλγόριθμο HMM, χρησιμοποιήσαμε επίσης plink (Έκδοση 1.07) (https://pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink/) [18] (με βάση παράθυρο σταθερού μεγέθους), ως εναλλακτικός τρόπος για την ανίχνευση ROH. Οι παράμετροι που χρησιμοποιούνται στο plink παρέχονται ως (Πίνακας S5).

ROH συχνότητας (ROHF) ορίζεται ως το ποσοστό των δειγμάτων με ROH για κάθε θέση SNP. Για να μειώσετε το θόρυβο υποβάθρου στον υπολογισμό ROHF, ROHF σε περιοχές FRA υπολογίζεται λαμβάνοντας μέσες τιμές της άνω 95

ο εκατοστημόριο ROHF στο εύρος ± 5 Mb.

Αντιγραφή παραλλαγή αριθμός αυτός υπολογίζεται από pennCNV [ ,,,0],19], η οποία παρέχει ακέραιο εκτίμηση του αριθμού αντιγράφων. Οι πληροφορίες αριθμός αντιγράφων χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό ημίζυγος συχνότητα διαγραφή (HDF) που ορίζεται ως το ποσοστό των δειγμάτων με μόνο 1 αντίγραφο του αλληλόμορφου για κάθε τόπο SNP. Ο μέσος αριθμός των SNP με ημίζυγος διαγραφή είναι περίπου 25.000 (5% SNPs σε 500 συστοιχία Κ). Η μέγιστη HDF είναι 0,24 στις κυτταρικές γραμμές ΝΟΙ-60.

miRNA και FRA βάση δεδομένων

Πληροφορίες σχετικά με 1049 miRNA λήφθηκε από miRBase www.miRNAbase.org (Έκδοση 16) [20]. Μετά την αφαίρεση των αρχείων που βρίσκονται στο χρωμόσωμα Χ και Υ, 955 αρχεία miRNA συμμετείχαν στην τρέχουσα ανάλυση. FRA πληροφορίες που λαμβάνονται από την Επιτροπή HUGO Gene Ονοματολογίας (HGNC) www.genenames.org/cgi-bin/hgnc_stats.pl (Τελευταία ενημέρωση 09/11/10). Εντελώς 111 ΠΣΕ βρίσκεται σε αυτοσωμικά συμμετείχαν στην τρέχουσα ανάλυση. Από κυτταρογενετική θέση μόνο ΠΣΕ »είναι διαθέσιμη, θα μετατραπούν αυτές τις θέσεις στην γονιδιωματική συντεταγμένες ως εξής. Μια βάση δεδομένων που καλύπτεται 42.574 εγγραφές γονίδιο (που λαμβάνεται από τη βάση δεδομένων NCBI Entrez Gene) τόσο με κυτταρογενετική και γονιδιωματική θέση χρησιμοποιήθηκε για τη χαρτογράφηση της γενωμική θέση του ΠΣΕ. Ως αποτέλεσμα, ελάχιστο γονιδιωματική μέγιστη γονιδιωματική τελικές θέσεις έναρξης και χρησιμοποιήθηκαν για να αντιπροσωπεύουν την περιοχή FRA, και η μέση τιμή χρησιμοποιήθηκε για να αντιπροσωπεύουν την θέση FRA (Όπως αναφέρεται στο 4

ου bar στο Σχήμα 1). Για κάθε FRA, θεωρήσαμε, με βάση ένα ποσοστό ανασυνδυασμού μικρότερη από 0,5, δηλαδή ± 5 Mb μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως μια μέγιστη απόσταση στην αναζήτησή μας για συνδεόμενα FRA γονιδιωματική αλλαγές. Μειώσαμε επίσης την περιοχή κάτω ± 1 Mb κατά την ανάλυση της σχέσης miRNA-FRA.

Κόκκινο βέλη στα δεξιά δείχνουν τις ΠΣΕ με μέσο όρο ανώτερο 95

ο εκατοστημόριο ROHF μεγαλύτερο από 0.5 σε μια περιοχή ± 5 Mb . Κόκκινο αστερίσκοι υποδεικνύουν υψηλή ζώνες ROHF (κατά μέσο όρο άνω 95

ο εκατοστημόριο ROHF & gt? 0,6) χωρίς FRA σε ± 5 Mb περιοχή. Οι σπάνιες ΠΣΕ σημειώνονται με κόκκινο χρώμα. Τα κενά μεταξύ των τμημάτων των χρωμοσωμάτων (για παράδειγμα στα 130 Mb νουκλεοτίδια σε χρωμόσωμα 1) περιέχουν την κεντρομερές. Η κορυφαία μερίδα αντιστοιχεί σε

σ

βραχίονα, και το κάτω τμήμα αντιστοιχεί σε

q

βραχίονα.

