Αφηρημένο

Είναι γνωστό ότι ο καρκίνος εξελίσσεται από κάθετη μεταφορά γονιδίων, αλλά αυτό το παράδειγμα αγνοεί ότι το DNA κυκλοφορεί και σε ανώτερους οργανισμούς και ότι είναι βιολογικά ενεργό μετά την πρόσληψη του από τον αποδέκτη των κυττάρων. Εδώ έχουμε επιβεβαιώσει τις προηγούμενες παρατηρήσεις σχετικά με την ικανότητα του ελεύθερου κυττάρων DNA για την επαγωγή

in vitro

κυτταρικό μετασχηματισμό και την ογκογένεση με κατεργασία ΝΙΗ3Τ3 παραλήπτης κύτταρα ποντικού με ορό των ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου και του υπερκειμένου SW480 ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα. μετασχηματισμός των κυττάρων και την ογκογένεση των κυττάρων-δεκτών δεν προκύψει εάν ορού και τα υπερκείμενα εξαντλημένο του DNA. Επίσης αποδεικνύεται ότι οι οριζόντιες καρκίνος εξέλιξη διαμεσολαβείται από κυκλοφορούντος DNA συμβαίνει μέσω πρόσληψης του από κύτταρα δέκτες σε ένα

in vivo

μοντέλο όπου ανοσοϊκανά ποντίκια υποβλήθηκαν σε καρκινογένεση κόλον με 1,2-διμεθυλυδραζίνη είχε αυξημένο ποσοστό του παχέος όγκους όταν εγχέεται σε ράχη με κύτταρα ανθρώπινου καρκινώματος SW480 του παχέος εντέρου ως πηγή του κυκλοφορούντος ογκογόνο DNA, η οποία θα μπορούσε να αντισταθμιστεί από τη θεραπεία αυτών των ζώων με DNAse Ι και πρωτεάσες. Αν και η συμβολή των βιολογικά δραστικών μορίων, εκτός από το DNA για το φαινόμενο αυτό να συμβεί, δεν μπορεί να αποκλειστεί, τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν το γεγονός ότι τα καρκινικά κύτταρα εκπέμπουν στην κυκλοφορία βιολογικά ενεργό DNA για την προώθηση της προόδου του όγκου. Περαιτέρω διερεύνηση της οριζόντιας φαινόμενο εξέλιξης του όγκου που προκαλείται από κυκλοφορούντων DNA σαφώς απαιτείται να προσδιοριστεί αν χειραγώγησης της θα μπορούσε να έχει κάποιο ρόλο στη θεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Trejo-Becerril C, Pérez-Cárdenas E, Taja-Chayeb L , Anker P, Herrera-Goepfert R, Medina-Βελάσκεθ LA, et al. (2012) Καρκίνος Εξέλιξη που Προκαλείται από οριζόντια μεταφορά γονιδίων σε ένα

In Vivo

μοντέλο. PLoS ONE 7 (12): e52754. doi: 10.1371 /journal.pone.0052754

Επιμέλεια: Brian Lichty, Πανεπιστήμιο McMaster του Καναδά

Ελήφθη: 23 Ιουλίου του 2012? Αποδεκτές: 20 Νοεμ 2012? Δημοσιεύθηκε: 28 του Δεκεμβρίου 2012

Copyright: © 2012 Trejo-Becerril et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από CONACYT χορηγεί 34649-Μ, 50699 και από PAPIIT UNAM IN214902. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν την ακόλουθη ενδιαφέρον. Συν-συγγραφέας Phillipe Anker είναι συνδεδεμένες με OncoXL. Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς.

Εισαγωγή

Το τρέχον παράδειγμα στην εξέλιξη του καρκίνου είναι ότι αυτό συμβαίνει μέσω κατακόρυφης μεταφοράς γονιδίων? Αυτό σημαίνει ότι οι απόγονοι της έναρξης των καρκινικών κυττάρων κληρονομούν τις γενετικές και επιγενετικές αλλοιώσεις που οδηγούν στην πρόοδο του όγκου. Αυτό το μοντέλο, ωστόσο, αγνοεί ότι οι οριζόντιες ή πλάγιες μεταφορά του DNA συνδέει και διαμορφώνει σχεδόν όλα τα έμβια όντα [1] και ότι μέσα σε έναν οργανισμό, που κυκλοφορούν DNA, όπως εξωσώματα που περιέχουν μεταγραφικά ενεργή mRNA και microRNA, δυνητικά μπορεί να δράσει ως ενδοκρινικές ή παρακρινής messenger, είναι σε θέση να επηρεάσει τη λειτουργικότητα των δικαιούχων κυττάρων [2]. Κατά συνέπεια, έχει προταθεί ότι ελεύθερα κυττάρων DNA (που κυκλοφορεί DNA) θα μπορούσε να συμμετέχει στην ανάπτυξη των μεταστάσεων μέσω «παθητική» διαμόλυνση-σαν πρόσληψη αυτών των νουκλεϊκών οξέων από ευαίσθητα [3] κύτταρα. Το 1994, Anker et al., Πρώτα έδειξαν ότι το υπερκείμενο καλλιεργημένων καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή SW480 ήταν σε θέση να μετατρέψει αποδέκτη αθάνατα κύτταρα ποντικού ΝΙΗ3Τ3, τα οποία αποκτούν μεταλλαγμένη ανθρώπινη

K-ras

[4]. Ο μετασχηματισμός αυτών των κυττάρων-δεκτών με πλάσμα των ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου έχει αναφερθεί επίσης [5].

