Αφηρημένο

Ιστορικό

μεθυλοτρανσφεράσης DNA (DNMT) είναι μία από τις σημαντικότερες παράγοντες που μεσολαβούν τη μεθυλίωση του σχετίζονται με τον καρκίνο γονίδια όπως ΤΟΡ-β υποδοχείς (TβRs). Αυτό με τη σειρά μπορεί να οδηγήσει σε απώλεια της ευαισθησίας σε φυσιολογικά επίπεδα του ΤΟΡ-β σε επιθετικό καρκίνο προστάτη (CaP). Οι ειδικοί μηχανισμοί του ρόλου DNMT της ΚΑΠ παραμένουν απροσδιόριστες. Σε αυτή τη μελέτη, θα περιγράψουμε τον μηχανισμό του TGF-β-μεσολάβηση DNMT στην ΚΓΠ και η σύνδεσή της με τις κλινικές εκβάσεις μετά από ριζική προστατεκτομή.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Εμείς που χρησιμοποιούνται ανθρώπινα CaP κυτταρικές σειρές με ποικίλους βαθμούς επεμβατική ικανότητα να περιγράψει πώς ΤΟΡ-β προκαλεί την έκφραση του DNMT στο Cap, και οι επιπτώσεις της για την κατάσταση μεθυλίωσης του ΤΟΡ-β υποδοχείς και τη διεισδυτική ικανότητα του Cap in vitro και in vivo. Επιπλέον, καθορίζεται η συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης DNMT και του κλινικού αποτελέσματος μετά από ριζική προστατεκτομή. Βρήκαμε ότι τα κύτταρα πιο επιθετική CaP είχαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα ΤΟΡ-β, αυξημένη έκφραση του DNMT, αλλά μειωμένη TβRs σε σύγκριση με καλοήθη κύτταρα του προστάτη και λιγότερο επιθετική κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Ο αποκλεισμός του ΤΟΡ-β σηματοδότηση ή την ενεργοποίηση ERK (ρ-ERK) συσχετίστηκε με μια δραματική μείωση στην έκφραση του DNMT, η οποία οδηγεί σε μια συμπίπτουσα αύξηση στην έκφραση του TβRs. Ο αποκλεισμός της είτε TGF-β σηματοδότηση ή DNMT μειώθηκε δραματικά τις επεμβατικές δυνατότητες της ΚΓΠ. Η αναστολή της ΤΟΡ-β σε ένα μοντέλο TRAMP-C2 CaP σε C57BL /6 ποντίκια χρησιμοποιώντας 1D11 συνδέθηκε με ρύθμιση προς τα κάτω του DNMTs και ρ-ΕΚΚ και την απομείωση στην ανάπτυξη του όγκου. Τέλος, ανεξάρτητα από βαθμό Gleason, αυξημένη έκφραση DNMT1 συνδέθηκε με βιοχημική υποτροπή μετά από χειρουργική θεραπεία για τον καρκίνο του προστάτη.

Συμπεράσματα και Σημασία

Τα ευρήματά μας αποδεικνύουν ότι προέρχεται CaP TGF-β μπορεί να επάγει την έκφραση του DNMTs σε Cap η οποία συνδέεται με τη μεθυλίωση των υποδοχέων του και την επιθετική δυναμικό του πώματος. Επιπλέον, DNMTs αποτελεί ανεξάρτητο προγνωστικό παράγοντα για υποτροπή της νόσου μετά από προστατεκτομή, και μπορεί να έχει κλινικές επιπτώσεις της ΚΓΠ πρόγνωση και θεραπεία

Παράθεση:. Zhang Q, Chen L, Helfand BT, Jang TL, Sharma V, Kozlowski J , et al. (2011) TGF-β ρυθμίζει DNA Έκφραση μεθυλοτρανσφεράσης στον καρκίνο του προστάτη, συσχετίζεται με την επιθετική Δυνατοτήτων, και προβλέπει Νοσημάτων υποτροπή. PLoS ONE 6 (9): e25168. doi: 10.1371 /journal.pone.0025168

Επιμέλεια: Chun-Ming Wong, Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 20 Ιουν 2011? Αποδεκτές: 26 του Αυγούστου 2011? Δημοσιεύθηκε: 30 Σεπτεμβρίου 2011

Copyright: © 2011 Zhang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε εν μέρει από την Grant Αριθμός 2 P50CA090386-06A2 από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, ΝΙΗ, καθώς και επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου (U01 CA152738), American Cancer Society, Illinois (# 08-22), Υπουργείο άμυνας (W81XWH -09-1-0311), Πόρτες Κέντρο /Ινστιτούτο Ιατρικής του Σικάγο (QZ), American Cancer Society Θεσμικών Research Grant (ACS-IRG 93-037-12), επιχορήγηση από την Genzyme Corporation, μια επιχορήγηση από το Northshore Πανεπιστήμιο Healthsystem και ένα δώρο από τον κ Fred L. Turner. Μέσω της απασχόλησης των SL, JH και η BT, ο ρόλος Genzyme Corporation περιλαμβάνονται: παροχή αντιδραστηρίων, προσφέροντας προτάσεις του πειραματικού σχεδιασμού και να βοηθήσει με την προετοιμασία του χειρογράφου. Οι άλλοι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. SL, JH και η BT είναι υπάλληλοι της Genzyme. Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας ή τα προϊόντα στην ανάπτυξη για να κηρύξει. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

TGF-β είναι ένας πλειοτροπικός αυξητικός παράγοντας που έχει ενοχοποιηθεί σε πολλές, και συχνά διαμετρικά αντίθετες λειτουργίες, συμπεριλαμβανομένων του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, διακοπή κυτταρικής ανάπτυξης, διαφοροποίησης και απόπτωσης [1], [2]. Ένα προφανές ερώτημα που τίθεται από αυτές τις διάφορες λειτουργίες είναι πώς TGF-β μεσολαβεί αυτά τα φαινομενικά αντικρουόμενους ρόλους τόσο καρκίνο και καλοήθη κύτταρα. Στα καρκινικά κύτταρα, ΤΟΡ-β δρα ως αυξητικός παράγοντας και βοηθά στην μετάσταση, ενώ σε φυσιολογικά κύτταρα φαίνεται να αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων και να διεγείρουν απόπτωση [3]. Χαρακτηριστικά του καρκίνου του προστάτη επιθετικών (CAP) περιλαμβάνουν μια σταδιακή απώλεια της ευαισθησίας σε ΤΟΡ-β και η υπερ-έκφραση του ΤΟΡ-β, η οποία φαίνεται να κινήσει έναν φαύλο κύκλο για την εξέλιξη του όγκου. Αν και είναι καλά γνωστό ότι η μείωση ή απώλεια της έκφρασης του TGF-β υποδοχείς (TβRs) επιτρέπει στα καρκινικά κύτταρα να ξεφύγουν από την επίδραση αναστολής της ανάπτυξης του ΤΟΡ-β και να αποκτήσουν υπεροχή αύξησης, ο κυτταρικός μηχανισμός (ες) στα οποία βασίζονται τα γεγονότα στην ανθρώπινα κύτταρα CaP παραμένει απροσδιόριστη. Προηγουμένως, έχουμε καταδείξει ότι η απώλεια της έκφρασης TβRs με μεθυλίωση προαγωγού συνδέεται με έλλειψη ευαισθησίας προς ΤΟΡ-β-διαμεσολαβούμενη αναστολή αύξησης [4].