Η

Στατιστική Ανάλυση

ROHF συντελεστές συσχέτισης (Πίνακας 1 12

ου στήλη) μεταξύ NCI-60 και HapMap δείγματα ελήφθησαν μετά την προσαρμογή για την πυκνότητα SNP και HDF. τιμές συσχέτισης Ρ προσαρμόστηκαν περαιτέρω με διόρθωση Bonferroni.

Η

ενηλίκων και νεαρών υποομάδες είναι διαφορετικά σε μέγεθος δείγματος (

Ν

ενηλίκων = 60,

Ν

νεαρό = 30), έτσι άμεση σύγκριση σε ROHF τους θα είναι ακατάλληλη (θεωρούν SNPs όπου μόνο έναν ενήλικα και μηδέν νέους έχει ROH). Για να εξαλειφθεί η προκατάληψη, θα συρρικνωθεί ο αριθμός των ενηλίκων σε 30 άτομα από μη-περιττές επανάληψη της δειγματοληψίας. 1000 τυχαία ενηλίκων σύνολα δεδομένων δημιουργήθηκαν. ROHF υπολογίστηκε για κάθε σύνολο δεδομένων. Για κάθε θέση η μέση τιμή χρησιμοποιήθηκε για να αντιπροσωπεύσει την ενήλικη ROHF, το οποίο σε σύγκριση με τους νέους ROHF να καθορίσει στατιστική σημαντικότητα (Student t-test που ακολουθείται από διόρθωση Bonferroni). Η μηδενική υπόθεση είναι ότι δεν υπάρχει σημαντική διαφορά στην ROHF μεταξύ ενήλικων και νεαρών. Για να εκτιμηθεί η ισχύς του ελέγχου, θα υπολογίζεται επίσης το ποσοστό των συνόλων δεδομένων με θετικά ROHF

diff (= ROHF

ενηλίκων ROHF

νέοι) μεταξύ των συνόλων δεδομένων που δείχνουν σημαντική διαφορά μεταξύ ενηλίκων και νεαρών.

ανάλυση Διαδρομή διεξήχθη από την επιλογή του SNPs με διαφορά ROHF κατετάγη κορυφή 5000 (ROHF

diff = 0,59), 10000 (0.54), 15000 (0.51), 20000 (0.49) και 25000 (0.47) μεταξύ NCI- 60 και δείγμα HapMap, καθώς και μεταξύ HapMap ενήλικων και νεαρών υποομάδες. SNPs που επιλέγονται από την εφαρμογή αυτών των διαφορετικών ρυθμίσεων αποκοπής αναλύθηκαν με το εργαλείο web GeneGO (GeneGO Inc.) για να αναφέρετε οδούς εμπλουτισμένο σε σημαντικές SNPs.

Για να αποφευχθεί η πόλωση που προκαλείται από τα χρωμοσώματα του φύλου, τόσο χρωμόσωμα Χ και Υ εξαιρέθηκαν από την τρέχουσα ανάλυση. Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση R έκδοση 2.10.0 στο περιβάλλον Unix.

Αποτελέσματα

ROH στα δείγματα NCI-60 και HapMap

Σχήμα 1 απεικονίζει ROHF μεταξύ των NCI-60 και HapMap δείγματα, καθώς και οι φυσικές θέσεις των τόπων miRNA και FRA. Η μέση ROHF είναι 0,32 για το NCI-60, και 0,03 για τα δείγματα HapMap (Πίνακας 1). Γενικά, παρατηρούμε μαζικές εκδηλώσεις ROH εξαπλωθεί σε ολόκληρο το γονιδίωμα για τις κυτταρικές σειρές NCI-60. Χρωμοσώματα 9p, 13q, και 17p έχει τα υψηλότερα επίπεδα του ROH, με μέση ROHF είναι 0,60, 0,51 και 0,57, αντίστοιχα. Οι ίδιες περιοχές του χρωμοσώματος με αυξημένη ROHF στην NCI-60 βρέθηκαν να προκύψει στις HapMap μη καρκινικά δείγματα αλλά με χαμηλότερες ROHF (Σχήμα 1). Σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ του NCI-60 και HapMap ROHF βρέθηκαν σε όλα τα χρωμοσώματα πριν και μετά την προσαρμογή για την πυκνότητα SNP και HDF (Πίνακας 1, 12

