Abstract

καρνοσίνη, ένα φυσικό διπεπτίδιο, έχει καταδειχθεί πρόσφατα ότι διαθέτουν δράση κατά των όγκων. Ωστόσο, υποκείμενος μηχανισμός του είναι ασαφής. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την επίδραση και το μηχανισμό της καρνοσίνης στην βιωσιμότητα των κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό των καλλιεργημένων ανθρώπινων γαστρικού καρκίνου SGC-7901 κύτταρα. θεραπεία καρνοσίνη δεν προκάλεσε κυτταρική απόπτωση ή νέκρωση, αλλά μείωσε την ικανότητα πολλαπλασιασμού του SGC-7901 κύτταρα. Seahorse ανάλυση έδειξε SGC-7901 κύτταρα που καλλιεργήθηκαν με πυροσταφυλικό έχουν ενεργά μιτοχόνδρια, και εξαρτώνται από την μιτοχονδριακή οξειδωτική φωσφορυλίωση περισσότερο από γλυκόλυση οδός για την παραγωγή του ΑΤΡ. Καρνοσίνη μειώθηκε αισθητά την απόλυτη τιμή του μιτοχονδριακού ΑΤΡ-συνδεδεμένων αναπνοή, και μείωσε την μέγιστη κατανάλωση οξυγόνου και ανταλλακτικά αναπνευστική ικανότητα, η οποία μπορεί να μειώσει μιτοχονδριακή λειτουργία συσχετίζεται με πολλαπλασιαστικού δυναμικού. Ταυτόχρονα, καρνοσίνη μείωσε επίσης τον εξωκυτταρικό ρυθμό οξίνισης και γλυκόλυση της ΓΓΕ-7901 κύτταρα. Τα αποτελέσματά μας πρότεινε ότι η καρνοσίνη είναι ένα δυναμικό ρυθμιστή της ενεργειακής μεταβολισμό της ΓΓΕ-7901 κύτταρα, τόσο στην αναερόβια και αερόβια μονοπάτια, και παρείχε μια ένδειξη για την προκλινική και κλινική αξιολόγηση της καρνοσίνης για γαστρικό θεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Shen Υ, Γιανγκ J, Λι J, Shi Χ, Ouyang L, Tian Y, et al. (2014) καρνοσίνη αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των Ανθρωπίνων γαστρικός καρκίνος SGC-7901 κύτταρα μέσω δύο του μιτοχονδριακή αναπνοή και γλυκόλυση Pathways. PLoS ONE 9 (8): e104632. doi: 10.1371 /journal.pone.0104632

Επιμέλεια: Salvatore V. Pizzo, του Πανεπιστημίου Duke Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 14, Φεβρουαρίου, 2014? Αποδεκτές: 15 του Ιούλη 2014? Δημοσιεύθηκε: 12 Αυγούστου 2014

Copyright: © 2014 Shen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81102427), και εν μέρει υποστηρίζεται από τη Zhejiang επαρχιακή επιστημονική Ερευνητικά Ιδρύματα (Y2110322), το Πρόγραμμα για την Zhejiang οδηγώντας την ομάδα του ενισχυτή S &? Τ Καινοτομίας (2010R50048) και Wenzhou City Επιστήμης και Τεχνολογίας του έργου (2010S0094 ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

γαστρικό καρκίνο είναι μία από τις πιο κοινές κακοήθειες του κόσμου. Στις οικονομικώς αναπτυσσόμενες χώρες, γαστρικό καρκίνος είναι η δεύτερη αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται [1], [2]. Παρά τη βελτίωση στην χειρουργική και πολυτροπικών θεραπείας, το συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5-ετών είναι ακόμη χαμηλή (15% έως 35%), λόγω των υψηλών ποσοστών υποτροπής, εισβολή και μετάσταση [3]. Ως εκ τούτου, στο παρόν, για να ανακαλύψουν περισσότερα αποτελεσματικά φάρμακα κατά του όγκου με λιγότερες παρενέργειες είναι απαραίτητη.

L-καρνοσίνη (β-αλανυλ-L-ιστιδίνη) είναι ένα φυσικό διπεπτίδιο που συντίθεται από ενδογενείς καρνοσίνη συνθετάση. Είναι ευρέως κατανεμημένη στον εγκέφαλο των θηλαστικών, των σκελετικών μυών, του στομάχου, των νεφρών, της καρδιάς και του δέρματος [4], [5]. Μέχρι στιγμής, δεν έχουν και πολλά είναι γνωστά σχετικά με την φυσιολογική λειτουργία του, αλλά αρκετά υποθετικό ρόλοι έχουν θεωρηθεί, όπως νευροδιαβιβαστών, αντι-φλεγμονώδη παράγοντα, ελεύθερων ριζών, οργανικό ρυθμιστικό κινητής ρΗ και χηλικό παράγοντα μετάλλου [6], [7]. Έχει αναφερθεί ότι η καρνοσίνη είναι ένας πιθανός θεραπευτικός παράγοντας για τη θεραπεία της νόσου, εγκεφαλικού επεισοδίου, διαβήτης Alzheimer και άλλες ασθένειες των οργάνων των αισθήσεων [8], [9]. Μόλις πρόσφατα, καταδείχθηκε ότι η καρνοσίνη μπορεί επίσης να έχει ένα αντι-ογκογόνο δράση. Για παράδειγμα, η καρνοσίνη έχει αναφερθεί ότι έχουν την ικανότητα να αναστέλλουν την ανάπτυξη κακοηθών γλοιωμάτων [10], και αυτό το αποτέλεσμα μπορεί να προκαλείται από κάποια επιρροή στην γλυκολυτικά μεταβολισμό της ενέργειας, το καλύτερα χαρακτηρισμένο μεταβολική φαινότυπο που παρατηρείται σε καρκινικά κύτταρα, που είναι γνωστή ως Warburg αποτέλεσμα [11 ], [12].

