Αφηρημένο

Ιστορικό

Τα καρκινικά κύτταρα χαρακτηρίζονται από την επιτάχυνση της ανάπτυξης που συνήθως συνοδεύεται από τη ρυθμιζόμενη οδούς που αυξάνουν τελικά ο ρυθμός παραγωγής ΑΤΡ. Αυτά τα κύτταρα μπορούν να υποστούν μεταβολική επαναπρογραμματισμού, με αποτέλεσμα διακριτές βιοενεργειακό φαινοτύπους, γενικά ενίσχυση γλυκόλυση διοχετεύονται σε γαλακτικό παραγωγής. Στην παρούσα εργασία δείξαμε μεταβολικό επαναπρογραμματισμό μέσω των αναστολέων αποακετυλάσης ιστόνης (HDACis), βουτυρικό νάτριο και τριχοστατίνη. Η θεραπεία αυτή ήταν σε θέση να μετατοπίσει το μεταβολισμό της ενέργειας με την ενεργοποίηση της μιτοχονδριακής συστήματα όπως το αλυσίδα και οξειδωτική φωσφορυλίωση του αναπνευστικού που είναι εν πολλοίς κατασταλεί στις χωρίς θεραπεία ελέγχους.

Μεθοδολογία /Principal Εκτίμηση

διαφόρων κυτταρικών και βιοχημικών παραμέτρων αξιολογήθηκαν στον καρκίνο του πνεύμονα Η460 κύτταρα επεξεργασμένα με τους αναστολείς αποακετυλάσης ιστόνης (HDACis), βουτυρικό νάτριο (ΝαΒ) και τριχοστατίνη Α (TSA). ΝΑΒ και TSA μειωμένη γλυκολυτικής ροής, προσδιορίστηκε με γαλακτικό απελευθέρωσης με Η460 κύτταρα σε ένα εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο. NaB ανέστειλε την έκφραση της γλυκόζης τύπου μεταφορέα 1 (GLUT 1), αλλά ουσιαστικά αυξημένη μιτοχόνδρια δεσμεύεται εξοκινάση (HK) δραστηριότητα. ΝΑΒ επαγόμενη αύξηση της δραστηριότητας HK συνδέθηκε προς ισομορφή HK Ι και συνοδεύτηκε από 1,5 φορές αύξηση στην έκφραση HK Ι mRNA και βιοσύνθεση συγγενούς πρωτεΐνης. Γαλακτική αφυδρογονάση (LDH) και πυροσταφυλική κινάση (ΡΥΚ) δραστηριότητες ήταν αμετάβλητη από HDACis γεγονός που υποδηλώνει ότι η αύξηση της δραστηριότητας HK δεν συζεύχθηκε με γλυκολυτικής ροής. Υψηλή ανάλυση αναπνευσιομετρίας των κυττάρων Η460 αποκάλυψε ΝαΒ-εξαρτώμενη αύξηση των ποσοστών της κατανάλωσης οξυγόνου σε συνδυασμό με τη σύνθεση ΑΤΡ. Μεταβολομική ανάλυση έδειξε ότι NaB τροποποίησαν το γλυκολυτικό προφίλ μεταβολίτη άθικτων κυττάρων Η460. Ταυτόχρονα ανιχνεύσαμε μια ενεργοποίηση της οδού της φωσφορικής πεντόζης (ΡΡΡ). Η υψηλή O

2 κατανάλωση στην ΝαΒ-επεξεργασμένα κύτταρα φάνηκε να σχετίζεται με μιτοχονδριακή βιογένεση από το κιτρικό συνθάσης (CS) δραστηριότητα και η ποσότητα του μιτοχονδριακού DNA παρέμειναν αμετάβλητες.