Η ικανότητα του γενετικού υλικού να κυκλοφορεί στα ευκαρυωτικά έχει γίνει γνωστό από το 1948 [6], και ότι αυτό το DNA μπορεί να είναι που απελευθερώνεται από τα βακτήρια και τους ανώτερους οργανισμούς και να τεθεί σε παραλήπτη κύτταρα καταδείχθηκε από Anker και Stroun [7] – [9]. Αυτά τα ευρήματα οδήγησαν στην ιδέα ότι το DNA θα μπορούσε να δράσει ως αγγελιοφόρος [10] – [16]. Η άποψη αυτή έχει υποστηριχθεί από την ευκολία με την οποία χορηγείται βακτήρια και ευκαρυωτικών που DNA μπορούν να κυκλοφορούν ελεύθερα σε όλο το σώμα των ζώων και των φυτών και στην ικανότητά της να εισάγετε μεμονωμένα κύτταρα, φυσικά, όπου μπορεί να εντοπίσει στους πυρήνες του κυττάρου ξενιστή [12], [17] – [18]. Η πρόσληψη των κυκλοφορούντων DNA από ευκαρυωτικούς οργανισμούς δείχνει ότι η βιολογία των κυττάρων δεκτών /οργανισμοί θα μπορούσαν να τροποποιηθούν ανεξάρτητα από το αν είναι ενσωματωμένο ή όχι [19] – [27]

Αξίζει να σημειωθεί ότι η χορήγηση τέτοιων DNA το κάνει. δεν απαιτεί καμία ειδική οχημάτων, π.χ., λιποσώματα, ηλεκτροδιάτρηση, και γονιδιακά όπλα, για να βοηθήσει την είσοδο στα κύτταρα, προκειμένου αυτή να είναι βιολογικά ενεργό. Πώς γενετικό υλικό κυκλοφορεί και μεταφορές σε σωματικά κύτταρα των ανώτερων οργανισμών παραμένει αμφιλεγόμενη. Αν και αυτό δεν είναι αμοιβαία αποκλειόμενες, μερικοί συγγραφείς έχουν δείξει ότι αυτό συμβαίνει μέσω της πρόσληψης αποπτωτικών σωμάτων [28], ενώ άλλα έχουν χαρακτηρίσει κυκλοφορούν DNA ως ένα σύμπλοκο του DNA /RNA-λιποπρωτεΐνη ονομάζεται «virtosome», το οποίο αυθόρμητα απελευθερώνεται από διαβίωσης κύτταρα [29]. Εδώ αποδεικνύουμε ότι κυκλοφορούν DNA είναι σε θέση να οδηγούν οριζόντιες εξέλιξης του όγκου σε ένα μοντέλο αρουραίου ανοσοεπαρκείς κόλου-καρκινογένεση.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρικές Γραμμές

SW480 (ανθρώπινου καρκίνου του κόλου κυτταρική γραμμή που έχει την σημειακή μετάλλαξη Gly σε Val στο κωδικόνιο 12 του εξονίου 1 του

K-ras ογκογονιδίου

), HeLa (ανθρώπινου τραχηλικού κυτταρική σειρά καρκίνου θετικό για τον HPV-18), και ΝΙΗ3Τ3 (ποντικού αθανατοποιημένα ινοβλάστες ) αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection. Κύρια καλλιέργεια ινοβλάστες ακροποσθίας (ΒΒ1) προήλθε από την περιτομή ακροποσθία του νεογέννητου αγοριού με τη γραπτή συγκατάθεση από τον πατέρα του και να χρησιμοποιηθεί στο δεύτερο πέρασμα.

Προετοιμασία υπερκείμενο

Όταν κυτταροκαλλιέργειες είχε μια συμβολή των 80%, τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν με χρήση πιπέτας και απάλειψη τυχόν εναπομείναντα κύτταρα και τα κυτταρικά θραύσματα από ένα στάδιο φυγοκέντρησης στα 400 χ

g

για 20 λεπτά (Biofuge Primo R, Heraeus) και πέρασε μέσω ενός φίλτρου 0.45 μπι ( Sartorius, 16555) για την αφαίρεση δυνητικώς μολυσματικά κύτταρα. Δείγματα του κάθε υπερκείμενο δείγματα σπάρθηκαν σε φιάλη καλλιέργειας και επωάζονται στους 37 ° C επί 120 ώρες για να επαληθευθεί η απουσία των ζωντανών κυττάρων. Για την ανάλυση DNA, 50 ml υπερκειμένου συμπυκνώθηκαν, πρώτα με ένα σύστημα υπερδιήθησης με πόρου 40 kDa μεμβράνης (Amicon, αναδεύεται υπερδιήθησης Cell, μοντέλο 8010) και στη συνέχεια με μία συσκευή κενού ταχύτητας (Vacufuge Plus, Eppendorf) μέχρι 10 ml. Το συμπυκνωμένο υπερκείμενο ήταν αμέσως κρυοσυντηρημένα στους -80 ° C.

ενζυματική πέψη των επεξεργασμένων υπερκείμενα

Πενήντα ml των επεξεργασμένων υπερκείμενα από SW480 (ΝΔ) και ΝΙΗ3Τ3 (ΝΗ) χωρίστηκαν σε 12,5 ml και επωάστηκαν με πρωτεϊνάση Κ ή /και ϋΝΑση Ι ως εξής: 1) SW + DNAse Ι? 2) SW + Πρωτεϊνάση Κ? 3) SW + DNAse Ι + πρωτεϊνάση Κ, και 4) χωρίς ένζυμο. Οι πέψεις ελέγχου ήταν DMEM + 2% FBS DNA σπέρματος σολομού +, και β) ϋΜΕΜ + 2% FBS + σπέρματος σολομού DNA + DNAse Ι πέψη πραγματοποιήθηκε με 1.5 μονάδες (50 μg) πρωτεϊνάσης Κ ανά mg συνολικής πρωτεΐνης που περιέχεται στο υπερκείμενο για 60 λεπτά στους 37 ° C που ακολουθείται από την αδρανοποίηση στους 80 ° C για 20 λεπτά. Για DNAse Ι, η συγκέντρωση του ενζύμου ήταν 12 μονάδες (3,6 Kunitz) ανά 12 μg του περιεχομένου DNA στο υπερκείμενο για 60 λεπτά στους 37 ° C και στη συνέχεια απενεργοποίηση στους 65 ° C για 15 λεπτά. Η πέψη με τα δύο ένζυμα έγινε με την ίδια συγκέντρωση και χρόνους αλλά πέψη πρώτα με πρωτεϊνάση Κ και κατόπιν DNAse Ι Ακολουθώντας ενζυματική πέψη, το υπερκείμενο χρησιμοποιήθηκε για τις «παθητικές» διαμόλυνση όπως αναφέρεται ανωτέρω. Η υποβάθμιση των πρωτεϊνών και /ή DNA επαληθεύτηκε με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα.

