Abstract

Η ικανότητα του τετρα

O

μεθυλο νορδιυδρογουαϊαρετικό οξύ (Μ

4Ν) για να επάγει ταχύ θάνατο κυττάρου σε συνδυασμό με ετοποσίδη, ραπαμυκίνη, ή UCN-01 εξετάστηκαν σε κύτταρα LNCaP, τόσο σε κυτταρική καλλιέργεια και ζωικά πειράματα. Τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με Μ

συνδυασμούς 4Ν φάρμακο είτε με Ετοποσίδη ή ραπαμυκίνη δεν έδειξε στοιχεία όγκου και είχαν ποσοστό επιβίωσης 100% 100 ημέρες μετά την εμφύτευση του όγκου. Συγκριτικά όλα τα άλλα οχήματα ή ποντίκια που έλαβαν θεραπεία μόνο φάρμακο απέτυχε να επιβιώσει περισσότερο από 30 ημέρες μετά την εμφύτευση. Αυτή η συνεργιστική βελτίωση της αντικαρκινικό αποτέλεσμα επιβεβαιώθηκε επίσης σε περισσότερες από 20 κυτταρικές γραμμές καρκίνου. Σε κύτταρα LNCaP, Μ

4Ν βρέθηκε να μειώνει την κυτταρική περιεχόμενο ΑΤΡ, και καταστέλλει την έκφραση NDUFS1 ενώ επάγει υπερπόλωση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης. Μ

κύτταρα 4Ν-επεξεργασία έλειπε αυτοφαγία με μειωμένη έκφραση BNIP3 και ATG5. Για να κατανοήσουμε τους μηχανισμούς αυτής της αντικαρκινική δράση των Μ

4Ν, η επίδραση αυτού του φαρμάκου σε τρεις καρκινικές κυτταρικές σειρές (LNCaP, AsPC-1, και L428 κύτταρα) εξετάστηκε περαιτέρω μέσω μεταγραφικό και η μεταβολισμική αναλύσεις. Μεταβολομική αποτελέσματα έδειξαν ότι υπήρχαν μειώσεις του 26 μεταβολιτών απαραίτητη για την παραγωγή ή /και την παραγωγή των κυτταρικών συστατικών ενέργειας από κοινού με αυτές τις τρεις κυτταρικές σειρές ακόλουθες 8 ώρες M

θεραπεία 4Ν. ανάλυση Deep αλληλούχιση RNA έδειξε ότι υπήρχαν δεκαέξι γονίδια των οποίων η έκφραση βρέθηκαν να διαμορφώνεται ακόλουθες 6 ώρες M

4Ν θεραπεία ομοίως σε αυτές τις τρεις κυτταρικές σειρές. Έξι από αυτά τα 16 γονίδια ήταν λειτουργικά συνδεδεμένα με τα 26 μεταβολίτες που περιγράφονται παραπάνω. Μία από αυτές τις up-ρυθμιζόμενων γονιδίων κωδικοποιεί για CHAC1, ένα βασικό ένζυμο που επηρεάζουν τις οδούς του στρες μέσω της υποβάθμισης της γλουταθειόνης. Στην πραγματικότητα, Μ

4Ν βρέθηκε να καταστείλουν το περιεχόμενο της γλουταθειόνης και να προκαλέσει αντιδραστική παραγωγή ειδών οξυγόνου. Τα δεδομένα δείχνουν ότι η συνολική Μ

4Ν έχει βαθιές συγκεκριμένες αρνητικές επιπτώσεις σε ένα ευρύ φάσμα μεταβολισμό καρκίνο υποστηρίζουν τη χρήση του Μ

συνδυασμό 4Ν για τις θεραπείες του καρκίνου

Παράθεση:. Kimura K, Huang RCC ( 2016) τετρα

O

-μεθυλο νορδιυδρογουαϊαρετικό οξύ Καταστέλλει γενικές Καρκίνος του μεταβολισμού και προκαλεί συνεργατικά ισχυρή αντικαρκινική δράση το Συνδυασμό με ετοποσίδη, ραπαμυκίνη και UCN-01. PLoS ONE 11 (2): e0148685. doi: 10.1371 /journal.pone.0148685

Επιμέλεια: Han-Chung Wu, Academia Sinica, Ταϊβάν

Ελήφθη: 22 Οκτωβρίου του 2015? Αποδεκτές: 20 Ιανουαρίου, 2016? Δημοσιεύθηκε: 17 του Φεβρουαρίου του 2016

Copyright: © 2016 Kimura, Huang. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και. Οι μελέτες που υποβάλλονται στη βάση δεδομένων NCBI βιολογικό δείγμα και ορίστηκαν τα εξής βιολογικό δείγμα Προσχωρήσεις: SAMN04407347 (LNCaP-Μ4Ν-RNA), SAMNO4407348 (LNCaP-Ctrl-RNA), SAMN04407349 (AsPC-1-Μ4Ν-RNA), SAMN04407350 (AsPC- 1-Ctrl-RNA), SAMN04407351 (L42 8-Μ4Ν-RNA) και SAMNO 4407 3 52 (L428-Ctrl-RNA)

Χρηματοδότηση:. η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας ( R01DE12165), Biocuremedical, LLC, και η Dorothy γεν Εμπιστοσύνη (P 690-C25-2407) για να RCH. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Ru Chih C. Huang είναι ένας κύριος εφευρέτης και Kotohiko Kimura είναι ένας εφευρέτης μιας αίτηση διπλώματος ευρεσιτεχνίας «Termeprocol με 7-υδροξυσταυροσπορίνη» (PCT WO 2011/103586 Α2 – δίπλωμα ευρεσιτεχνίας επιτρέπεται 1 Απρ 2015). Ο Δρ Huang είναι επίσης ένας κύριος εφευρέτης αρκετών διπλωμάτων ευρεσιτεχνίας JHU στο Μ4Ν. JHU έχει μισθώσει το φάρμακο (Μ4Ν, Terameprocol) που σχετίζονται με τα διπλώματα ευρεσιτεχνίας, αλλά δεν είναι αυτό το PCT WO 2011/103586 Α2 Έρημος Pharmaceuticals μέχρι το 2017. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι τετρα-

O

μεθυλο νορδιυδρογουαϊαρετικό οξύ (Μ

4Ν), επίσης γνωστή ως EM1421 και terameprocol, διέθετε αντιικές και δραστηριότητες κατά του καρκίνου [ ,,,0],1-4] και ότι το Μ

4Ν θα μπορούσε να είναι δυνητικά χρήσιμο σαν ένα αντικαρκινικό φάρμακο. Δείξαμε επίσης ότι ένας από τους κύριους φαρμακολογικές δραστηριότητες του Μ