Συμπέρασμα

ΝΑΒ και TSA προκάλεσε αύξηση στη λειτουργία των μιτοχονδρίων και σε οξειδωτικό μεταβολισμό στα κύτταρα όγκου πνεύμονα Η460 ταυτόχρονα με λιγότερο πολλαπλασιαστική κυτταρικό φαινότυπο

Παράθεση:. Amoêdo ΝΔ, Rodrigues MF, Pezzuto P, Galina Α, da Costa RM, de Almeida FCL, et al. (2011) του μεταβολισμού της ενέργειας σε Η460 κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα: επιδράσεις των αναστολέων αποακετυλάσης ιστόνης. PLoS ONE 6 (7): e22264. doi: 10.1371 /journal.pone.0022264

Επιμέλεια: Alicia J. Kowaltowski, Instituto de Química – Universidade de São Paulo, Βραζιλία

Ελήφθη: 1 Φλεβάρη 2011? Αποδεκτές: 20 Ιουν 2011? Δημοσιεύθηκε: 18 του Ιούλη 2011

Copyright: © 2011 Amoêdo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Τεχνολογικό (CNPq), Fundação de Amparo à Pesquisa κάνει Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Fundação κάνει τον καρκίνο, Βραζιλίας Ινστιτούτο Νευροεπιστήμης – IBNnet FINEP, INCT – διεγερτοτοξικότητα και Νευροπροστασία # 01.06 0,0842 και INCT – Καρκίνος. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η ανεξέλεγκτη πολλαπλασιασμό και την εισβολή χαρακτηριστικό των καρκινικών κυττάρων είναι διαδικασίες που μπορεί να διατηρηθεί μόνο όταν υπάρχει επαρκής παροχή ενέργειας, ένα χαρακτηριστικό που υποδεικνύει την εμφάνιση σε μετασχηματισμένα κύτταρα διακριτών φαινοτύπων που περιλαμβάνει απαραιτήτως τα στοιχεία του ενδιάμεσου μεταβολισμού. Σε συμπαγείς όγκους έχει δειχθεί από τον Otto Warburg ότι τα κύτταρα έχουν προσαρμοστεί να βασίζονται σε αναερόβια γλυκόλυση ως στρατηγική για τη διατήρηση επικρατούσα κατάσταση αναβολικές τους [1]. Ωστόσο, η προς τα πάνω ρύθμιση της γλυκόλυσης που παρουσιάζεται από τα καρκινικά κύτταρα δεν συνεπάγεται κατ ‘ανάγκη αυστηρές αναερόβιες φαινότυπο ούτε ένα δυσλειτουργικό οξειδωτική φωσφορυλίωση σύστημα (OXPHOS). Αντίθετα, πιστεύεται ότι η φυσιολογική αλληλεπίδραση μεταξύ του γλυκόλυση στο κυτταρόπλασμα και OXPHOS στα μιτοχόνδρια γίνεται διαταραχθεί ή επαναπρογραμματιστεί σε κύτταρα όγκου. Η επίδραση Crabtree παρατηρείται σε καρκινικά κύτταρα, ή σε ταχέως πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα χαρακτηριστικό παράδειγμα τη στενή σύνδεση μεταξύ γλυκόλυση και τον οξειδωτικό μεταβολισμό [2].

Είναι ενδιαφέρον ότι η αναερόβια φαινότυπος που παρουσιάζεται από τα καρκινικά κύτταρα μπορεί στην πραγματικότητα αντιπροσωπεύουν την αιτία αντί η συνέπεια της προσαρμοστικής πίεση. Θεωρώντας ότι ο διακόπτης γλυκολυτικά τυπικό των καρκινικών κυττάρων που αποκτήθηκαν κατά την πολύ έναρξη της καρκινογένεσης, η ιδέα προέκυψε ότι μεταβολές στην γλυκολυτική οδό μπορεί να προδιαθέτουν τα κύτταρα σε κακοήθη μετασχηματισμό [3], [4]. Επιλεκτική πλεονεκτήματα για τα μετασχηματισμένα κύτταρα θα μπορούσαν να προκύψουν από διάφορα χαρακτηριστικά. Για παράδειγμα, είναι γνωστό ότι η υποξία παράγοντα-1 (HIF-1α) διεγείρει σημαντικά την έκφραση της γλυκόζης και μονοκαρβοξυλικό μεταφορείς, γλυκολυτικά ένζυμα και επάγει μία κάτω ρύθμιση σε πυροσταφυλικής αφυδρογονάσης συγκρότημα [5]. Επιπλέον, τα καρκινικά κύτταρα παρουσιάζουν την ισομορφή του Χονγκ Κονγκ που δεσμεύεται με την πρωτεΐνη που σχηματίζει την τάση εξαρτώμενη από κανάλι ανιόν μιτοχονδριακού πόρου (VDAC). Με την πρόληψη της αλληλεπίδρασης των προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών με μιτοχόνδρια το δεσμευμένο ένζυμο ουσιαστικά δρα ως αντι-αποπτωτικό παράγοντα. Πράγματι, έχει δειχθεί ότι η απελευθέρωση των αποπτωτικών πρωτεϊνών όπως το κυτόχρωμα

