Αφηρημένο

ινοβλαστών-όπως στρωματικά κύτταρα ρυθμίζουν τα καρκινικά κύτταρα μέσω εκκρίνονται παράγοντες και την πρόσφυση, αλλά τα στοιχεία αυτά δεν είναι πλήρως κατανοητοί. Εδώ, έχουμε εντοπίσει κρίσιμοι παράγοντες στρωματικά που ρυθμίζουν την ανάπτυξη του καρκίνου θετικά και αρνητικά. Χρησιμοποιώντας ένα σύστημα κυτταρικής συγκαλλιέργειας, βρήκαμε ότι η γαστρική στρωματικά κύτταρα εκκρίνεται IL-6 ως ανάπτυξη και παράγοντας επιβίωσης για γαστρικά καρκινικά κύτταρα. Επιπλέον, γαστρικό καρκίνο κύτταρα εκκρίνεται PGE2 και TNFa που διεγείρεται έκκριση IL-6 από τα στρωματικά κύτταρα. Επιπλέον, βρήκαμε ότι τα στρωματικά κύτταρα εκκρίνεται αφυδρογονάσης 3-φωσφορικής γλυκεραλδεΰδης (GAPDH). Εξωκυτταρική GAPDH, ή Ν-τερματικό τομέα του, ανέστειλε την γαστρική ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, ένα εύρημα επιβεβαιώθηκε σε άλλα συστήματα κυττάρων. GAPDH δεσμεύεται να E-cadherin και μειωτικά της κινάσης mTOR-p70S6. Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι τα στρωματικά κύτταρα μπορεί να ρυθμίζουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων μέσω της ισορροπία αυτών των παραγόντων που εκκρίνονται. Προτείνουμε ότι η αρνητική ρύθμιση της ανάπτυξης του καρκίνου, χρησιμοποιώντας GAPDH θα μπορούσε να είναι μια νέα στρατηγική για την καταπολέμηση του καρκίνου

Παράθεση:. Kawada Μ, Inoue Η, Ohba S-i, Yoshida J, Masuda Τ, Yamasaki Μ, et al. (2015) στρωματικά κύτταρα θετικά και αρνητικά Ρυθμίζουν την ανάπτυξη των κυττάρων του καρκίνου: Διέγερση μέσω του PGE2-ΤΝΡα-IL-6 Pathway και αναστολή μέσω εκκρινόμενη GAPDH-Ε-καδερίνης αλληλεπίδραση. PLoS ONE 10 (3): e0119415. doi: 10.1371 /journal.pone.0119415

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Hiroshi Shiku, Mie Πανεπιστημίου Graduate School of Medicine, Ιαπωνία

Ελήφθη: 2 Οκτώβρη, 2014? Αποδεκτές: 13η Ιανουαρίου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 18 Μάρτη του 2015

Copyright: © 2015 Kawada et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από MEXT KAKENHI Grant Αριθμός 23112522. Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία της το χειρόγραφο

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Τα Εισαγωγή

ιστούς όγκων που αποτελούνται από καρκινικά κύτταρα και γύρω από το στρώμα. Το στρώμα περιλαμβάνει διάφορους τύπους κυττάρων ενσωματωμένα σε μια μήτρα, όπως τα μακροφάγα, ενδοθηλιακά κύτταρα, κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος, και στρωματικά κύτταρα που ομοιάζουν με ινοβλάστη [1, 2]. Τα στρωματικά κύτταρα επιδεικνύουν φαινοτυπική πλαστικότητα την αλλαγή μεταξύ ινοβλαστικά και μυοϊνοβλαστικά χαρακτηριστικά [3, 4]. Μυοϊνοβλαστών που εκφράζουν βιμεντίνη και λείου μυός α-ακτίνης (SM-α-ακτίνης) [1] έχουν υψηλή ικανότητα να εκκρίνουν παράγοντες ανάπτυξης, πρωτεΐνες ECM, και πρωτεϊνάσες [1, 5] και ονομάζονται αντιδραστικά στρώμα ή σχετίζονται με τον καρκίνο ινοβλάστες (CAFS ) [5, 6]. Δεδομένου ότι η περιεκτικότητα μυοϊνοβλάστη ιστών όγκου συσχετίζεται καλά με κακή πρόγνωση ορισμένων μορφών καρκίνου [7], στρωματικά κύτταρα, ιδιαίτερα μυοϊνοβλάστες, εμπλέκονται σημαντικά στην ανάπτυξη του καρκίνου. Πρόσφατες αναφορές έχουν αποσαφηνίσει το ρόλο των στρωματικών κυττάρων στη διατήρηση των καρκινικών βλαστικών κυττάρων [8], μεταστατικό κόγχες [9, 10], και χημειοαντίσταση [11, 12]. Λόγω αυτών των όλο και περισσότερες ενδείξεις, τα στρωματικά κύτταρα καθίστανται ένας ελκυστικός στόχος για αντι-καρκινικών στρατηγικών.

