Αφηρημένο

Οι αδενοϊοί είναι εξαιρετικά ανοσογόνα και εξετάζονται ως πιθανοί φορείς για ανοσοθεραπεία. Η μόλυνση από αδενοϊό ογκολυτική ακολουθείται από μαζική αυτοφαγία στα καρκινικά κύτταρα. Εδώ, υποθέτουμε ότι η αυτοφαγία ρυθμίζει την επεξεργασία των αδενοϊικές πρωτεΐνες για την παρουσίαση του αντιγόνου. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, εξετάσαμε πρώτα την παρουσίαση των ιικών αντιγόνων από τα μολυσμένα κύτταρα χρησιμοποιώντας ένα κοκτέιλ αντισωμάτων των ιικών πρωτεϊνών καψιδίου. Βρήκαμε ότι ιικά αντιγόνα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με JNK μεσολάβηση αυτοφαγία, και ότι αυτοφαγία ήταν απαραίτητη για την παρουσίασή τους. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα αυτά, σπληνοκύτταρα απομονώθηκαν από ποντίκια ανοσοποιημένα με ιό ενεργοποιήθηκαν από μολυσμένα κύτταρα σε ένα MHC II-εξαρτώμενο τρόπο. Στη συνέχεια υποθέτουν ότι ο μηχανισμός αυτός μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη δημιουργία ενός αποτελεσματικού εμβολίου καρκίνου. Για το σκοπό αυτό, κατασκευάσαμε έναν ιό ογκολυτική περικλείει μία EGFRvIII καρκίνος-ειδικό επιτόπιο στον αδενοϊικό ίνα. Η μόλυνση των καρκινικών κυττάρων με την ίνα αυτή τροποποιημένου αδενοϊού οδήγησε σε αναγνώριση των μολυσμένων κυττάρων καρκίνου από ένα συγκεκριμένο αντι-ΕΟΡΚνΙΙΙ αντίσωμα. Ωστόσο, η αναστολή της αυτοφαγία μειώθηκαν δραστικά την ικανότητα του ειδικού αντισώματος για την ανίχνευση της επίτοπο καρκίνου που σχετίζονται με μολυσμένα κύτταρα. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι ο συνδυασμός των αδενοϊούς με επαγωγείς αυτοφαγία μπορεί να ενισχύσει την επεξεργασία και παρουσίαση των καρκινικών ειδικών αντιγόνων ενσωματώνονται σε πρωτεΐνες καψιδίου

Παράθεση:. Klein SR, Jiang Η Hossain MB, Fan Χ, Gumin J, Dong Α, et al. (2016) Κριτική ρόλος της αυτοφαγία στην επεξεργασία αδενοϊό Καψιδικής-Incorporated Καρκίνος ειδικά αντιγόνα. PLoS ONE 11 (4): e0153814. doi: 10.1371 /journal.pone.0153814

Επιμέλεια: Μαρία Γ Κάστρο, του Πανεπιστημίου του Michigan Ιατρική Σχολή, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 25 Γενάρη 2016? Αποδεκτές: 4 Απριλίου, 2016? Δημοσιεύθηκε: 19 Απριλίου 2016

Copyright: © 2016 Klein et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το NIH (P50CA127001? R01NS069964? Cancer Center Support Grant P30CA016672-αλληλουχίας και μικροσυστοιχιών διευκόλυνσης και ερευνητικές εγκαταστάσεις υποστήριξης των ζώων), το Ίδρυμα Marnie Rose, το Ίδρυμα θα Δύναμη, το Ίδρυμα Schissler, και η αμερικανική Λεγεώνας Βοηθητική. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. JF, CG-Μ, και HJ έχουν πνευματικής ιδιοκτησίας Delta-24-RGD , την άδεια να DNAtrix, Inc. (δίπλωμα ευρεσιτεχνίας κατατέθηκε ΗΠΑ 14 /148.259? μολυσματικότητα ενισχυμένη υπό όρους αναπαραγόμενο αδενοϊό και χρήσεις αυτών). J.F. και Ο.Θ.-M. είναι ιδρυτές και σύμβουλος του DNATrix, Inc. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Oncolytic αδενοϊοί, όπως Δ24-RGD (Delta -24-RGD), [1, 2] είναι ιδιαίτερα ανοσογόνες. [3] η τρέχουσα υπόθεση για να εξηγήσει τον μηχανισμό κατά του όγκου σε ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με ογκολυτική αδενοϊούς είναι ότι το κύριο αποτέλεσμα επιτυγχάνεται μέσω της ενεργοποίησης ενός κατά του όγκου ανοσοαπόκριση. [4 ] autophagy είναι ένα αναγνωρισμένο χαρακτηριστικό των κυττάρων που έχουν μολυνθεί με αδενοϊούς [5, 6], και είναι μια σημαντική συνιστώσα της διαδικασίας λύσης. [7] Xenophagy [8] και που προέρχεται από παθογόνο επεξεργασία αντιγόνου [9, 10] είναι θεμελιώδεις λειτουργίες του αυτοφαγία σε κύτταρα μολυσμένα με ιούς. Autophagy υποβαθμίζει ενδοκυτταρικό περιεχόμενο, την επεξεργασία επίτοπα που πρόκειται να φορτωθούν σε μείζον σύμπλεγμα ιστοσυμβατότητας (MHC) για την παρουσίαση στην επιφάνεια των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος. [9-11] Ωστόσο, ο τρόπος με τον οποίο τα καρκινικά κύτταρα επεξεργάζονται αντιγόνα αδενοϊού προερχόμενο είναι προς το παρόν άγνωστη.

η διαμόρφωση του αυτοφαγία σε κύτταρα θηλαστικών περιγράφεται καλύτερα στα κύτταρα που υφίστανται την πείνα. [12-14] Εκτός από την κανονική οδό, [12-14], η c-Jun Ν-τερματικής κινάσης (JNK) μεταγωγής σήματος οδός ενεργοποιείται σε κύτταρα που υφίστανται αυτοφαγία. [15] Επιπλέον, η ενεργοποίηση JNK έχει παρατηρηθεί σε κύτταρα που έχουν μολυνθεί με ιούς. [16] Παρά τη σαφή ρόλο που ΙΝΚ παίζει για τη ρύθμιση της έμφυτης και προσαρμοστικής ανοσοαποκρίσεις, [17], συμπεριλαμβανομένης της δυνατότητας να ενισχύουν την ανοσοαπόκριση προς ιικών παθογόνων με up-ρυθμίζουν την έκφραση των προφλεγμονωδών κυτοκινών, [18-20], η άμεση συνάρτηση της JNK σε παθογόνα που προέρχονται επεξεργασίας αντιγόνου και παρουσίασης δεν έχει ακόμη οριστεί.