Πρόσφατα, η σημασία των μιτοχονδρίων ως αισθητήρες οξυγόνου, καθώς και οι παραγωγοί της ΑΤΡ έχει γίνει ένα κομβικό σημείο της έρευνας για τον καρκίνο, και μελέτες έχουν δείξει ένα σημαντικό φαινόμενο που μιτοχονδριακό μεταβολισμό, ιδιαίτερα κιτρικό οξύ δραστηριότητα κύκλος είναι σημαντική για την ταχεία διάδοση των πολλαπλών τύπων καρκινικών κυττάρων [13], [14]. Ωστόσο, στην περίπτωση του ανθρώπινου γαστρικού καρκινικών κυττάρων, λίγες πληροφορίες είναι διαθέσιμες σε ποιο βαθμό γλυκόλυση και μιτοχονδριακή οξειδωτική φωσφορυλίωση (OXPHOS) συμβάλλουν στην παραγωγή κυτταρικής ενέργειας και ταχεία διάδοση. Είτε καρνοσίνη μπορεί επίσης να αναστέλλουν την ανάπτυξη των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων γαστρικού παραμένει άγνωστη. Και αν το ανασταλτικό αποτέλεσμα της καρνοσίνης στην ανάπτυξη καρκινικών κυττάρων σχετίζεται επίσης με τη δράση της στη μιτοχονδριακή αναπνοή και OXPHOS παραμένει ασαφής.

Πρόσφατα, η Seahorse Bioscience XF96 Εξωκυττάρια Flux Αναλυτής έχει χρησιμοποιηθεί για την ταυτόχρονη και συνεχή παρακολούθηση τόσο η αερόβια και γλυκολυτικά συστατικά των κυτταρικών βιοενεργητική [15]. Ως εκ τούτου, στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε τις επιδράσεις της καρνοσίνης στην ανάπτυξη του ανθρώπινου γαστρικού καρκινικά κύτταρα και να χαρακτηριστεί περαιτέρω η βιοενεργητική προφίλ καλλιεργημένων ανθρώπινων γαστρικών καρκινικών κυττάρων SGC-7901 και τους ρόλους της καρνοσίνης σε SGC-7901 μεταβολισμό κυττάρων ενέργεια με η ροή Αναλυτής Seahorse Βιοεπιστήμης XF96 Εξωκυττάρια και άλλων συναφών τεχνολογιών.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

L-καρνοσίνη, πυροσταφυλικό νάτριο, ροτενόνη, καρβονυλίου κυανίου p-τριφθορομεθοξυφαινυλο-υδραζόνη (FCCP), αντιμυκίνη Α, 3- [4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ] -2,5-diphenyltetra-zolium βρωμίδιο (ΜΤΤ), μεθανόλη, γαλακτικό οξύ ήταν από την Sigma (St. Louis, ΜΟ, USA). Πενικιλίνη, στρεπτομυκίνη, L-γλουταμίνη, θρυψίνη, μέσο Dulbecco τροποποιημένο Eagle (ϋΜΕΜ), ορό εμβρύου μόσχου ήταν από την GIBCO-BRL (Grand Island, ΝΥ, USA). Αννεξίνη V-FITC /PI κιτ ανίχνευσης απόπτωσης, BCA κιτ Δοκιμασίας Πρωτεΐνης και ATP Assay Kit αγοράστηκαν από Beyotime Ινστιτούτο Βιοτεχνολογίας ((Nanjing, Κίνα). Μέσου δοκιμασίας XF και η λύση βαθμονόμησης XF αγοράστηκαν από Seahorse Bioscience.

καλλιέργειας κυττάρων

ανθρώπινο γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή SGC-7901 (SGC-7901), η κυτταρική γραμμή ηπατοκυτταρικού καρκινώματος ανθρώπινου ήπατος (HepG2) και C6 αρουραίου κυτταρική γραμμή γλοιώματος (C6) αγοράστηκαν από την τράπεζα κυττάρων Σαγκάη Ινστιτούτο, κινεζική Ακαδημία Επιστημών (η αρχική πηγή είναι American Type Culture Collection, ATCC, Manassas, VA, USA). τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 100 U /ml πενικιλλίνη G, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, και διατηρήθηκαν στους 37 ° C και 5% CO

2 σε υγροποιημένο επωαστή. τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν σε αναλογία 1:03 μετά τη συμβολή χρησιμοποιώντας 0,25% θρυψίνη. υποκαλλιεργήθηκαν κύτταρα σπάρθηκαν επάνω σε 96-, 24- ή 6-φρεατίων σε πυκνότητες 2 × 10

3, 5 × 10

4, 2 × 10

5 ή 1 × 10

6 κύτταρα /φρεάτιο, αντίστοιχα.

μείωση ΜΤΤ δοκιμασία

μεταβολική δραστηριότητα των κυττάρων παρακολουθήθηκε με την δοκιμασία ΜΤΤ χρωματομετρική όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]. Εν συντομία, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 96 φρεατίων και υπήρχαν 6 φρεάτια σε κάθε ομάδα. Στο τέλος των πειραμάτων, τα κύτταρα επωάστηκαν με 0,5 mg /ml ΜΤΤ για 4 ώρες στους 37 ° C. Στη συνέχεια, το υπερκείμενο στρώμα αφαιρέθηκε, και 100 μι διμεθυλοσουλφοξειδίου προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. μεταβολισμός ΜΤΤ ποσοτικοποιήθηκε φασματοφωτομετρικά στα 570 nm σε αναγνώστη μικροπλάκας Biorad. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως το ποσοστό της μείωσης ΜΤΤ, λαμβάνοντας την απορρόφηση των κυττάρων ελέγχου ως 100%.

Colony δοκιμασία σχηματισμού

Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων σε πυκνότητα της τάξης των 100-200 κυττάρων ανά φρεάτιο, και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με καρνοσίνης (20 mM). Οι κλώνοι αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 14 ημέρες σε μέσο καλλιέργειας DMEM συμπληρωμένο με 10% FBS, 100 U /ml πενικιλλίνη G, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με 70% αιθανόλη και χρωματίστηκαν με Coomassie Brilliant Blue για την ανάλυση του σχηματισμού αποικιών όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17].

Δοκιμασία κυτταρομετρίας ροής του κυτταρικού θανάτου

Ο κυτταρικός θάνατος προσδιορίσθηκε ποσοτικά με Annexin V-FITC-ΡΙ (ιωδιούχο προπίδιο) διπλή χρώση, χρησιμοποιώντας ένα κιτ ανίχνευσης απόπτωσης Annexin V-FITC, σύμφωνα με την πρόταση του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων σε μέσο DMEM. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 20 mM καρνοσίνης για 48 ώρες και στη συνέχεια συλλέχθηκαν και πλύθηκαν δύο φορές σε παγωμένο PBS, επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης σε πυκνότητα 1 × 10

6 κύτταρα /ml. Τα κύτταρα επωάστηκαν ταυτόχρονα με φλουορεσκεΐνη-σημασμένο αννεξίνης V και ΡΙ για 20 λεπτά και αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. Annexin V-FITC που δημιουργούνται σήματα ανιχνεύθηκαν με έναν ανιχνευτή σήματος FITC (FL1, 525 nm). σήματα ΡΙ παρακολουθήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ανιχνευτή που προορίζεται για εκπομπή φυκοερυθρίνη (FL2, 575 nm). Τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση του λογισμικού Cell Quest από BD.