Serum Συλλογή και Παρασκευή

Οι οροί προέρχονται από το αίμα τριών ασθενών με προχωρημένο καρκίνο του παχέος εντέρου και σε υγιή άτομα. Αίμα λήφθηκε από περιφερική φλέβα σε δύο σωλήνες Vacutainer (Becton Dickinson, 368162) που περιέχει πρόσθετο θρόμβο-ενεργοποίησης και μια γέλη εμπόδιο για την απομόνωση του ορού. Το αίμα διατηρήθηκε στους 4 ° C, και υποβάλλονται σε επεξεργασία μέσα σε 2 ώρες, και φυγοκεντρείται στα 1000

Χ g

για 20 λεπτά (Biofuge Primo R, Heraeus) σε θερμοκρασία δωματίου? ορός συλλέχθηκε και διαβιβάστηκε μέσω φίλτρου 0,45 μπι (Sartorius, 16555) για την απομάκρυνση των κυττάρων. Ελήφθησαν δείγματα αίματος με γραπτή συγκατάθεση από ασθενείς πηγή.

Παθητική Διαμόλυνση Mouse ΝΙΗ3Τ3 κύτταρα

κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 -όπως παραλήπτη για το μετασχηματισμό Ανιχνεύσεις σπάρθηκαν σε 24 φρεατίων πλάκες και εκτίθενται σε ανθρώπινο ορό ή υπερκείμενα SW480 (πέψη ή όχι) σε 1:01 αναλογία (ϋΜΕΜ με 2% FBS /ορό ή υπερκείμενο) για 14 ημέρες, για ανανέωση του μέσου κάθε 24 ώρες [4]. Μετά από 14 ημέρες έκθεσης (μόνο επτά ημέρες σε τρυβλία εκτέθηκαν σε ορό), τα κύτταρα διασκορπίζονται και πολλαπλασιάζονται κάτω από πρότυπες συνθήκες. Στη συνέχεια, οι εκτεθειμένες κύτταρα αναλύθηκαν για την παρουσία μεταλλαγμένης ανθρώπινης

K-ras

αλληλουχιών με PCR, RT-PCR, και αλληλούχιση. Τα πειράματα διεξήχθησαν με τριπλούν.

Ενεργή Transfection (Lipofectamine)

Μία ημέρα πριν από την επιμόλυνση, τα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 σπάρθηκαν σε πυκνότητα 1 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο (έξι φρεατίων πλάκες) σε 500 μΐ μέσου ανάπτυξης χωρίς αντιβιοτικά (DMEM). Οι επιμολύνσεις έγιναν χρησιμοποιώντας 5 μg από DNA (είτε γονιδιακό DNA ή υπερκείμενο DNA από κύτταρα SW480 συν 0.5 μg πλασμίδιο (pEGFP-CMV) Lipofectamine επιμολύνσεις έγιναν ακόλουθες οδηγίες των κατασκευαστών (Invitrogen ™, LTX & amp?.. Αντιδραστήριο Plus) Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες? μέσο ήταν ανανεωμένοι και η επιλογή G418 ξεκίνησε για να πάρει σταθερή επιμολύνσεις

αναλύσεις μετασχηματισμού

ΝΙΗ3Τ3 που παθητικά επιμολυσμένα χρησιμοποιήθηκαν για την εκτέλεση των δοκιμασιών μετασχηματισμού Όπως ελέγχου,.. χρησιμοποιήσαμε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 εκτεθούν σε ορό ενός υγιούς δότη και με τη δική τους υπερκείμενο. Τα χαρακτηριστικά που χρησιμοποιούνται ως δείκτες της κακοήθους μετασχηματισμού ήταν μορφολογικές αλλαγές (σχηματισμός εστίαση), ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη (αύξηση σε μαλακό άγαρ), και ογκογονικότητα [30] .

Μορφολογική Ανάλυση

Επιμολυσμένα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 εξετάσθηκαν για το σχηματισμό εστιών και μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης.

Η ανάπτυξη των κυττάρων σε μαλακό άγαρ

εστίες απομονώθηκαν από πλαστικά τρυβλία καλλιέργειας και επεκτάθηκε για μαλακά ανάλυση άγαρ. Μετά trypsinitation κύτταρα εναιωρήθηκαν σε μέσο DMEM που περιέχει 0.3% ευγενές άγαρ και 15% FBS. Ένα στρώμα αυτού του αιωρήματος απλώθηκε πάνω από ένα στρώμα μέσου που περιέχει 0,7% άγαρ χωρίς ορό. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 5 χ 10

5 κύτταρα ανά 10-cm πιάτο. Αποικίες ήταν σκόραρε μετά από 14 ημέρες καλλιέργειας (αποικία ορίστηκε σαν να περιείχε τουλάχιστον 50 κύτταρα).

Στην

in vivo πειράματα

δοκιμασίες Ογκογένεση πραγματοποιήθηκαν σε 6 -Εβδομάδα-old αθυμικά BALB /c (ηυ /ηυ) θηλυκά ποντίκια (Harlan Laboratories). Σε όλα τα πειράματα, ομάδες έξι ποντικών εγχύθηκαν υποδορίως με 2 εκατομμύρια κύτταρα αιωρούνται σε 100 μΐ FBS-DMEM χωρίς. Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθείται σε εβδομαδιαία και καταγράφονται. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε με ηλεκτρονικό παχύμετρο και το μέγεθος όγκου εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας τους τύπους ενός × b

2 × (π /6) = V (mm

3) (Α = μείζων διάμετρος? b = μικρή διάμετρο και V = όγκος). Σε πειράματα για να αξιολογηθεί η ικανότητα της ογκογένεσης του υπερκειμένου των κυττάρων HeLa σε μη υποβληθέντα σε χειρισμό ζώα, 6-εβδομάδων αθυμικά BALB /c (ηυ /ηυ) θηλυκά ποντίκια χρησιμοποιήθηκαν επίσης. Τα ζώα εγχύθηκαν καθημερινά με ενδοπεριτοναϊκή οδό με 500 μΙ υπερκειμένου από κύτταρα HeLa επί 30 ημέρες. Την ημέρα 31, τα ζώα θυσιάστηκαν. Χωρίς θύμο αδένα Hsd: Rh-