ου στήλη). Παρόμοια μοτίβα παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας plink να υπολογίσει ROH (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αναλύσαμε επίσης τα δεδομένα συστοιχία HapMap CEPH Affymetrix 100 Κ και βρέθηκε ROHF πρότυπο ίδια με εκείνη από 500 συστοιχία Κ (δεδομένα δεν παρουσιάζονται), υποδεικνύοντας ότι οι παρατηρούμενες σχέδια είναι ανεξάρτητες από την πλατφόρμα που χρησιμοποιείται για προσδιορισμό του γονότυπου, καθώς και της εφαρμογής που χρησιμοποιείται για να υπολογιστεί ROHs . Υποπτεύεται ότι οι περιφέρειες με το υψηλότερο επίπεδο ROHF σε υγιή κατάσταση έχουν την ισχυρότερη συσχέτιση ROHF μεταξύ NCI-60 και HapMap δείγματα, εφαρμόσαμε μια σταδιακή αύξηση της αποκοπής σε SNPs ανάλογα με τα επίπεδα ROHF τους σε HapMap δείγματα. Τα αποτελέσματα δείχνουν μια σταδιακή αύξηση του συντελεστή συσχέτισης 0,34 – 0,5 ως αποκοπής αυξάνει από & gt? 0,1 έως & gt? 0,95 ποσοστημόριο (Σχήμα S1). Αυτό υποδεικνύει ότι οι περιοχές με τις υπάρχουσες ROH σε υγιή κατάσταση είναι πιο πιθανό να έχουν ένα υψηλότερο επίπεδο ROHF σε καρκινικά κύτταρα. Αναλύσαμε επίσης τις HapMap τρίο ανάλογα με την κατάστασή τους ως ενήλικα ή νεαρά (λεπτομερείς πληροφορίες ηλικία δεν είναι διαθέσιμη, έτσι ώστε μόνο ενήλικος /νεαρή διαστρωμάτωση χρησιμοποιείται). Τόσο σε αντιστοίχιση και un-paired t test έδειξαν σημαντικές διαφορές ROHF μεταξύ ενήλικων και νεαρών υποομάδες (ρ & lt? 1.1E-10 μετά από τη ρύθμιση Bonferroni) με μέσο όρο 0,06% υψηλότερη ROHF σε ενήλικα υποομάδα σε όλο το γονιδίωμα (3,36% σε νεαρά, 3,42 % στους ενήλικες). Ανάμεσα στα 1000 δημιουργείται τυχαία ενηλίκων σύνολα δεδομένων (παρακάτω αριθμούς σε παρένθεση είναι από plink έκπτωση), 662 (833) έχουν ROHF

διαφ & gt? 0 και 747 (743) έχουν P & lt? 10

-7 (P & lt? 0.05 μετά Bonferroni προσαρμογή, δίπλευρη Student t test). Μεταξύ των 747 (743) σύνολα δεδομένων που έχουν σημασία, 552 (686) έχουν ROHF

διαφ & gt? 0. Αυτό ισοδυναμεί με ένα ποσοστό 73,9% (92,3%).

ROHF και ΠΣΕ

Εμείς δεν παρατηρούμε μια σαφή σχέση μεταξύ FRA και ROHF σε όλη την κλίμακα του γονιδιώματος, παρουσιάζουν αρνητική συσχέτιση σε το NCI-60, και θετική συσχέτιση στα δείγματα HapMap. συσχετίσεις τους σε διαφορετικά χρωμοσώματα δείχνουν επίσης διαφορετικές κατευθύνσεις (Πίνακας 1). Παρά αυτού ασαφή σχέση, μπορούμε πράγματι παρατηρείται το συν-εμφάνιση αρκετών ζωνών υψηλής ROHF με ΠΣΕ. Μεταξύ των 111 αναγνωρισμένων ΠΣΕ, υπάρχουν 30 ζώνες με μέσο όρο ανώτερο 95