Εξωκυττάρια Flux Τεχνολογία

Για τη μέτρηση του ρυθμού κατανάλωσης οξυγόνου (OCR) και εξωκυτταρικό ρυθμό οξίνισης (ECAR) των κυττάρων σε διαφορετικές συνθήκες, ένας ιππόκαμπος XF96 εξωκυττάρια Flux Analyzer (Seahorse Bioscience, Billerica, ΜΑ, USA) χρησιμοποιήθηκε. Το μέσο αυτό επιτρέπει την ευαίσθητη μέτρηση της γλυκόλυσης και πολλαπλές παραμέτρους της λειτουργίας των μιτοχονδρίων, συμπεριλαμβανομένων των βασικών OCR, ανταλλακτικά αναπνευστική ικανότητα, μέγιστη OCR, ΑΤΡ-συνδεδεμένη αναπνοή και πρωτονίων διαρροή από προσκολλημένα ανέπαφα καλλιεργημένα κύτταρα. Μετά βασικές μετρήσεις, OCR και ECAR μετρήθηκαν μετά από διαδοχική προσθήκη σε κάθε φρεάτιο 20 μΐ ολιγομυκίνη, FCCP και ροτενόνη, για να φθάσει οι συγκεντρώσεις εργασίας του 1 μg /ml, 1 μΜ και 1 μΜ, αντίστοιχα. Όλες οι δοκιμασίες διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας μία πυκνότητα σποράς 10.000 κύτταρα /φρεάτιο σε 200 μΐ DMEM σε ένα XF96 μικροπλάκας κυτταρικής καλλιέργειας (Seahorse Bioscience). Τα κύτταρα μεταφέρθηκαν σε μη ρυθμισμένο DMEM συμπληρωμένο με 2 mM πυροσταφυλικό νάτριο και 20 mM καρνοσίνη 1 ώρα πριν από την έναρξη της δοκιμασίας και διατηρήθηκε στους 37 ° C. OCR αναφέρεται στη μονάδα του picomoles ανά λεπτό και ECAR αναφέρεται σε μονάδες milli-pH (mph) ανά λεπτό.

Προσδιορισμός της ΑΤΡ

Παραγωγής

Ο προσδιορισμός του ΑΤΡ πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τον κατασκευαστή του εντολή. Εν συντομία, συλλέχθηκαν τα καλλιεργημένα κύτταρα λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης, που ακολουθείται από φυγοκέντρηση στα 10,000 χ g για 2 λεπτά, στους 4 ° C. Τέλος, σε τρυβλία 6 φρεατίων, το επίπεδο της ΑΤΡ προσδιορίσθηκε με ανάμιξη 20 μΐ του υπερκειμένου με 100 μΙ αντιδραστηρίου λουσιφεράσης, η οποία καταλύεται την παραγωγή φωτός από την ΑΤΡ και λουσιφερίνη. Η φωτεινότητα μετρήθηκε με έναν αναγνώστη μικροπλάκας μονοχρωμάτορα. Πρότυπη καμπύλη δημιουργούνται επίσης και η συγκέντρωση πρωτεΐνης της κάθε ομάδας προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης BCA. Τα συνολικά επίπεδα ΑΤΡ εκφράστηκαν ως nmol /mg πρωτεΐνης.

Ανάλυση

HPLC εξωκυτταρικών

γαλακτικό οξύ

Η συγκέντρωση του γαλακτικού οξέος στο υπερκείμενο ελεύθερο κυττάρων μετρήθηκε με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC ) σε συνδυασμό με έναν ανιχνευτή υπεριώδους χρησιμοποιώντας την τεχνική όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Εν συντομία, τα παρασκευασμένα analysates διαχωρίστηκαν σε Ecosil C-18 ανάστροφης στήλης (3 μm, 250 mm × 4,6 mm) με χρησιμοποίηση διαλύτη Α και διαλύτη Β [0,1 mol /l NH

4Η

2 ΡΟ

4 ( ρΗ 3.4) αραιώνεται ν /ν σε μεθανόλη 97:3] με μία ταχύτητα ροής 0,5 ml /min. Η θερμοκρασία της στήλης διατηρήθηκε στους 25 ° C, και το μήκος κύματος του υν ανίχνευση ορίστηκε στα 210 nm.

μεμβράνη μιτοχονδριακού δυναμικού

εκτίμηση

Οι μεταβολές στις σχετικές δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης (Δ

Ψ

m) αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας την λιπόφιλη κατιονική ανιχνευτή JC-1 5,5 ‘, 6,6′-τετραχλωρο-1,1′, 3,3’-τετρααιθυλο-benzamid ιωδιούχο azolocarbocyanine (JC-1? Molecular Probes). Η χρωστική JC-1 υποβάλλεται σε μια αντιστρεπτή μεταβολή στην εκπομπή φθορισμού από πράσινο σε πρασινωπό πορτοκαλί ως Δ

Ψ

m αυξήσεις. Κύτταρα με υψηλή Δ

μορφής Ψ

m JC-1 αδρανών υλικών και φθορίζουν κόκκινο? τα άτομα με χαμηλό Δ

Ψ

m περιέχουν μονομερή JC-1 και φθορίζουν πράσινο. Μετά τη θεραπεία με καρνοσίνη για 48 ώρες, το μέσο καλλιέργειας απομακρύνθηκε και τα κύτταρα, που καλλιεργούνται σε καλυπτρίδες, επωάστηκαν στο σκοτάδι με JC-1 σε μία τελική συγκέντρωση 2 μΜ για 20 λεπτά. Τα κύτταρα ξεπλύθηκαν με PBS δύο φορές και συγκινημένος στα 488 nm με την Olympus ΒΧ-51 μικροσκόπιο φθορισμού.