Foxn1

rnu

των θηλυκών αρουραίων και ανοσοεπαρκή Hsd: Wistar θηλυκούς αρουραίους καθώς και (Harlan Laboratories) εγχύθηκε με αποπτωτικά σώματα από τα κύτταρα HeLa, τα οποία ελήφθησαν μετά από έκθεση σε υψηλή δόση για 24 ώρα στη σισπλατίνη στα 75 μΜ. Πωλείται κύτταρα συλλέχθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν βήμα σε 400 χ

g

για 10 λεπτά (Biofuge Primo R, Heraeus) σε PBS τρεις φορές για να απομακρυνθεί κάθε υπόλοιπο σισπλατίνη. Ενέσεις αποπτωτικών σωμάτων έγιναν κάθε δεύτερη ημέρα με ενδοφλέβια ένεση στην ουρά σε έναν συνολικό όγκο 100 μΙ φυσιολογικού ορού. Η θεραπεία διήρκησε 60 ημέρες. Την ημέρα 61 οι αρουραίοι θυσιάστηκαν και νεκροψία για να αξιολογηθεί μακροσκοπικά σχηματισμό όγκων. Κύρια όργανα (ήπαρ, σπλήνα, νεφρό, πνεύμονα και μήτρα) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για Η &? Ε παθολογική εξέταση

Για να αξιολογηθεί οριζόντια εξέλιξη του όγκου, Hsd: υποβλήθηκαν σε επεξεργασία Wistar 6 εβδομάδων θηλυκοί αρουραίοι (Harlan Laboratories). είτε με: i) χωρίς θεραπεία? ii) υποδόρια ένεση 1 × 10

6 SW480 κύτταρα (αραιωμένη σε 100 μΐ φυσιολογικού ορού) στο πλευρό κατά τις ημέρες 28 και 49 της θεραπείας ΩΜΗ? iii) η καρκινογόνος παχέος εντέρου ΩΜΗ με ενδοπεριτοναϊκή οδό για 20 εβδομάδες, όπως ανέφερε [31]? iv) την αγωγή του DMH συν SW480 κύτταρα? και ν) ως ομάδα IV συν θεραπεία /πρωτεάσης ϋΝΑση Ι η οποία συνίστατο σε ϋΝΑση Ι σε δόση 2,3 mg /Kg με ενδομυϊκή ένεση και ένα μίγμα πρωτεασών (θρυψίνη, χυμοθρυψίνη, και παπαΐνη) με ενδοπεριτοναϊκή ένεση σε δόσεις των 10 mg /kg, 10 mg /kg και 25 mg /kg, αντίστοιχα, όπως αναφέρεται στο [32]. Τόσο DNAse Ι και πρωτεάσες μίγματος αραιώθηκαν σε 100 μΙ φυσιολογικού ορού. Οι ενέσεις χορηγήθηκαν καθημερινά εκτός Σαββάτου και Κυριακής από την εβδομάδα 4 έως 12. Ομάδα vi έλαβε ΩΜΗ + DNAse Ι /πρωτεάσες. Μετά από αξιολόγηση με μικρο PET-CT (όπως περιγράφεται παρακάτω) τα ζώα θυσιάστηκαν και αυτοψία 6 μήνες μετά την ολοκλήρωση των 20 εβδομάδων της καρκινογόνος (ΩΜΗ)

Για να αξιολογηθεί η τύχη των ανθρώπινων κυττάρων SW480 ένεση σε ζώα με φυσιολογικό ανοσοποιητικό σύστημα Hybrid.: Wistar 6 εβδομάδων θηλυκοί αρουραίοι (Harlan Laboratories) έλαβαν υποδόρια ένεση με 10 εκατομμύρια SW480 κύτταρα στο πλευρό και θυσιάστηκαν στις ημέρες 1, 2, 3, 7, και 14 μετά την ένεση για να απομακρυνθεί το σημείο της ένεσης και υποβάλλονται σε επεξεργασία για τη συνήθη χρώση η & ? Ε ιστολογική ανάλυση. Ηθικές εγκρίσεις ελήφθησαν από το Διοικητικό Συμβούλιο Δεοντολογίας Θεσμικών Έρευνας και Επιτροπή Φροντίδας Ζώων.

Micro PET-CT

σχηματισμό όγκων στα ζώα παρακολουθήθηκε χρησιμοποιώντας τεχνικές μοριακής απεικόνισης με ένα μικρο PET-CT (Albira ARS, Oncovision) και

18F-FDG. παρακολούθηση του όγκου διεξήχθη στις εβδομάδες 15 και 24 μετά την έναρξη της θεραπείας (DMH). Για να ποσοτικοποιηθεί δραστηριότητα του όγκου, η κατ ‘αποκοπή αξία πρόσληψης (SUV) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας Albira εργαλεία λογισμικού συστήματος (Carestream Μοριακής Απεικόνισης, CT, USA). SUV είναι ένα ποσοτικό εργαλείο για PET-CT μελέτες που επιτρέπει τον προσδιορισμό της

συγκέντρωση 18F-FDG σε ένα συγκεκριμένο (δηλαδή, η δραστηριότητα του όγκου) περιοχή ενδιαφέροντος. παρουσία όγκου ορίστηκε όταν το SUV (όγκου /ήπαρ) αναλογία ήταν ≥1.5.

Παρασκευή ιστών και μικροανατομίας

Οι φορμόλη σταθερό, παραφίνη-ενσωματωμένες παχέος όγκους (έναν από κάθε ομάδα) από κάθε ομάδα DMH-αγωγή αρουραίοι κόπηκαν σε 5-μm πάχους τομές με μικροτόμο με μια αναλώσιμη λεπίδα. Για μικροδιατομής, οι τομές απαλλάχθηκαν από την παραφίνη σε δύο αλλαγές ξυλένιου για 10 λεπτά, επανυδατώθηκαν σε 100% αιθανόλη, 90% αιθανόλη, και 70% αιθανόλη για 5 λεπτά η κάθε μία, χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε) για 45 δευτερόλεπτα, ξεπλύθηκαν σε RNase-free H

2O για 30 δευτερόλεπτα, και τελικά βυθίζεται σε 100% αιθανόλη για 1 λεπτό. Το PALM Laser-MicroBeam System (P.A.L.M., Wolfratshausen, Γερμανία) χρησιμοποιήθηκε για μικροδιατομής. Μετά την επιλογή των κυττάρων ενδιαφέροντος, δίπλα κύτταρα photolysed από το microbeam. Για να ανακτήσετε τα επιλεγμένα κύτταρα από το κλείστρο, ένα ηλεκτρονικά ελεγχόμενο μικροεπεξεργαστής και τα συμβατικά αποστειρωμένες βελόνες χρησιμοποιήθηκαν για να πάρει και να μεταφέρει τα κύτταρα σε ένα σωλήνα αντίδρασης.