μεθυλίωσης του DNA διεξάγεται με μεθυλοτρανσφεράσες DNA (DNMTs). Υπάρχουν τουλάχιστον τρεις λειτουργικές DNMTs που έχουν εντοπιστεί σε ευκαρυωτικά συστήματα. DNMT1 έχει ενοχοποιηθεί κυρίως στη συντήρηση των προτύπων μεθυλίωσης που συμβαίνει κατά τη διάρκεια της κυτταρικής αντιγραφής, και κατά προτίμηση μεθυλιώνει ημι-μεθυλιωμένο DNA [5]. Υπήρξε η πιο εκτεταμένα μελετηθεί μεθυλτρανσφεράση συντήρηση και είναι άφθονο σε καρκινικά κύτταρα και ιστούς. Σε σύγκριση, DNMT2 δεν φαίνεται να έχουν σημαντική δραστικότητα μεθυλίωση και DNMT3L είναι πιθανό να περιοριστεί στο DNA κατά τη διάρκεια της μεθυλίωσης βλαστικής σειράς ανάπτυξης [5]. Τέλος, Dnmt3a και DNMT3B είναι γνωστό ότι είναι de novo methylators του CpG θέσεις [6], οι οποίες έχουν μεγαλύτερη δραστικότητα μεθυλοτρανσφεράσης για μη μεθυλιωμένο DNA από DNMT1 και μπορούν να συμβάλουν στην de ηονο μεθυλίωση κατά την διάρκεια της εμβρυογένεσης [7], [8]. Αν και DNMT φέρεται να σχετίζεται με κάποια επιθετικών καρκίνων όπως ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, καρκίνος του στομάχου, μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, το λέμφωμα και καρκίνοι του προστάτη [9], [10], [11], [12], [13], του ρόλος παραμένει αμφιλεγόμενη και η συνολική ρύθμιση, το συντονισμό και τη δραστηριότητα των DNMTs είναι ασαφές με διαφορετικούς καρκίνους. Επιπλέον, ο μηχανισμός της DNMTs σε καρκινικά κύτταρα και η σύνδεσή της με διηθητική κακοήθη δυνατότητες και τα κλινικά αποτελέσματα μετά την επεξεργασία δεν έχουν περιγραφεί.

Πρόσφατα αναφέρθηκε ότι η επιγενετική ρύθμιση των ΤΟΡ-β-επαγόμενη έκφραση του Foxp3 μπορεί να είναι μεσολαβεί η αδρανοποίηση των εξωκυτταρικών κινασών σήματος ρυθμιζόμενη (ΕΚΚ), η οποία μπορεί να ρυθμίζει προς τα κάτω DNMTs σε καλοήθη κύτταρα [14]. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, τα κύτταρα ΚΓΠ και ιστών είναι ευαίσθητα στην ΤΟΡ-β-διαμεσολαβούμενη αναστολή αύξησης και διαθέτουν προτύπων μεθυλίωσης υποκινητή οι οποίες μειώνουν την έκφραση του TβRs (TβRI και TβRII) [4], [15], [16]. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η έλλειψη ευαισθησίας προς ΤΟΡ-β σε ορισμένα κύτταρα καπάκι είναι τουλάχιστον εν μέρει λόγω της μεθυλίωσης υποκινητή του TβRs. Τα ευρήματα αυτά μας οδήγησαν να διερευνήσει τις ακόλουθες δύο υποθέσεις στην παρούσα μελέτη: 1) Μπορεί να υπάρχει διαφωνία μεταξύ προέρχεται όγκου TGF-β και DNMTs που σχετίζεται με μεθυλίωση στον καρκίνο? 2) DNMTs μπορεί να σχετίζεται στενά με την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη και τα αποτελέσματα μετά από ριζική προστατεκτομή. Για τις γνώσεις μας, το θέμα αυτό το θέμα δεν έχει ακόμη αναφερθεί.

Ο σκοπός της μελέτης μας ήταν αρκετές φορές. Πρώτον, επιδιώξαμε να ερευνήσει τις αντίστοιχες αλλαγές στις DNMT και TβRs έκφραση και ενεργοποίηση ERK μετά κατεργασία κυττάρων καπάκι με ποικίλους βαθμούς επεμβατική ικανότητα και καλοήθη επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη με ΤΟΡ-β. Στη συνέχεια, εξετάσαμε την επίδραση ενός αντισώματος εξουδετέρωσης του ΤΟΡ-β επί της έκφρασης DNMTs και την ανάπτυξη του όγκου in vivo χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος. Τέλος, θα εξεταστεί αν η ενεργοποίηση της DNMTs συνδέθηκε με βιοχημική υποτροπή μετά από ριζική προστατεκτομή.