αντίγραφο του μιτοχονδριακού DNA μέτρησης του αριθμού των

Απόλυτη μιτοχονδριακού DNA αντίγραφο αριθμό μετρήθηκε με τη σύγκριση των PCR ενίσχυση ενός μιτοχόνδρια amplicon [άνθρωπο, NADH-ουβικινόνη αλυσίδα οξειδοαναγωγάσης 4 (ND4)] με ένα πυρηνικό αμπλικονίου (ανθρώπινο, β-ακτίνη) από DNA που απομονώθηκε χρησιμοποιώντας κιτ Qiagen DNA mini. Primer αλληλουχίες είναι ως εξής: ανθρώπινη β-ακτίνης (προς τα εμπρός: 5′-ACCCACACTGTGCC CATCTAC-3 ‘? Αντίστροφος: 5′-TCGGTGAGGATCTTCATGAGGTA-3′)? ανθρώπινο ND4 (εμπρός: 5’-TCCTCCTATCCCTCAACCCC-3 ‘? αντίστροφη: 5′-CACAATCTGATGTTTT GGTTAAAC-3’). DNA εκμαγεία παρασκευάστηκαν από περιοχές που εκτείνονται σε κάθε αμπλικόνιο με ενίσχυση PCR. Οι αραιώσεις από 1 × 10

8 μέχρι 1 × 10

2 αντίγραφα του απομονωμένου DNA χρησιμοποιήθηκαν για να δημιουργήσουν μια πρότυπη καμπύλη για ποσοτικό προσδιορισμό. Οι συνθήκες των κύκλων PCR συνίστατο από ένα στάδιο ενεργοποίησης στους 95 ° C για 30 δευτερόλεπτα, ακολουθούμενη από 40 κύκλους για 5 sec στους 95 ° C και 30 sec στους 58 ° C. Όλες οι PCR διεξήχθησαν σε Bio-Rad CFX Διευθυντής Real-Time PCR System (Applied Biosciences).

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τρία ή περισσότερα ανεξάρτητα πειράματα. Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SD. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με SPSS 11.5 για Windows. Μονόδρομη ANOVA (ανάλυση διακύμανσης) ακολουθούμενη από LSD (ελάχιστη σημαντική διαφορά) ή Τ3 του Dunnett

post-hoc

δοκιμή (όπου οι ίσες διακυμάνσεις δεν υποτεθεί) εφαρμόστηκε για πολλαπλές συγκρίσεις, ενώ έλεγχος τ ήταν χρησιμοποιείται για συγκρίσεις μεταξύ των δύο ομάδων.

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Επίδραση της καρνοσίνης στη ΓΓΕ-7901 κύτταρα βιωσιμότητα

Για να προσδιοριστεί η επίδραση της καρνοσίνης στο. ανθρώπινο γαστρικό καρκίνο SGC-7901 κύτταρα βιωσιμότητα, χρησιμοποιήθηκε ανάλυση αναγωγής ΜΤΤ. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία καρνοσίνη μείωσε σημαντικά την κυτταρική βιωσιμότητα σε χρόνο και τη συγκέντρωση-εξαρτώμενο τρόπο. Καρνοσίνη σε συγκεντρώσεις 5 και 20 mM μείωσε σημαντικά την κυτταρική βιωσιμότητα σε 84,0% και 57,9% του ελέγχου στις 24 ώρες, και σε 73,5% και 45,9% του ελέγχου στις 48 ώρες, αντίστοιχα (Εικ. 1Α). Ωστόσο, καρνοσίνη σε συγκέντρωση 1 mM δεν επηρέασε SGC-7901 κύτταρα βιωσιμότητα σε 24 ή 48 ώρες. Χρησιμοποιήσαμε περαιτέρω κυτταρομετρία ροής για να προσδιοριστεί αν θα μπορούσε να προκαλέσει καρνοσίνη SGC-7901 νέκρωση κυττάρου ή απόπτωση. Παραδόξως, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία καρνοσίνη για 48 ώρες δεν προκάλεσε νεκρωτικό ή αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε SGC-7901 κυττάρων (Σχ. 1Β). Επειδή η μείωση ΜΤΤ επίσης ερμηνεύεται να είναι ενδεικτική κυτταρικού μεταβολική δραστηριότητα, και η αξία ΜΤΤ ενός πληθυσμού κυττάρου προσδιορίζεται τόσο από τον αριθμό των βιώσιμων κυττάρων που υπάρχουν και τη σχετική μεταβολική ποσοστά τους, έτσι δίπλα για τον υπολογισμό του αριθμού των κυττάρων σε ένα παράλληλο πείραμα με τον ίδιο τρόπο αντιμετωπίζονται SGC-7901 κύτταρα χρησιμοποιώντας πλάκα καταμέτρηση των κυττάρων. Βρήκαμε ότι ο αριθμός των κυττάρων σε καρνοσίνης αγωγή για 48 ομάδα h ήταν παρόμοια με εκείνη στην ομάδα ελέγχου (Εικ. 1C), δείχνοντας έτσι ότι η μειωμένη κυτταρική βιωσιμότητα που επάγεται από θεραπεία καρνοσίνη για 48 ώρες σε SGC-7901 κυττάρων οφείλεται σε μεταβολικές αλλαγές αλλά δεν οφείλεται σε κυτταρικό θάνατο ή τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων.

(Α) τα κύτταρα προ-επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις καρνοσίνη για 24 ή 48 ώρες, και στη συνέχεια η κυτταρική βιωσιμότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ αναγωγή. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως ποσοστό ελέγχου, και ήταν έδειξε μέση τιμή ± SD. n = 10-12.

** P

& lt? 0,01 έναντι του ελέγχου σε 24 ώρες ομάδας?

##

P

& lt? 0,01 έναντι του ελέγχου σε 48 ώρες ομάδας. (Β) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 20 mM καρνοσίνης για 48 ώρες και στη συνέχεια θάνατο των κυττάρων προσδιορίστηκε με ΡΙ και αννεξίνης χρώση V-FITC που ακολουθείται από κυτταρομετρία ροής. (C) SGC-7901 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 20 mM καρνοσίνη και ο συνολικός αριθμός των κυττάρων υπολογίστηκε μετά από θεραπεία καρνοσίνης για 2, 3, 4, 5, 6 ημέρες χρησιμοποιώντας πλάκα μέτρησης κυττάρων. Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SD. n = 6.

** P

& lt?. 0,01 έναντι του ελέγχου

Η

Για να επαληθευτεί αν οι ενέργειες της καρνοσίνης υπάρχουν και σε άλλα καρκινικά κύτταρα, χρησιμοποιήθηκαν HepG2 και C6 κύτταρα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι 20 mM καρνοσίνη θεραπεία για 48 ώρες δεν προκάλεσε κυτταρικό θάνατο (Πίνακας. S1) ή τον πολλαπλασιασμό, αλλά εμφανώς μειωμένη ΜΤΤ μείωση της δραστηριότητας, τόσο σε κύτταρα HepG2 και C6 (Εικ. S1).