4Ν ήταν να αναστέλλουν τη δράση του παράγοντα μεταγραφής SP1 με σύνδεση προς GC-πλούσιες περιοχές (SP1 συναινετικές αλληλουχίες) των υποκινητών γονιδίων ανταγωνιστικά με SP1 [4]. Διαπιστώθηκε επίσης ότι το Μ

4Ν, λόγω της δραστηριότητας αυτής, ήταν σε θέση να καταστείλει SP1-ρυθμίζονται

CDK1

έκφρασης και να προκαλέσει διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη φάση G2 του [4] του κυτταρικού κύκλου, η οποία μερικώς παρείχε μια εξήγηση για Μ

επαγόμενη 4Ν αντικαρκινική δράση, καθώς άναρχη ανάπτυξη θεωρείται ότι είναι ένα από χαρακτηριστικά του καρκίνου. Επιπλέον Wang et al. έδειξε ότι η υπερέκφραση του SP1 διευκόλυνε την ανάπτυξη και την εξέλιξη της γαστρικού καρκίνου [5], υποδηλώνοντας περαιτέρω ότι η καταστολή της μεταγραφής SP1 ρυθμιζόμενων θα μπορούσε να προκαλέσει αντικαρκινική δραστηριότητα. Εκτός από αυτές τις μελέτες για την αναστολή της μεταγραφής, υπήρξαν αλλά μερικές μελέτες που σχετίζονται με τις φαρμακολογικές δραστηριότητες του Μ

4Ν. Πιο συγκεκριμένα Pardini et al. έδειξε ότι νορδιυδρογουαϊαρετικό οξύ (NDGA, μια πρόδρομη ένωση του Μ

4Ν) ανέστειλε την μιτοχονδριακή σύστημα μεταφοράς ηλεκτρονίων και κατέστειλε οξειδωτική φωσφορυλίωση [6-7]. NDGA ήταν υποψήφιος αντικαρκινικό παράγοντα, ωστόσο ήταν τελικά αποδειχθεί ότι είναι κλινικά ακατάλληλη λόγω της σημαντικής παρενέργεια της. Λόγω της ομοιότητας στη μοριακή δομή μεταξύ M

4Ν και NDGA (Σχήμα 1Α), τα δεδομένα αυτά αφορούν NDGA είναι σχετικές με τις μελέτες μας σχετικά με Μ

4Ν. Συνολικά, αυτά τα προηγούμενα ευρήματα της Μ

4Ν φαίνεται να δείχνουν ότι η M

4Ν μπορεί να έχουν πολλαπλές φαρμακολογικές δράσεις.

Α. Μοριακές δομές νορδιυδρογουαϊαρετικό οξύ (NDGA) και τετρα-Ο-μεθυλ νορδιυδρογουαϊαρετικό οξύ (Μ

4Ν). Β: Synergistic επαγωγή κυτταρικού θανάτου σε κύτταρα ιστοκαλλιέργειας LNCaP. C: έλεγχος, Ε: Ετοποσίδη (20 μΜ), Ra: ραπαμυκίνη (20 μΜ), U: UCN-01 (2 μΜ), Μ: Μ

4Ν (80 μΜ), ME: Μ

4Ν + Etoposide, MR: Μ

4Ν + ραπαμυκίνη, MU: Μ

4Ν + UCN-01. Ο θάνατος των κυττάρων μετρήθηκε με TUNEL δοκιμασίας και μπλε δοκιμασία αποκλεισμού Trypan στις 24 ώρες μετά τη θεραπεία. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD εις τριπλούν. C: Ένα οικόπεδο Chou-Talalay για TUNEL θετικά κυτταρικού θανάτου που επάγεται από συνδυασμένες θεραπείες σε κύτταρα LNCaP. δείκτης συνδυασμού (CI) & lt? 1, 1, και & gt? 1 δείχνουν συνέργεια, προσθετική δράση, και τον ανταγωνισμό. D: Επίδραση του συνδυασμού θεραπειών του Μ

4Ν με ετοποσίδη ή ραπαμυκίνη στην επιβίωση των γυμνών (ηυ /ηυ) ποντικούς orthotropically εμφυτεύεται με όγκους LNCaP. Το ποσοστό των ποντικών που έχουν διασωθεί από την ημερομηνία μετά τον εμβολιασμό του όγκου παρουσιάστηκε για κάθε ομάδα.

Η

M

4Ν είναι σήμερα σε Ι /ΙΙ των κλινικών δοκιμών φάσης σε ασθενείς με διάφορες προχωρημένο καρκίνο [8 , 9]. Τα αποτελέσματα αυτών των κλινικών μελετών μέχρι στιγμής δείχνουν ότι το Μ

4Ν έχει ένα ορισμένο βαθμό αντικαρκινικής δραστικότητας, αλλά δεν ήταν σε θέση να προκαλέσει ύφεση σε οποιαδήποτε από αυτούς τους ασθενείς με προχωρημένους καρκίνους. Ένα από τα πιο συχνά προσπάθησαν στρατηγική για την αύξηση της αντικαρκινικής αποτελεσματικότητας των φαρμάκων χημειοθεραπείας είναι η θεραπεία συνδυασμού με ένα ή περισσότερα κατάλληλα επιλεγμένα φάρμακα [10]. Ένα σημαντικό εύρημα από τις κλινικές δοκιμές με Μ

4Ν είναι ότι η τοξικότητα του φαρμάκου ήταν πολύ χαμηλή [8, 9]. Οι ασθενείς ήταν σε θέση να ανεχτούν υψηλές δόσεις της Μ

4Ν με ελάχιστες παρενέργειες, που κάνουν αυτό το φάρμακο είναι πολύ κατάλληλο για την ύπαρξη χρήση σε θεραπείες σε πολλαπλά φάρμακα (για παράδειγμα, η LD

50 Μ

4Ν για τα ποντίκια είναι μεγαλύτερη από 1000 mg /kg, ενώ εκείνη της NDGA είναι μόνο 75 mg /kg [11, 12]). Η βελτιστοποίηση των θεραπειών πολλαπλών φαρμάκων απαιτεί βαθιά γνώση σχετικά με φαρμακολογικούς μηχανισμούς των αντικαρκινικών δράσεων των φαρμάκων που πρόκειται να χρησιμοποιηθούν σε συνδυασμό. Ωστόσο, ο ακριβής μηχανισμός της αντικαρκινικής δραστικότητας του Μ

4Ν παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστος. Η δυσκολία στην κατανόηση της φαρμακολογίας της Μ

4Ν έχει τις ρίζες της στο γεγονός ότι αυτό το φάρμακο μπορεί να αναμένεται να επηρεάσει πολλαπλά βιοχημικές δραστηριότητες από το φαρμακολογικό στόχο, παράγοντας μεταγραφής SP1 του, ελέγχει ένα τεράστιο αριθμό των γονιδίων σπιτιού διατήρησης [13]. Ως Μάλιστα, μια έρευνα των 22.633 γνωστών γονιδίων στη βάση δεδομένων Ensemble Ανθρώπινου Γονιδιώματος (https://www.ensembl.org/index.html) έδειξε ότι πάνω από τους μισούς (52,5%) περιείχε το μοτίβο σύνδεσης στο άμεσο τους SP1 (500 bp) ανάντη περιοχές.