ο εκατοστημόριο ROHF υψηλότερο από 0,5 (πάνω από 1,64 τυπική απόκλιση σημαίνει ROHF) στην περιοχή του ΠΣΕ (Πίνακας 2, 4

ου στήλη). Για αυτές τις ΠΣΕ βλέπουμε σαφείς ζώνες ROH μεταξύ των δειγμάτων HapMap, καθώς επίσης και μεταξύ των δειγμάτων NCI-60 (με υψηλότερη ROHFs) στην ίδια φυσική τοποθεσία. Επιπλέον, 4 ΠΣΕ έχουν τουλάχιστον 0,5 διαφορά ROHF μεταξύ των δειγμάτων NCI-60 και HapMap (Πίνακας 2, 6

ου στήλη, εμφανίζονται με κόκκινο χρώμα). Λόγω της υπολογιστικής ομοιότητα μεταξύ ROH και ΑΕ, συγκρίναμε την ROHF με αναφέρθηκε προηγουμένως ΑΕ συχνότητα γύρω ΠΣΕ. Για FRA16D [21], [22], FRA7G [23], καθώς και πολλές άλλες ΠΣΕ που είχαν αναφερθεί προηγουμένως να έχουν ΑΕ σε στενή γειτνίαση, παρόμοια ευρήματα παρατηρήθηκαν επίσης στα δεδομένα μας. Η κυτταρική γραμμή ειδική ανάλυση έδειξε 50% ROHF στη νεφρική καρκινικές κυτταρικές σειρές σε FRA3B, και 57,1% σε ωοθηκών σε FRA6E, η οποία είναι κοντά στην αναφερόμενη τιμή του 69% σε νεφροκυτταρικό καρκίνωμα για FRA3B [24], και 72% στον καρκίνο των ωοθηκών για FRA6E [25].

Η

Αρκετά υψηλές μπάντες ROHF δεν έχουν αναγνωριστεί ΠΣΕ στην περιοχή τους. Ο Πίνακας 3 δείχνει ένα σύνολο οκτώ κορυφαίες μπάντες ROH με μέση κορυφαία 95

ο εκατοστημόριο ROHF κυμαίνονται 0,551 με 0,879, αλλά δεν αναγνωρίζεται ΠΣΕ σε κοντινή απόσταση. Οι ζώνες σημειώνονται επίσης με κόκκινο αστερίσκο στο Σχήμα 1. Δύο από αυτά τα συγκροτήματα ROH βρίσκονται στο χρωμόσωμα 16 κεντρομερές. Μια λίστα των γονιδίων που βρίσκονται στις ζώνες αυτές ROH είναι διαθέσιμη στον πίνακα S1. Από την άλλη πλευρά, παρατηρήσαμε ότι 81 από 111 ΠΣΕ δεν έχουν συσχετίσει σημαντική αύξηση ROHF σε κοντινές περιοχές (Πίνακας S2).

Η

ROHF και miRNA

Καλίν Ο.Α.

et al.

[12] πρότεινε μια πιθανή συσχέτιση μεταξύ του ΠΣΕ και τη θέση miRNA (συχνότητα εμφάνισης των 186 γονιδίων miRNA ± 1 Mb της ΠΣΕ είναι 13 (λόγος = 0,07)). Για να αποκτήσετε μια ολοκληρωμένη εικόνα της σχέσης μεταξύ FRA, miRNA και ROH banding, θα ενσωματωθούν τα δεδομένα miRNA σε αυτή τη μελέτη. Μεταξύ των 955 miRNAs ερευνηθεί στη μελέτη μας, 63 ήταν εντός ± εύρος 1 Mb τοποθεσίες FRA (λόγος = 0,066). Ο αριθμός αυτός αυξήθηκε σε 334, μετά την επέκταση σε ± 5 γκάμα Mb (λόγος = 0,35). ανάλυση συσχέτισης Pearson δεν παρουσιάζει καμία συσχέτιση μεταξύ miRNA θέση (± σειρά 1 Μ) και τα επίπεδα ROHF (Σχήμα 1, p & gt? 0.05 μετά Bonferroni διόρθωση). Επιπλέον, διερευνήθηκε η συνύπαρξη των miRNA και FRA με ROHF υψόμετρο. Στην ± 5 Mb περιοχή του ΠΣΕ με ROHFs υψηλότερο από 0,5, ο μέσος αριθμός των miRNAs είναι 3,30. Αυτός ο αριθμός είναι 2,94 για την ΠΣΕ με κοντινό ROHFs χαμηλότερο από 0,5.