DNA Extraction

Κυκλοφορούν εκχύλιση του DNA εκτελούνται από πέψη SDS /πρωτεϊνάση Κ που ακολουθείται από εκχύλιση με φαινόλη /χλωροφόρμιο όπως περιγράφεται από τους Anker, Ρ [4]. Εν συντομία, 500 μΐ ορού ή το υπερκείμενο αναμίχθηκαν με 500 μΙ ενός διαλύματος SDS /πρωτεϊνάση Κ (Invitrogen) και επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 55 ° C. Ένας ίσος όγκος φαινόλης /χλωροφορμίου (1:01 ν /ν) προστέθηκε, στροβιλίστηκε για λίγο, και φυγοκεντρήθηκαν στα 800 χ g για 10 λεπτά (Biofuge Primo R, Heraeus). Η υδατική φάση ανακτήθηκε και αναμίχθηκε με ίσο όγκο χλωροφορμίου και φυγοκεντρήθηκε στα 800 χ g (Biofuge Primo R, Heraeus) για 5 λεπτά. Η υδατική φάση καταβυθίζεται όλη τη νύχτα στους -20 ° C με 1/10 του όγκου 7.5 Μ οξικό αμμώνιο, 1 μΙ γλυκογόνου και 2,5 όγκων 100% αιθανόλης και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στα 1200 χ g (Biofuge Primo R, Heraeus) για 45 min. Το σφαιρίδιο ϋΝΑ πλύθηκε με 70% αιθανόλη, ξηραίνεται στον αέρα και επαναιωρήθηκε σε νερό. Ποσοτικοποίηση του συνολικού DNA πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία PicoGreen (Invitrogen) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. DNA από μικροτομή όγκους παραφίνη παραφίνη ιστό εκχυλίζεται με το κιτ απομόνωσης DNA PicoPure ™ (ARCTURUS Mountain View CA) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.

RNA Extraction

Το συνολικό RNA απομονώθηκε από επεξεργασία υπερκείμενο και ανθρώπινο ορό χρησιμοποιώντας QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Γερμανία), ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.

PCR

Όλες οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν σε 20 μΐ που περιείχε 100 ng εκμαγείου DNA, 10 mmol /l Tris-HCl (ρΗ 8,3), 40 mmol /l KCI, 2 mmol /l MgCl

2, (1 mmol /l MgCl

2 για

RAB30

, και 5 mmol /l MgCl

2 για

Alu Yd6

), 200 μmol /l από κάθε dNTP, 0,25 U Taq πολυμεράση (Applied Biosystems), και 1 mmol /l από κάθε ειδικό εκκινητή: ανθρώπινη

K-ras

(5′-gactgaatataaacttgtggtagt-3 ‘, και 3′-ggacgaatatgatccaacaatag-5’), 107 bp αμπλικόνιο?

Ε6

(5 ‘gggggatccatggcgcgctttgaagatccaaca-3′, και 3’-ggggaattcttatacttgtgtttctctgcgtcg-5 ‘), 450 bp αμπλικόνιο?

Ε7

(5′-cccgacgagccgaaccacaac-3 ‘, και 3′-gggatgcacaccacggacacac-5’), 300 bp αμπλικόνιο? ανθρώπινο

DHFR

(5′-agaaccaccacgaggagc-3 ‘, και 3′-acagaactgcctccgactatc-5’), 120 bp αμπλικόνιο? ανθρώπινο

ACTIN

(5′-ggagtcctgtggcatccacg-3 ‘, και 3′-ctagaagcatttgcggtgga-5’), 320 bp αμπλικόνιο. Ανθρώπινα

RAB30

(5′-gtccattacccagagttactaccg-3 ‘, και 3′-gaccttgttgctggcatattgttc-5’), 130 bp αμπλικόνιο?

Alu Yd6

(5′-gagatcgagaccacggtgaaa-3 ‘, και 3′-ttgctctgaggcagagttt-5’), 200 bp αμπλικόνιο [33].

Μια αρχική μετουσίωση στους 94 ° C για 5 λεπτά ακολουθήθηκε από 40 κύκλους ενίσχυσης και μια τελική επέκταση βήμα 5 λεπτά στους 72 ° C, (

Ε6

,

Ε7

και

Alu Yd6

είχε χρόνο παράταση για 30 sec ). Οι κύκλοι που περιλαμβάνονται μετουσίωση στους 94 ° C για 30 sec, 30 sec της ανόπτησης (60 ° C για

K-ras

και

RAB30

, 59 ° C για

ΑΚΤΙΝΗΣ

και

DHFR

, 57 ° C για

Ε6

και

Ε7

και 61 ° C για

Alu Yd6

), οι αντιδράσεις PCR διεξήχθησαν σε ένα 2400 θερμικού (Applied Biosystems). Τα προϊόντα ενίσχυσης επαληθεύεται με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Για συγκεκριμένες αρουραίος

LINE 1

αλληλουχίες την ενίσχυση πραγματοποιήθηκε σε 20 μΐ που περιέχουν αντιδράσεις 100 ng εκμαγείου DNA, 10 mmol /L Tris-HCl (ρΗ 8,3), 40 mmol /L KCI, 1 mmol /L MgCl

2, 200 μmol /L από κάθε dNTP, 0,25 U Taq πολυμεράση (Applied Biosystems) και 1 mmol /L για κάθε ειδικό εκκινητή για αρουραίος

LINE 1

(5′-aaatcagggactagacaaggctgc-3 ‘, και 3’-cccagccactttgctgaagttgt-5 ‘) [34]. Αρχική μετουσίωση στους 94 ° C για 5 λεπτά ακολουθήθηκε από 40 κύκλους ενίσχυσης και ένα τελικό στάδιο επέκτασης (5 λεπτά στους 72 ° C). κύκλοι ενίσχυσης αποτελούνταν επί μετουσίωση στους 94 ° C για 30 δευτερόλεπτα, ανόπτηση στους 59 ° C για 30 δευτερόλεπτα, και επέκταση στους 72 ° C για 30 δευτερόλεπτα. αντίδραση PCR διεξήχθη επί 2400 θερμικού (Applied Biosystems). Τα προϊόντα ενίσχυσης επαληθεύεται με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης.