γ

εξαρτάται από την ακεραιότητα της Ν-τερματικό τμήμα της VDAC [6]. Δεδομένου ότι αποδείχθηκε ότι HK και Bcl-2 ήταν σε θέση να προσφέρει προστασία έναντι της απόπτωσης μέσω αλληλεπίδρασης με την περιοχή 1 Ν-τερματικό VDAC, η συμμετοχή της HK II ως υποκινητή της διαφοροποιήσεως των κυττάρων ενισχύθηκε.

Ένζυμα του οι γλυκολυτικό και το οξειδωτικό οδών είναι, όπως πρωτεΐνες γενικά, δεκτικά ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων στο επίπεδο της χρωματίνης. Χρωματίνης δομές εναλλάσσονται μεταξύ συμπιέζεται και χαλαρή διαμορφώσεων που με τη σειρά τους εξαρτώνται από ακετυλίωση και η αποακετυλίωση της ιστόνης πρωτεΐνης πυρήνα. Τα ενζυμικά συστήματα που εμπλέκονται σε αυτές τις διαδικασίες είναι ιστόνες ακετυλο τρανσφεράσες (καπέλα) που προσθέτουν ακετυλο ομάδων σε κατάλοιπα λυσίνης και αποακετυλάσες ιστόνης (HDACs) που τους αφαιρέσει. έχουν συμπιέζεται και χαλαρή χρωματίνη έχουν συνδεθεί με γονιδιακή καταστολή της έκφρασης και την ενεργοποίηση, αντίστοιχα. Αν και ιστόνες αποτελεί την κύρια υποστρώματα για καπέλα και HDCAs, άλλες μη-ιστόνης πρωτεΐνες όπως μεταγραφικών παραγόντων-p53, πρωτεΐνη ρετινοβλαστώματος pRb και HIF-1α? συνοδούς (HSP90), μεταβολικά ένζυμα (πυροσταφυλική κινάση? ακετυλο-CoA συνθάσης) και υποδοχείς στεροειδών είναι επίσης ακετυλιώνεται /αποακετυλιώνεται από αυτά τα ένζυμα. Ως εκ τούτου, καπέλα και HDACs μπορεί να επηρεάσει ένα ευρύ φάσμα βιολογικών διεργασιών που περιλαμβάνουν διακοπή αύξησης, την επιδιόρθωση του DNA, κυτταρική βιοενεργητική, οδούς κυτταρικού θανάτου (απόπτωση, και αυτοφαγία), μίτωση, παραγωγή δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS), γήρανση και την αγγειογένεση [7 ], [8]. Λόγω των κατασταλτικών ενεργειών της, HDACs έχουν γίνει ενδιαφέρουσες στόχους για την ανάπτυξη φαρμάκων που θα μπορούσε να ανακτήσει την ικανότητα των μετασχηματισμένων κυττάρων να υποβληθούν σε απόπτωση. Επί του παρόντος, διάφοροι αναστολείς HDAC (HDACis) που λαμβάνεται από φυσικές ή συνθετικές πηγές έχουν χαρακτηριστεί. Αυτά ομαδοποιούνται σε πέντε χημικών τάξεων οι οποίες περιλαμβάνουν υδροξαμικό οξύ και παράγωγα ενώσεων, βενζαμίδια, κυκλικά πεπτίδια, λιπαρά οξέα βραχείας αλύσου και κετόνες.

Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, οι HDACis αλλάξει αρκετές λειτουργίες σε φυσιολογικά και μετασχηματισμένα κύτταρα που το καθιστά δύσκολο να εντοπίσουμε έναν μηχανισμό δράσης σε αυτά τα φάρμακα. Αρκετές αναφορές υπάρχουν που δείχνει την δράση του HDACi επί του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης. Η παρούσα εργασία έχει διαχωριστεί αυτές τις ευρείες δράσεις με επίκεντρο το μεταβολισμό της ενέργειας και αποδεικνύοντας ότι HDACis μπορεί να επηρεάσει τον πολλαπλασιασμό δρώντας σε μεμονωμένα ένζυμα του γλυκολυτικού και οξειδωτική μονοπάτια. Οι πληροφορίες που διατίθενται μέχρι τώρα μελετούν μιτοχόνδρια από ήπαρ αρουραίου υποβλήθηκε σε επεξεργασία με το παράγωγο βαλπροϊκό βραχείας αλύσου λιπαρό οξύ (VPA) έχουν δείξει ότι αναστέλλει λιπαρό οξύ β-οξείδωση και γενικά πιέζει το μεταβολισμό των κυττάρων οξειδωτικό που οδηγούν σε μείωση και στις δύο, του ρυθμού O

2 κατανάλωσης σε συνδυασμό με τη δραστηριότητα της σύνθεσης ATP και οξειδάση κυτοχρώματος [9], [10], [11]. Ο ορθοκολικός αδενοκαρκινώματα κύτταρα (ΗΤ29) που έλαβαν θεραπεία με βουτυρικό, μια άλλη κατηγορία μικρής αλυσίδας λιπαρών οξέων HDACi, ανέστειλε την πρόσληψη γλυκόζης και οξείδωση, καθώς και σύνθεση ριβόζη και αυξημένη

σύνθεση de novo

λιπαρό οξύ μαζί με την ενεργοποίηση του ΡΡΡ. Ωστόσο κύτταρα MIA, παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα βουτυρικό ανθεκτικά, δεν εμφανίζει καμία αλλαγή στο μεταβολικό προφίλ τους μετά τη θεραπεία. Αυτές οι μεταβολικές αλλαγές συσχετίστηκαν με επαγωγή διαδικασίες διαφοροποίησης που προκαλούνται από βουτυρικό και, κατά συνέπεια, με ανασταλτικά αποτελέσματα της στην ανάπτυξη. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με κύτταρα που εκτίθενται σε TSA [12], [13]. Σε κύτταρα μυελώματος, ο HDACis VPA και σουβεροϋλανιλιδο υδροξαμικό οξύ (SAHA) προκάλεσε μια μείωση στην πρόσληψη γλυκόζης, GLUT 1 έκφραση και δραστικότητα HK, οδηγώντας σε απόπτωση σε κύτταρα όγκου. Επιπλέον, αυτοί οι αναστολείς αύξησε τον καταβολισμό αμινοξέων [14].

Η παρούσα μελέτη εξέτασε τους ρόλους του ΝΑΒ και TSA σε διάφορες παραμέτρους, βιοχημικές και μορφολογικές, της κυτταρικής γραμμής Η460 του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων ώστε να διευκρινίσει πώς αυτά τα HDACis παρεμβαίνει με την ομοιόσταση των κυττάρων του όγκου. Τα δεδομένα έδειξαν με βεβαιότητα ότι η θεραπεία με ΝαΒ για 24 ώρες να οδηγήσει σε μια γενικά βελτιωμένη οξειδωτικό μεταβολισμό υποδηλώνοντας σαφώς ότι HDACis είναι δυνατόν να υπερβαίνουν κανονικά το ρόλο τους σε επίπεδο χρωματίνης.

Μέθοδοι

Cell Culture

Η460, ένα ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα (ATCC, κατατίθενται από AF Gazdar, 1982), διατηρήθηκε σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), ρΗ 7,4 στους 37 ° C σε υγροποιημένο θάλαμο επώασης με 5% CO

2. Τα κύτταρα υπο-καλλιεργήθηκαν κάθε 2 ημέρες και χρησιμοποιήθηκαν για τα πειράματα όταν έφθασαν 85% συρροή. Τα κύτταρα Η460 γονότυπος στο εργαστήριό μας χρησιμοποιώντας 8 θέσεις συν αμελογενίνης. Όλα loci συμφωνημένα το προφίλ ATCC DNA STR.