Διαδρομή Ανάλυση

Αναλύσαμε την SNPs με τις διαφορές πάνω ROHF (Βλέπε ενότητα στατιστική ανάλυση για λεπτομέρειες) μεταξύ ενηλίκων και νεαρών υποομάδες, καθώς επίσης και μεταξύ του NCI-60 και HapMap δείγματα (Σχήμα S2). Για τον ενήλικα σε σύγκριση με νεαρά υποομάδα, η κορυφαία διαδικασία είναι η διαδικασία χημειόταξη (Σχήμα 2). Τα γονίδια που υπάρχουν σε αυτή την κατηγορία που σημειώνονται με συμπαγές κόκκινο κύκλους στο σχήμα 2, και παρατίθενται στον Πίνακα S3. Για το NCI-60 σε σχέση με τα δείγματα HapMap, η κορυφαία διαδικασία κατάταξης είναι η διαδικασία του κυτταρικού κύκλου G1_S (Σχήμα S3 και S4 Πίνακας), που υποδηλώνει μια αλλαγή σε πολλά γνωστά ογκογονίδια όπως Ρ53 και LATS2. Για αυτά τα δύο γονίδια που βλέπουμε ROHF αυξήσεις τόσο υψηλό όπως 61% και 50% στην NCI-60 σε σύγκριση με το HapMap δείγματα.

ανάλυση δρόμος για SNPs με κορυφαία διαφορά ROHF μεταξύ ενηλίκων και νεαρών υποομάδων δείχνουν τη συμμετοχή της διαδικασία χημειοταξία. Κόκκινο μαύροι κύκλοι δείχνουν τα γονίδια που καλύπτουν SNPs με κορυφαία την αλλαγή (βλέπε παράγραφο στατιστικές για λεπτομέρειες)