Έχουμε πρόσφατα αναφέρθηκε ότι η έκφραση JNK και ενεργοποίηση με phoshporylation απαιτείται για την επαγωγή της παραγωγικής αυτοφαγία σε κύτταρα μολυσμένων με αδενοϊό. [16] σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι αδενοϊικές δομικές πρωτείνες αλληλεπιδρούν με πρωτεΐνες autophagy φορτίο υποδοχέα οδηγεί σε υποβάθμιση της στις autophagolysosomes . Autophagy φαίνεται να είναι ουσιώδης για τα αντιγόνα αδενοϊού προερχόμενο παρουσίαση επειδή απενεργοποίηση του JNK ρυθμιστή autophagy ή άμεση απενεργοποίηση του autophagy περιορίζονται δραστικά την αναγνώριση των καρκινικών κυττάρων που έχουν μολυνθεί με γεμάτοι ανοσοκύτταρα και αντισώματα έναντι καψιδίου ή ειδική για τον καρκίνο έκτοπη επιτόπων που κωδικοποιούνται από το ίνα αδενοϊού.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιέργεια

U87 MG γλοίωμα, τον καρκίνο του τραχήλου HeLa, και κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα Α549 ελήφθησαν όλα από την ATCC. κύτταρα HeLa καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ (1Χ), και τα κύτταρα Α549 καλλιεργήθηκαν σε DMEM /F-12 50:50 μέσου (Invitrogen). κύτταρα U87 MG (ATCC) καλλιεργήθηκαν σε ΜΕΜ με 10% FBS και 1% απαραίτητα αμινοξέα. Άγριου τύπου και

JNK1 /2 – /-

ινοβλάστες εμβρύου ποντικού (ΠΜΑ) δόθηκαν από τον Roger Davis (Πανεπιστήμιο της Μασαχουσέτης Ιατρική Σχολή, ΜΑ). Αγρίου τύπου και knock-out Atg5 ΠΜΑ (

Atg5 – /-

) είναι ένα γενναιόδωρο δώρο από Noboru Mizushima (Τόκιο Ιατρική και Οδοντιατρική του Πανεπιστημίου, Τόκιο, Ιαπωνία). Αγρίου τύπου και knock-out ΠΜΑ Ρ62 (

ρ62 – /-)

ήταν ένα γενναιόδωρο δώρο από τον Jorge Moscat (Sanford-Burnham Medical Research Institute, La Jolla, CA). Οι MEF καλλιεργήθηκαν σε DMEM /F12 50:50 μέσο. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν με 10% FBS στους 37 ° C σε 5% CO

2 σε αέρα.

Χημικά και αντισώματα

Η JNK SP600125 αναστολέας κινάσης και βαφιλομυκίνης Α1 αγοράστηκαν από Sigma- Aldrich, St Louis, MO, USA). Η ραπαμυκίνη αγοράστηκε από την Calbiochem (San Diego, CA, USA). Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη πρωτεΐνη ιντερφερόνη γάμμα (ΙΡΝ-γ) αγοράστηκε από Prospec (East Brusnwick, NJ, USA). Αντισώματα προς LC3, Beclin 1, και ουβικιτίνης αγοράστηκαν από Cell Signaling Technologies (Beverly, ΜΑ, USA). Αντι-Ρ62 και αντι-ακτίνης αντισώματα αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Ντάλας, Τέξας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Anti-αδενοϊικός ινών ελήφθη από ThermoScientific (Waltham, MA, USA). EGFRvIII ανιχνεύθηκε με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα (L8A4) που λαμβάνεται ως ένα γενναιόδωρο δώρο από τον Δρ Bigner (Πανεπιστήμιο Duke, NC, USA). Αλλοφυκοκυανίνη (APC), συζευγμένης με δευτερογενή αντισώματα αντι-ποντικιού και (FITC) συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology.

αδενοϊό παραγωγή και μόλυνση

παρήχθησαν

Δ24RGD και AdWT αδενοϊοί όπως περιγράφηκε προηγουμένως. [1] Δ24FvIII δομήθηκε με εισαγωγή του επιτόπιου EGFRvIII (LEEKKGNYVVT) [21] στην HI βρόχο των πρωτεϊνών ινών μεταξύ των αμινοξέων 543 και 544. [22] Πρώτον, η αλληλουχία που κωδικοποιεί την EGFRvIII επίτοπο ενσωματώθηκε το γονίδιο ίνας σε φορέα pXK-F περιέχει την

Xba Ι-

Κρη

Ι θραύσμα του pVK503C [23] μέσω τοπο-κατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση. Στη συνέχεια, το θραύσμα Xba Ι-Κρη Ι από τον προκύπτοντα φορέα pXK-FVIII ήταν συν-μεταγωγή με

Swa

Ι-γραμμικοποιημένου pVK500C.delta-24 σε

E

.

coli BJ5183

για ομόλογο ανασυνδυασμό όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Ο ιός στη συνέχεια διασώθηκε σε 293 κύτταρα και πολλαπλασιάζονται σε κύτταρα Α549, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Οι αδενοϊοί προστέθηκαν στο μέσο κυτταρικής καλλιέργειας στην υποδεικνυόμενη πολλαπλότητα μόλυνσης (ΜΟΙ).