Υλικά και Μέθοδοι

(Μια λεπτομερής εξήγηση παρουσιάζεται στη Μέθοδο S1)

Γραμμές κυττάρων

Η ΚΓΠ κυτταρική σειρά κυττάρων ποντικού TRAMP-C2 ελήφθη από τον Dr. Ν Greenberg [12]. Η καλοήθης κυτταρική σειρά ανθρώπινων επιθηλιακών προστάτη, RWPE-1, αγοράστηκε από την American Type Culture συλλογή (ATCC). ΒΡΗ-1 κύτταρα ευγενώς από τον Dr. Simon Hayward. Τέσσερις παραλλαγές του ανθρώπινου CaP PC-3 κυτταρικές σειρές (PC-3, PC-3M-Pro4, PC-3M και PC-3M-LN4) με διάφορους βαθμούς επεμβατικές δυνατότητες παρεσχέθησαν ευγενώς από τον Dr. Fidler και ο Δρ Pettaway [ ,,,0],17], [18], [19], [20]. Ο λόγος που επιλέξαμε PC-3 παραλλαγές ήταν επειδή αυτές οι παραλλαγές προέρχονται από την ίδια κυτταρική γραμμή, αλλά διαφέρουν ως προς την επιθετική τους δυνατότητες. Τα αποτελέσματα της ρύθμισης σηματοδότησης ήταν περισσότερο συγκρίσιμο σε αντίθεση με τη χρήση των διαφόρων ειδών των κυτταρικών σειρών καπάκι. Για ορισμένα πειράματα, τα κύτταρα καθίστανται ευαίσθητα στην ΤΟΡ-β (ως αρνητικός έλεγχος) με την εισαγωγή ενός TβRIIDN όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21], [22]. Σε μερικά πειράματα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς ΤΟΡ-β1 ή ΜΕΚ αναστολέα U0126 (Promega). Τέλος, ορισμένα πειράματα περιελάμβανε τη χρήση αντι-ΤΟΡ-β (1, -2, -3) εξουδετέρωση mAb (κλώνος 1D11? Ένα δώρο από την Genzyme Corporation) όπως περιγράφεται προηγουμένως [23], [24]. (Μέθοδος S1).

ΤΟΡ-β1 ELISA

RWPE-1, ΒΡΗ-1 και όλες οι παραλλαγές PC3 και το αντίστοιχο TβRIIDN μολυσμένα κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε φρέσκο ​​άνευ ορού μέσων για 24 ώρες . TGF-β1 ELISA διεξήχθη με τη χρήση του Ανθρώπου TGF-β1 Immunoassay Kit (R &? D Systems). (Μέθοδος S1)

[

3Η] -θυμιδίνης Δοκιμασία Ενσωμάτωση

Όλα τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε καλλιέργεια για 48 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια εκτίθενται σε ένα μέσο που περιέχει [

3Η] -θυμιδίνης (0.5 μΟί /κ.εκ? Amersham Biosciences) για επιπλέον 5 ώρες. Η ενσωμάτωση θυμιδίνης εκφράστηκε ως το κλάσμα των μετρήσεων που βρέθηκαν σε κύτταρα των μη επεξεργασμένων ελέγχων (Μέθοδος S1).

Western ανάλυση κηλίδος

αναλύσεις κηλίδος Western διεξήχθησαν για σύγκριση TβRs, DNMTs και έκφραση ERK μετά από διαφορετικές θεραπείες πάροδο του χρόνου (Μέθοδος S1).

ειδική της μεθυλίωσης PCR (MSP) και Sequencing

MSP για την κατάσταση μεθυλίωσης του TβRs πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με προηγούμενη αναφορά μας [4]. Εντοπίστηκαν οι μετουσιωμένο τοποθεσίες σε θέσεις κυτοσίνη με /χωρίς θεραπεία 5-Aza ή TGF-β.

ανοσοφθορισμού και Συν-χρώση

μελέτες ανοσοφθορισμού πραγματοποιήθηκαν σε όλα τα PC-3 παράγωγα κυτταρική σειρά όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22], [25]. Για συν-εντοπισμό των DNMTs και φωσφορυλιωμένων ERK (ρ-ERK), τα κύτταρα αναλύθηκαν με τη χρήση πυρήνα (DAPI) -DNMTs (TR) -ρ-ΕΚΚ (FITC) τριπλή χρώση (Μέθοδος S1).

Ποσοτική RT-PCR

Ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα καλοήθους προστάτη RWPE-1 και ΒΡΗ-1, και το καπάκι PC-3 σε συνέχειες) καλλιεργήθηκαν σε φρέσκο ​​μέσο για 24 ώρες, στη συνέχεια εκτίθενται για 24 ώρες είτε: 1) εξωτερικά ανασυνδυασμένου ΤΟΡ-β1 (10 ng /ml), 2) αντι-ΤΟΡ-β εξουδετερωτικά μονοκλωνικά Ab (1D11? 5 μg /ml), ή 3) ΜΕΚ αναστολέα U0126 (5 μΜ). Ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ RNeasy (Qiagen). Εκκινητές για την ανθρώπινη για DNMTs [26] και TβRs [4] εισήχθησαν στη μέθοδο S1.

τηλέφωνα εισβολή δοκιμασία

δοκιμασία κυττάρων εισβολής (δοκιμασία εισβολή Matrigel) έγινε σε 24-καλά Transwell θάλαμο (8 μm μέγεθος πόρων? CytoSelect? κυττάρων Biolabs). Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 0.5 χ 10

6 να 1,0 × 10

6 /ml σε μέσο χωρίς ορό. ΤΟΡ-β1 ή /και Erk αναστολέα UO126, 5-Αζα προστέθηκαν απευθείας στο κυτταρικό εναιώρημα, και 24 ώρες αργότερα, το εναιώρημα αναρροφήθηκε και τα εισέβαλαν κύτταρα μετρήθηκαν με ένα μικροσκόπιο φωτός υπό υψηλή μεγέθυνση του αντικειμενικού φακού (× 100? Της Olympus) και μετράται σε Α560 nm σε μια συσκευή ανάγνωσης πλάκας μετά τη θεραπεία με το διάλυμα εκχύλισης.

Μελέτες σε ζώα

Η μελέτη ξεκίνησε με τη χρήση της υποδόριας (SC) ένεση του καρκίνου του προστάτη κυττάρων ποντικού TRAMP-C2 επιμολυσμένα με HSV1-tk-GFP-λουσιφεράσης (SFG-nTGL) φορέα έκφρασης του γονιδίου αναφοράς [27], [28] στην δεξιά περιοχή πλευρό 30 ποντικούς C57BL /6 όπως περιγράφεται προηγουμένως [25]. Τα ζώα χωρίστηκαν τυχαία σε μία από τρεις ομάδες μετά από ενδοπεριτοναϊκή ενέσεις με το ειδικό αντι-ΤΟΡ-β αντίσωμα εξουδετέρωσης 1D11 ή αντίσωμα ελέγχου 13C4 όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23], [24]. Όλα τα ποντίκια θυσιάστηκαν μετά από 15 ενέσεις των αντισωμάτων και την ομάδα 3 θυσιάστηκαν για το ίδιο χρονικό διάστημα. (Μέθοδος S1). Αυτή η μελέτη έλαβε έγκριση από την επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Northwestern (Evanston, IL). Northwestern University ACUC αριθμό πρωτοκόλλου Έγκριση 2007 – 0565. »(Επιστολή S1).