σε αυτή τη μελέτη, που ασκήσαμε το πρώτο καλύτερες προσπάθειές μας για να βρείτε ορισμένους συνδυασμούς φαρμάκων με Μ

4Ν που πέτυχε πολλά υποσχόμενη αντικαρκινική αποτελεσματικότητα σε καλλιέργεια ιστών και τα πειράματα ξενομοσχεύματος ποντικού. Μέσω αυτών των προσπαθειών, ανακαλύψαμε επιτυχώς ότι το Μ

συνδυασμό 4Ν θεραπείες με ετοποσίδη και η ραπαμυκίνη ήταν σε θέση να εξαλείψουν εντελώς ορθοτοπικά εμφυτευμένων LNCaP προέρχονται όγκους και μετάσταση σε γυμνούς ποντικούς. Το M

συνδυασμός 4Ν αγωγή ποντικοί είχαν ποσοστό επιβίωσης 100% 100 ημέρες μετά την εμφύτευση του όγκου. Συγκριτικά όλα τα άλλα οχήματα ή ποντίκια που έλαβαν θεραπεία μόνο φάρμακο απέτυχε να επιβιώσει περισσότερο από 30 ημέρες μετά την εμφύτευση. Αυτό απεικονίζεται το εξαιρετικό δυναμικό ικανότητα της Μ

4Ν να βελτιώσει αντικαρκινική αποτελεσματικότητα από θεραπείες συνδυασμού. Για να κατανοήσουμε τις φαρμακολογικές τους μηχανισμούς που εμπλέκονται, εξετάσαμε τις βιοχημικές και φυσιολογικές επιπτώσεις της Μ

θεραπεία 4Ν σε καρκινικά κύτταρα με τη βοήθεια των μεθόδων διαλογής υψηλής απόδοσης, όπως η (χρωματογραφία-φασματοσκοπία μάζας αερίου χρωματογραφίας /υγρού) GC /LC-MS με έδρα δοκιμασία μεταβολίτη και βαθιά αλληλουχίας RNA. Δεδομένου ότι, τα μόρια στόχοι της Μ

4Ν θα μπορούσε να είναι πολλές, λόγω της φύσης της φαρμακολογική δράση του ως αναστολέας SP1, η διαλογή υψηλής απόδοσης με την εξουσία της να συλλέγει πληροφορίες σχετικά με την κατάσταση ενός μεγάλου αριθμού των μεταβολιτών και των mRNA σε κάποτε ήταν πολύ χρήσιμο να αποκρυπτογραφήσουν την περίπλοκη φύση της Μ

δραστηριότητα 4Ν. Η μελέτη μας μέχρι τώρα έχει αποκαλύψει ότι υπήρχε σημαντική μείωση των μεταβολιτών απαραίτητη για την ανάπτυξη του όγκου σε όλες τις κυτταρικές σειρές τριών καρκίνο που μελετήθηκαν μετά από μια σύντομη περίοδο M

θεραπεία 4Ν, και ότι συνεργιστική επαγωγή της διάσπασης κασπάσης και ταχεία αντιδραστικά παραγωγή ειδών οξυγόνου συνέβη όταν Μ

4Ν χρησιμοποιήθηκε με τη δεύτερη αντικαρκινικά φάρμακα σε συνδυασμό.

Αποτελέσματα

Synergistic επαγωγή αντικαρκινική δράση από την M

4Ν-βασισμένη θεραπείες συνδυασμού

έχουμε αξιολόγησε τη χρήση των Μ

4Ν σε πολλαπλές θεραπείες συνδυασμού φαρμάκων χρησιμοποιώντας πειράματα καλλιέργειας κυττάρων και γυμνό μελέτες ξενομοσχεύματος ποντικού. Σε αυτές τις μελέτες, χρησιμοποιήσαμε την ανθρώπινου προστάτη καρκινική κυτταρική γραμμή LNCaP ως κύριο πειραματικό υλικό, δεδομένου ότι έχει χρησιμοποιηθεί σε ζωικά μοντέλα μεταστατικό καρκίνο του προστάτη [14]. Επιπλέον έχει δειχθεί ότι ο καρκίνος γενετικές μεταλλάξεις συχνά συνέβη στο LNCaP κυτταρική γραμμή [15], υποδηλώνοντας αυτή η κυτταρική σειρά συμπεριφέρεται παρόμοια με καρκίνους σε κλινικές ρυθμίσεις οι οποίες συχνά υφίστανται διάφορες μεταλλάξεις του γονιδίου κατά τη διάρκεια της εξέλιξης τους [16]. Ως πιλοτικό πείραμα για τον προσδιορισμό των καταλληλότερων φαρμάκων που θα χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με Μ

4Ν για κλινικές εφαρμογές, επιλέξαμε τρία αντικαρκινικά φάρμακα, δηλαδή ετοποσίδη [17], ραπαμυκίνη [18], και UCN-01 [19] και αξιολόγησε αντικαρκινική αποτελεσματικότητα του συνδυασμού θεραπείες με αυτά τα φάρμακα σε κύτταρα LNCaP χρησιμοποιώντας τόσο τη δοκιμασία TUNEL και δοκιμασία αποκλεισμό μπλε Τρυπάνης. Τα αποτελέσματα (Σχήμα 1 Β) έδειξε ότι το Μ

4Ν συνεργικά κυτταρικό θάνατο που επάγεται με τα τρία αντικαρκινικά φάρμακα εξετάστηκαν. Ένα οικόπεδο Chou-Talalay [20] επιβεβαίωσε ότι όλες οι θεραπείες συνδυασμού ήταν σημαντικά συνεργιστική (Σχήμα 1Β). Επιπλέον, η ποσότητα του κυτταρικού θανάτου ανιχνεύθηκε με μπλε δοκιμασία αποκλεισμού Trypan ξεπέρασε κατά πολύ αυτά που εντοπίστηκαν από TUNEL δοκιμασίας (Σχήμα 1Α), υποδεικνύοντας ότι TUNEL-αρνητικά κυτταρικός θάνατος έπαιξε σημαντικό ρόλο στην συνεργιστική κυτταρικό θάνατο, ειδικά σε Μ