Western ανάλυση κηλίδος

τα κύτταρα λύθηκαν με RIPA ρυθμιστικό λύσης. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίσθηκαν με τη χρήση ενός ποσοτικού προσδιορισμού πρωτεΐνης Bio-Rad. Δείγματα πρωτεΐνης (25 μg) σε ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης SDS 1Χ έβρασαν και φορτώθηκαν σε Τρις-γλυκίνης δωδεκυλικού νατρίου ηλεκτροφόρηση πηκτής θειικού-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) γέλες (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Τα δείγματα διαχωρίστηκαν με χρήση ηλεκτροφόρησης. Τα πήγματα στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες πολυβινυλιδενο φθορίδιο, τα οποία είχαν μπλοκαριστεί από τη χρήση 5% άπαχο γάλα σε 1Χ TBS-Τ (0,025% Tween) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C σε ένα πρωτεύον αντίσωμα σε κατάλληλες αραιώσεις. Οι μεμβράνες πλύθηκαν τρεις φορές με ΤΒδ-Τ (0.05% Tween) και στη συνέχεια επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα με κατάλληλα δευτερεύοντα αντισώματα (Santa Cruz Biotechnology? 1: 4000) που παρασκευάζεται σε 1% άπαχο γάλα σε ΤΒδ-Τ. SuperSignal West Femto χημειοφωταύγειας υποστρώματος (ThermoScientific) και HyBlot CL αυτοραδιογραφία ταινία (Denville Scientific Inc., South Plainfield, NJ, USA) χρησιμοποιήθηκαν για να απεικονίσει ταινίες πρωτεΐνης.

RNA παρεμβολής

Άγρια τύπου MEF κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων 24 ώρες πριν από μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) την επιμόλυνση. ΠΑΡΕΜΠΟΔΙΣΗ (Polyplus Επιμόλυνση (Illkirch-Graffenstaden, Γαλλία) χρησιμοποιήθηκε για την εισαγωγή των siRNAs στα κύτταρα σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, 50 ηΜ siRNA ολιγονουκλεοτίδια συνδυάστηκαν με 10 μL του αντιδραστηρίου διαμόλυνσης και προστίθεται στα κύτταρα μετά από 15 λεπτά επώασης σε θερμοκρασία δωματίου. siRNA ολιγονουκλεοτίδια για ποντίκι MHC τάξης Ι, MHC τάξης II, και μη κωδικεύουσες περιοχές αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology.

συνανοσοκαθίζησης

τα κύτταρα μολύνθηκαν με AdWT ή Δ24RGD για έως και 48 ώρες. Επιπλέοντα και συνδεδεμένα κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν με ανοσοκαταβύθιση (ΙΡ) ρυθμιστικού διαλύματος λύσης (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl [ρΗ 7.4], 2 mM EDTA, 10% γλυκερόλη, 1% Igepal CA-630) . τα δείγματα πρωτεΐνης προ-καθαριστεί με σφαιρίδια αγαρόζης πρωτεΐνης G Α και πρωτεΐνη αντισώματα αντι-αδενοϊικά ίνα ή αντι-Ρ62 προστέθηκαν στα προϊόντα λύσης σε αραίωση 1:. 100, και τα σύμπλοκα των πρωτεϊνών ακινητοποιήθηκαν με πρωτεΐνη Α και πρωτεΐνη G (1: 1). σφαιρίδια αγαρόζης Ανοσοκαταβυθισμένες δείγματα, προ-καθαριστεί χάντρες, και 5% συμβολή αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. ανίχνευση IP δευτερεύον αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση πρωτεϊνών που δεσμεύονται από όλα τα πρωτογενή IgGs αντι-κουνελιού και αντι-ποντικού.

Η κυτταρομετρία ροής

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για τα αντίστοιχα χρονικά σημεία, επεξεργασία με θρυψίνη, και συλλέγεται σε ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο διάλυμα (PBS) με 1% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όταν υποδεικνύεται με IFN-γ (300 μονάδες /ml) και βαφιλομυκίνης Α1 (Sigma-Aldrich). Τα ζωντανά κύτταρα χρωματίστηκαν για αδενοϊικό αντιγόνων με τη χρησιμοποίηση ενός συνδυασμού αντι-αδενοϊού επίστρωση ποντικού (μείγμα) (1:75? Millipore, Billerica, ΜΑ, USA) και αντισώματα ίνα ποντικού αντι-αδενοϊού (1:75? ThermoScientific) για 30 λεπτά στους 4 ° C. Μετά τα κύτταρα πλύθηκαν, αυτά χρωματίστηκαν με APC-συζευγμένη δευτερογενή αντισώματα αντι-ποντικού (1,75? Santa Cruz Biotechnology) για 30 λεπτά στους 4 ° C. Για την ανίχνευση του EGFRvIII επιτόπου (LEEKKGNYVVT), τα κύτταρα χρωματίστηκαν με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα (L8A4) ακολουθούμενη από χρώση με FITC συζευγμένο δευτερογενές αντίσωμα. Τα ζωντανά κύτταρα αναλύθηκαν με τη χρήση ενός BD FACSCalibur (Becton-Dickenson, Franklin Lakes, ΝΥ, USA). Τα νεκρά κύτταρα αποκλείσθηκαν με τη χρήση ιωδιούχου προπιδίου ή αιθίδιο χρώση ομοδιμερές-1 πριν από την ανάλυση. Τα δεδομένα που αντιπροσωπεύουν τουλάχιστον τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα.

ενεργοποίηση σπληνοκυττάρων

Όλες οι μελέτες σε ζώα διεξήχθησαν στις κτηνιατρικές εγκαταστάσεις στο Πανεπιστήμιο του Τέξας MD Anderson Cancer Κέντρο σύμφωνα με τις θεσμικές κατευθυντήριες γραμμές και τον Οδηγό για η φροντίδα και χρήση του εργαστηρίου των ζώων. Η μελέτη εγκρίθηκε από το πανεπιστήμιο MD Anderson Cancer Center Θεσμικών φροντίδα των ζώων και την Επιτροπή Χρήση (IACUC). C57BL /6 ποντίκια (ηλικίας 10-12 εβδομάδων) μολύνθηκαν ενδοκρανιακά με δύο ενέσεις (ημέρα 0 και 3) 1 × 10

8 ρίυ /ποντικό Δ24RGD μέσω του συστήματος οδηγού πληρωμάτων, όπως περιγράφηκε προηγουμένως. [1] Η τα ζώα υποβλήθηκαν σε ευθανασία με τη χρήση ενός CO

2 θάλαμο? οι σπλήνες αφαιρέθηκαν andsmashed σκάφης 100 μικρομέτρων σουρωτήρι? [25] και τα σπληνοκύτταρα πλύθηκαν με PBS. Ερυθρά αιμοσφαίρια απομακρύνθηκαν μέσω ρυθμιστικό ACK λύσης (Lonza, Houston, ΤΧ, USA). Άγριου τύπου και JNK ΠΜΑ knock-out σπάρθηκαν σε 1 × 10