Choronic θεραπεία με καρνοσίνη ανέστειλε SGC-7901 σχηματισμός κυττάρων αποικίες

για να εξεταστεί εάν η έκθεση σε choronic καρνοσίνη μπορούσαν να επηρεάσουν την ικανότητα πολλαπλασιασμού του SGC-7901 κύτταρα, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε χαμηλή πυκνότητα (100-200 κύτταρα /φρεάτιο) και αφήνονται να σχηματίσουν αποικίες για 14 ημέρες σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 20 mM καρνοσίνης. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2, choronic έκθεση σε σχηματισμό καρνοσίνης μειώνονται οι αποικίες σε 39,9% του ελέγχου.

(Α) Εκπρόσωπος εικόνες των φρεατίων κλωνοποίησης. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε χαμηλή πυκνότητα σε ϋΜΕΜ συμπλήρωμα με ή χωρίς καρνοσίνης (20 mM) για 14 ημέρες. Οι αποικίες στη συνέχεια μονιμοποιήθηκαν με 70% αιθανόλη και χρωματίστηκαν με Coomassie Brilliant Blue για την ανάλυση του σχηματισμού αποικιών. (Β) Ποσοτική ανάλυση εικόνας των αποικιών σε καλλιεργημένα κύτταρα SGC7901. Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SD. n = 6.

** P

& lt?. 0,01 vs. ομάδα ελέγχου

Η

Βιοενεργειακό χαρακτηρισμός των καλλιεργημένων SGC-7901 κύτταρα

Ερευνήσαμε τις OCRs και ECAR σε καλλιεργημένα SGC-7901 κύτταρα χρησιμοποιώντας ένα εξωκυτταρικό αναλυτή ροής ιππόκαμπος XF-96, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Basal κυτταρική OCR και ECAR βρέθηκαν να είναι 161,02 ± 29,58 pmol /min ανά 10 × 10

3 κύτταρα (αρχική μέτρηση κυττάρων), και 39,31 ± 4,29 mpH /min ανά 10 × 10

3 κύτταρα αντίστοιχα (Σχ. 3Α). Η ΑΤΡ-συνδεδεμένη αναπνοή (το συνολικό βασικό ρυθμό μείον το ποσοστό με ολιγομυκίνη, όπου ολιγομυκίνης είναι ένας αναστολέας της σύνθεσης ΑΤΡ) ήταν 96,15 ± 18,34 pmol /min ανά 10 × 10

3 κύτταρα, υποδεικνύοντας ότι ~ 60% του κυτταρικού οξυγόνο κατανάλωση σχετιζόταν με ATP σύνθεση. Ταυτόχρονα ECAR αυξήθηκε σε -250% των ποσοστών βασικής γραμμής σε παρουσία μέγιστη αποτελεσματική δόση της ολιγομυκίνη (1 μg /ml), υποδεικνύοντας ότι τα κύτταρα μετατοπίζονται μιτοχονδριακή αναπνοή σε γλυκόλυση. Ροτενόνη (1 μΜ) μείωσε OCR σε 55.78 ± 8.86 pmol /min ανά 10 × 10

3 κύτταρα (~ 35% των συντελεστών βάσης). Το ποσοστό ροτενόνη ανθεκτικά αντανακλά την μη-μιτοχονδριακή ρυθμού αναπνοής, η οποία περιλαμβάνει την οξείδωση του υποστρώματος και την κατανάλωση οξυγόνου κυτταρικής επιφάνειας [19]. Έτσι, τα μη μιτοχονδριακή αναπνοή αντιπροσώπευαν -35%, ενώ μιτοχονδριακή αναπνοή αντιπροσώπευαν -65% της συνολικής κυτταρικής αναπνοής. Έτσι, σε καλλιεργημένα SGC-7901 κύτταρα ~92% (60% /65%) της μιτοχονδριακής αναπνοής συζεύχθηκε με σύνθεση ΑΤΡ και ~ 8% των μιτοχονδριακή αναπνοή οφειλόταν σε πρωτόνιο διαρροή (Σχ. 3Β). Με την παρουσία του μεγίστως αποτελεσματική δόση του FCCP (1 μΜ, μια αποσύζευξη παράγων που επιτρέπει τη μεταφορά μέγιστης ηλεκτρονίων,), παρατηρήθηκε μία ταυτόχρονη αύξηση OCR, και αυξήθηκε σε 204 ± 30,24 pmol /min ανά 10 × 10

3 κύτταρα.

(Α) σε πραγματικό χρόνο ανάλυση των ποσοστών κατανάλωσης οξυγόνου (OCR) και εξωκυττάριο ποσοστά οξίνισης (ECAR) των καλλιεργημένων SGC-7901 κύτταρα διαταράσσοντας τους με μικρό μόριο μεταβολικές ρυθμιστές. Ολιγομυκίνη (O? 1 μg /ml), καρβονύλ κυανιούχο ρ-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP? F? 1 μΜ), οξαμικό (Οχ? 100 mM), και ροτενόνη (R? 1 μΜ) ενέθηκαν διαδοχικά στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία σε κάθε και περιέχει SGC-7901 κυττάρων μετά από μέτρηση του ρυθμού βασικής γραμμής. Κάθε αντιπροσωπεύει την μέση ± SD. n = 17. (Β) Ποσοτική ανάλυση εικόνας της οπτικής αναγνώρισης χαρακτήρων σε καλλιεργημένα SGC-7901 κύτταρα. Βασικό, ενδογενή ρυθμό? Ολιγομυκίνης, ΑΤΡ-συνθάση-ανέστειλε ρυθμό? FCCP, μέγιστη αποσυνδεθεί ποσοστό? και Ροτενόνη, ποσοστό ροτενόν-αναστέλλεται. (C) Βασικός ρυθμός παραγωγής ECAR και πρωτονίων από μετρήσεις που λαμβάνονται σε συνδυασμό με τα ποσοστά αναπνοή. (D) ΑΤΡ ποσοστό παραγωγής από την οξειδωτική φωσφορυλίωση και τη γλυκόλυση.