4Ν συνδυασμένη θεραπεία με ραπαμυκίνη. Οι θεραπείες συνδυασμού ήταν αποτελεσματικά σε ένα πάνελ καρκινικών κυτταρικών σειρών οι οποίες επιλέχθηκαν για γενετική ποικιλομορφία τους (S1 Εικ). Synergistic θάνατος, όμως, δεν παρατηρήθηκε σε HL-1, ένα κανονικό ποντίκι καρδιακού μυός κυτταρικής γραμμής (μη δημοσιευμένα δεδομένα μας). Δείκτης μείωση της δόσης (ΣΑΑ) για τα κύτταρα LNCaP παρουσιάστηκε σε S2 Εικ. Το όφελος από τις θεραπείες συνδυασμού αξιολογήθηκε επίσης χρησιμοποιώντας ποντικούς που φέρουν ξενομόσχευμα LNCaP όγκων. Η καμπύλη ποσοστό επιβίωσης (Σχήμα 1D) έδειξε ότι όλα τα ποντίκια LNCaP που φέρουν όγκο που έλαβαν ένα συνδυασμό Μ

4Ν με ετοποσίδη ή ραπαμυκίνη επέζησαν πέραν 100 ημέρες μετά την εμφύτευση του όγκου, ενώ κανένας από αυτούς που έλαβαν θεραπεία με ένα μόνο φάρμακο επέζησαν πέρα 34 ημέρες λόγω πολλαπλές μεταστάσεις [21]. Επιπλέον αρκετές άλλες ξενομοσχεύματος πειράματα ποντίκια επιβεβαίωσαν ότι Μ

4Ν-based θεραπείες συνδυασμού ήταν αποτελεσματική σε πολλές καρκινικές κυτταρικές γραμμές εκτός από τα κύτταρα LNCaP [22]. Τα δεδομένα έδειξαν μια συνολική υπεροχή των θεραπειών συνδυασμού σε σύγκριση με ενιαία φαρμακευτικές αγωγές και επίσης έδειξε ότι το Μ

4Ν φάνηκε να λειτουργεί καλά με διάφορα φάρμακα των οποίων η φαρμακολογική μηχανισμούς αντικαρκινική δράση τους ήταν πολύ διαφορετική από την άλλη.

Η συνδυασμένη θεραπεία με Μ

4Ν προκαλεί κασπάσης-7 διάσπαση

Για να διερευνήσει πιθανή εμπλοκή κασπασών σε μηχανισμούς κυτταρικού θανάτου του Μ

θεραπείες συνδυασμού 4Ν [23], εξετάσαμε το προφίλ διάσπασης κασπάσης σε LNCaP κύτταρα μετά από μόνο φαρμάκου (Μ

4Ν, Etoposide, ραπαμυκίνη, ή UCN-01) και Μ

συνδυασμό 4Ν (Μ

4Ν /Etoposide, Μ

4Ν /ραπαμυκίνη, και Μ

4Ν θεραπείες με ανάλυση κηλίδος Western /UCN-01). Μετά θεραπείες μονού φαρμάκου, UCN-01, αλλά δεν Etoposide ή ραπαμυκίνη ενεργοποιείται έντονα κασπάσες-9, -3, και -7 (Σχ 2Αα και 2αβ). Από την άλλη πλευρά, μόνο μια μικρή ποσότητα της κασπάσης-9 και -3 δραστικότητα ανιχνεύθηκε μετά οποιοδήποτε από τα Μ

συνδυασμός 4Ν αγωγές (Σχήμα 2Αα). Προφανώς, Μ

4Ν παρενέβαινε με την ικανότητα της UCN-01 για την ενεργοποίηση της κασπάσης-9 και -3. Αντιθέτως, η ανάλυση Western Blot της κασπάσης-7 (Σχήμα 2Αα) απέδειξαν ότι το Μ

4Ν δεν εμπόδισε τη διάσπαση της παρούσας κασπάσης με UCN-01. Επιπλέον, η διάσπαση της κασπάσης-7 συνέβη επίσης παρακάτω M

4Ν /θεραπεία Ετοποσίδη και, σε μικρότερο βαθμό εξής M

4Ν θεραπεία /ραπαμυκίνη (Σχήμα 2Αα και 2αβ). Η χρωματομετρική δοκιμασία για κασπάσης-7 δραστηριότητας (Σχήμα 2Β) επιβεβαίωσε τα αποτελέσματα της ανάλυσης του Western Blot (Εικ 2Αα και 2αβ). Αυτά τα δεδομένα συνολικά έδειξε ότι ο συνδυασμός θεραπειών ενεργοποιημένη κασπάση-7 πολύ περισσότερο από οποιοδήποτε ενιαίο θεραπείας από τα ναρκωτικά. Είναι ενδιαφέρον είτε UCN-01 θεραπεία ή οποιοδήποτε από τα Μ

θεραπείες συνδυασμού 4Ν απέδωσε δύο διαφορετικά κασπάσης-7 θραύσματα, ένα μεγάλο (Ρ30) και ένα μικρό (ρ17) θραύσμα (Σχ 2Αα και 2αβ). Boucher

et al

. έδειξαν ότι μία από τις κύριες λειτουργίες της κασπάσης-7 ήταν να διασπάσει και να αδρανοποιήσουν πολυ-ΑϋΡ ριβόζης πολυμεράσης (PARP) [24]. Για το λόγο αυτό εξετάστηκε η διάσπαση της ΡΑΚΡ σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με Μ

4Ν-based θεραπείες συνδυασμού. Τα δεδομένα (Εικ 2Αα) έδειξε ότι συνολικά μια σημαντικά μεγαλύτερη διάσπαση PARP παρατηρήθηκε για τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με αγωγές συνδυασμού από τα απλά φαρμακευτικές αγωγές. Επιπλέον τα δεδομένα έδειξαν επίσης ότι η θεραπεία συνδυασμού Μ

4Ν με ετοποσίδη ή UCN-01 έδωσε ένα μεγαλύτερο ποσό των δύο θραυσμάτων P89 και p24 από εκείνη με ραπαμυκίνη. Αυτά τα δεδομένα συμφωνούν με τα δεδομένα της κασπάσης-7 που σχετίζονται με (Σχήμα 2Α και 2Β) υποδεικνύοντας ότι κασπάσης-7 δραστηριότητα ήταν μεγαλύτερη με τη θεραπεία συνδυασμού που περιέχει Ετοποσίδη ή UCN-01 από ότι με ραπαμυκίνη

AB:. Ανάλυση της κασπάσης εξαρτώμενη μηχανισμούς κυτταρικού θανάτου που επάγεται από συνδυασμό θεραπειών του Μ