5 κύτταρα σε μια πλάκα 6 φρεατίων (εις τριπλούν). Τα κύτταρα μολύνθηκαν με 100 ΜΟΙ Δ24RGD για 24 ώρες, σε επεξεργασία με θρυψίνη, και επανα-επιστρώθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων σε 5 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο σε RPMI 1640 με 10% FBS και 55 μΜ β-μερκαπτοαιθανόλη . Σπληνοκύτταρα (1 × 10

6 κύτταρα) επωάστηκαν με τα ΠΜΑ σε καλλιέργεια για 24 ώρες. Για τα πειράματα, συμπεριλαμβανομένων αντισωμάτων αποκλεισμού, προ-μολυσμένα MEF κύτταρα επωάστηκαν με 2 μα αντι-ποντικού MHC τάξης II (ΙΑ /IE), αντι-ποντικού MHC κατηγορίας Ι (Η-2Κ *) (eBioscience, San Diego, CA), ή IgG ποντικού (Santa Cruz) 2 ώρες πριν την συν-καλλιέργεια με γεμάτοι σπληνοκύτταρα. Σπληνοκύτταρα επωάστηκαν στη συνέχεια με προ-μολυσμένα κύτταρα MEF και αντισώματα αποκλεισμού για 24 ώρες. Ένα ποντίκι IFN-γ ELISA κιτ (ThermoScientific) χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η συγκέντρωση της ΙΡΝ-γ σε 50 μL του μέσου εκχυλίζεται από το συν-καλλιέργεια. ELISA διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, και η απορρόφηση αναλύθηκε μέσω ενός Omega αναγνώστη μικροπλάκας (BMG Labtech, Ortenberg, Γερμανία).

Στατιστική ανάλυση

Μια δίπλευρη Student

t

-test χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η στατιστική σημαντικότητα των επεξεργασμένων και μολυσμένων δειγμάτων σε σχέση με τον έλεγχο δειγμάτων. τιμές P λιγότερο από 0.05 έγιναν δεκτές ως στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

JNK μεσολάβηση αυτοφαγία ρυθμίζει την παρουσίαση των αντιγόνων από αδενοϊό που προέρχεται

αντιγόνα που προέρχεται από παθογόνο μπορεί να υποβάλλονται σε επεξεργασία σε το διαμέρισμα autophagolysosomal μέσω αυτοφαγία, [10], αλλά ο ρόλος της αυτοφαγία στην παρουσίαση του αδενοϊικού επιτόπων δεν έχει ακόμη καθοριστεί. Με τη χρήση ενός κοκτέιλ αντι-αδενοϊικά αντισώματα πρωτεΐνη, μπορούμε διαλογή μολυσμένα κύτταρα για την παρουσία των πεπτιδίων που προέρχονται από αδενοϊό επί της επιφανείας των ζώντων, nonpermeabilized, τα μολυσμένα κύτταρα. Για αυτές τις μελέτες, εκμεταλλευτήκαμε το γεγονός ότι η ΙΝΚ-μηδενικά κύτταρα είναι ανεπαρκή για την αυτοφαγία. [15, 16] Παρατηρήσαμε ότι ενώ η πλειοψηφία (& gt? 77%) του

JNK κ.β.

ΠΜΑ μολυνθεί με AdWT εκφράζεται αδενοϊικές πρωτεΐνες στην επιφάνειά τους, όπως ανιχνεύεται από την FACS αναλύσεις (Σχήμα 1Α), το γενετικό εκτομή του

JNK1

και

JNK2

ισομορφές οδήγησε σε σημαντική μείωση του ποσοστού των κυττάρων που βρέθηκε θετικός για αδενοϊικές πρωτεΐνες. Επειδή η ενεργοποίηση των Τ-κυττάρων, που αποδεικνύεται από την σύνθεση και έκκριση της IFN-γ, είναι η μέθοδος σήμα κατατεθέν για την επιβεβαίωση παρουσίαση αντιγόνου μέσω αλληλεπιδράσεων μεταξύ περιέχει επίτοπο MHC μόρια και υποδοχέα Τ-κυττάρων, [26] θα τεκμηριώνεται το ανοσοποιητικό συνάφεια των μας δεδομένων από την ποσοτικοποίηση της έκκρισης ΙΡΝ-γ από σπληνοκύτταρα από μη-μολυσμένα ποντίκια (αφελείς) ή αδενοϊό αγωγή ποντικοί (δοκιμάζεται) σε συν-καλλιέργεια με

JNK κ.β.

ή

JNK1 /2

– /- Οι MEF μολυνθεί με αδενοϊό. Όπως αναμενόταν, συν-καλλιέργειες αφελείς σπληνοκυττάρων με αδενοϊό μολυσμένα

JNK κ.β.

, ή

JNK1 /2

– /- κύτταρα δεν προκαλούν σημαντική έκκριση IFN-γ. Ωστόσο, ΠΜΑ άγριου τύπου μολυσμένων με αδενοϊό ζητηθεί ΙΡΝ-γ παραγωγή όταν συν-καλλιεργήθηκαν με κύτταρα σπλήνας γεμάτοι (Σχήμα 1Β). Σε αντίθεση, καλλιέργειες autophagy ελλειμματικών

JNK1 /2

– /- MEFs με σπληνοκύτταρα αδενοϊό γεμάτοι περιείχαν σημαντικά χαμηλότερο εκκρινόμενη ΙΡΝ-γ επίπεδα (Σχήμα 1Β). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι autophagy-εξασθενημένη κύτταρα είναι ανεπαρκή για την παρουσίαση των αντιγόνων αδενοϊού προερχόμενου στο ανοσοποιητικό σύστημα.

(α)

JNK κ.β.