Κατασκευή ιστικές μικροσυστοιχίες (TMAs) και του κλινικού αποτελέσματος Assement

Οι υπάρχουσες πληροφορίες κλινική περίπτωση και κλίση του ιστού εγκατεστημένος μας προστάτη βάση δεδομένων του προγράμματος SPORE στο Πανεπιστήμιο Northwestern χρησιμοποιήθηκε. Όλα τα συμμετέχοντα άτομα παρέχεται γραπτή συγκατάθεση από Memorial Hospital Northwestern και η μελέτη εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review Πανεπιστημίου Northwestern (Η IRB αριθμός είναι 1480-002, Letter S2). Ένα σύνολο 243 ριζική προστατεκτομή δείγματα ήταν διαθέσιμα με τις σχετικές κλινικές πληροφορίες. Μια σειρά από προστάτη TMAs κατασκευάστηκαν με σταθεροποιημένο με φορμαλίνη, ριζική προστατεκτομή δείγματα εμπεδωθεί με παραφίνη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [4], (Μέθοδος S1 και S2 Μέθοδος).

Ανοσοϊστοχημεία

Όλα τα αντισώματα εγείρονται έναντι DNMTs, φωσφορυλιωμένη ERK (ρ-ΕΚΚ), ολική ΕΚΚ (t-ΕΚΚ), φωσφορυλιωμένο Smad2, TβRI και TβRII πρώτα δοκιμαστεί και βελτιστοποιηθεί σε τομές ολόκληρου ιστού και συστοιχίες δοκιμή όπως περιγράφηκε προηγουμένως [4], [17], [29 ], [30], (Μέθοδος S1 και S2 μέθοδος).

Στατιστική Ανάλυση.

Το SPSS 10.0.7 πακέτο λογισμικού (SPSS, Inc.) χρησιμοποιήθηκε για όλες τις αναλύσεις. Καμπύλη επιβίωσης Kaplan-Meier αναλύθηκε με τη δοκιμασία log-rank με τη χρήση του λογισμικού Graphpad Prism 4.02 (Graphpad Software) (Μέθοδος S1).

Αποτελέσματα

1. έκφραση DNMTs συσχετίζεται με προς τα κάτω ρύθμιση των TβRs και πιο επεμβατική φαινοτύπους καρκίνου του προστάτη

δοκιμασία ELISA για αρχικά για να προσδιοριστεί αν υπήρχαν διαφορές στα επίπεδα ενδογενούς έκφρασης του ΤΟΡ-β σε διαφορετικά CaP κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με την καλοήθεις κυτταρικές σειρές του προστάτη. Βρήκαμε ότι όλοι οι κυτταρικές σειρές PC-3 που εκφράζεται σημαντικά υψηλότερα επίπεδα του ΤΟΡ-β (χ 2 έως 6 φορές) σε σύγκριση με την ΒΡΗ-1 και RWPE-1 (ρ & lt? 0,05). Επιπλέον, βρήκαμε ότι περισσότερο επεμβατική κύτταρα (PC-3M και PC-3M-LN4) που εκκρίνεται σχεδόν 2 φορές υψηλότερα αρχικά επίπεδα του ΤΟΡ-β1 σε σύγκριση με τα λιγότερο επεμβατικές κυτταρικές γραμμές (PC-3 και PC-3M-Pro4) ( Εικ. 1Α).

Α. δοκιμασία ELISA που καταδεικνύουν ότι κυτταρικές σειρές PC-3 εκφράζουν σημαντικά (ρ & lt? 0,05) υψηλότερη (χ 2-6 φορές) επίπεδα του ΤΟΡ-β σε σύγκριση με καλοήθη κυτταρικές σειρές του προστάτη, ΒΡΗ-1 και RWPE-1. Επιπλέον, PC-3M και PC-3M-LN4, εκκρίνεται σχεδόν 2 φορές υψηλότερα αρχικά επίπεδα του ΤΟΡ-β1 σε σύγκριση με PC-3 και τα κύτταρα PC-3M-Pro4, αντίστοιχα, οι οποίες είναι λιγότερο επεμβατικές. B. Μία δοκιμασία ενσωμάτωσης θυμιδίνης δείχνει ότι η ανάπτυξη του RWPE-1 και ΒΡΗ-1 κύτταρα αναστέλλεται σημαντικά από την έκθεση σε TGF-β1. Σε σύγκριση, η αύξηση των PC-3 και τα κύτταρα PC-3M-Pro4 είναι μόνο ελαφρώς αναστέλλεται, και PC-3M-LN4 και PC-3M κύτταρα δεν δείχνουν σημαντική απόκριση σε ΤΟΡ-β1 έκθεση. C. Σε όλες τις κυτταρικές γραμμές καρκίνου (εδώ δείχνουμε PC-3 ως παράδειγμα), η αναστολή του ΤΟΡ-β με τη χρήση του TβRIIDN κατασκεύασμα σαν αποτέλεσμα σημαντικά υψηλότερες αφελή έκφραση TβRII, και D. υψηλότερη έκκριση ΤΟΡ-β. Παρόμοια ευρήματα που βρέθηκαν στα ευρήματα στις πιο επεμβατική κυτταρικές σειρές. Σε σύγκριση, δεν υπήρχε διαφορά στην έκφραση των TβRII στην ΚΥΠ-1 ή RWPE-1, όταν μολύνθηκαν με TßRIIDN (Πίνακας S1).