4Ν με ετοποσίδη, ραπαμυκίνη, ή UCN-01. Αα & amp? Ab: Διάσπαση της κασπάσης-3, -4, -7, -9 και μαζί με το πολυ-ΑϋΡ ριβόζης πολυμεράσης (PARP) σε κύτταρα LNCaP αντιμετωπίζονται από τις θεραπείες συνδυασμού για 17 ώρες. β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Β: Κασπάση-7 ενζυματική δραστικότητα σε κύτταρα LNCaP αντιμετωπίζονται από τις θεραπείες συνδυασμού για 13 ώρες. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD εις τριπλούν. Α & amp? Β: C: έλεγχος, Ε: Ετοποσίδη (10 μΜ), Ra: Ραπαμυκίνη (10 μΜ), Ra30μM: Ραπαμυκίνη (30 μΜ), U: UCN-01 (2 μΜ), Μ4Ν: Μ

4Ν (80 μΜ ), και Casp: Caspase. C: Επίδραση του συνδυασμού θεραπειών για το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης (ΔΨ

m). LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Μ

4Ν (80 μΜ) σε συνδυασμό με Ετοποσίδη (10 μΜ), ραπαμυκίνη (10 μΜ), ή UCN-01 (2 μΜ) για 4 ώρες. Η ΔΨ

m μετρήθηκε χρησιμοποιώντας JC-1 βαφή. Η εικόνα δείχνει τις αναλογίες προκύπτει από τη διαίρεση της έντασης στα 568 nm φως-διέγερσης (J-συσσωματώματα) από την εν λόγω στα 488 nm φως-διέγερσης (J-συσσωματώματα + μονομερές). Η έγχρωμη γραμμή εμφανίζεται στη δεξιά πλευρά του σχήματος (H: υψηλή, L: χαμηλή αναλογία).

Η

Η ενεργοποίηση του μηχανισμού κυτταρικού θανάτου κασπάσης-03.09-εξαρτώμενη μιτοχόνδρια που σχετίζεται είναι που συνήθως συνδέεται με αποπόλωση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης (ΔΨ

m) [25]. Για το λόγο αυτό το επόμενο διεξαχθεί πειράματα χρησιμοποιώντας JC-1 χρωστική ουσία για να μετρηθεί η ΔΨ

m (Σχήμα 2C). Τα πειράματα βαφής JC-1 έδειξε ότι UCN-01 θεραπεία, αλλά όχι Etoposide ή ραπαμυκίνη θεραπεία επαγόμενης αποπόλωση της ΔΨ

m σε ένα σύντομο χρονικό διάστημα. Πιο σημαντικό είναι ότι έδειξε επίσης ότι το Μ

4Ν προκαλούμενη υπερπόλωση του ΔΨ

m και εμπόδισε εκπόλωση της ΔΨ

M προκαλείται από UCN-01.

M

θεραπεία 4Ν ρυθμίζει προς τα κάτω αυτοφαγία

η αυτοφαγία είναι μια διαδικασία που υποβαθμίζει κατεστραμμένα ή περιττή κυτταρικά συστατικά με σκοπό την ανακύκλωσή τους, καθώς οι πόροι, και ενεργοποιείται από θρεπτικά συστατικά συνθήκες στέρησης ως μέρος των κυτταρικών μηχανισμών άμυνας [26]. έκφραση LC3B-ΙΙ είναι ευρέως γνωστό ότι συσχετίζονται καλά με αυτοφαγικά δραστικότητα και χρησιμοποιείται ως δείκτης για autophagy [27] δεδομένα .western κηλίδα (Σχήμα 3Α) έδειξε ότι το Μ

4Ν κατέστειλε καθαρά σχηματισμός LC3B-ΙΙ σχεδόν εντελώς, δείχνοντας ότι το Μ

4Ν αναστέλλεται αυτοφαγία. Στη συνέχεια εξετάστηκε η επίδραση της Μ

4Ν στην έκφραση των BNIP3 από τη βόρεια και τη δυτική αποτύπωση. BNIP3 είναι ένα BH3-μόνο πρωτεΐνη και είναι γνωστό ότι εμπλέκεται σε τόσο απόπτωση και autophagy [28-30]. Επειδή BNIP3 είναι επαγώγιμος από υποξία, η έκφραση του εξετάστηκε υπό δύο νορμοξικές και υποξικές συνθήκες. Η θεραπεία με Μ

4Ν για 6 ώρες μείωσε αποτελεσματικά τόσο mRNA και πρωτεΐνης έκφραση του BNIP3 (σχήμα 3Β και 3C), υποδεικνύοντας ότι το Μ

4Ν καταστέλλεται

BNIP3

έκφραση στο μεταγραφικό επίπεδο. Τα δεδομένα έδειξαν επίσης ότι το Μ

4Ν ήταν σε θέση να καταστείλει την βασική όσο και την έκφραση που προκαλείται από υποξία του

BNIP3

σε σχεδόν μηδενική (Σχήμα 3C). Επιπλέον, ο κηλίδωση Western (Σχήμα 3C) έδειξε ότι το Μ

4Ν δεν άλλαξε την έκφραση του BNIP3L, μια πρωτεΐνη που σχετίζονται με BNIP3 [28]. Η επίδραση του Μ

4Ν στην έκφραση ATG5, ένα βασικό συστατικό για μηχανήματα autophagy [31], στη συνέχεια εξετάστηκε και ανάλυση κηλίδος western (Σχήμα 3D) έδειξε ότι το Μ

4Ν κατέστειλε σημαντικά την έκφραση ATG5 σε λιγότερο από 18 ώρες . Τα δεδομένα απέδειξαν έτσι ότι M

4Ν καταστέλλεται αυτοφαγία διαμορφώνοντας πολλαπλά κυτταρικά συστατικά ζωτικής σημασίας για αυτοφαγικά μηχανισμών, όπως ATG5 και BNIP3

Α:. Επίδραση της Μ

4Ν σε αυτοφαγία στα κύτταρα LNCaP. Η έκφραση του LC3B-Ι και II εξετάστηκε από την κηλίδωση Western σε κύτταρα LNCaP που έλαβαν θεραπεία με συνδυασμό θεραπειών του Μ

4Ν με ετοποσίδη, ραπαμυκίνη, ή UCN-01 για 18 ώρες υπό την παρουσία βαφιλομυκίνης Α

1 ( 100 ηΜ), ένας αναστολέας της υποβάθμισης autophagosome. Βαφιλομυκίνης A

1 προστέθηκε για να μετρηθεί η καθαρή δραστηριότητα της αυτοφαγία. Οι συγκεντρώσεις του Μ

4Ν, ετοποσίδη, ραπαμυκίνη, και UCN-01 ήταν 80, 20, 20, και 5 μΜ, αντίστοιχα. C: Έλεγχος, Ε: ετοποσίδη, Ra: ραπαμυκίνη, U: UCN-01. Β: Η έκφραση του mRNA του

BNIP3

γονίδιο, εξετάστηκαν με στύπωμα Northern, σε κύτταρα LNCaP που έλαβαν θεραπεία με Μ

4Ν (80 μΜ) κάτω από νορμοξικές ή υποξικές συνθήκες για 2 ή 6 ώρες. Hyp: υποξική κατάσταση. C: Η έκφραση του BNIP3 και BNIP3L, εξετάζονται από την κηλίδωση Western, σε κύτταρα LNCaP που έλαβαν θεραπεία με Μ

4Ν (80 μΜ) κάτω από νορμοξικές ή υποξικές συνθήκες επί 6 ή 18 ώρες. D: Η έκφραση του ATG5, εξετάζονται από την κηλίδωση Western, σε κύτταρα LNCaP που έλαβαν θεραπεία με Μ

4Ν (80 μΜ) για 18 ώρες. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας.