Στρωματικά κύτταρα ρυθμίζουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων θετικά και αρνητικά μέσω των εκκρινόμενων παραγόντων και προσκόλληση [1, 5, 6, 13- 17]. Διάφοροι παράγοντες ανάπτυξης όπως του αυξητικού παράγοντα ηπατοκυττάρων (HGF) [18], που μοιάζει με ινσουλίνη αυξητικού παράγοντα-Ι (IGF-I) [19], και αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών-7 (FGF-7) [20] εκκρίνονται από στρωματικά κύτταρα . Από την άλλη πλευρά, τα καρκινικά κύτταρα εκκρίνουν επίσης διάφορους παράγοντες να τροποποιήσουν ή «εκπαιδεύσει» στρωματικά κύτταρα να βελτιώσουν μικροπεριβάλλον τους. Ο μετασχηματισμός του αυξητικού παράγοντα-β1 (ΤΟΡ-β1) είναι ένας από αυτούς τους παράγοντες και διεγείρει τους ινοβλάστες να διαφοροποιηθούν σε μυοϊνοβλάστες [1, 3]. Διατριβές παράγοντες και οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των καρκινικών κυττάρων και στρωματικών κυττάρων διαφέρουν σε κάθε καρκίνο και ως εκ τούτου δεν είναι πλήρως κατανοητοί [21].

Έχουμε μελετήσει τις αλληλεπιδράσεις κυττάρου όγκου-στρωματικών χρησιμοποιώντας συστήματα συν-καλλιέργεια των δύο κυττάρων [22] . Ενώ στρωματικά κύτταρα προστάτη αυξάνουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη όταν συν-εγχέεται σε γυμνά ποντίκια [19], μας

in vitro

συν-καλλιέργεια μέθοδος μιμείται τις

in vivo

Αποτελέσματα [22]. Χρησιμοποιώντας αυτό το μοντέλο, έχουμε βρει ότι ο IGF-Ι εκκρίνεται από τα στρωματικά κύτταρα του προστάτη και παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη [19]. Επιπλέον, χρησιμοποιήσαμε το

in vitro

σύστημα συν-καλλιέργειας ως μία δοκιμασία διαλογής για την ταυτοποίηση ενώσεων οι οποίες ασκούν αντικαρκινική δράση, μέσω της διαφοροποίησης των αλληλεπιδράσεων κυττάρου όγκου-στρωματικών. Ως αποτέλεσμα, έχουμε ανακαλύψει πολλές ενώσεις από φυσικές πηγές, όπως καλλιεργημένα ζωμούς των βακτηρίων και μυκήτων [23-26]. Μεταξύ αυτών, phthoxazolin Α και leucinostatin Α βρέθηκε να αναστέλλει την έκκριση του IGF-I από στρωματικά κύτταρα του προστάτη και καταστέλλουν την ανάπτυξη των κυττάρων καρκίνου του προστάτη με την παρουσία στρωματικών κυττάρων [23, 24]. Από την άλλη πλευρά, NBRI16716A αναστέλλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος [26], αλλά αυτό δεν επηρεάζει την έκκριση του IGF-I από στρωματικά κύτταρα του προστάτη. προκαταρκτικά πειράματα μας δείχνουν ότι NBRI16716A μπορεί να διεγείρουν τα στρωματικά κύτταρα να εκκρίνουν αγνώστων παραγόντων καταστολής όγκου. Έτσι, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν έντονα ότι μπορούμε να ελέγξουμε την ανάπτυξη του καρκίνου με τη διαμόρφωση των αλληλεπιδράσεων κυττάρου όγκου-στρωματικών.

Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε τις αλληλεπιδράσεις χρησιμοποιώντας γαστρικό καρκίνο ως μοντέλο. Έχουμε εντοπίσει κρίσιμοι παράγοντες που ρυθμίζουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων θετικά και αρνητικά. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν νέες στρατηγικές κατά του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και τα αντιδραστήρια

ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη DU-145 κύτταρα, τα ανθρώπινα καρκίνου του κόλου DLD-1 κύτταρα, ανθρώπινα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές MIAPaCa2, BxPC-3, Capan-1 και Panc-1 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC). καρκίνο του προστάτη PC-3 κύτταρα Ανθρώπινα κύτταρα και ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά 293 ελήφθησαν από την DS Pharma. Το LNCaP-CR κυτταρική γραμμή [27] ιδρύθηκε το εργαστήριο μας από ανθρώπινα κύτταρα προστάτη LNCaP καρκίνου του (DS Pharma). Άλλες καρκινικές κυτταρικές σειρές περιγράφονται αλλού [28, 29]. Όλες οι καρκινικές κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (ϋΜΕΜ) (Nissui) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS? Sigma), 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη G (Invitrogen), και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη (Invitrogen) σε 37 ° C με 5% CO

2. ανθρώπινα γαστρικά κύτταρα Hs738 στρωματικά (CRL-7869), CCD-18Co ανθρώπινους ινοβλάστες κόλον (CRL-1459), και μαστικό αδένα ινοβλάστες Hs371 (CRL-7256) ελήφθησαν από την ATCC. NHLF φυσιολογικών ανθρώπινων ινοβλαστών πνεύμονα και στρωματικά κύτταρα ανθρώπινου προστάτη pRSC ελήφθησαν από BioWhittaker. PS ανθρώπινα παγκρεατικά κύτταρα στρώματος ελήφθησαν από DS Pharma. Όλα τα στρωματικά κύτταρα διατηρήθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 10% FBS, 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη G, 100 μg /mL στρεπτομυκίνη, ΙΤΗ (5 μg /ml ινσουλίνη, 5 μg /mL τρανσφερρίνη, και 1.4 μΜ υδροκορτιζόνη), και 5 ng /mL βασικό FGF (PeproTech) στους 37 ° C με 5% CO

2 όπως περιγράφεται [22].

Anti-παν-κυτοκερατίνη (sc-8018), αντι-STAT3 (sc-8019), αντι-GAPDH (sc-47724), αντι-ΡΑΙ-1 (sc-8979), αντι-p70S6 κινάσης (sc-230), αντι-14-3-3 έψιλον (sc-1020), και αντι-φωσφο-ΜΑΡΚ (sc-7383) αντισώματα αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology. Αντι-βιμεντίνη (V2258), αντι-SM-α-ακτίνη (A2547), αντι-α-τουμπουλίνης (T9026), αντι-φωσφο (tyr705) -STAT3 (SAB4300033), αντι-RPL-18Α (HPA055259), και αντι-FLAG Μ2 (F3165) αντισώματα, μυ κουνελιού GAPDH (G2267) και των ανθρώπινων ερυθροκυττάρων GAPDH (G6019) αγοράστηκαν από τη Sigma. Αντι-φωσφο-Ser /Thr υπόστρωμα κινάσης (9614 και 9624), αντι-ριβοσωμική πρωτεΐνη S6 (rpS6) (2217), αντι-φωσφο (Ser235 /236) -RPS6 (2211), αντι-φωσφο (Ser240 /244 ) -RPS6 (2215), αντι-φωσφο- (Ser473) -Akt (9271), αντι-φωσφο- (Thr389) -p70 S6 κινάση (9234), αντι-φωσφο- (οικογένεια Tyr416) ​​-SRc (2102), αντι -phospho- (Thr172) -AMPKα (2535), αντι-Μγο (2278), αντι-caveolin-1 (3267), και αντι-β-κατενίνης (9562) αντισωμάτων αγοράστηκαν από Cell Signaling Technology. Αντι-φωσφο-14-3-3 αντίσωμα αγοράστηκε από Abgent. Αντι-φωσφο (Tyr705) -STAT3 (612.356) αντίσωμα αγοράστηκε από την BD Biosciences. Anti-RPL-18A αντίσωμα αγοράστηκε από Abcam. IL-6 αντίσωμα αντι-ανθρώπινου εξουδετέρωσης (MAB206), ανασυνδυασμένη ανθρώπινη IL-6 (206-IL), και ανασυνδυασμένη ανθρώπινη CXCL1 (275-CR /CF) αγοράστηκαν από την R GFP. μπαρ κλίμακας είναι 200 ​​μm.