Κυττάρων Η βιωσιμότητα και κυτταροτοξικότητας Δοκιμασία

Για εκείνες τις δοκιμασίες τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 24 και 96 φρεατίων. 24 ώρες μετά την επίστρωση, τα κύτταρα επωάστηκαν με τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις NaB (1, 3 και 10 mM) και TSA (0.02, 0.2 και 1 μΜ) για μέχρι 48 ώρες. Μετά από κάθε θεραπεία, η βιωσιμότητα των κυττάρων προσπελαστεί χρησιμοποιούσε ΜΤΤ δοκιμασία, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15], και κυανού δοκιμασία χρωστικής αποκλεισμό. Κυτταροτοξικότητας δοκιμάσθηκε με γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH) απελευθέρωση μετά από θεραπεία NaB χρησιμοποιώντας κιτ προσδιορισμού κυτταροτοξικότητος CytoTox96 μη ραδιενεργά (Promega).

Κύκλου Κυττάρου Ανάλυση

Για τα κύτταρα Η460 χρώση DNA αναπτύχθηκαν σε 6 φρεατίων πλάκες και επεξεργάστηκε με 3 ή 10 mM ΝΑΒ και 0,2 μΜ TSA για 24 ώρες. Τα κύτταρα σφαιροποιήθηκαν (1000

xg

για 5 λεπτά. Στους 4 ° C) και ressuspended σε 500 uL διαλύματος χρώσης ΡΙ, που αποτελείται από 50 μg /ml ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ), 1 mg /mL RNAse και 0,2% Triton Χ-100. Τα δείγματα επωάστηκαν σε πάγο για 15 λεπτά. στο σκοτάδι και στη συνέχεια αναλύθηκαν σε κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur (Becton Dickinson) χρησιμοποιώντας λογισμικό CellQuest (Becton Dickinson), αντίστοιχα, για την απόκτηση δεδομένων και ανάλυση κατανομής του κυτταρικού κύκλου.

Κινητική γαλακτικού Release στο Culture media

Μετά την επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις ΝΑΒ και TSA για 24 ώρες, το μέσο καλλιέργειας αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο RPMI 1640 χωρίς ερυθρό και FBS φαινόλης. Στους χρόνους που υποδεικνύονται (0, 15, 30, 40, 50 και 60 λεπτά.), Κλάσματα από μέσο καλλιέργειας συλλέχθηκαν για να αξιολογηθεί γαλακτικό απελευθέρωση μέσω αυτής της ενζυμικής δοκιμασίας: μέτρηση γαλακτικού διεξήχθη σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα υδραζίνης /γλυκίνη (ρΗ 9.2), που περιέχει 5 mg /mL β-ΝΑΟ

+ και 15 μονάδες /mL γαλακτική αφυδρογονάση. Η απορρόφηση λόγω του σχηματισμού ΝΑϋΗ παρακολουθήθηκε σε μία συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας (SpectraMax M5, Molecular Devices) στα 340 nm και συσχετίστηκε με την παρουσία γαλακτικού σε δείγματα από μία πρότυπη καμπύλη [16].

Παρασκευή του μιτοχονδριακού και κυτοσολικά κλάσματα πρωτεΐνης

σφαιρίδιο κυττάρων Η460 αναμίχθηκε σε ένα ρυθμιστικό λύσης που περιέχει 10 mM Tris-HCl ρΗ 7,4, 0,25 Μ σακχαρόζης, 20 mM NaF, 1 mM DTT, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF και αναστολείς πρωτεάσης κοκτέιλ (χυμοστατίνη, λευπεπτίνη, αντιπαΐνη, πεπστατίνη Α – Sigma-Aldrich). Το κυτταρικό εναιώρημα μεταφέρθηκε σε ομογενοποιητές (Wheaton Potter-Elvehjem) για κυτταρική λύση. Το εναιώρημα φυγοκεντρήθηκε στα 100