Η

M

4Ν διαμορφώνει σε μεγάλο βαθμό μεταβολικών οδών

Για να κατανοήσουμε το μηχανισμό της συνέργειας στην αντικαρκινική δράση (Σχήμα 1, S1 Σχήμα) , κυτταρικών περιεχομένων των βιοχημικών μεταβολιτών και προφίλ για πιΚΝΑ που εξετάστηκαν ψάχνουν για πιθανές φυσιολογικές αλλαγές μετά M

θεραπεία 4Ν σε LNCaP ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη, ASPC-1 ανθρώπινου παγκρεατικού καρκίνου, και L428 κύτταρα ανθρώπινου λεμφώματος Hodgkin. Πρώτα εξετάσαμε την επίδραση της Μ

4Ν σε περιεχόμενο μεταβολίτη σε αυτά τα κύτταρα (που εκτελούνται από Metabolon, Co. Ltd) [32]. Ο προσδιορισμός του μεταβολίτη (S1 πίνακα) έδειξε ευρεία επιρροές της Μ

4Ν σε διάφορες κύριες μεταβολικές οδούς. Δεδομένου ότι η έλλειψη συγκεκριμένων μεταβολιτών έχει πιο ουσιαστική επιπτώσεις στην κυτταρική φυσιολογία από την αφθονία τους, θα επιλέξει τους μεταβολίτες του οποίου κυτταρικό περιεχόμενο μειώνεται σταθερά από το Μ

4Ν σε τουλάχιστον δύο από τις τρεις κυτταρικές σειρές και unchange ή απροσδιόριστο στο τρίτο (Σχήμα 4).

LNCaP, AsPC-1 και L428 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Μ

4Ν (80 μΜ) επί 8 ώρες και μεταβολίτης περιεχόμενα των δειγμάτων μετρήθηκαν με LC /GC φασματοσκοπία μάζας με Metabolon (S1 πίνακα). Μεταξύ των μεταβολιτών που εξετάστηκαν, μόνο οι μεταβολίτες των οποίων το περιεχόμενο ήταν σημαντικά (p ≤ 0,05) καταστέλλεται με Μ

4Ν σε επιλέχθηκαν τουλάχιστον δύο από τους τρεις κυτταρικές σειρές και παρατίθενται εδώ υπό την πρόσθετη προϋπόθεση ότι το αποτέλεσμα της Μ

4Ν σχετικά με το περιεχόμενο των μεταβολιτών στην τρίτη κυτταρική γραμμή ήταν μια καταστολή, καμία σημαντική μεταβολή, ή δεν έχουν εξεταστεί. «M /C» δείχνει την αναλογία των περιεχομένων μεταβολίτη για τα δείγματα που έλαβαν θεραπεία με Μ

4Ν έναντι του ελέγχου. Ν.Α. δηλώνει «μη διαθέσιμα στοιχεία». Οι εξαιρέσεις των κανόνων αυτών ήταν ADP και UDP-γλυκόζη (το περιεχόμενο των οποίων και οι δύο κατασταλεί από Μ

4Ν σε δύο από τις τρεις κυτταρικές γραμμές αλλά η διαφορά ήταν στατιστικά σημαντική μόνο σε μία από τις δύο κυτταρικές σειρές. Στην τρίτη γραμμή κυττάρων τα δεδομένα δεν ήταν διαθέσιμα). Οι αριθμοί για το λόγο σκιασμένες με πράσινο χρώμα υποδεικνύει ότι ο μεταβολίτης περιεχόμενο ήταν στατιστικά μικρότερη στα δείγματα αντιμετωπίζονται από τον έλεγχο ενώ αυτοί χωρίς αποχρώσεις δείχνουν ότι δεν υπήρχε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ του ελέγχου και των επεξεργασμένων δειγμάτων.

Η

μεταβολίτες συνδέονται με τον κύκλο Πολλές TCA (κιτρικό, ηλεκτρικό, φουμαρικό, μηλικό και) έχουν εξαντληθεί από Μ

θεραπεία 4Ν (Σχήμα 4). Μόνο το περιεχόμενο της α-κετογλουταρικού αυξήθηκε ελαφρά κατά Μ

4Ν μεταξύ των TCA κύκλου που σχετίζονται με μεταβολίτες (S1 πίνακα). Η επίδραση του Μ

4Ν επί glucolysis /μεταβολιτών γλυκονεογένεση σχετίζονται ήταν μεταβλητή, ανάλογα με την κυτταρική σειρά (S1 Πίνακα) αν και το περιεχόμενο της γλυκόζης-6-φωσφορικής και γλυκόζης-1-φωσφορικής μειώθηκε σταθερά από Μ

4Ν αγωγή (Σχήμα 4). Γλυκόζη-1-φωσφορική μετατρέπεται σε UDP-γλυκόζη μέσω αντιδράσεων γλυκοζυλοτρανσφεράσης με UTP. Το περιεχόμενο των δύο UDP-γλυκόζη και UTP μειώθηκε κατά M

4Ν, καθώς και (Σχήμα 4), υποδεικνύοντας ότι τα μεταβολισμό που σχετίζονται με την γλυκόζη-6-φωσφορικό /γλυκόζη-1-φωσφορικό άλας /UDP-γλυκόζη συνολική κατασταλεί από Μ

4Ν. Η περιεκτικότητα του 3-φωσφογλυκερικού, ένα βασικό μεταβολίτη στο μονοπάτι glucolysis /γλυκονεογένεση, αυξήθηκε σημαντικά από την M

4Ν σε LNCaP κύτταρα αλλά όχι σε AsPC-1 ή L428 κύτταρα, ενώ το περιεχόμενο του πυροσταφυλικού, το οποίο είναι επίσης ένα βασικό γλυκόλυση μεταβολίτη, αυξήθηκε σημαντικά από την M

4Ν σε AsPC-1 και L428 κύτταρα αλλά όχι σε κύτταρα LNCaP (S1 πίνακα). Αυτό έδειξε ότι αν και η επίδραση του Μ

4Ν για τους μεταβολίτες γλυκόλυσης που σχετίζονται ήταν μεταβλητή, ανάλογα με κυτταρικές σειρές, Μ