και

ΙΝΚ

1 /2 – /- MEFs ήταν ψευδο-μολύνθηκαν ή μολύνθηκαν με AdWT (100 ΜΟΙ) για 48 ώρες και επωάστηκαν με δύο συνδυασμένες σειρές αντι-αδενοϊικών αντισώματα (ένα μίγμα αδενοϊικές πρωτεΐνες παλτό και αδενοϊικού ινών). Αυτά στη συνέχεια επωάστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με APC-και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. IgG ισοτύπου χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. ιωδιούχο προπίδιο χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της βιωσιμότητας των κυττάρων και να αναλύσει τα ζωντανά κύτταρα. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το ποσοστό των θετικών κυττάρων ως μέση τιμή ± SD. ***

P

& lt? 0.001 (AdWT μολυσμένα

JNK

1/2 – /- ΠΜΑ έναντι AdWT μολυσμένα

JNK κ.β.

ΠΜΑ) (αταίριαστα, δίπλευρη Student

t-test)

. (Β) Σπληνοκύτταρα απομονώθηκαν από αφελείς και Δ24RGD μολυσμένα ποντίκια C57BL /6 και συν-καλλιεργήθηκαν με

JNK κ.β.

ή

JNK

1/2 – /- MEFs που ήταν ψευδο-μολύνθηκαν ή μολύνθηκαν με αδενοϊό Δ24RGD (100 ΜΟΙ) για 24 ώρες πριν από την συν-καλλιέργεια. Μετά από 48 ώρες συν-καλλιέργειας, τα επίπεδα ΙΡΝ-γ (pg /mL) στο ρυθμισμένο μέσο εκτιμήθηκαν με ELISA. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τα επίπεδα ΙΡΝ-γ (pg /mL) ως μέση τιμή ± SD από τρία ανεξάρτητα συν-καλλιέργειες. **

P

& lt? 0.01 (μη ζευγαρωμένα, δίπλευρη Student

t-test

). (Γ) κύτταρα U87MG προκατεργάστηκαν με DMSO, SP600125 (25 μΜ), ή βαφιλομυκίνης Α1 (BA1, 10 ηΜ) 30 λεπτά πριν από τη μόλυνση με αδενοϊό Δ24RGD (50 ΜΟΙ) για 48 ώρες. Ζωντανά κύτταρα επωάστηκαν με αντισώματα που εγείρονται έναντι αδενοϊικές πρωτεΐνες καψιδίου, ή IgG ισότυπου ως έλεγχο, και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Το ποσοστό των APC-θετικών κυττάρων προσδιορίστηκαν ποσοτικά και παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD (

n

= 3). *

P

& lt? 0.05 (ποσοστό των θετικών κυττάρων μετά από θεραπεία με AdWT και SP600125 εναντίον AdWT και BA1) (μη ζευγαρωμένα, δίπλευρη Student

t-test

). (Δ) Σημαντική αύξηση στην παρουσίαση των αδενοϊικών αντιγόνων σε κύτταρα μολυσμένα με Δ24RGD όταν ραπαμυκίνη προστέθηκε στις καλλιέργειες. κύτταρα U87 MG ήταν ψευδο-μολύνθηκαν, μολύνθηκαν με Δ24RGD, ή μολύνθηκαν με Δ24RGD και η ραπαμυκίνη (100 nm /48 ώρες) για 48 ώρες και στη συνέχεια εξετάστηκε για αδενοϊικό αντιγόνα με κυτταρομετρία ροής.

Η

υποστηρίζοντας περαιτέρω την ρόλος των JNK και αυτοφαγία στην επεξεργασία των αντιγόνων αδενοϊού προερχόμενο, παρατηρήσαμε ότι η κατεργασία του autophagy-καλά μολυσμένες καλλιέργειες με αναστολείς JNK (SP600125) αναστολείς [27] ή autophagy ροής (βαφιλομυκίνης Α1 [28]) μειώθηκε σημαντικά το ποσοστό των μολυσμένων ζωντανά κύτταρα που παρουσιάζουν σε αδενοϊικές πρωτεΐνες επιφανείας τους στις αναλύσεις FACS (Σχήμα 1 C). Σε συμφωνία με αυτά τα δεδομένα, το αντίθετο πείραμα έδειξε ότι προεπεξεργασία των μολυσμένων κυττάρων με το autophagy-επαγωγέα ραπαμυκίνη [29] είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση του ποσοστού των κυττάρων που ήταν θετικοί για αδενοϊικό επιτόπων στον έλεγχο FACS (Σχήμα 1 D). Σε συνδυασμό, όλοι οι παρατηρήσεις αυτές υποδηλώνουν έντονα ότι autophagy θα μπορούσαν να παίξουν ένα ρόλο στην παρουσίαση των αντιγόνων που προέρχεται από παθογόνο σε κύτταρα μολυσμένων με αδενοϊό.

MHC κατηγορίας II απαιτείται για αδενοϊικό αντιγόνα

Autophagy εμπλέκεται στην επεξεργασία πεπτιδίων για παρουσίαση κυρίως μέσω μορίων MHC κατηγορίας II, [10, 11] έτσι αποφασίσαμε να καθοριστεί εάν αποκλεισμός που βασίζονται σε αντισώματα MHC τάξης II εμπόδισε την αναγνώριση των μολυσμένων κυττάρων από τα αδενοϊό γεμάτοι σπληνοκύτταρα. Για το σκοπό αυτό, έχουμε ποσοτικά το ΙΡΝ-γ παραγωγή σε συν-καλλιέργειες σπληνοκυττάρων αδενοϊό ασταρώνονται με ΠΜΑ μολυσμένα με ιό προ-επωάστηκαν με δεσμευτικά αντισώματα για MHC τάξης Ι ή II. Παρατηρήσαμε ότι τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με αντισώματα κατά των πρωτεϊνών MHC τάξης II έδειξαν σημαντική αναστολή της παραγωγής ΙΡΝ-γ σε σύγκριση με κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με αντισώματα κατά των πρωτεϊνών MHC τάξης Ι ή IgG-αγωγή μάρτυρες (Σχήμα 2Α). Για να επιβεβαιώσετε τα στοιχεία αυτά μπορούμε αμφισβήτησε την παρουσίαση των αντιγόνων αδενοϊού χρησιμοποιώντας συγκεκριμένη κατηγορία siMHC II (Σχήμα 2Β). Παρατηρήσαμε ότι τα κάτω διαμόρφωση του MHC κατηγορίας II mRNA ως αποτέλεσμα τη μείωση του αριθμού των κυττάρων που παρουσιάζουν αδενοϊικού επίτοπα (Σχήμα 2C). Αναφέροντας τον κυρίαρχο ρόλο της MHC τάξης II στην διαδικασία, έδειξε ότι η κάτω διαμόρφωση του MHC τάξης Ι είχε πολύ μικρότερη επίδραση στην παρουσίαση του αδενοϊού προερχόμενο αντιγόνα από ό, τι το κάτω ρύθμιση MHC κατηγορίας II. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι τα αντιγόνα αδενοϊού προερχόμενο παρουσιάζονται κυρίως μέσω MHC τάξης II, το κυρίαρχο μονοπάτι παρουσίασης επιτόπου για πρωτεΐνες σε επεξεργασία μέσω αυτοφαγία. [10, 11]