χ g

για 5 λεπτά. στους 4 ° C, το σφαιρίδιο με συντρίμμια απορρίφθηκε και το υπερκείμενο που προέκυψε φυγοκεντρήθηκε στα 10.000

χ g

για 15 λεπτά. στους 4 ° C. Στη συνέχεια, το υπερκείμενο (κυτοσολικό κλάσμα) χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση των ανακτημένων δραστηριότητες του ΗΚ, ΡΥΚ, LDH και αφυδρογονάση γλυκόζης-6-φωσφορικής (G6PDH) και το σφαιρίδιο (μιτοχονδριακό κλάσμα) χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση των ανακτημένων δραστηριότητες του mt-HK και CS. Αυτά τα εκχυλίσματα χρησιμοποιήθηκαν για την κηλίδωση Western και ενζυμική δοκιμασίες δραστικότητας. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης διεξήχθη με τη χρήση της μεθόδου Bradford

ενζυματικές αναλύσεις Δραστηριότητα

Η ενζυματική δραστηριότητα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας την ακόλουθη μέσα αντίδρασης:. (α) για HK, 20 mM Tris-HCl ρΗ 7,4, 10 mM MgCl

2, 1 mM β-ΝΑΟ

+, 1 μονάδα /mL G6PDH (

Leuconostoc mesenteroides

), 0,1% Triton Χ-100, 2 mM ΑΤΡ και 5 mM γλυκόζης. (Β) Για ΡΥΚ, 50 mM Tris-HCl ρΗ 7,4, 5 mM MgCl

2, 50 mM KCl, 0,2 mM β-NADH, 2.5 mM ADP, 0,1% Triton Χ-100, 5 mM φωσφοενολοπυροσταφυλικό, 0,5 μονάδες /mL γαλακτική αφυδρογονάση. (Γ) Για LDH, 50 mM Tris-HCl ρΗ 7,4, 1 mM EDTA, 0,2 mM β-NADH, 0.1% Triton Χ-100, 1 mM πυροσταφυλικό. (Δ) Για G6PDH, 50 mM Tris-HCl ρΗ 7,4, 5 mM MgCl

2, 0,1% Triton Χ-100, 2 mM γλυκόζη-6-φωσφορικής και 0,2 mM β-NADH. Οι αντιδράσεις ξεκίνησαν με την προσθήκη 20 έως 140 μg πρωτεΐνης για HK και 10 μg πρωτεΐνης για ΡΥΚ, LDH και G6PDH και διεξήχθησαν στους 37 ° C για 5 λεπτά. Μετά την επώαση, τα δείγματα αμέσως βρασμένο και τοποθετήθηκαν σε πάγο. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 340 nm και την τιμή που χρησιμοποιείται για τον υπολογισμό της ειδικής δραστικότητας των ενζύμων που ορίζεται ως η ποσότητα του υποστρώματος που σχηματίζεται ανά χιλιοστόγραμμο πρωτεΐνης ανά λεπτό. (Ε) Για CS, 50 mM Tris-HCl ρΗ 8.1, 0.3 mM ακετυλο-CoA, 0.1% Triton Χ-100, 0,1 mM DTNB, 0,5 mM οξαλοξικό. Η αντίδραση ξεκίνησε με την προσθήκη 10 μg πρωτεΐνης και διεξάγεται σε 30 ° C για 5 λεπτά. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 412 nm. (Στ) Για ηλεκτρική αφυδρογονάση (SDH), φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα 50 mM (ρΗ 7.4), 0.1% Triton Χ-100, 0.8 mM KCN, 0,06 mM 2,6-διχλωροφαινολινδοφαινόλη (DCIPIP), 1,1 mM φαιναζίνη (PMS) και 100 μg πρωτεΐνη Η αντίδραση διεξήχθη στους 25 ° C για 7 λεπτά και διεκόπη με 10 mM μηλονικό. Η μείωση του DCPIP παρακολουθήθηκε στα 600 nm.