Η

Είμαστε αξιολόγησε επίσης τη σχετική συμβολή της γλυκόλυσης και OXPHOS στο ρυθμό παραγωγής ATP στο SGC-7901 κύτταρα. Απόλυτη ποσοτικούς προσδιορισμούς τόσο του ρυθμού γλυκόλυσης και ολιγομυκίνη ευαίσθητα ρυθμός κατανάλωσης οξυγόνου μετρήθηκαν σε SGC-7901 κύτταρα. Το εξωκυτταρικό ρυθμό οξίνισης οφείλεται κυρίως σε γαλακτικό και όξινο ανθρακικό παραγωγής και, όταν βαθμονομηθεί ως ο ρυθμός παραγωγής πρωτόνιο, δείχνει γλυκολυτικά ποσοστό [15]. Έτσι, χρησιμοποιήθηκε για να αναστείλει οξαμικό γαλακτικής αφυδρογονάσης, που μετατρέπει πυροσταφυλικού σε γαλακτικό κατά το τελευταίο στάδιο της γλυκόλυσης, για τον υπολογισμό του ρυθμού παραγωγής πρωτονίων (Σχ. 3C). Υπάρχει μια σχέση ένα-προς-ένα μεταξύ του ρυθμού παραγωγής γαλακτικού και ΑΤΡ ρυθμό παραγωγής από γλυκόλυση. Η κατανάλωση οξυγόνου ολιγομυκίνη ευαίσθητα μετατράπηκε στο ΑΤΡ ρυθμού παραγωγής χρησιμοποιώντας μια αναλογία Ρ /Ο από 2,3 [20]. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι SGC-7901 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ (υψηλή γλυκόζη) συμπληρωμένο με 2 mM πυροσταφυλικού γίνονται τουλάχιστον 93% του ΑΤΡ τους χρησιμοποιώντας OXPHOS (Σχ. 3D).

καρνοσίνη άλλαξε την βιοενεργητική χαρακτηρισμό ΓΓΕ- 7901 κύτταρα

Εμείς ερεύνησε τις επιπτώσεις της καρνοσίνης στο ρυθμό κατανάλωσης οξυγόνου και εξωκυτταρικό ρυθμό οξίνισης σε καλλιεργημένα SGC-7901 κύτταρα. Τα αποτελέσματα στο Σχ. 4 έδειξαν ότι η θεραπεία με 20 mM καρνοσίνης για 48 ώρες μείωσε το βασικό OCR και ECAR σε 141,13 ± 27,06 pmol /min ανά 10 × 10

3 κύτταρα (-87% του ελέγχου), και 11,32 ± 2,49 mpH /min ανά 10 × 10

3 κύτταρα (~27% του ελέγχου), αντίστοιχα (Σχ. 4Α, Β). Η ΑΤΡ-συνδεδεμένη αναπνοή, διαρροή πρωτόνιο, και μη-μιτοχονδριακή ρυθμός αναπνοής ήταν 81,03 ± 17,97, 7,15 ± 3,6, και 52,96 ± 8,40 pmol /min ανά 10 × 10

3 κύτταρα, αντίστοιχα (Σχ. 4C, D, E ). Έτσι, σε καρνοσίνη αγωγή SGC-7901 κύτταρα, μιτοχονδριακή αναπνοή αντιπροσώπευαν ~62% της συνολικής κυτταρικής αναπνοής, και ~92% (57% /62%) της μιτοχονδριακής αναπνοής συζεύχθηκε με σύνθεση ΑΤΡ και ~ 8% των μιτοχονδριακή αναπνοή ήταν λογιστικοποιούνται με διαρροή πρωτονίων. Ως εκ τούτου, η θεραπεία καρνοσίνη μείωσε την απόλυτη τιμή του ΑΤΡ-συνδεδεμένων αναπνοή, αλλά δεν επηρέασε τη σχετική ποσοστό συνεισφοράς του ΑΤΡ-συνδεδεμένων αναπνοή, διαρροή πρωτόνιο, και μη μιτοχονδριακή αναπνοή με τη συνολική κυτταρική αναπνοή. Επιπλέον, βρήκαμε επίσης ότι η θεραπεία με καρνοσίνη μείωσε σημαντικά τη μέγιστη OCR και ανταλλακτικά αναπνευστική ικανότητα 161.60 ± 28.46 pmol /min ανά 10 × 10

3 κύτταρα (~79% του ελέγχου) και 20,47 ± 6,92 pmol /min ανά 10 × 10

3 κύτταρα (~47% του ελέγχου) (Εικ. 4F, G).

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε μικροπλάκες εξειδικεύεται και καλλιεργήθηκαν με ή χωρίς καρνοσίνης (20 mM) για 48 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια άλλαξαν σε μη ρυθμισμένο DMEM συμπληρωμένο με 2 mM πυροσταφυλικό νάτριο και 20 mM καρνοσίνη, και μιτοχονδριακή λειτουργία εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας διαδοχική έγχυση ολιγομυκίνη, FCCP, και ροτενόνη. (Α) Βασική OCR, (Β) Βασική ECAR, (C) ΑΤΡ-συνδεδεμένη OCR, (D) πρωτονίων διαρροή, (Ε) μη μιτοχονδριακή OCR (μη-Mito), (F) μέγιστη OCR, και (G) ανταλλακτικά ικανότητα φαίνονται. Τα αποτελέσματα είναι μέσα ± SD. n = 6-9.

* P

& lt? 0,05?

** P

& lt? 0,01 vs. ομάδα ελέγχου

Η

HepG2 και C6 κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν επίσης για την περαιτέρω επαλήθευση των επιπτώσεων της καρνοσίνης στο μεταβολισμό των καρκινικών κυττάρων ενέργειας.. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι 20 mM καρνοσίνη θεραπεία για 48 ώρες μείωσε σημαντικά το OCR βασική και ECAR των κυττάρων HepG2 και C6, αντίστοιχα. Επιπλέον καρνοσίνη μείωσε επίσης ΑΤΡ-συνδεδεμένη αναπνοή σε κύτταρα C6, αλλά όχι σε κύτταρα HepG2 (εικ. S2). Ωστόσο, 20 mM καρνοσίνη μείωσε σημαντικά το κυτταρικό περιεχόμενο ΑΤΡ τόσο σε κύτταρα HepG2 και C6, υποδεικνύοντας ότι η αναστολή γλυκόλυση συμμετείχε στη δράση της καρνοσίνης, τουλάχιστον σε κύτταρα HepG2 (εικ. S2J).