(α) των ψευδώς ή Δ24RGD μολυσμένα άγριας Τύπος οι MEF προ-επωάστηκαν με αντισώματα έναντι MHC τάξης Ι, MCH κατηγορίας II, ή IgG ισότοπο και στη συνέχεια συν-καλλιεργήθηκαν με κύτταρα σπλήνας που λαμβάνονται από Δ24RGD-μολυσμένα ποντίκια. Η πολλαπλή μεταβολή της ΙΡΝ-γ επίπεδα (pg /mL) στα μέσα συν-καλλιέργειας εμφανίζεται σε σχέση με τον έλεγχο και παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD. **

P

& lt? 0.01 (μη ζευγαρωμένα, δίπλευρη Student

t-test

). (Β) MEF κύτταρα φυσικού τύπου επιμολύνονται με μια δεξαμενή SINC, siMHCI, siMHCII, ή συνδυασμένη ίσες ποσότητες siMHC Ι και siMHC II για 48 ώρες και στη συνέχεια μολύνθηκαν με τον αδενοϊό Δ24RGD σε ΜΟΙ 10 για επιπλέον 48 h . Λύματα ολόκληρων κυττάρων αναλύθηκαν με χρήση αντι-ΜΗΟ κατηγορίας Ι και αντι-ΜΗΟ τάξης II αντισώματα. Η επίδραση της κάθε θεραπείας siRNA στο επίπεδο πρωτεΐνης των μορίων MHC απεικονίζεται. (Γ) Οι MEF Αγρίου τύπου επιμολύνθηκαν με μια δεξαμενή SINC, siMHCI, siMHCII, ή συνδυασμένη ίσες ποσότητες siMHCI και siMHCII για 48 ώρες, και στη συνέχεια μολύνθηκαν με τον αδενοϊό Δ24RGD σε ΜΟΙ 10 για επιπλέον 48 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα χρωματίστηκαν για ανίχνευση αδενοϊικών αντιγόνων. ιωδιούχο προπίδιο χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της βιωσιμότητας των κυττάρων. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως ποσοστό των θετικών κυττάρων (μέσος όρος ± SD). Η μείωση στο ποσοστό των θετικών μολυσμένων με αδενοϊό, siMHCII-επιμολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με αδενοϊό-μολυσμένα, Sinc-επιμολυσμένα κύτταρα ήταν στατιστικά σημαντική. **

P

& lt? 0.01 (αταίριαστα, δίπλευρη Μαθητή

t-test)

.

Η

αδενοϊό δομικές πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν με ρ62 και αποικοδομούνται στο autolysosome

Στη συνέχεια προσπάθησε να εξετάζει αν δομικές αδενοϊικές πρωτεΐνες αποικοδομούνται στα autophagolysosomes. Επειδή η πρωτεΐνη ρ62 συνοδός συνδέεται με ουβικουιτινωμένης πρωτεϊνών για την παγίδευση και την υποβάθμιση τους σε autophagolysosomes, [30] που ανέλυσε τις δυνατότητες αλληλεπίδρασης μεταξύ ρ62 και της πρωτεΐνης ινών που εκτελούν πειράματα συν-immunoprecipitaton. Δείξαμε ότι ο αδενοϊικός πρωτεΐνη ίνα ουβικουιτινωμένης διάρκεια αδενοϊό μόλυνση και αλληλεπίδρασε με ρ62 (Σχήμα 3Α). Συνεπής με ένα ρόλο του autophagolysosome στην αποικοδόμηση των αδενοϊικών πρωτεϊνών ινών, οι αλληλεπιδράσεις των ρ62 και πρωτεϊνικές ίνες ήταν περισσότερο εμφανής σε

Atg5

– /- οι MEF, τα οποία είναι ανεπαρκή για αδενοϊού που επάγεται autophagy [7] ( Σχήμα 3Α). Στην πραγματικότητα, η λεπτομερής εξέταση των επιπέδων της πρωτεΐνης ίνας σε διάφορα χρονικά σημεία μετά την αδενοϊική μόλυνση αποκάλυψε αξιοσημείωτα υψηλότερα επίπεδα αυτών των πρωτεϊνών σε autophagy ανεπάρκεια

Atg5 – /-

MEFs κυττάρων σε σύγκριση με την άγριου τύπου

Atg5

Οι MEF (

Atg5 wt

) μολυσμένα με ίσες ποσότητες αδενοϊούς άγριου τύπου (σχήμα 3Β). Επιπλέον, παρατηρήσαμε επίσης ότι μετά αδενοϊική μόλυνση υπήρχε σημαντική μείωση στο ποσοστό των κυττάρων που παρουσιάζονται αδενοϊικές πρωτεΐνες στο

Atg5 – /-

MEFs καλλιέργειες σε σύγκριση με το

Atg5wt

ΠΜΑ (Σχ 3C ). Όπως ήταν αναμενόμενο, παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν με

ρ62

– /- MEFs μολύνθηκαν με αδενοϊό, επιβεβαιώνοντας ότι η έλλειψη του

ρ62

έκφραση οδήγησε σε σημαντική μείωση του ποσοστού των αδενοϊικών παλτό-θετικών κυττάρων με σχέση με αδενοϊό μολυσμένα άγριου τύπου

Ρ62

ΠΜΑ (Σχήμα 3D), πιθανώς εξαιτίας του ανεπαρκούς ρ62-διαμεσολαβούμενη μεταφορά αδενοϊικών πρωτεϊνών στην autophagosome. Αυτά τα δεδομένα πρότειναν περαιτέρω ότι αδενοϊικές πρωτεΐνες αποικοδομούνται στα autophagolysosomes κατά την ενεργή αυτοφαγικά ροής με αποτέλεσμα την παρουσίαση του αδενοϊού που προέρχεται επιτόπων στην επιφάνεια του κυττάρου-ξενιστή.