RT-PCR

Για την σύνθεση πρώτου κλώνου cDNA 1-5 μg ολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε ένα 20-μΙ όγκου αντιδράσεως που περιέχει 2 μΙ ρυθμιστικό διάλυμα 10 χ PCR, 50 ng τυχαίων εξαμερών, 50 mM MgCl

2, 200 ng ηΜ dNTP, 0.1 Μ DTT, και 200U αντίστροφη μεταγραφάση, (GeneAmp, Applied Biosystems) για 50 λεπτά στους 42 ° C. PCR ενίσχυση του cDNA πραγματοποιήθηκε σε ένα όγκο αντίδρασης 20 μΐ που περιέχει 100 cDNA ng, 10 mmol /L Tris-HCl (ρΗ 8,3), 40 mmol /L KCI, 1 mmol /L MgCl

2 (για

K -ras

V12 και

RAB30

), και 200 ​​μmol /L από κάθε dNTP, 0,25 U Taq πολυμεράση (Applied Biosystems), και 1 mmol /l από κάθε ειδικό εκκινητή για ανθρώπινη

K-ras

V12 (5′-actgaatataaacttgtggtagttggacct-3 ‘, και 3′-caaatcacatttatttcctaccaggacct-5’), καθώς και για

RAB30

(5′-gtccattacccagagttactaccg-3 ‘, και 3 «-gaccttgttgctggcatattgttc-5 ‘). Αρχική μετουσίωση στους 94 ° C για 5 λεπτά ακολουθήθηκε από 40 κύκλους ενίσχυσης και ένα τελικό στάδιο επέκτασης (5 λεπτά στους 72 ° C). Οι κύκλοι που περιλαμβάνονται μετουσίωση στους 94 ° C για 30 δευτερόλεπτα, αναδιάταξη στους 58 ° C (

K-ras

V12), και στους 56 ° C (

RAB30

) για 30 sec , και επέκταση στους 72 ° C για 30 sec. Το μέγεθος των αμπλικονίων και η αλληλουχία των εκκινητών που χρησιμοποιούνται για την PCR για

K-ras

V12 είναι 357 bp, και για το

RAB30

, 130 bp. Η αντίδραση PCR διεξήχθη επί 2400 θερμικού (Applied Biosystems). Τα προϊόντα ενίσχυσης υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε γέλη αγαρόζης 3%.

DNA Sequencing

Για να επαληθευθεί η προέλευση της ενισχυμένης αλληλουχίας (ανθρώπου ή ποντικού), τα προϊόντα PCR υποβλήθηκαν σε καθορισμό αλληλουχίας. αμπλικόνια PCR καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας καθίζηση με ισοπροπανόλη και στη συνέχεια η αλληλουχία, τόσο προς τα εμπρός και αντίστροφες κατευθύνσεις από τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα προϊόντα ενίσχυσης. Καθαρισμένο DNA αραιώθηκε και κύκλο-αλληλουχία τους χρησιμοποιώντας το κιτ v3.1 ΑΒΙ BigDye Terminator (ΑΒΙ, Foster City, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι αντιδράσεις προσδιορισμού αλληλουχίας ηλεκτροφορήθηκαν σε μια γενετική αναλυτή ABI3100. Ηλεκτροφορήματα αναλύθηκαν και στις δύο κατευθύνσεις με νόημα και αντινόημα. Οι αλληλουχίες που προέκυψαν σε σχέση με την αναφορά

KRAS

ακολουθία (GenBank DQ893829) και το

RAB30

ακολουθία (GenBank NM_014488).

Νότια Blot

Επισημασμένο SW480 γενωμικού DNA υβριδοποιήθηκε με τα ακόλουθα κυτταρικές γραμμές: SW480 (θετικός έλεγχος)? ΝΙΗ3Τ3 (αρνητικός έλεγχος), και μια δεξαμενή

K-ras

θετικοί κλώνοι κυττάρων που προέρχονται από ΝΙΗ3Τ3 εκτεθούν σε ανθρώπινο ορό από έναν ασθενή με καρκίνο του παχέος εντέρου. Δέκα μg του υψηλού μοριακού βάρους γονιδιωματικό DNA του κάθε δείγματος DNA υποβλήθηκε σε πέψη με

Hind III

(New England Biolabs). Τα θραύσματα του DNA διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 0,8%, μετουσιωμένη, και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νάιλον (Amersham). Ο υβριδισμός διεξήχθη σε ένα διάλυμα του κιτ χημειοφωταύγειας ΒΜ Blotting (Roche Applied Science) που περιέχει τον ανιχνευτή DNA (100 ng /ml) για 20 ώρες στους 42 ° C. Οι κηλίδες πλύθηκαν κάτω από συνθήκες υψηλής αυστηρότητας σε 0,1 Χ SSC, 0,1% SDS για 90 λεπτά στους 65 ° C, επωάστηκαν σε στρεπταβιδίνη για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, τοποθετείται σε Hyperfilm ECL (GE Healthcare Life Sciences), και εκτέθηκαν για 60 sec.

SNP Array υβριδισμός και DNA Copy Number Ανάλυση

DNA από γονικά κύτταρα SW480, DNA που απομονώθηκε από το υπερκείμενο των κυττάρων SW480, και γονιδιακού DNA από κύτταρα SB1 (ΝΙΗ3Τ3 παθητικά μεταμορφωθεί από υπερκείμενο SW480) υβριδοποιήθηκε επί της συστοιχίας γονοτύπησης 500K Affymetrix οριστεί για την ανάλυση αριθμού αντιγράφων του DNA, ακολουθώντας το πρωτόκολλο των κατασκευαστών. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του αγωγού αριθμό αντιγράφων του DNA στο λογισμικό Partek Γονιδιωματική Suite. Όλα τα δείγματα συγκρίθηκαν έναντι μιας κοινής φυσιολογική τιμή αναφοράς του αριθμού αντιγράφων ανθρώπινου DNA αναφοράς.