Η

Για τη μελέτη των όγκων-στρωματικών αλληλεπιδράσεων κυττάρου, έχουμε αναπτύξει για πρώτη φορά ένα

in vitro σύστημα

συν-καλλιέργεια των κυτταρικών γραμμών γαστρικού καρκίνου και τα κύτταρα Hs738 όπως περιγράφεται πριν [22]. Για να μετρηθεί η ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων επιλεκτικά σε συν-καλλιέργεια με στρωματικά κυτταρική, χρησιμοποιήσαμε GFP-επιμολυσμένα γαστρικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές (S1A Εικ.). εντάσεις φθορισμού GFP σε λυμένα κύτταρα συσχετίζεται καλά με τον αριθμό των κυττάρων, καθώς και προσδιορισμοί ΜΤΤ (S1c Εικ.). Για να μειωθεί η επίδραση των αυξητικών παραγόντων σε FBS, χρησιμοποιήσαμε σε διαπίδυση FBS (D-FBS). Όταν οι γαστρικού κυτταρικές σειρές καρκίνου του συν-καλλιεργήθηκαν με κύτταρα Hs738, την ανάπτυξη των ΜΚΝ-1, ΜΚΝ-7, και ΜΚΝ-28 κύτταρα καταστάλθηκε από την παρουσία κυττάρων Hs738 (Εικ. 1 Β και S3 Εικ.). Ενώ η αύξηση του ΜΚΝ-45 κύτταρα δεν άλλαξε με συν-καλλιέργεια, εκείνη του ΜΚΝ-74 κύτταρα αυξήθηκε με συν-καλλιέργεια με κύτταρα Hs738 ειδικά σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις του D-FBS (σχ. 1Β και S3A Εικ.). Παρά το γεγονός ότι το μέγεθος της επίδρασης εξαρτιόταν από τις συγκεντρώσεις των D-FBS, τα αποτελέσματα αυτά από

πειράματα in vitro

συν-καλλιέργεια ήταν παρόμοιες με το

in vivo

αποτελέσματα (Σχ. 1Α και S3 Σχ. ).

Εκκρίνεται παράγοντες από γαστρικά στρωματικά κύτταρα ρυθμίζουν τη σύνθεση πρωτεΐνης σε γαστρικό καρκίνο κύτταρα

Ένα από τα χαρακτηριστικά των καρκινικών κυττάρων είναι ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη [40]. Επειδή γαστρικά καρκινικά κύτταρα εμβολιάστηκαν πάνω σε μία μονοστιβάδα κυττάρων Hs738, η αλλαγή της ανάπτυξης σε συν-καλλιέργεια μπορεί να ήταν αποδίδεται σε ανεξάρτητο από αγκύρωση ανάπτυξη. Όταν συγκρίναμε την ανάπτυξη σε συνθήκες εναιώρημα με φυσιολογικό προσκολλημένα προϋπόθεση, η ανάπτυξη όλων των κυτταρικών γραμμών γαστρικού καρκίνου έτεινε να κατασταλεί υπό συνθήκες αναστολής (S3b Εικ.). Από την άλλη πλευρά, Transwell πειράματα αποκάλυψαν ότι η ανάπτυξη του ΜΚΝ-1, ΜΚΝ-7, και ΜΚΝ-28 κύτταρα μειώθηκε με συν-καλλιέργεια με κύτταρα Hs738, ενώ η αύξηση του ΜΚΝ-74 κύτταρα ήταν αυξημένη και ότι του MKN- 45 κύτταρα ήταν αμετάβλητη (S3C Εικ.). Αυτά τα αποτελέσματα ήταν σύμφωνα με το