(α) Κυτταρολύματα από

Atg5wt

ή

Atg5 – /-

MEFs μολυνθεί με AdWT (50 ΜΟΙ) αναλύθηκαν για την παραγωγή ινών /ουμπικουϊτίνης και σύμπλοκα πρωτεΐνης ίνας /ρ62. επίπεδα έκφρασης Ρ62 μετατροπή και LC3-Ι-ΙΙ LC3 αναλύθηκαν σε ένα δείγμα εισόδου (5%). Actin παρουσιάζεται ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) κυτταρολύματα από

Atg5wt

και

Atg5

– /- MEFs ήταν ψευδο-μολύνθηκαν ή μολύνθηκαν με AdWT (50 ΜΟΙ) για τους υποδεικνυόμενους χρόνους και αναλύθηκαν για έκφραση αδενοϊικών ινών. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε έλεγχος φόρτωσης. (Γ)

Atg5wt

και

Atg5 – /-

MEFs είχαν ψευδο-μολύνθηκαν ή μολύνθηκαν με αδενοϊό AdWT (50 ΜΟΙ) για 48 ώρες και στη συνέχεια βάφτηκαν με αντισώματα για αδενοϊικές πρωτεΐνες καλύμματος, επωάστηκαν με APC-συζευγμένο δευτερογενές αντίσωμα και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. IgG ισοτύπου χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. ιωδιούχο προπίδιο χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της βιωσιμότητας των κυττάρων. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως ποσοστό των APC-θετικών κυττάρων (μέσος όρος ± SD) τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. ***

P

& lt? 0.001 (ποσοστό APC-θετικών σε AdWT μολυσμένα

Atg5wt

κύτταρα εναντίον AdWT μολυσμένα

Atg5

– /- κύτταρα) (μη ζευγαρωμένα, δίπλευρη Student

t-test

). (Δ)

p62wt

και

ρ62 – /-

MEFs μολύνθηκαν με αδενοϊό AdWT (100 ΜΟΙ) για 48 ώρες και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με αντισώματα έναντι αδενοϊικές πρωτεΐνες παλτό, επωάστηκαν με ΑΡΟ-συζευγμένο δευτερεύον αντισώματα, και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. IgG ισοτύπου χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. ιωδιούχο προπίδιο χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της βιωσιμότητας των κυττάρων. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως ποσοστό των APC-θετικών κυττάρων (μέσος όρος ± SD) των τριών πειραμάτων. ***

P

& lt? 0.001 (επί τοις εκατό του APC-θετικών κυττάρων σε AdWT μολυσμένα

ρ62

– /- έναντι AdWT μολυσμένα

p62wt

κύτταρα) (μη ζευγαρωμένα, δίπλευρη Student

t-test

).

η

Δημιουργία Δ24FvIII αδενοϊού

Τροποποίηση των αδενοϊικών καψιδίων με ένθεση αλληλουχιών αντιγόνων είναι μια πολλά υποσχόμενη τεχνολογία για την ανάπτυξη εμβολίων και εμβολίων κατά του καρκίνου, [31] και γι ‘αυτό φρόντισε να διαπιστώσει αν αυτοφαγία ήταν ο κύριος μηχανισμός για την επεξεργασία των έκτοπη καρκίνου-ειδικά επιτόπια που κωδικοποιούνται από αδενοϊικούς ίνες. Στη συνέχεια δημιουργείται ένα πειραματικό μοντέλο που θα μας επιτρέψει να προσδιοριστεί αν μια συγκεκριμένη ακολουθία στον αδενοϊικό ίνα θα μπορούσε να ανιχνευθεί σε κύτταρα μολυσμένων με αδενοϊό. Για το σκοπό αυτό, έχουμε σχεδιάσει και κατασκευάσει ένα χιμαιρικό ίνα αδενοϊού που περιλαμβάνει την αλληλουχία ενός καλώς χαρακτηρισμένου ανθρώπινο επίτοπο (Σχήμα 4Α). Το προκύπτον κατασκεύασμα ονομάστηκε Δ24FvIII, και να χρησιμοποιηθεί το Δ24 όγκο επιλεκτική ραχοκοκαλιά αδενοϊού [32] και κωδικοποιούσε την LEEKKGNYVVT επίτοπο εισάγεται εντός του HI-βρόχου της αλληλουχίας ίνας αδενοϊού. Αυτό το πεπτίδιο προέρχεται από τη συνδετική ακολουθία του ακρωτηριασμένου πρωτεΐνης που παράγεται στο μεταλλαγμένο παραλλαγή III του μεταλλαγμένου EGFR και έχει προηγουμένως δειχθεί ότι είναι εξαιρετικά ανοσογόνος [21] (Εικόνα 4Α).

(α) Σχηματική αναπαράσταση της γενιάς του χιμαιρικού ίνας VIII. Βασιζόμενη σε PCR μεταλλαξογένεση χρησιμοποιήθηκε για την εισαγωγή της αλληλουχίας του επιτόπου LEEKKGNYVVT στην υπερμεταβλητή περιοχή του βρόχου ΗΙ. Μια μοναδική θέση περιορισμού EcoRV ενσωματώθηκε για να επιτρέψει την εισαγωγή της έκτοπης αλληλουχίας μεταξύ γλυκίνης-543 και ασπαρτικό οξύ-544. (Β) Έκφραση του χιμαιρικού ίνας που περιλαμβάνει το πεπτίδιο LEEKKGNYVVT εκτιμήθηκε σε κύτταρα Α549 μολύνθηκαν με Δ24FvIII (40 ΜΟΙ). Πρωτεϊνικά λύματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western 72 ώρες μετά τη μόλυνση χρησιμοποιώντας τόσο αντι-ινών και L8A4 αντισώματα αντι-LEEKKGNYVVT. (Γ) Ζωντανοί άγριου τύπου