Η

Εμείς επιβεβαίωσε ότι διαφορετικά κυττάρων του προστάτη γραμμές συμπεριφέρονται διαφορετικά σε απόκριση σε εξωγενή έκθεση ΤΟΡ-β1. Για παράδειγμα, βρήκαμε ότι RWPE-1 και ΒΡΗ-1 κύτταρα ήταν πιο ευαίσθητα σε εξωγενή TGF-β1 καθώς η ανάπτυξη τους ανεστάλη κατά 64,1% και 61,9%, αντίστοιχα, μετά από 24 ώρες θεραπείας με ΤΟΡ-β1. Σε σύγκριση, τα κύτταρα PC-3M-Pro4 PC-3 και ανεστάλησαν μόνο κατά 13,7% και 12,3%, αντίστοιχα. Τέλος, ο ρυθμός αύξησης των PC-3M-LN4 και PC-3M ήταν ανεπηρέαστη από την έκθεση ΤΟΡ-β1 (Εικ. 1Β). Είναι ενδιαφέρον ότι, σε κυτταρικές γραμμές CaP, η αναστολή της σηματοδότησης ΤΟΡ-β, με χρήση των κυρίαρχων αρνητικών τύπου II ΤΟΡ-β υποδοχέα (TßRIIDN) κατασκεύασμα, συσχετίστηκε με σημαντικά υψηλότερη ενδογενή έκφραση TβRII (χρησιμοποιώντας αντισώματα που κατευθύνονται έναντι της ενδοκυτταρικής περιοχής, επειδή TβRIIDN περιλαμβάνει μόνο εξωκυτταρικές και διαμεμβρανικές περιοχές, αλλά όχι ενδοκυτταρική περιοχή) (Σχ. 1C) και υψηλότερη έκκριση ΤΟΡ-β (Σχ. 1D). Σε σύγκριση, δεν υπήρχε διαφορά στην έκφραση του ΤΟΡ-β στην ΚΥΠ-1 ή RWPE-1, όταν μολύνθηκαν με τον ρετροϊικό TβRIIDN κατασκεύασμα (Πίνακας S1).

Σε αντίθεση με την έκφραση του ΤΟΡ- β, αμφότερα TβRI και έκφραση TβRII μειώθηκε σημαντικά στις πιο επεμβατική κυτταρικές σειρές, PC-3M-LN04 και PC-3M, σε σύγκριση με το PC-3 και τα κύτταρα PC-3M-Pro4 (Εικ. 2Α). Ο αποκλεισμός του ΤΟΡ-β σηματοδότησης με τον φορέα TβRIIDN προκάλεσε αύξηση περίπου δύο έως δέκα φορές στην έκφραση τόσο της TβRI και TβRII σε όλες τις κυτταρικές σειρές CaP (Σχ. 2Β). Λαμβανόμενα μαζί αυτό υποδηλώνει ότι τα αυξημένα αρχικά επίπεδα του ΤΟΡ-β σχετίζονται με την αναστολή της έκφρασης TβRs. Ο αποκλεισμός της ενδοκυτταρικής σηματοδότησης ΤΟΡ-β είχε ως αποτέλεσμα πάνω ρύθμιση της έκκρισης του ΤΟΡ-β σε καρκινικά κύτταρα.

A. κηλίδα Western αναλύσεις δείχνουν ότι σε αντίθεση με την έκφραση του TGF-β, και οι δύο TβRI και έκφραση TβRII (όπως περιγράφεται στο Σχήμα 1 Β) μειώνεται σημαντικά στις πιο επεμβατική κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με λιγότερο επεμβατικές κυτταρικές γραμμές. B. Αποκλεισμός της ΤΟΡ-β σηματοδότηση με την TβRIIDN προκαλεί σημαντική αύξηση των TβRIs έκφρασης σε όλες τις κυτταρικές σειρές. C. Σε αντίθεση με την έκφραση του TβRs, η υπερέκφραση του DNMTs συνδέεται με πιο επεμβατική κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με τις λιγότερο επεμβατικές κυτταρικές γραμμές. D. Ο αποκλεισμός του ΤΟΡ-β σηματοδότηση με TβRIIDN προκάλεσε ≥3 φορές μείωση στην έκφραση της DNMTs. Η αντίστοιχη τιμή (σχετική αναλογία TβRs /GAPDH, ή DNMTs /GAPDH) παρουσιάζεται στο δεξί διαγράμματα. (Εικ. 2Α και 2Β ήταν από την ίδια Western Blot της εικόνας, και Το σχ. 2C και 2D ήταν από την άλλη εικόνα στυπώματος Western ενιαία).

Η

Δεδομένου ότι η μεθυλίωση προαγωγού του TβRs σχετίζεται με μειωμένη έκφραση [ ,,,0],4], συγκρίναμε τα επίπεδα έκφρασης των DNMTs στις διάφορες CaP κυτταρικές σειρές. Σε γενικές γραμμές, οι πιο επεμβατικές PC-3M-LN4 και PC-3M κύτταρα έδειξαν αυξημένη έκφραση του DNMTs, σε σύγκριση με την λιγότερο επεμβατική PC-3 και PC-3M-Pro4 (Σχ. 2C). Ο αποκλεισμός του ΤΟΡ-β σηματοδότησης με τον φορέα TβRIIDN προκάλεσε ≥3 φορές μείωση στην έκφραση του DNMTs σε όλες τις κυτταρικές σειρές CaP (Εικ. 2D), και υπήρχε μία αντίστοιχη αύξηση στην έκφραση τόσο του TβRI και TβRII (Σχ. 2Β). Η αντίστοιχη τιμή (σχετική αναλογία TβRs /GAPDH, ή DNMTs /GAPDH) παρουσιάζεται στο δεξί πάνελ. Η διαπίστωση αυτή ενισχύεται και από πρόσθετες επιβεβαιωτικές μελέτες. αναλύσεις ανοσοστυπώματος έδειξαν ότι μετά από θεραπεία με 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5-Αζα), η έκφραση του TβRI και TβRII σε PC-3 αυξήθηκαν δραματικά. Αντίθετα, η έκφραση και των δύο TβRI και TβRII μειώθηκε σημαντικά με τη θεραπεία του ΤΟΡ-β και η αλλαγή αυτή μπορούσε να ανακτηθεί όταν 5-Αζα προστίθεται (Σχήμα S1A). Ομοίως, σε πραγματικό χρόνο PCR επιβεβαίωσε ότι η έκφραση και των δύο TβRI και TβRII αυξήθηκε 2 έως 2,5 πτυχώσεις μετά την επεξεργασία του 5-Αζα σε PC-3 κύτταρα. Η θεραπεία με ΤΟΡ-β κατέστειλε τις εκφράσεις του TβRI και TβRII 46% και 29% αντίστοιχα (Σχήμα S1B). Εντοπίσαμε επίσης την κατάσταση μεθυλίωσης του TβRI και TβRII υποκινητές, χρησιμοποιώντας τις ίδιες μεθοδολογίες προσέγγισης MSP και αλληλουχίας [4]. Χρησιμοποιώντας αυτή την τεχνική, βρήκαμε τις ίδιες μετουσιωμένο χώρων ως προηγούμενη μελέτη μας [4] ότι κυτοσίνη θέσεις -251, -231, -244, -348, -356 και -365 στον προαγωγό της TβRI, και 27, 32 και -140 για τον υποκινητή του TβRII μεθυλιώθηκαν (Σχήμα S1c). PC-3 κύτταρα έχουν επίσης ένα τμήμα του TβRI και TβRII υποκινητές που είναι μη μεθυλιωμένα. Είναι ενδιαφέρον ότι, η αγωγή με ΤΟΡ-β αύξησε την κατάσταση μεθυλίωσης, αλλά η θεραπεία με 5-Αζα μετατραπούν όλα τα μεθυλιωμένα περιοχές για να μη μεθυλιωμένα. Η δοκιμασία ενσωμάτωσης θυμιδίνης έδειξε ότι ο πολλαπλασιασμός των PC-3 κύτταρα μόνο μέτρια αναστέλλεται μετρίως από εξωγενή TGF-β. Σε σύγκριση, 5-Αζα θεραπεία οδήγησε σε σημαντική αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, ανεξάρτητα από το αν εξωγενούς ΤΟΡ-β προστέθηκε μέσα στην καλλιέργεια ή όχι. Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά παρατηρήθηκε μεταξύ της θεραπείας με τα δύο 5-Αζα και ΤΟΡ-β ή με 5-Αζα μόνο (Ρ & gt? 0,05) (Σχήμα S1D)