καρνοσίνη μειώθηκε εξωκυτταρικό γαλακτικό οξύ επίπεδο σε καλλιεργημένα SGC-7901 κύτταρα

Επειδή καρνοσίνη είναι ένα κινητό οργανικό ρυθμιστικό pH, το εξωκυτταρικό ρυθμό οξίνισης προσδιορίστηκαν στην παρούσα της καρνοσίνης χρησιμοποιώντας το Seahorse XF96 εξωκυττάρια Flux αναλυτής δεν μπορεί να αντανακλά το πραγματικό ποσοστό γλυκόλυση. Γι ‘αυτό και χρησιμοποιείται επίσης HPLC για να προσδιοριστεί το επίπεδο εξωκυττάριο γαλακτικό οξύ για να ελέγξει την επίδραση της καρνοσίνης στη γλυκόλυση σε SGC-7901 κύτταρα. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η θεραπεία με καρνοσίνη μείωσε σημαντικά το επίπεδο εξωκυτταρικό γαλακτικό οξύ έως 84% του ελέγχου (Εικ. 5), υποδεικνύοντας ότι η καρνοσίνη έχει δυνατότητα ανασταλτική επίδραση επί της γλυκολύσεως σε καλλιεργημένα SGC-7901 κύτταρα.

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 48 ώρες σε DMEM με ή χωρίς καρνοσίνης (20 mM). Το υπερκείμενο συλλέχθηκε για ανάλυση HPLC του γαλακτικού οξέος. Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SD. n = 6.

** P

& lt?. 0,01 vs. ομάδα ελέγχου

Η

Η καρνοσίνη αλλάξει τη σχετική συμβολή της γλυκόλυσης και OXPHOS με χρέωση ΑΤΡ στο SGC-7901 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε DMEM έλλειψη του πυροσταφυλικού

χαρακτηριζόμενη επίσης την επίδραση της καρνοσίνης σχετικά με τις αλλαγές του περιεχομένου ΑΤΡ και η σχετική συμβολή της γλυκόλυσης και OXPHOS να φορτίο ΑΤΡ σε SGC-7901 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε DMEM έλλειψη του πυροσταφυλικού. Εμείς μετρούμενη συγκέντρωση κυτταρική ΑΤΡ στα κύτταρα εκτέθηκαν για 45 λεπτά σε έξι προϋποθέσεις: όχημα, τον αναστολέα γλυκόλυσης 2-DG, FCCP, ροτενόνη, FCCP συν ροτενόνη, και 2-DG συν FCCP συν ροτενόνη. Βρήκαμε ότι η θεραπεία καρνοσίνη για 48 ώρες μείωσε σημαντικά το περιεχόμενο ΑΤΡ σε 62% του ελέγχου. 2-DG θεραπεία μείωσε σημαντικά το περιεχόμενο ΑΤΡ κατά 48% και 34% σε καρνοσίνη απουσιάζει και καρνοσίνη παρούσα ομάδες σε σύγκριση με τις δικές τους ομάδες οχήματος, αντίστοιχα. FCCP και FCCP συν ροτενόνη κάθε επίσης μείωσε σημαντικά το περιεχόμενο ΑΤΡ κατά 15% και 18% σε καρνοσίνης απούσα ομάδα. Ωστόσο, τα φάρμακα αυτά δεν επηρέασαν ΑΤΡ περιεχόμενο σε καρνοσίνης παρούσα ομάδα. Ροτενόνη δεν επηρέασε ΑΤΡ περιεχόμενο τόσο στην καρνοσίνη απουσιάζει ή υπάρχει ομάδες. 2-DG σε συνδυασμό με FCCP και ροτενόνη εξαλειφθεί ουσιαστικά η παραγωγή ΑΤΡ τόσο στις δύο ομάδες (Εικ. 6). Έτσι 2-DG μειώθηκε ΑΤΡ χρεώνουν περισσότερο από ό, τι FCCP ή ροτενόν έκαναν τόσο στην καρνοσίνη απούσα και να παρουσιάσει τις ομάδες. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι βάρδιες ATP γενιά από OXPHOS σε γλυκόλυση, όταν μιτοχονδριακή λειτουργία είναι διαταραγμένη. χρέωση ΑΤΡ δεν διατηρείται πλήρως μετά την αναστολή είτε γλυκόλυση ή λειτουργία των μιτοχονδρίων στην καρνοσίνης απούσα ομάδα, ενώ ΑΤΡ φορτίο διατηρείται μετά την αναστολή της λειτουργίας των μιτοχονδρίων σε καρνοσίνης παρούσα ομάδα. Έτσι, η θεραπεία καρνοσίνη μεταβάλλεται η σχετική συμβολή του OXPHOS και γλυκόλυση σε ΑΤΡ ρυθμού παραγωγής σε SGC-7901 κύτταρα.

επίπεδο Η ενδοκυτταρική ΑΤΡ μετρήθηκε σε απόκριση σε γλυκόλυση αναστολέα 2-δεοξυγλυκόζης (2-DG, 100 mM), μιτοχονδριακή αποσυζεύκτη FCCP (1 μΜ), και συμπλόκου Ι αναστολέα ροτενόνη (1 μΜ) αγωγή για 45 λεπτά, μεμονωμένα ή σε συνδυασμό, όπως φαίνεται, σε καλλιεργημένα κύτταρα SGC7901 με ή χωρίς καρνοσίνης (20 mM) θεραπεία για 48 ώρες. επίπεδο ΑΤΡ εκφράστηκε ως% του ελέγχου, η οποία ορίστηκε ως η αρχική τιμή στα κύτταρα που εκτίθενται μόνο σε όχημα. Κάθε αντιπροσωπεύει την μέση ± SD. n = 6.