Η

Συζήτηση

Μελέτες σε προκαρυωτικούς και ευκαρυωτικούς οργανισμούς [3] -. [5] δείχνουν ότι η υψηλή ομοιότητα γονιδιωματικές περιοχές μπορούν να προκαλέσουν ομόλογο ανασυνδυασμό, η οποία προτάθηκε ως αιτία της ΑΕ σε κύτταρο θηλαστικού [6] και έχει σύνθετο ρόλο στη σταθερότητα του γονιδιώματος [7], [8]. Σε αυτή τη μελέτη, ανακρίθηκε την ομοιότητα αλληλουχίας με την ανίχνευση της κατάστασης ROH σε 500 συστοιχία Κ μέσω μοντέλο βασικός-ΗΜΜ, καθώς και μονάδα plink ROH. Ανάλυση σε NCI-60 κυτταρικές γραμμές καρκίνου και HapMap τρίο παρουσιάζουν πολύ παρόμοια πρότυπα ROH (Σχήμα 1), οι οποίες διαφέρουν μόνο ως προς τη δύναμη. Η τρέχουσα εύρημα υποδεικνύει ότι η μαζική ROH που παρατηρείται σε καρκινικά κύτταρα μπορεί να είναι μια προέκταση του κάτω επίπεδα ROH παρατηρούνται σε υγιή κύτταρα. Θεωρούμε ότι η σημερινή διαπίστωση έχει ευρεία εφαρμογή για διάφορους λόγους. Πρώτον, η παρούσα μελέτη βασίζεται σε 60 διαφορετικές καρκινικές κυτταρικές γραμμές, οι οποίες εξαιρούνται το δυναμικό πόλωσης που προκαλείται από το μοναδικό γενετικό κατασκεύασμα ενός συγκεκριμένου τύπου καρκίνου. Δεύτερον, αντί να χρησιμοποιούν έλεγχο του ασθενούς ταιριαστό (μικρόβιο-line) δείγματα DNA που λαμβάνεται από μη καρκινικό ιστό, οι υποθέσεις και οι έλεγχοι είναι εντελώς un-ταιριάζουν. Έτσι ομοιότητά τους σε ROH μοτίβο δεν οφείλεται στην παρουσία του ίδιου γενετικού υπόβαθρου, και μπορεί να αντανακλούν μια πιο γενική κατάσταση του ανθρώπινου γονιδιώματος. Τέλος, οι κυτταρικές σειρές NCI-60 που χρησιμοποιείται για την τρέχουσα ανάλυση της σειράς SNP έχει τον αριθμό πέρασμα κάτω από τους 30 [26]. Αυτό θα πρέπει να ελαχιστοποιηθεί η πιθανή επίδραση του πολιτισμού που προκαλείται από γονιδιωματική μεταβολή [27]. Από την άλλη πλευρά, παρατηρήσαμε ότι τα ενήλικα υποομάδα έχει υψηλότερο επίπεδο ROH από εκείνες των νέων σε HapMap Καυκάσου τρίο (p & lt? 1.1E-10 μετά την αυστηρή Bonferroni προσαρμογή). Από την 1η) ακριβώς οι ίδιες παράμετροι του μοντέλου HMM που χρησιμοποιείται για να καλέσετε ROH ανεξάρτητα σε ενήλικες και νέους υποομάδες, και 2) είναι αβάσιμα να υποθέσουμε ότι οι νέοι πρέπει να έχουν γεννηθεί με το χαμηλότερο επίπεδο ROH από ό, τι των ενηλίκων, θα πρέπει να αποδεχθεί την εναλλακτική υπόθεση και προτείνει την μια συνεχής ROH συνέβη σε ενήλικες από το χρονικό σημείο της δικής τους σχηματισμού ζυγωτών στο σχηματισμό ζυγώτες του παιδιού τους. Αξίζει να σημειωθεί είναι ότι οι κυτταρικές σειρές, αντί αρχικού DNA λεμφοκυττάρων χρησιμοποιήθηκαν στην ανάλυση της σειράς HapMap SNP. Έτσι, κανείς δεν μπορεί να αποκλείσει ότι η παρατηρούμενη διαφορά θα μπορούσε να προκληθεί από τον πολιτισμό που προκαλείται από μετάλλαξη ή διαφορετικό αριθμό πέρασμα. Ωστόσο, η τρέχουσα παρατήρηση είναι σε συμφωνία με την αναφερόμενη υψηλότερο επίπεδο της ΑΕ στην παλιά κύτταρα στο μοντέλο οργανισμούς [28]. Παρόμοια παρατήρηση έγινε επίσης σε ανθρώπινο από Moragoda

et al.

[29] ο οποίος περιέγραψε την ηλικία που σχετίζονται με το στομάχι βλεννογόνο ΑΕ μεταξύ υγιών ατόμων άνω των 60 έτος της ηλικίας τους. Παρ ‘όλα αυτά, απαιτούνται περαιτέρω έρευνες για να αποσαφηνιστεί εάν η διαφορά επιπέδου ROH που παρατηρήθηκε στη μελέτη μας προέκυψε από τη γήρανση, την ασθένεια, ή επιγενετικών παραγόντων.

Τα στοιχεία μας δείχνουν κάποια συνύπαρξη των ΠΣΕ και η ζώνη υψηλής ROHF στην ίδια γονιδιωματική περιοχή. Η παρατήρηση αυτή είναι σε συμφωνία με τα προηγούμενα ευρήματα γίνει σε ορισμένες περιοχές της γονιδιωματικής [21], [23]. Προτάθηκε ότι η ΑΤ-πλούσια φύση των ακολουθιών FRA θα μπορούσε να τους προσδώσει μια εξαιρετικά μεταβλητή φύση [30] – [32]. Για ορισμένες ΠΣΕ, τα δεδομένα μας δεν αναπαράγουν την υψηλή ζώνη ROHF όπως αναφέρεται στο ιστορικό μελέτες για ενιαίο τύπο Caner. Μια πιθανή εξήγηση είναι ότι η ικανότητα του ΠΣΕ για την πρόκληση ROH είναι διαφορετική σε όλους τους τύπους καρκίνου. Δεδομένου ότι η ενδο-ιστού ROH ομοιότητα heatmap παρουσιάζει ένα μοναδικό μοτίβο ROH σε διάφορους τύπους καρκίνου ιστού (Σχήμα S4), έτσι ίσως μόνο ΠΣΕ που μπορεί να προκαλέσει ROH σε διάφορες κυτταρικές σειρές θα δείξει συσχέτιση με υψηλή ROHF. Ωστόσο, δεν υπάρχει σαφής συσχέτιση μπορούσε να παρατηρηθεί σε επίπεδο γονιδιώματος σε επίπεδο μεταξύ των ΠΣΕ και υψηλή ROHF. Αυτό υποδηλώνει ότι, αν και ΠΣΕ μπορεί να παίξει ένα ρόλο στο σχηματισμό ROH, δεν είναι η μόνη αιτία σχηματισμού ROH. Πιο ενδιαφέρον, κατά τη σύγκριση της NCI-60 για να HapMap δείγματα, η διαφορά της ROHF ήταν χαμηλότερο σε περιοχές FRA από ό, τι σε περιοχές μη-FRA. Οι παρατηρήσεις αυτές θα μπορούσαν να σχετίζονται με την ελλιπή της τρέχουσας βάσης δεδομένων του FRA, ή θα μπορούσε να υποδηλώνει ότι η ΠΣΕ θα μπορούσε να προστατεύσει ενάντια ROH. Στην τελευταία περίπτωση, ο FRA μπορεί να λειτουργήσει ως ένα σημείο επισκευής για την αποκατάσταση των τυχαία mis-διαχωρίζονται χρωματιδικές κατά τη διάρκεια της μίτωσης.