2.. έκφραση DNMTs διαμεσολαβείται μέσω ενός φωσφορυλιωμένου-ΕΚΚ οδού που εξαρτάται

προηγούμενες μελέτες μας αποδεικνύουν ότι η ERK μπορεί να επηρεάσει την έκφραση DNMT σε καλοήθη κύτταρα [14]. Γι ‘αυτό φρόντισε να διαπιστώσει αν το επίπεδο των ενεργοποιημένων ERK (φωσφορυλιωμένη ERK? P-ΕΚΚ) σχετίζεται με TGF-β επαγόμενη έκφραση DNMTs. Για να ελέγξει την υπόθεση αυτή, θα καθορίζεται πρώτα το επίπεδο της p-ERK στα καλοήθη κύτταρα του προστάτη και τον συνέκρινε με τα επίπεδα σε διαφορετικές CaP κυτταρικές σειρές. ΒΡΗ-1 και RPWE-1 κύτταρα εξέφρασαν σημαντικά υψηλότερα αρχικά επίπεδα του p-ERK από PC-3 κύτταρα (Σχ. 3Α). Είναι ενδιαφέρον ότι η χρονική πορεία της έκφρασης ρ-ERK μετά από έκθεση σε ΤΟΡ-β ήταν διαφορετική μεταξύ των καλοήθων και κακοήθων κυτταρικών γραμμών. Συγκεκριμένα, υπήρχε μια εξαρτώμενη από το χρόνο θετική συσχέτιση μεταξύ της θεραπείας με ΤΟΡ-β1 και την έκφραση της ρ-ERK σε όλες τις κυτταρικές σειρές PC-3. Στην πραγματικότητα, αυτή η ταχεία αύξηση στην έκφραση ρ-ERK (4 φορές) άρχισε μέσα σε 5 λεπτά μετά την αγωγή ΤΟΡ-β1. Τα επίπεδα του p-ERK συνέχισε να αυξάνεται κατά τη διάρκεια όλων μετέπειτα χρονικά σημεία έως και 30 λεπτά μετά την προσθήκη ΤΟΡ-β1. Σε αντίθεση, η έκφραση του ρ-ERK ταχέως ανασταλεί (& lt? 5 λεπτά) μετά την προσθήκη του ΤΟΡ-β1 στο μέσο της καλοήθους κυττάρων, με έναν τρόπο που ήταν ανεξάρτητη από τη συνολική έκφραση της πρωτεΐνης ERK (Εικόνα 3Α).. μελέτες ανοσοφθορισμού στη συνέχεια χρησιμοποιείται για να σας βοηθήσει να προσδιορίσετε αν p-ERK και DNMTs ήταν συν-εντοπίζεται στις ίδιες κυτταρικές περιοχές. Για το σκοπό αυτό, συνεστιακή μικροσκοπικές αναλύσεις φορμαλδεΰδης σταθερών ανοσοχρωματίστηκαν PC-3 κύτταρα, απουσία ή παρουσία ΤΟΡ-β1, κατέδειξαν συν-loczalization μεταξύ ρ-ERK και DNMTs σήματα. Μόνο τα κύτταρα με ρ-ERK ανοσοφθορισμού επέδειξε DNMT έκφρασης. Αντίθετα, όταν το PC-3 κύτταρα κατέστησαν ευαίσθητα στην ΤΟΡ-β1 από επιμόλυνση με το TβRIIDN, τα επίπεδα και των δύο π-ERK και DNMTs μειώθηκαν δραματικά, όπως προσδιορίζεται με χρώση immunofluorsence (Σχ. 3Β). Για την καλύτερη ποσοτικοποίηση της σχέσης μεταξύ του ΤΟΡ-β1, ρ-ERK και DNMTs, χρησιμοποιήσαμε την επόμενη πραγματικού χρόνου PCR. Αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι η έκθεση σε TGF-β1 για 24 ώρες αύξησε σημαντικά την έκφραση και των τριών DNMTs (~16.7% -14%) σε όλα τα PC-3 κυτταρικές γραμμές που μελετήθηκαν. Η θεραπεία με ένα αντίσωμα ειδικό για τον ΤΟΡ-β1 (1D11? 5 mg /ml) ή το ειδικό αναστολέα ΕΚΚ, UO126, οδήγησε σε σημαντική προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης DNMTs mRNA (~33.9% -52.3%, και ~41.5% -57,6% αντίστοιχα, το Σχ. 3C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ο TGF-β μεσολαβούμενη έκφραση της DNMTs σχετίζεται με μια αύξηση στην p-ERK σε καρκινικά κύτταρα. Συγκεκριμένα, προερχόμενο όγκο ΤΟΡ-β φαίνεται να είναι υπεύθυνη για αυτή την ενεργοποίηση ERK, ως αποκλεισμός της αρχικής εκκρίνεται ΤΟΡ-β είχε ως αποτέλεσμα μια μεγάλη αλλαγή στην έκφραση του DNMTs (Σχ. 3C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν επίσης ότι προέρχεται όγκο ΤΟΡ-β ενεργοποίηση με τη μεσολάβηση ERK είναι τουλάχιστον ένας από τους σημαντικότερους μεσολαβητές για ΤΟΡ-β επαγόμενη έκφραση του DNMTs που οδηγούν σε TβRs τα κάτω ρύθμιση με μεθυλίωση προαγωγού σε CaP [4], [14]. Μετά την επεξεργασία με ΤΟΡ-β, υπήρξε μια σημαντική αύξηση των επεμβατικών δυνατοτήτων των κυττάρων καπάκι. Εισβολή των κυττάρων ΚΓΠ παρεμποδίζεται είτε με αναστολέα της TGF-β 1D11, ή ρ-ΕΚΚ αναστολέας U0126 ή DNMT inhibor 5-Aza. Η αναστολή της εισβολής από την U0126 δεν θα μπορούσε να αναστραφεί με κατεργασία του ΤΟΡ-β1. Σημαντικά, DNMTs αναστολέας της 5-Αζα μπορεί ανέστειλε δραματικά την εισβολή κυττάρων καπάκι, ακόμη περισσότερο από τον αποκλεισμό του ΤΟΡ-β ή ρ-ERK (Σχ. 3D). Αυτή η παρατήρηση προτείνει ότι p-ERK ήταν προς τα κάτω παράγοντας TGF-β, και συνεργικά μεσολαβεί TGF-β ρυθμίζονται DNMTs η οποία συνδέεται στενά με την επεμβατική ικανότητα των κυττάρων του Κεφ.