in vitro

πειράματα συν-καλλιέργειας (Σχ. 1 Β και S3A Σχ.) Και έδειξε ότι εκκρινόμενη παράγοντες από κύτταρα Hs738 αντί αγκύρωση ανάπτυξη ανεξάρτητη συμμετείχαν στην ρύθμιση της ανάπτυξης.

από εκκρινόμενη παράγοντες πιθανόν εμπλέκονται στη ρύθμιση της ανάπτυξης, μπορούμε στη συνέχεια προστέθηκε ρυθμισμένο μέσο (CM) από κύτταρα Hs738 στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα και διαπίστωσε ότι η φωσφορυλίωση του Ser /υπολείμματα Thr πρωτεϊνών, ειδικά ~ 30 kDa πρωτεϊνών, ήταν σημαντικά άλλαξε (Εικ. 2Α). Η φωσφορυλίωση των ~ 30 kDa πρωτεϊνών σε ΜΚΝ-1, ΜΚΝ-7, και ΜΚΝ-28 κύτταρα ήταν σημαντικά μειωμένη από την CM, αλλά ότι σε ΜΚΝ-45 και ΜΚΝ-74 κύτταρα δεν επηρεάστηκε (Σχ. 2Α και S4 Σχ. ). Πρωτεομική ανάλυση των ~ 30 kDa πρωτεΐνες έδειξε ότι ένας από τους υποψηφίους ήταν ριβοσωμική πρωτεΐνη S6 (rpS6) (S4B Εικ.). siRNAs κατά rpS6 μείωσε τη φωσφορυλίωση των ~ 30 kDa πρωτεΐνες καθώς επίσης και φωσφορυλιωμένη rpS6 (S4C Εικ.). Επιπλέον, ανοσοκαθιζήματα που παράγεται από το αντίσωμα αντι-rpS6 ανιχνεύθηκαν με αντίσωμα αντι-φωσφο-Ser /Thr, καθώς και αντι-φωσφορυλιωμένες αντίσωμα rpS6 (S4C Εικ.). Έτσι, η πρωτεΐνη ~ 30 kDa ήταν πράγματι rpS6. Στην πραγματικότητα Hs738 CM μείωσε τη φωσφορυλίωση του rpS6 σε ΜΚΝ-1, ΜΚΝ-7, και ΜΚΝ-28 κύτταρα, αλλά όχι εκείνη της πρωτεΐνης 14-3-3, ένας άλλος υποψήφιος του φωσφορυλιωμένη πρωτεΐνη (Εικ. 2Β και S4B Εικ.). Επιπλέον, φωσφορυλιωμένη rpS6 σε κύτταρα ΜΚΝ-7 βρέθηκε να μειώνεται όταν συν-καλλιεργήθηκαν με κύτταρα Hs738 (Σχ. 2C). Η φωσφορυλίωση του rpS6 είναι καλά γνωστό ότι παίζει ένα κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση της πρωτεϊνικής σύνθεσης [41]. Έτσι, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι τα κύτταρα Hs738 τουλάχιστον μειωτικά την πρωτεϊνική σύνθεση και κατέστειλε την ανάπτυξη του ΜΚΝ-1, ΜΚΝ-7, και ΜΚΝ-28 κυττάρων μέσω εκκρίνεται παράγοντες.

(Α) Γαστρικό καρκινικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν hexafluorophosphate.

doi:10.1371/journal.pone.0119415.s026

(PDF)

Acknowledgments

We