4Ν στασιμότητα γλυκόλυση σε όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν και συσσωρευμένη ορισμένοι μεταβολίτες γλυκόλυσης που σχετίζονται όπως 3-φωσφογλυκερική και πυροσταφυλικό. Εν τω μεταξύ, το περιεχόμενο του γαλακτικού οξέος μειώθηκε σταθερά από Μ

4Ν θεραπείας (Σχήμα 4), η οποία έδειξε ότι η μετατροπή από πυροσταφυλικό σε γαλακτικό κατεστάλη από τον Μ

4Ν. Συμπερασματικά, τα δεδομένα που σχετίζονται με τον μεταβολισμό των υδατανθράκων (Σχήμα 5Α) οι συνολικές έδειξε ότι το Μ

4Ν μείωσε την περιεκτικότητα του TCA συνδέονται με τον κύκλο των μεταβολιτών ενώ συσσώρευση ορισμένων μεταβολιτών γλυκόλυση σχετίζονται, και έτσι επάγεται cataplerosis (cataplerosis ορίζεται εδώ ως ένα μεταβολικό κατάσταση η οποία εμφανίζεται κάτω από την έλλειψη TCA μεταβολίτες συνδέονται με τον κύκλο) [33]

Α:. Ένα σχήμα για glycolysis-, TCA-κύκλου περίπου, και μιτοχονδριακό σχετίζονται με το σύστημα μεταφοράς ηλεκτρονίων μονοπάτι μεταβολισμού. Τα ακατέργαστα δεδομένα του προσδιορισμού μεταβολίτη παρουσιάζεται στον Πίνακα S1. Η επιλογή των S1 πίνακα μπορεί να βρεθεί στο Σχ 4. Οι ανοδικές βέλη που δείχνουν δείχνουν ότι τα περιεχόμενα των μεταβολιτών που σχετίζονται με αυτά τα βέλη ήταν σημαντικά (p ≤ 0,05) που προκαλείται από Μ

4Ν σε τουλάχιστον δύο από τις τρεις κυτταρικές γραμμές (LNCaP, AsPC-1, και L428 κύτταρα) υπό την πρόσθετη προϋπόθεση ότι το αποτέλεσμα της Μ

4Ν σχετικά με το περιεχόμενο αυτών των μεταβολιτών στο τρίτο κυτταρική σειρά ήταν μια πρόκληση χωρίς στατιστικά σημαντική διαφορά, καμία σημαντική αλλαγή, ή δεν έχουν εξεταστεί . Εν τω μεταξύ τα βέλη προς τα κάτω δείχνουν δείχνουν ότι τα περιεχόμενα των μεταβολιτών που σχετίζονται με αυτά τα βέλη ήταν σημαντικά (p ≤ 0,05) καταστέλλεται με M

4Ν σε τουλάχιστον δύο από τις τρεις κυτταρικές σειρές (LNCaP, AsPC-1, και L428 κύτταρα) υπό την πρόσθετη προϋπόθεση ότι το αποτέλεσμα της Μ

4Ν σχετικά με το περιεχόμενο αυτών των μεταβολιτών στο τρίτο κυτταρική γραμμή ήταν μια καταστολή χωρίς στατιστικά σημαντική διαφορά, καμία σημαντική αλλαγή, ή δεν έχουν εξεταστεί. Οι εξαιρέσεις των κανόνων αυτών είναι 6-φωσφορικής γλυκόζης (του οποίου η περιεκτικότητα σε κατεστάλη από τον Μ

4Ν και στις τρεις κυτταρικές σειρές, αλλά η διαφορά ήταν στατιστικά σημαντική μόνο σε L428 κύτταρα), 3-φωσφογλυκερινικού (το περιεχόμενο των οποίων ήταν σημαντικά προκαλείται από Μ

4Ν σε LNCaP, αλλά όχι σε AsPC-1 και L428 κύτταρα) και πυροσταφυλικού (το περιεχόμενο των οποίων ήταν σημαντικά επάγεται από Μ

4Ν σε AsPC-1 και L428 κύτταρα, αλλά καταστέλλει σημαντικά στα κύτταρα LNCaP). 3-φωσφογλυκερική και πυροσταφυλικού σημειώνονται με τα συνδεδεμένα προς τα άνω βέλη που δείχνουν γιατί τα δεδομένα (S1 Πίνακα) έδειξε ότι το Μ

4Ν συσσωρευμένη αυτούς τους μεταβολίτες και στασιμότητα γλυκόλυση, αν και πώς Μ

4Ν επηρεάζονται αυτοί οι μεταβολίτες ήταν μεταβλητή, ανάλογα με την κυτταρική σειρά (ανατρέξτε στο κείμενο). Η επίδραση του Μ

4Ν σε ΑΤΡ περιεχόμενο στα ολόκληρα κύτταρα φαίνεται στο Σχ 6Α. Η επίδραση του Μ

4Ν στην έκφραση NDUFS1 φαίνεται στο Σχ 6C. Το αποτέλεσμα δείχνει την αύξηση στην έκφραση του mRNA της φωσφοενολοπυροσταφυλικής καρβοξυκινάσης 2 (pck2) και ασπαραγίνη συνθάσης (τους παραμένουν ίδιοι) με M κατεργασία

4Ν (80 μΜ) για 6 ώρες ήταν από ανάλυση βαθιά αλληλούχιση RNA φαίνονται στον Πίνακα 1. Β: Ένα σχήμα για λιπιδίων μεταβολικό μονοπάτι. Οι σημασίες των ανοδικών και καθοδικών βέλη που δείχνουν σε αυτό το σχήμα είναι τα ίδια με εκείνα στο σχήμα για glucolysis-, TCA-κύκλου περίπου, και μιτοχονδριακά σχετίζονται με το σύστημα μεταφοράς ηλεκτρονίων μονοπάτι μεταβολικές (Σχήμα 5Α). Μακράς αλύσου λιπαρά ακυλο-καρνιτίνης περιλαμβάνει palmitoylcarnitine (16: 1) και oleoylcarnitine (18: 1). Όταν τα λιπαρά οξέα αποικοδομούνται μέσω του κύκλου β-οξείδωση, πρέπει να μετατραπούν σε ακυλο-καρνιτινών για να μεταφερθούν στο εσωτερικό των μιτοχονδρίων. Έτσι, τα δεδομένα έδειξαν ότι η Μ

4Ν θα πρέπει να καταστείλει τον κύκλο της β-οξείδωσης με τη μείωση της παραγωγής της ακυλο-καρνιτίνης μακράς αλύσου.