FISH

Μεσόφαση πυρήνες και χρωμοσώματα μετάφασης των επιμολυσμένων κυττάρων ΝΙΗ3Τ3 (SB1) αναλύθηκαν σε πρότυπο κυτταρογενετική παρασκευασμάτων, όπως προηγουμένως περιγράφεται [35], με μια συναινετική αλληλουχία του ανθρώπινου διάσπαρτες επαναλήψεις. Το ανθρώπινο ανιχνευτή Cot DNA (το οποίο είναι DNA πλακούντα που είναι κυρίως 50-300 bp σε μέγεθος και εμπλουτισμένο για επαναληπτικές ακολουθίες DNA όπως

Alu

και

Κρη

μέλη της οικογένειας) σημάνθηκε με μετάφραση αποκοπής με διγοξιγενίνη-11-dUTP (Roche) χρησιμοποιώντας το DIG-Nick Translation Mix (Roche) και ανιχνεύεται χρησιμοποιώντας ένα συζευγμένο με ένα φθοριόχρωμα αντίσωμα αντιδιγοξιγενίνης. Εκατό πυρήνες μικροσκοπικά αναλύθηκαν

ανάλυση FISH του ιστολογικές τομές όγκων του παχέος εντέρου αρουραίων έγινε ως εξής: α. Οι τομές αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο και επανυδατώθηκαν σε διαβαθμισμένη σειρά αιθανόλης. Οι πλάκες προ-αγωγή με 0.2 Μ HCl, 8% θειοκυανικό νάτριο, και 0,5% πεψίνη. Στη συνέχεια, το κόκκινο-σημασμένο με φλουορεσκεΐνη

ALU

ανθρώπου (FISHBright, Kreatech Βιοτεχνολογία) και πράσινο-σημασμένο με φλουορεσκεΐνη

ανιχνευτές προστέθηκαν ταυτόχρονα LINE 1

αρουραίο (FISHBright, Kreatech Biotechnology)? τα πλακίδια καλύπτονται με καλυπτρίδες και σφραγίζεται με καουτσούκ τσιμέντο. Οι τομές μετουσιώθηκαν και υβριδοποιήθηκαν σε hybridizer (Life Technologies) στους 37 ° C όλη τη νύκτα. Το τσιμέντο καουτσούκ και οι καλυπτρίδες απομακρύνθηκαν και τα τμήματα πλύθηκαν αυστηρά χρησιμοποιώντας SSC: 2 × SSC για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, 0.4 χ SSC /0.3% ΝΡ40 για 5 λεπτά στους 75 ° C, και 2 χ SSC /0.1% ΝΡ40 για 4 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με τη χρησιμοποίηση 4 ‘, 6’-διαμινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ) σε συγκέντρωση 0,1-μg /ml σε αντιξεθωριάσματος (Vector Laboratories). Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού Zeiss Axioplan (Zeiss) σε διασύνδεση με το σύστημα CytoVision (Applied Imaging).

Αποτελέσματα

Το εξωκυτταρικό DNA Μετασχηματισμοί αθανατοποιημένα κύτταρα ποντικού συνδεδεμένη με το DNA Transfer

υπερκείμενα κυτταροκαλλιέργειας των ανθρώπινων κακοήθων κυτταρικών γραμμών SW480 και HeLa (αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ με 2% FBS), καθώς και στον ορό από τους τρεις ασθενείς με προχωρημένο μη επεξεργασμένα καρκίνο του παχέος εντέρου και δύο υγιείς ελέγχους εκκαθαρίστηκαν βιώσιμων κυττάρων και των κυτταρικών υπολειμμάτων με φυγοκέντρηση και φιλτραρίσματος (φίλτρο 0.45 μπι). Το DNA που εξάγεται από αυτές τις πηγές, (SW480 και HeLa υπερκείμενα) ήταν PCR θετικά για το μεταλλαγμένο ανθρώπινο

K-ras

στο κωδικόνιο 12, και

Ε6

και

Ε7

ογκογονίδια αντίστοιχα. Τα τρία δείγματα ορού για ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου έτρεφε η

K-ras

μετάλλαξη στο κωδικόνιο 12, η ​​οποία επίσης έχει αποδειχθεί στο DNA που εξάγεται από παραφίνη-ενσωματωμένες πρωτοπαθείς όγκους τους. Αυτά τα υλικά (υπερκείμενα υγρά και ορό ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου και των υγιών μαρτύρων ήταν PCR θετικά για συστατική ανθρώπινη

DHFR

και

ACTIN

γονίδια (δεν φαίνεται). Οι συγκεντρώσεις του DNA στον ορό ορού ήταν 2,04, 0,66 και 0,93 μg /ml για τους ασθενείς και 0,28 και 0,178 μg /ml για τα υγιή άτομα. τα υπερκείμενα από πέντε ανεξάρτητες κυτταρικές καλλιέργειες από SW480 τα οποία ελήφθησαν σε 80% συρροή των κυττάρων, είχαν μέση συγκέντρωση του 0,1875 ± 0,007 μg /ml. «pasive» επιμολύνσεις με υπερκείμενα ή οροί γίνεται ως εξής: 0,5 ml (ορό ή υπερκείμενο που περιέχει 1,815 μg ή 0,09 μg αντίστοιχα) προστέθηκαν σε 0.5 ml μέσου (1:01 αναλογία) των καλλιεργημένων δέκτη ποντικού αθάνατα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 (τα οποία αποδείχθηκε ποντικού με κυτταρογενετική ανάλυση και από την απουσία των επαναλαμβανόμενων ανθρώπινης

Alu Yd6

με PCR, που δεν φαίνεται) σε πλάκες μικροτίτλου των 24 φρεατίων. Μεσαίο συν ορό ή υπερκείμενο αλλάζονται καθημερινά για 7 ή 14 ημέρες (μικρότερος χρόνος για ορό λόγω της περιορισμένο ποσό), έτσι, τα κύτταρα εκτίθενται καθημερινά σε 1.815 μg του DNA που περιέχεται στον ορό ή στο 0,09 μα DNA που περιέχεται στο υπερκείμενο DNA. Κατά την ημέρα 8 ή 15, ο αριθμός των μετασχηματισμός εστιών αποδέκτη ΝΙΗ3Τ3 κυττάρων σε πλαστικό και σχηματισμό αποικίας σε άγαρ ήταν συντριπτικά ανώτερες τόσο για τον ορό και το υπερκείμενο (σε σύγκριση με τον μάρτυρα (κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 εκτεθούν σε δικές τους υπερκείμενο και στο φυσιολογικό ορό). μεταξύ εγκατεστημένος μετασχηματισμένοι κλώνοι, 11 από 27 εκτίθενται σε SW480 και 5/9 (εκτίθεται στον ορό του ασθενούς με καρκίνο) είχαν τις

K-ras

μετάλλαξη όπως αποδείχθηκε με PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές ειδικούς για την ενίσχυση του ανθρώπου