Atg5

και

Atg5

– /- MEFs μολύνθηκαν με Δ24FvIII σε ΜΟΙ 150 για 48 ώρες και στη συνέχεια βάφονται με L8A4, που ακολουθείται από FITC-συζευγμένο δευτερογενή αντισώματα για κυτταρομετρία ροής αναλύσεις. Αιθίδιο χρώση ομοδιμερές-1 χρησιμοποιήθηκε για τον αποκλεισμό των νεκρών κυττάρων. Τα ποσοστά της FITC-θετικών ζωντανά κύτταρα που αναφέρεται στην επάνω δεξιά γωνία κάθε γράφημα. Η μείωση του αριθμού των θετικών κυττάρων σε Δ24FvIII μολυσμένα

Atg5

– /- σε σύγκριση με Δ24FvIII μολυσμένα άγριου τύπου

Atg5

κύτταρα ήταν στατιστικά σημαντική. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± SD τριών πειραμάτων. ***

P

& lt? 0.001 (μη ζευγαρωμένα, δίπλευρη Student

t-test

). (Δ) τα κύτταρα HeLa μολύνθηκαν με Δ24FvIII σε ΜΟΙ 40. ΙΡΝ-γ (300 μονάδες /ml) και /ή βαφιλομυκίνης Α1 (BA1? 100 ηΜ) προστέθηκαν στο μέσο 6 ώρες ή 24 ώρες μετά τη μόλυνση, αντίστοιχα. Ζωντανά κύτταρα βάφτηκαν με L8A4 48 ώρες μετά τη μόλυνση και στη συνέχεια επωάστηκαν με συζευγμένο με FITC δευτερογενή αντισώματα για να απεικονίσει θετικά κύτταρα με ένα κυτταρόμετρο ροής. Αιθίδιο χρώση ομοδιμερές-1 χρησιμοποιήθηκε για τον αποκλεισμό των νεκρών κυττάρων. Γράφημα παριστάνουν τις μέσες τιμές τριών πειραμάτων ± SD. *

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0.01 (μη ζευγαρωμένα, δίπλευρη Student

t-test

).

Η

Κύτταρα μολυσμένα με F_21 «\\ o» Humphrey, 1990 # 149 «thEGFRvIII προερχόμενο καρκίνος-ειδικό επιτόπιο

Χρησιμοποιώντας ένα πολύ ειδικό αντίσωμα που δημιουργείται εναντίον του EGFRvIII πεπτίδιο [21], μπορούμε τεκμηριωμένο ότι η έκφραση του χιμαιρικού ινών ανιχνεύθηκε εύκολα σε Δ24FvIII-μολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 4Β). Υποθέσαμε ότι η έκτοπη αλληλουχία του ανθρωπίνου επίτοπος που εισάγεται εντός του αδενοϊού ίνα υποβλήθηκε σε επεξεργασία μέσω αυτοφαγία και παρουσιάζονται στην επιφάνεια των μολυσμένων κυττάρων εκ τούτου, μετά άγριου τύπου και autophagy ανεπάρκεια

Atg5

-. /- MEFs μολύνθηκαν με Δ24FvIII, οι επιφάνειες των ζωντανών κυττάρων ήταν εξετάζονται για την παρουσία του LEEKKGNYVVT με τη χρήση του ειδικού αντισώματος [21] και αναλύσεις FACS. Δείξαμε ότι ένα υψηλό ποσοστό του αγρίου τύπου

Atg5

MEFs θετικά που προσδιορίζονται από το αντι-LEEKKGNYVVT αντίσωμα (σχήμα 4Γ .) Ωστόσο, το ποσοστό των θετικών κυττάρων μειώθηκε σημαντικά σε autophagy ανεπάρκεια

Atg5

– /- MEFs μολύνθηκαν με αδενοϊό Δ24FvIII (σχήμα 4Γ). Παρόμοια δεδομένα ελήφθησαν όταν τα κύτταρα HeLa μολύνθηκαν με αδενοϊό Δ24FvIII και η ροή autophagy μπλοκαρίστηκε με βαφιλομυκίνης Α1. Έτσι, το ποσοστό των κυττάρων HeLa που παρουσιάζουν το πεπτίδιο LEEKKGNYVVT μειώθηκε δραματικά όταν οι μολυσμένες καλλιέργειες υποβλήθηκαν σε αγωγή με βαφιλομυκίνης Α1 (Σχήμα 4D). Απόλυτα υποδηλώνοντας την ειδική ενεργοποίηση της μηχανής αντιγόνου επεξεργασίας κατά τη διάρκεια της μόλυνσης, η παρουσίαση του πεπτιδίου LEEKKGNYVVT αυξήθηκε μετά την προσθήκη ΙΡΝ-γ, η οποία μεταγραφικά ενεργοποιούν MHC, [33] σε καλλιέργειες μολύνθηκαν με αδενοϊό Δ24FvIII (Εικ 4D). Τέλος, καταδεικνύοντας περαιτέρω το ρόλο της αυτοφαγία στην επεξεργασία των LEEKKGNYVVT, βαφιλομυκίνης Α1 προεπεξεργασίας προκάλεσε μία επίδραση αποκλεισμού που ανταγωνίζεται και μείωσε σημαντικά την θετική διαμόρφωση της παρουσίασης του αντιγόνου που προκαλείται από ΙΡΝ-γ (Εικόνα 4D).

Συζήτηση

Τα στοιχεία μας αποδεικνύουν για πρώτη φορά ότι η αναστολή της αυτοφαγία σε κύτταρα μολυσμένα με αδενοϊό παρεμποδίζει την αποτελεσματική παρουσίαση του αδενοϊού που προέρχεται και ίνες ενσωματώθηκαν καρκίνο ειδικών επιτόπων. Έχουμε επίσης καταδείξει ότι αδενοϊικές πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν με την πρωτεΐνη ρ62 του φορτίου υποδοχέα αυτοφαγία, υποδηλώνοντας έντονα ότι η ρ62 μπορεί να φέρει αδενοϊικές πρωτεΐνες καψιδίου στην autophagosome. Είναι ενδιαφέρον, Ρ62 έχει προταθεί για να εργαστεί ως δυνητικός αισθητήρα για λοίμωξη από τον ιό και η σχέση μεταξύ των πρωτεϊνών του ιού και αυτοφαγία. [34] Το γεγονός ότι η ρ62 συνδέει αδενοϊικός ίνα υποδηλώνουν έντονα ότι αυτοφαγία είχε εμπλακεί σε αδενοϊική αποικοδόμηση πρωτεϊνών.