** P

& lt? 0,01 έναντι του οχήματος σε καρνοσίνης απούσα ομάδα,

## P

& lt? 0,01 έναντι του οχήματος σε καρνοσίνης απούσα ομάδα,

& amp? P

& lt? 0,05,

& amp? & amp? P

& lt?. 0,01 έναντι του οχήματος σε καρνοσίνη παρούσα ομάδα

Η

Επίδραση του πυροσταφυλικού σχετικά με το ανασταλτικό δράση της καρνοσίνης στη ΓΓΕ-7901 κυττάρων μιτοχονδριακή λειτουργία

για να διερευνηθεί κατά πόσο η αύξηση του επιπέδου του πυροσταφυλικού μπορεί να αντιστρέψει το ανασταλτικό αποτέλεσμα της καρνοσίνης στη μιτοχονδριακή αναπνοή της ΓΓΕ-7901 κύτταρα, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις του πυροσταφυλικού. Όπως φαίνεται στον Πίνακα. 1, αυξάνοντας το επίπεδο του πυροσταφυλικού δεν μπορούσε να αντιστρέψει το ανασταλτικό αποτέλεσμα της καρνοσίνης επί SGC-7901 κύτταρα μιτοχονδριακή αναπνοή. Επιπλέον, ο προσδιορισμός ΜΤΤ έδειξε επίσης ότι η αύξηση του επιπέδου του πυροσταφυλικού δεν μπορούσε να αντιστρέψει τη δράση καρνοσίνη για SGC-7901 κύτταρα μιτοχονδριακό μεταβολισμό (Εικ. 7).

(Α) Αλλαγές στο JC-1 φθορισμού με καρνοσίνη θεραπείας σε καλλιεργημένα SGC-7901 κύτταρα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με καρνοσίνης (20 mM) για 48 ώρες και στη συνέχεια βάφτηκαν με JC-1. Κόκκινο φθορισμού δείχνει μια πολωμένη κατάσταση και πράσινο φθορισμό δηλώνει αποπολωμένα κατάσταση. μπαρ κλίμακας: 20 μm. (Β) του μιτοχονδριακού DNA αριθμού αντιγράφων σε ΓΓΕ-7901 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με ή χωρίς καρνοσίνης.

Η

Επιδράσεις της καρνοσίνης στο μιτοχονδριακό DNA περιεχόμενο και το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης σε ΓΓΕ-7901 κύτταρα

μιτοχονδριακή μεμβράνη δυναμικό (Δ

Ψ

m) αντιπροσωπεύει το μεγαλύτερο μέρος του πρωτονίου-κινητήρια δύναμη που χρησιμοποιείται για την οδήγηση σύνθεση ΑΤΡ και ως εκ τούτου έχει ένα σημαντικό ρόλο στη μέγιστη ικανότητα παραγωγής ΑΤΡ [21]. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιήσαμε επίσης την λιπόφιλες κατιονικές ανιχνευτή JC-1 για να διερευνήσει κατά πόσον καρνοσίνη καταστέλλει OXPHOS μέσω καταστολής του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης (Δ

Ψ

m). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία καρνοσίνη για 48 ώρες δεν θα μπορούσε να προκαλέσει μια προφανή αλλαγή του Δ

Ψ

m σε καλλιεργημένα SGC-7901 κυττάρων (Σχ. 8Α).

SGC-7901 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με αυξανόμενες δόσεις του πυροσταφυλικού (2, 4, 6 mM) παρουσία ή απουσία της καρνοσίνης (20 mM) για 48 ώρες, και στη συνέχεια τα κύτταρα μιτοχονδριακό δραστηριότητα του μεταβολισμού μετρήθηκε με δοκιμασία αναγωγής του ΜΤΤ. Τα αποτελέσματα είναι μέσες ± SD. n = 8-16.

** P

& lt?. 0,01 vs. ομάδα ελέγχου

Η

Για να αντιμετωπιστεί η φαινομενικά μειωμένη μιτοχονδριακή αναπνοή που προκαλείται από καρνοσίνης, έχουμε ποσοτικά επίσης την απόλυτη μιτοχονδριακό DNA (mtDNA) τον αριθμό, τα οποία ρυθμίζεται αυστηρά για τη διατήρηση της κυτταρικής απαιτήσεις ενέργειας [22]. Προς έκπληξή μας, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου, οι απόλυτοι mtDNA αντιγράψετε αριθμούς των 7901 κυττάρων καρνοσίνη που έλαβαν θεραπεία με σημαντικά αυξημένη, και οι μέσες απόλυτες mtDNA αντιγράψετε αριθμούς ήταν 141,49 ± 7,42 στα κύτταρα ελέγχου και 360,0 ± 59,84 στη καρνοσίνη κατεργασμένα κύτταρα (Εικ. 8Β).

Συζήτηση

Για τις γνώσεις μας, αυτή είναι η πρώτη έκθεση της βιοενεργειακό προφίλ των καλλιεργημένων SGC-7901 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με και χωρίς καρνοσίνης. κύρια ευρήματά μας έχουν ως εξής. Πρώτον, καρνοσίνη μείωσε την πολλαπλασιαστική ικανότητα των SGC-7901 κύτταρα. Δεύτερον, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ (υψηλή γλυκόζη) συμπληρωμένο με 2 mM πυροσταφυλικού κατασκευασμένο ~93% του ΑΤΡ τους χρησιμοποιώντας OXPHOS. Τρίτον, καρνοσίνη εξασκείται ανασταλτική επίδρασή της στην SGC-7901 κύτταρα πολλαπλασιασμού μέσω αναστολής της γλυκόλυσης, OXPHOS και μιτοχονδριακή αναπνοή των κυττάρων, και αυτές οι δράσεις της καρνοσίνης βρέθηκαν επίσης σε κύτταρα HepG2 και C6. Έτσι, καρνοσίνη θα πρέπει να θεωρείται μαζί με το αυξανόμενο οπλισμός των ενώσεων σε διάφορα στάδια της ανάπτυξης φαρμάκων που στοχεύουν το μεταβολισμό του όγκου, ένα από τα βασικά χαρακτηριστικά της όγκου [23].

Λόγω του ευρέως φάσματος δραστηριότητας, καρνοσίνη μπορεί να considerded ως θεραπευτικό παράγοντα για την θεραπεία πολλών ασθενειών. Για παράδειγμα, ψευδάργυρος καρνοσίνη έχει χρησιμοποιηθεί για γαστρικό υγεία και για την επισκευή του εντέρου [24]. Πρόσφατα, μελέτες έδειξαν μετασχηματισμένα κύτταρα δεν αναπτύχθηκαν σε ΜΕΜ που περιέχει υψηλές συγκεντρώσεις καρνοσίνη, και καρνοσίνη μπορεί να χορηγηθεί ως φάρμακο ίη νίνο για να αναστέλλουν την ανάπτυξη των κακοηθών κυττάρων [25]. Ωστόσο, έπρεπε να τεθεί το ερώτημα εάν καρνοσίνη μπορεί να εμποδίσει την ανάπτυξη του ανθρώπινου γαστρικού καρκινικά κύτταρα εκτός από τα κακοήθη κύτταρα που έχουν αναφερθεί προηγουμένως.