Τα διαγονιδιακά ποντίκια και αρουραίους είναι γενετικώς τροποποιημένα ζώα των οποίων τα γονιδιώματα έχουν μεταβληθεί με τη χρήση τεχνικών γενετικής μηχανικής. Τα γενετικά τροποποιημένα ποντίκια που χρησιμοποιούνται συνήθως για την έρευνα ή ως ζωικά μοντέλα ανθρώπινων ασθενειών. Πώς αυτοί οι επιστήμονες κάνουν αυτά τα διαγονιδιακά ζώα; Σε γενικές γραμμές, οι ερευνητές θα πρέπει κατ ‘αρχάς να κατασκευάσει ένα διαγονίδιο με έναν υποκινητή και ένα δομικό γονίδιο. Στη συνέχεια, το DNA παρασκευάζεται και μικροεγχύεται σε γονιμοποιημένα ωάρια ποντικού, και αργότερα τα διαγονιδιακά ποντίκια ή αρουραίους που γεννήθηκαν. Τα ακόλουθα χωρία παρέχουν μια σύντομη περιγραφή των βημάτων που απαιτούνται για την απόκτηση διαγονιδιακών ποντικών ή διαγονιδιακά ποντίκια.

1. Προγραμματισμό και την προετοιμασία του πειράματος

Κάποιος πρέπει να καταστήσουμε σαφές ότι αυτό που ο σκοπός είναι. Τότε πρέπει να αποκτήσετε ή να κλωνοποιήσουν το επιθυμητό υποκινητή και του δομικού γονιδίου και να δημιουργήσει μια δοκιμασία γονιδιακής έκφρασης για τη συγκεκριμένη έρευνα. Η έκφραση ορισμένων γονιδίων θα είναι επιβλαβής ή μη συμβατό με σωστή ανάπτυξη του εμβρύου. Η έκφραση ενός διαγονιδίου απαιτεί τα κατάλληλα στοιχεία μεταγραφικού ελέγχου να συμπεριληφθεί στο κατασκεύασμα DNA. Προκαταρκτικές μελέτες σε κυτταρικές καλλιέργειες μπορούν να έρθουν σε επαφή για να επαληθεύσει την ακεραιότητα της κατασκευής και της λειτουργίας του υποκινητή.

2. Κλώνος και η επαλήθευση της ακεραιότητας του διαγονιδίου

Πολλά πράγματα πρέπει να θεωρούνται κατά τη διάρκεια της κλωνοποίησης. Το διαγονίδιο πρέπει να περιέχει μοναδικό δείκτες έτσι ώστε η παρουσία της μπορεί να ανιχνευθεί εύκολα σε δείγματα DNA ιστό ποντικού και η έκφρασή του μπορεί να προσδιοριστεί και να διακριθεί από ενδογενή γονιδιακή έκφραση. Αλληλούχηση θραυσμάτων διασταύρωση θα πρέπει να διεξάγονται για να επιβεβαιωθεί ότι το διαγονίδιο έχει ένα λειτουργικό προαγωγό, κωδικόνιο έναρξης, και σήμα πολυαδενυλίωσης. Υπό τις καλύτερες συνθήκες, το διαγονίδιο θα πρέπει να ελέγχονται για την έκφραση σε ένα σύστημα καλλιέργειας κυττάρων πριν γίνουν διαγονιδιακά ποντίκια.

3. Καθιερώστε μια μέθοδο διαλογής

δοκιμασίας Μια PCR συνιστάται ιδιαίτερα για τον προσδιορισμό διαγονιδιακών ζώα. Πριν από την υποβολή του DNA για μικροέγχυση σε γονιμοποιημένα ωάρια ποντικού ή αρουραίου, θα πρέπει να προετοιμάσει ένα προσδιορισμό στυπώματος Southern ή PCR χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση του διαγονιδίου όταν εμβολιάζεται στο DNA ουρά σε συγκέντρωση ένα αντίγραφο. Μια δεύτερη δοκιμασία για την ανίχνευση ενός ενδογενούς γονιδίου ποντικού ή ένα ενδογενές γονίδιο αρουραίου είναι απαραίτητη για να αποδείξει ότι τα παρασκευάσματα του DNA είναι ελεύθερες αναστολέων PCR. Τα ζώα πρέπει να δοκιμάζεται με τα δύο δοκιμασίες έτσι ώστε να μην διαγονιδιακά ιδρυτής λανθασμένα απορρίπτεται επειδή η ουρά του DNA είναι μολυσμένο με αναστολείς PCR.

4. Καθιέρωση Εκδήλωση Δοκιμασία

Κάποιος μπορεί να χρησιμοποιήσει RT-PCR προσέγγιση , η έκφραση του RNA με in situ υβριδισμό ή δοκιμασία προστασίας ΚΝΑσης με RNA ανιχνευτές για να επιτευχθεί η έκφραση του διαγονιδίου. Η πρωτεΐνη που πρόκειται να παραχθεί πρέπει να είναι διαφορετική από τις πρωτεΐνες που εκφράζονται κανονικά στον ποντικό. Υπάρχουν διάφοροι τρόποι για να επιτευχθεί αυτό και κάποιος μπορεί να χρησιμοποιήσει ένα γονίδιο αναφοράς όπως μια φθορίζουσα πρωτεΐνη να απεικονίσει άμεσα τη διαδικασία.

5. DNA Καθαρισμός και μικροέγχυση.

κιτ εκχυλίσματος DNA συνιστάται για τον καθαρισμό της μικροέγχυσης DNA. Αλλά αν κάποιος θέλει χρησιμοποιούν μεγάλες θραύσματα του DNA, υπάρχει μια συγκεκριμένη πρωτόκολλο για την παρασκευή του DNA για μικροέγχυση BAC. Πολυάριθμες δημοσιεύσεις δείχνουν ότι οι BACs που περιέχουν προκαρυωτικές αλληλουχίες φορέα που εκφράζονται σε φυσιολογικά επίπεδα σε διαγονιδιακά ποντίκια. Σε αντίθεση με διαγονίδια πλασμίδιο που βασίζεται, αφαίρεση των ακολουθιών φορέα σε δεν απαιτείται για το BAC διαγονίδια. Τα διαγονιδιακά κατασκευάσματα στη συνέχεια ποσοτικοποιείται και με μικροένεση στα αυγά του ποντικιού και χειρουργικά μεταφέρονται σε παραλήπτες.

6. Ανάλυση Southern

Η ανάλυση 6 εβδομάδων Southern blot πρέπει να γίνει για να καθορίσει πόσα αντίγραφα του διαγονιδίου ολοκληρωμένη, και πόσες χρωμοσωμικές περιοχές το διαγονίδιο εισάγεται, καθώς επίσης και για την επαλήθευση διαγονιδιακά κατάσταση και να καθορίσει εάν η διαγονιδίου είναι άθικτη. Εκείνοι πληροφορίες απαιτούνται για να βεβαιωθείτε ότι τα διαγονιδιακά ιδρυτές με μια καλή πιθανότητα μετάδοσης ενός ακέραιου διαγονιδίου σε μια ενιαία θέση εισαγωγής μπορεί να επιλεγεί για την εντατική εκτροφή.