ανάλυση δρόμος για SNPs με υψηλότερη ROHF στον ενήλικα σε σύγκριση με νεαρά υποομάδες εμπλέκει μια αλλαγή στα γονίδια που σχετίζονται με χημειοταξία. Τα γονίδια στα οποία αυτά τα SNPs συμβεί σημειώνονται με στερεά κόκκινους κύκλους στο σχήμα 2. Προς το παρόν δεν είναι σαφές πώς ROH μπορεί ποιοτικά /ποσοτικά επηρεάζουν αυτά τα γονίδια. Ωστόσο, αυτή η παρατήρηση είναι σε σύμφωνη με την εξέλιξη των μεταστατικών κυττάρων όγκου προς υψηλότερα ικανότητα χημειοταξία [33] – [35], η οποία συσχετίζεται με το δυναμικό τους για εισβολή, ενδαγγείωση, και μετάσταση και είναι υπεύθυνη για την προσέλκυση κυττάρων καρκινώματος προς τα αιμοφόρα αγγεία . Η πλειοψηφία των γονιδίων που ταυτοποιούνται εδώ, που περιλαμβάνουν αλλά δεν περιορίζονται σε CCR1 [36], CCR2 [37], CCR3 [38], ENA78 [39], GPCR [40], GRO1 [41], GRO2 /GRO3 [42], IP10 [43], IL-8 [44], ΝΑΡ-2 [45], PF-4 [46] έχει αποδειχθεί πρόσφατα να συνδέσουν με την εξέλιξη των διαφόρων τύπων καρκίνου. Εμείς υποθέσουμε ότι αυτά τα γονίδια θα μπορούσαν εν μέρει ευθύνονται για την ογκογένεση σε εξέλιξη από τα χαμηλά ROHF στο υγιές κύτταρο σε υψηλές ROHF στην κατάσταση του καρκίνου. Από την άλλη πλευρά, η ανάλυση των SNPs με μεγάλες διαφορές ROHF μεταξύ των δειγμάτων NCI-60 και HapMap δείχνει μια αλλαγή στο κυτταρικό κύκλο και διεργασίες που σχετίζονται έναρξης μετάφρασης, η οποία θα μπορούσε να προκύψει από την εξέλιξη των φυσιολογικών κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα προς την αυτονομία και ταχύτερη αντιγραφή. Έτσι, αυτά τα αποτελέσματα ανάλυσης μονοπατιού μπορεί να παρουσιάσει μια σειρά από αλλαγές που οδηγούν σε ογκογένεση. Ωστόσο, πρόσθετα αποδεικτικά στοιχεία εξακολουθεί να είναι απαραίτητη για να καλύψει το κενό μεταξύ των μεταβολών των γονιδίων στη διαδικασία χημειοταξία και του κυτταρικού κύκλου, και την έναρξη της ογκογένεσης.