Α. Τα καλοήθη κύτταρα ΒΡΗ-1 και RPWE-1 εκφράζουν σημαντικά υψηλότερα αρχικά επίπεδα του p-ERK από τα κύτταρα PC-3. Υπάρχει μια εξαρτώμενη από το χρόνο θετική συσχέτιση μεταξύ της θεραπείας με ΤΟΡ-β1 και την έκφραση της ρ-ERK σε κύτταρα PC-3. Τα επίπεδα του p-ERK συνεχίσει να αυξάνεται κατά τη διάρκεια όλων μετέπειτα χρονικά σημεία έως και 30 λεπτά μετά την προσθήκη ΤΟΡ-β1. Σε αντίθεση, η έκφραση του ρ-ERK ταχέως (& lt? 5 λεπτά) ανέστειλε μετά ΤΟΡ-β1 έκθεση σε καλοήθη κύτταρα κατά ένα τρόπο που είναι ανεξάρτητος της συνολικής έκφρασης πρωτεΐνης ERK. Β ανοσοφθορισμού αποκαλύπτει ότι μόνο κύτταρα (αυτό είναι PC3 για παράδειγμα) που εκφράζουν ρ-ΕΚΚ έκφραση έκθεμα DNMT. Σε αντίθεση, όταν τα κύτταρα PC-3 καθίστανται ευαίσθητα στην ΤΟΡ-SS1 από TβRIIDN, τα επίπεδα τόσο της ρ-ERK και DNMT μειωθεί σημαντικά (μεγέθυνση: 10 × 20). Γ Πραγματοποιήσαμε πραγματικό χρόνο PCR για την καλύτερη ποσοτικοποίηση της σχέσης μεταξύ του ΤΟΡ-β1, ρ-ERK και DNMTs. Η έκθεση σε ΤΟΡ-β1 αύξησε σημαντικά την έκφραση και των τριών DNMTs σε PC-3 κύτταρα. Η θεραπεία με 1D11, ή αναστολέα ΜΕΚ, UO126 συνδέεται με την προς τα κάτω ρύθμιση όλων έκφρασης DNMT mRNA. Δ (Εδώ δείξαμε πιο επιθετική PC-3M ως δείγμα). Υπήρξε μια σημαντική αύξηση στην κυτταρική κινητικότητα μέσω Matrigel επικαλυμμένα πολυανθρακική μεμβράνη κάτω από την θεραπεία του ΤΟΡ-β1 (10 ng /mL). Η εισβολή όλων των κυττάρων CaP μπορούσε να ανασταλεί με το φράξιμο του σήματος ΤΟΡ-β με 1D11 ή χρησιμοποιώντας ένα UO126 αναστολέα ρ-ΕΚΚ, ή DNMT αναστολέας της 5-Αζα χωριστά. Η αναστολή της εισβολής από UO126 δεν μπορεί να επανέλθει με επεξεργασία TGF-β. Επάνω δεξιά πάνελ: αντίστοιχους αριθμούς των μεταστατικών κυττάρων. Κάτω δεξιά πίνακας: απορρόφηση τιμές. Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ρ-ΕΚΚ μεσολαβεί ΤΟΡ-β επαγόμενη DNMT ενισχύει την επεμβατική ικανότητα των κυτταρικών σειρών καρκίνου του προστάτη. (Μεγέθυνση, 10 × 10).

Η

3. In vivo επικύρωση των αποτελεσμάτων του ΤΟΡ-β στην ενεργοποίηση ERK, η έκφραση DNMT, και του προστάτη ανάπτυξη του καρκίνου

Για την επικύρωση εάν ΤΟΡ-β είναι υπεύθυνος για την ενεργοποίηση της ERK και πάνω ρύθμιση DNMTs που μπορεί να εμπλέκεται στην πρόοδο του όγκου in vivo, πραγματοποιήσαμε πειράματα χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο CaP ξενομοσχεύματος ποντικού που περιελάμβανε την έγχυση CaP κυττάρων όγκου κύτταρα (TRAMP-C2 επιμολύνονται σταθερά με HSV1-tk-GFP-λουσιφεράσης, 5 × 10

6 /έκαστο ποντίκι). Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε χρησιμοποιώντας απεικόνιση λουσιφεράσης. Χρησιμοποιήσαμε τρεις ομάδες ποντικών για την καλύτερη κατανόηση των επιπτώσεων της ΤΟΡ-β στην ενεργοποίηση ERK και έκφραση DNMT: Ομάδα 1: ποντίκια (η = 10) έλαβε τακτικές ενέσεις του ΤΟΡ-β αντίσωμα εξουδετέρωσης, 1D11. Ομάδα 2: ποντίκια (η = 10) έλαβαν το αντίσωμα ελέγχου ισοτύπου, 13C4, στα ίδια τακτικά διαστήματα, όπως ομάδας 1. Ομάδα 3: δεν υποβλήθηκαν σε θεραπεία μετά την ένεση ξενομοσχεύματος ως έλεγχος. Βρήκαμε ότι η ανάπτυξη του όγκου ανεστάλη σημαντικά με αντι-ΤΟΡ-β αντίσωμα 1D11, θεραπεία (Ομάδα 1) συγκριτικά με τις άλλες δύο ομάδες (Εικ. 4Α, 4Β). Στην πραγματικότητα, κατά το τέλος της περιόδου θεραπείας των 45 ημερών, ένα από τα δέκα ποντίκια (10%) σε αυτή την ομάδα ήταν ελεύθερο όγκου. Στις υπόλοιπες 9 ποντικούς, το μέσο βάρος του όγκου και ο όγκος ήταν 5.3 g και 6,85 cm