Η

Τα στοιχεία μεταβολίτη, επίσης, έδειξε ότι η Μ

4Ν μείωσε σημαντικά το περιεχόμενο ασπαρτικού και στις τρεις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 4). Από ασπαρτικό παράγεται είτε από οξαλοξικό από μια αντίδραση τρανσαμίνωση ή από φουμαρικό μέσω αδενυλοηλεκτρικού, Μ

4Ν μεσολάβηση cataplerosis (Σχήματα 4 και 5Α) ήταν η αιτία της μειωμένης παραγωγής του ασπαρτικού [33]. Τα δεδομένα του μεταβολίτη έδειξαν επίσης ότι το Μ

4Ν διαμορφωμένο μεταβολισμό των λιπιδίων, καθώς και. Αν και Μ

4Ν διαμορφωμένο διαφορετικά το περιεχόμενο των διαφόρων τύπων λιπιδίων ανάλογα σε κυτταρικές σειρές (S1 πίνακας), Μ

4Ν μειωθεί με συνέπεια το περιεχόμενο των μακράς αλυσίδας ακυλο-καρνιτίνης, όπως palmitoylcarnitine και oleoylcarnitine (Σχήμα 4) και αύξησε το περιεχόμενο της καρνιτίνης και των παραγώγων της σε όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές (S1 πίνακα). Από μακράς αλυσίδας ακυλο-καρνιτίνης είναι απαραίτητη για τη μεταφορά λιπαρών οξέων μακράς αλυσίδας throughthe μιτοχονδριακής μεμβράνης [34] Τα δεδομένα έδειξαν ότι το Μ

4Ν θα πρέπει να μειώσει β-οξείδωση των λιπαρών οξέων (Σχήμα 5Β).

Μ

4Ν καταστέλλει το μεταβολισμό της ενέργειας

Pardini

et al

. έδειξε ότι NDGA, μια πρόδρομη ένωση κατά την οποία το Μ

4Ν βασίστηκε, ανέστειλε το σύστημα μεταφοράς ηλεκτρονίων των μιτοχονδρίων [6-7], το οποίο υποδηλώνει ότι το Μ

4Ν μπορούσε ρυθμίζουν το μεταβολισμό της ενέργειας (Σχήματα 4 και 5, και S1 πίνακα ) μέσω μιας επίδρασης επί των μιτοχονδρίων. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, μια ενζυματική δοκιμασία φωταύγειας που βασίζεται διεξήχθη για να μετρηθεί η περιεκτικότητα ολόκληρο κύτταρο ΑΤΡ στα κύτταρα LNCaP που έλαβαν θεραπεία με Μ

4Ν. Η δοκιμασία (Σχήμα 6Α) έδειξε ότι το Μ

4Ν μείωσε σημαντικά το περιεχόμενο ΑΤΡ σε 5 ώρες. ΑΜΡΚ είναι γνωστό ότι λειτουργεί ως αισθητήρας κυτταρικής σηματοδότησης για ΑΤΡ, ADP, και ΑΜΡ και να ενεργοποιείται (φωσφορυλιώνεται), όταν η αναλογία του ΑΜΡ /περιεχόμενο ΑΤΡ είναι υψηλή [35, 36]. Η αναλογία της ΑΜΡ /ΑΤΡ ενισχύθηκε από τη Μ

θεραπεία 4Ν δεδομένου ότι το περιεχόμενό της AMP ήταν αμετάβλητο από Μ επεξεργασία

4Ν σύμφωνα με την ανάλυση μεταβολίτη (S1 πίνακα). Όπως ήταν αναμενόμενο, η ανάλυση στυπώματος western έδειξε ότι το Μ

4Ν επάγεται η έκφραση και των δύο συνολικών ΑΜΡΚ και φωσφορυλιωμένη μορφή του (T174) σε 5 ώρες (Σχήμα 6Β), υποδεικνύοντας ότι ΑΜΡΚ ενεργοποιήθηκε με Μ

4Ν και το Μ

4Ν-επεξεργασμένα κύτταρα στερήθηκαν για ΑΤΡ. αφυδρογονάση NADH (ουβικινόνη) Fe-S πρωτεΐνη 1 (NDUFS1) είναι μία υπομονάδα του μιτοχονδριακού συμπλόκου Ι Έχει δειχθεί ότι η δράση του συστήματος μεταφοράς ηλεκτρονίων καταστέλλεται όταν το γονίδιο που κωδικοποιεί για την πρωτεΐνη αυτή είναι μεταλλαγμένη [37]. Βρήκαμε ότι η έκφραση της NDUFS1 κατεστάλη στα κύτταρα LNCaP μετά από 5 ώρες θεραπείας Μ4Ν (Σχήμα 6C), που δείχνει ότι το Μ

4Ν ήταν σε θέση να παρεμβαίνουν με ορισμένα συστατικά του συστήματος μεταφοράς ηλεκτρονίων. Υπερπόλωση του ΔΨ

m θεωρείται γενικά ότι είναι μια κατάσταση που σχετίζεται με απόφραξη του συστήματος μεταφοράς ηλεκτρονίων και η χαμηλή παραγωγή ΑΤΡ [38]. Ως εκ τούτου, το αποτέλεσμα των πειραμάτων JC-1 βαφή που περιγράφεται παραπάνω (Σχ 2C), καθώς και άλλα δεδομένα μιτοχόνδρια που σχετίζονται περιγράφεται εδώ (Σχήμα 6) υποστήριξαν την προαναφερθείσα υπόθεση ότι το Μ

4Ν καθώς και NDGA είχε ανασταλτικά αποτελέσματα επί της μιτοχονδριακής σύστημα μεταφοράς ηλεκτρονίων [6, 7], καταστέλλοντας την οξειδωτική φωσφορυλίωση και τη μείωση των κυτταρικών περιεχομένων ΑΤΡ. Εναλλακτικά η μείωση της ΑΤΡ μπορεί να είναι το αποτέλεσμα μιας Μ

4Ν-εξαρτώμενη μείωση στην γλυκολυτική ροή. Σχήμα 5Α συνόψισε την επίδραση του Μ

4Ν στις μεταβολισμό του συστήματος που σχετίζονται με τον κύκλο TCA /μεταφοράς ηλεκτρονίων. Ηλεκτρική αφυδρογονάση που μετατρέπει ηλεκτρικού άλατος προς το φουμαρικό στον κύκλο TCA είναι επίσης γνωστή ως σημαντική συνιστώσα του συμπλόκου II του συστήματος μεταφοράς ηλεκτρονίων. Είναι ενδιαφέρον ότι τα περιεχόμενα αμφοτέρων των ηλεκτρικού και φουμαρικό μειώθηκαν σημαντικά από το Μ

4Ν (Σχήμα 4), υποδεικνύοντας ότι το Μ

4Ν καταστέλλεται μεταβολική δραστηριότητα τόσο του κύκλου TCA και του συστήματος μεταφοράς ηλεκτρονίων. [14].