K-ras

. Ομοίως, 8/24 κλώνοι εκτίθενται σε HeLa ήταν PCR θετικά για το

Ε6

και

Ε7

HPV ογκογονίδια. προσδιορισμοί Ογκογένεση στο

nu /nu

θηλυκά ποντίκια έδειξαν μεγαλύτερο και ταχύτερα αναπτυσσόμενους όγκους από ένα σύνολο κλώνων «παθητικά» επιμολυσμένα με υπερκείμενο SW480 (πισίνα SB1) και ορό καρκίνο του παχέος εντέρου (CCP) σε σύγκριση με γονικά κύτταρα SW480 (+ Ctr), με εμφανή ποντικού ΝΙΗ3Τ3 σε κανονική ορού (NS), καθώς και με τη γονική ΝΙΗ3Τ3 (-Ctr) (Σχ. 1 Α, Β). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν τις προηγούμενες παρατηρήσεις σχετικά με την ικανότητα μετασχηματισμού του υπερκειμένου των κυττάρων SW480, καθώς και εκείνες του πλάσματος από ασθενείς με καρκίνο [4], [5]. Southern υβριδοποίηση αυτών των ΝΙΗ3Τ3 μετασχηματισμένων δεξαμενές κλώνων (πισίνα SB1) έναντι γονιδιωματικό DNA από κύτταρα SW480 έδειξε σαφή σήματα υβριδοποίησης, επιβεβαιώνοντας την οριζόντια μεταφορά του ανθρώπινου DNA για να λήπτη κύτταρα ποντικού (Εικ. 1 C). Περαιτέρω, η ανάλυση FISH του παθητικά μετασχηματισμένων κυττάρων ποντικού (SB1) εκπέμπονται θετικά σήματα για την ανθρώπινη επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες (Σχ. 1 D), η οποία επιβεβαιώνει ότι ο μετασχηματισμός των κυττάρων που σχετίζονται με τη μεταφορά του DNA.

Η ανάπτυξη του όγκου σε γυμνούς ποντικούς από » παθητικά «μετασχηματισμένα κύτταρα. Ταχύτερη και μεγαλύτερη αύξηση του όγκου παρατηρήθηκε σε πισίνα SB1 και πισίνα CCPS (ΝΙΗ3Τ3 εκτεθούν σε υπερκείμενο κυττάρων SW480 και προς τον ορό ενός ασθενούς με καρκίνο του παχέος εντέρου, αντίστοιχα). SW480 κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος, ενώ ΝΙΗ3Τ3 και ΝΙΗ3Τ3 εκτεθούν σε φυσιολογικό ορό έδειξαν ουσιαστικά μηδενική ανάπτυξη. Β Αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες των όγκων σε ποντίκια από κάθε ομάδα. υβριδοποίηση στυπώματος Southern Γ του SB1 και CCPS δεξαμενές κυττάρων έναντι γονιδιωματικού DNA των κυττάρων SW480. κύτταρα Lane SW480 είναι ο θετικός έλεγχος και ΝΙΗ3Τ3, ο αρνητική. Ένα σαφές σήμα υβριδοποίησης παρατηρείται μόνο σε SB1 και οι κεντρικοί αντισυμβαλλόμενοι λωρίδες. Δ FISH ανάλυση των επαναλαμβανόμενων ανθρώπινων αλληλουχιών. Θετικός έλεγχος είναι ανθρώπινα λεμφοκύτταρα και κύτταρα ποντικού αρνητικού ελέγχου. κύτταρα SB1 δείχνει ισχυρό σήμα. Η ανάπτυξη του όγκου Ε είναι παρόμοια σε ΝΙΗ3Τ3 επιμολυσμένα με ενεργά γονιδιωματικό DNA από κύτταρα SW480 (Neo-Geno) και ενεργά επιμολυντικό DNA εκχυλίζεται από το υπερκείμενο των κυττάρων SW480 σε σύγκριση με απουσία ανάπτυξης σε ΝΙΗ3Τ3 (-Crt) και επιμολύνθηκαν με τον κενό φορέα-μόνο . Θετικός μάρτυρας, SW480 κυττάρων.

Η

Για να αποδειχθεί ότι η ικανότητα μετασχηματισμού του υπερκειμένου κατοικεί στο DNA, 5 μg καθαρισμένου DNA από το υπερκείμενο SW480 συν-επιμολύνονται με ένα ευκαρυωτικό φορέα pNeo χρησιμοποιώντας λιποφεκταμίνη (ενεργός επιμόλυνση). ιδρύθηκαν πολλαπλές genetecin-ανθεκτικών κλώνων. Μια πισίνα από αυτούς τους κλώνους ήταν σε θέση να σχηματίζουν όγκους σε

ηυ /ηυ

θηλυκά ποντίκια (Σχ. 1 Ε). Αντιστρόφως, «παθητική» επιμόλυνσης χρησιμοποιώντας 5 μg καθαρισμένου DNA (που εξάγεται από κύτταρα υπερκείμενο καλλιέργειας) και προστίθενται καθημερινά για 14 ημέρες σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3) δεν ήταν σε θέση να μετασχηματίσει κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 και επίσης απέτυχαν να μεταφέρουν αλληλουχίες DNA σε κύτταρα-δέκτες (όπως αξιολογείται από PCR των μεταλλαγμένων ανθρώπινης

K-ras

και

Alu Yd6

, δεν φαίνεται).

DNA-εξαντλημένο υπερκείμενο δεν μετατρέπει αθανατοποιημένα κύτταρα ποντικού

έχει αποδειχθεί ότι η άνευ κυττάρου DNA κυκλοφορεί ως ένα σύμπλοκο του DNA /RNA-λιποπρωτεΐνης (virtosome) που αυθόρμητα απελευθερώνεται από τα ζωντανά κύτταρα [29] και αυτό το συγκρότημα θα μπορούσε να προστατεύσει το DNA από το να αποδομείται από την κυκλοφορούσα νουκλεάσες. Για να διερευνηθεί αυτό, φρέσκο ​​υπερκείμενο κυττάρων SW480 εκτέθηκε σε ϋΝΑση Ι, πρωτεϊνάση Κ, και τα δύο, και στη συνέχεια το DNA εκχυλίστηκε και ηλεκτροφορήθηκε. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι DNAse απέτυχα να αφομοιώσει πλήρως το DNA. Παρομοίως, η έκθεση των υπερκειμένου σε πρωτεϊνάση Κ μόνο ήπια πέψη DNA. Σύκο. Σύκο. Σύκο.