3, αντίστοιχα. Σε σύγκριση, οι όγκοι βρέθηκαν σε όλα τα ποντίκια στις ομάδες 2 και 3. Το μέσο βάρος και ο όγκος των όγκων στα 10 ζώα που έλαβαν θεραπεία με το αντίσωμα μάρτυρα (Ομάδα 2) ή χωρίς αγωγή (Ομάδα 3) ήταν σημαντικά μεγαλύτερη (Εικ. 4C) . Δεν υπήρχαν μεταστάσεων σε όλες τις ομάδες, όπως αξιολογείται με απεικόνιση βιοφωταύγειας. Ανοσοϊστοχημική ανάλυση των πρωτογενών όγκων αποκάλυψε ότι η έκφραση του ρ-ERK και DNMTs σε ζώα στην Ομάδα 1 ήταν σημαντικά χαμηλότερες από εκείνες των άλλων δύο ομάδων (Εικ. 4D).

A. IVIS σύστημα 100 απεικόνισης χρησιμοποιήθηκε για την παρακολούθηση της ανάπτυξης του όγκου σε πραγματικό χρόνο. Βρήκαμε ότι η ανάπτυξη του όγκου αναστέλλεται σημαντικά με τη θεραπεία των 1D11 σύγκριση με την ομάδα 2 (13C4 θεραπεία) και 3 (αριθ θεραπεία ελέγχου). θεραπεία Β 1D11 αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου σε ένα χρονικό διάστημα εξαρτώμενο τρόπο. C, Στο τέλος της περιόδου θεραπείας των 45 ημερών, οι ποντικοί θυσιάστηκαν και οι όγκοι απομονώθηκαν. Το μέσο βάρος του όγκου και ο όγκος ήταν 5.3 g και 6,85 cm

3, αντίστοιχα σε ομάδα θεραπείας 1D11. Σε σύγκριση, το μέσο βάρος και ο όγκος των όγκων στα 10 ζώα που έλαβαν θεραπεία με τον έλεγχο 13C4 ήταν σημαντικά μεγαλύτερη σε 15,8 g και 12,85 cm

3, αντίστοιχα. Οι αντίστοιχες τιμές στα ποντίκια που δεν έλαβαν θεραπεία ήταν 31,4 g και 23,39 εκατοστά

3, αντίστοιχα (

P

& lt? 0,01 σε τρεις ομάδες). Δ ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις των πρωτογενών όγκων αποκάλυψε ότι η έκφραση του ρ-ΕΚΚ, DNMTs σε ζώα με αγωγή 1D11 είναι σημαντικά χαμηλότερες από εκείνες των άλλων δύο ομάδων.

Η

4. DNMTs συσχετίζεται με τα κλινικά χαρακτηριστικά

Για να αξιολογηθεί η σχέση μεταξύ του ΤΟΡ-β και την επαγωγή DNMTs σε δείγματα CaP, συγκρίναμε τα επίπεδα έκφρασης του TGF-β1, ERK, ρ-ΕΚΚ, TβRI, TβRII, ρ- Smad2 και DNMTs σε αρχειοθετημένα δείγματα μικροσυστοιχίες ιστό που λαμβάνεται κατά τη στιγμή της ριζικής προστατεκτομής και να συσχετίζονται με τα κλινικά και παθολογικά χαρακτηριστικά που αντιστοιχούν ασθενών (Πίνακας S2 Κάθε δείκτης έχει ανατεθεί μια τιμή 0 (& lt?. 20% ανοσοχρώση των κυττάρων), 1 ( 20-49% ανοσοχρώση κυττάρου), 2 (50-74% ανοσοχρώση των κυττάρων) και 3 (75-100% ανοσοχρώση των κυττάρων), ανάλογα με το ποσοστό των καρκινικών κυττάρων να παρουσιάζουν θετική ανοσοχρώση. Η χρώση θετικού και αρνητικού ελέγχου έδειξε στο «Σχήμα S2 «. Βρήκαμε ότι ένα υψηλό επίπεδο έκφρασης του TGF-β1, ρ-ERK και DNMTs σε συνδυασμό με ένα χαμηλό επίπεδο έκφρασης του TβRI, TβRII, και ρ-Smad2 συνδέθηκε με δυσμενή παθολογικά χαρακτηριστικά, όπως ανώτερο βαθμό Gleason του ( Εικ. 5Α, εικ. 5Β, Πίνακας S3). τα αποτελέσματα αυτά αντιστοιχούν σε εύρημα μας στο PC-3M-LN4 και τα κύτταρα PC-3M που TGF-β επαγόμενη DNMTs συνδέεται με κλινικά πιο επιθετικό φαινότυπο.

. Ανοσοϊστοχημική ανάλυση των διαδοχικών τομών ΤΜΑ από έναν ασθενή με σκορ Gleason της 8ης, αποκάλυψε υψηλότερη έκφραση του ΤΟΡ-β, ρ-ΕΚΚ, DNMTs, αλλά χαμηλότερη έκφραση του TβRI και TβRII και ρ-Smad2 σε σύγκριση με σειριακές τομές που λαμβάνονται από έναν ασθενή με ένα χαμηλότερο βαθμό Gleason του 6. Αυτά τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά του επικρατέστερου πρότυπο χρώσης παρατηρήθηκε σε όλα τα δείγματα των ασθενών /συστοιχίες ιστών (μεγέθυνση: 10 × 20). Η αντίστοιχη συχνότητα (ή ποσοστό) της χρώσης και την ένταση της χρώσης θα μπορούσε να βρεθεί σε ΒΒ Υψηλά επίπεδα του ΤΟΡ-β1 έκφραση (Score = 3) ταυτοποιήθηκαν στο 42,3%, 8,9% και 7,0%, η έκφραση ρ-Erk σε 36,4%, 6,7% και 13,5%, η έκφραση DNMT1 στο 27,9%, 1,8% και 1,3%, η έκφραση Dnmt3a στο 40,6%, 11,9% και 6,7%, και η έκφραση DNMT3B στο 58,7%, 18,3% και 22,8% των υψηλών (≥8), το ενδιάμεσο