Ο μεγάλος αριθμός των περιοχών ROH βρίσκονται στις κυτταρικές σειρές καρκίνου του NCI-60 και στατιστικά σημαντική συσχέτιση της με τις HapMap δείγματα προτείνει μια ζωτικής σημασίας σύνδεση των γεγονότων ROH με νεοπλασματική εξέλιξη. Είναι σημαντικό, η παρατήρηση της τριτοβάθμιας ROHF σε ενήλικες από ό, τι στους νέους και η συμμετοχή των γονιδίων χημειοταξίας ογκο που σχετίζονται μπορεί να παρέχει μια ένδειξη για να κατανοήσουν την υψηλότερη συχνότητα εμφάνισης καρκίνου μεταξύ των ηλικιωμένων. Μαζί, αυτές οι παρατηρήσεις υποδηλώνουν ότι η σημαντική αύξηση ομοζυγώτες στα καρκινικά κύτταρα μπορεί να είναι μια εξέλιξη από τις αλλαγές που ξεκίνησε στις αρχές του υγιούς κατάστασης. Περαιτέρω έρευνα σχετικά με την αιτιώδη σχέση μεταξύ ROH και του καρκίνου θα πρέπει να διεξαχθεί στο φως σκιά σχετικά με τους μηχανισμούς που οδηγούν σε υψηλές ROH.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

NCI-60 /HapMap ROHF συσχέτιση σε περιοχές του γονιδιώματος με διαφορετικά επίπεδα HapMap ROHF. Το οικόπεδο παρουσιάζει αύξηση σε NCI-60 /συντελεστής συσχέτισης HapMap ROHF (αριστερό άξονα, 0,34 έως 0,5), και NCI-60 ROHF (δεξιός άξονας, 0,33 – 0,44) σε περιοχές του γονιδιώματος με αυξημένα επίπεδα ROHF (από & gt? 0,1 έως & gt? 0,95 ποσοστημόριο) σε HapMap δείγματα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0031628.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

διαδικασίες που εμπλέκονται στην SNPs με κορυφαία διαφορές ROHF. Διεργασίες που εμπλέκονται στην SNPs με κορυφαία διαφορά ROHF μεταξύ α) των ενηλίκων και των νέων υποομάδες, και β) το NCI-60 και HapMap δείγματα (βλέπε παράγραφο στατιστικές για λεπτομέρειες)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0031628.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

κυτταρικού κύκλου G1_S φάση. ανάλυση μονοπατιού για SNPs με κορυφαία διαφορά ROHF μεταξύ NCI-60 και HapMap δείχνουν η συμμετοχή του κυτταρικού κύκλου G1_S φάση. Κόκκινο μαύροι κύκλοι δείχνουν τα γονίδια που καλύπτουν SNPs με κορυφαία την αλλαγή (βλέπε παράγραφο στατιστικές για λεπτομέρειες)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0031628.s003

(ΔΕΘ)

Εικόνα S4.

Ζεύγος σοφή ROH ομοιότητα. α) εντός του ιστού, β) Inter κυτταρική σειρά (ομαδοποίηση με βάση ζεύγη ομοιότητες ROH), και γ) ζεύγος Inter ιστό σοφός ομοιότητα ROH στις κυτταρικές σειρές καρκίνου του NCI-60

doi: 10.1371 /journal.pone.0031628 .s004

(ΔΕΘ)

πίνακα S1.

γονίδια σε High ROHF ζώνες χωρίς FRA σε ± 5 Mb περιοχή (περιφέρειες που προσδιορίζονται στον Πίνακα 3)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0031628.s005

(XLS)

Πίνακας S2.

Μέση άνω 95η ROHF εκατοστημόριο και ο αριθμός των γονιδίων miR γύρω ΠΣΕ.

doi: 10.1371 /journal.pone.0031628.s006

(XLS)

Πίνακα S3.

γονίδια με ROHF ανύψωση στο γονέα που εμπλέκονται στη διαδικασία χημειοταξία (φαίνεται στο Σχήμα 2).

doi: 10.1371 /journal.pone.0031628.s007

(XLS)

Πίνακας S4.

γονίδια με μεγάλη διαφορά ROHF μεταξύ NCI-60 και HapMap εμπλέκονται στη διαδικασία G1_S κυτταρικού κύκλου.

doi: 10.1371 /journal.pone.0031628.s008

(XLS)

Πίνακας S5.

plink ROH ρύθμιση παραμέτρων της μονάδας.

doi: 10.1371 /journal.pone.0031628.s009

(XLS)