Western Blotting

25 μg εκχυλισμάτων πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με τυπική SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες nitrocelulose με ηλεκτροκηλίδωση σε ρυθμιστικό που αποτελείται από 39 mM γλυκίνης , 48 mM Tris-base, 0,037% SDS και 20% μεθανόλη. Κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας πρωτογενή αντισώματα αραιωμένα σε TBS, 0,1% Tween 20 και 5% BSA. Πρωτογενή αντισώματα εναντίον HK Ι, HKII και VDAC 2 (Abcam) χρησιμοποιήθηκαν.

οξυγόνου Κατανάλωση άθικτη και Digitonin-διαπερατά Η460 κύτταρα

O

2 ποσοστά κατανάλωσης μετρήθηκαν πολαρογραφικώς τη χρήση υψηλής -Ανάλυση αναπνευσιομετρίας (Oroboros Oxygraph-O2K). Μετά την περίοδο θεραπείας, το μέσο απομακρύνθηκε και τα κύτταρα είτε αιωρούνται σε RPMI (11,1 mM γλυκόζη και 2 mM γλουταμίνη) ή γλυκόζη DMEM ελεύθερο για μετρήσεις O

2 κατανάλωση ακέραια κύτταρα, ή στο μέσο αναπνοή ρΗ 7,0 (0,25 Μ μαννιτόλη, 10 mM MgCl

2, 10 mM ΚΗ

2 ΡΟ

4, 10 mM HEPES, 0,08 mM EDTA, 1 mM EGTA και 0.1% άνευ λιπαρού οξέος BSA) για την αξιολόγηση της αναπνευστικής συμπλοκών διαπερατών κυττάρων . Ρουτίνα κατανάλωση, ολιγομυκίνης ανεξάρτητη αναπνοή (πρωτόνιο διαρροή) και FCCP διεγείρεται αναπνοή (αναπνοή μέγιστο) μετρήθηκαν σε ανέπαφα κύτταρα Η460 όπως περιγράφεται προηγουμένως [17]. ΝΑΒ επιδράσεις στην αναπνευστική σύμπλοκα 0.003% Η460 κύτταρα διγιτονίνη-διαπερατά διεξήχθησαν μετά την προσθήκη διαφορετικών υποστρωμάτων /ρυθμιστές όπως 10 mM πυροσταφυλικό + 10 mM μηλικού (σύμπλοκο Ι-συνδεδεμένη υποστρώματα), 10 mM ηλεκτρικό (σύμπλεγμα II-συνδεδεμένο υπόστρωμα) , 0.5 μΜ ροτενόνη, 100 μΜ ADP. Όταν αναλύοντας κατάσταση 3 προκαλείται από 2-δεοξυγλυκόζης (2-DOG), 10 mM 2-DOG προστέθηκε. DatLab λογισμικού (Oroboros Instruments, Ίνσμπρουκ, Αυστρία) χρησιμοποιήθηκε για την απόκτηση και την ανάλυση των δεδομένων.

Εξαγωγή RNA και Σύνθεση cDNA

Το συνολικό RNA απομονώθηκε από Η460 κύτταρα χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ολικό RNA ποσοτικοποιήθηκε φασματοφωτομετρικά και 1 μg υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 U DNAse RNAse-δωρεάν για 30 λεπτά. στους 37 ° C. Οι αντιδράσεις σταμάτησαν με την προσθήκη 1 μλ 20 mM EDTA και θέρμανση για 10 λεπτά. στους 65 ° C. cDNA σύνθεση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του RNA αντιμετωπίζεται σύμφωνα με ϋΝΑση High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit από την Applied Biosystems.

Real Time PCR

Ανάλυση έκφρασης γονιδίων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας 7500 Real Time PCR (Applied Biosystems) και SYBR-Green Power PCR Master Mix (Applied Biosystems). Για τη δοκιμή αυτή ζεύγη εκκινητών συντέθηκαν με βάση την GenBank ακολουθιών του mRNA. Οι αλληλουχίες των εκκινητών παρουσιάζονται στον Πίνακα S1. Η συγκριτική μέθοδος Ct χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει τις αλλαγές στα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης [18]. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ενδογενής έλεγχος.

Ηλεκτρονική Μικροσκοπία

Τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά σε θερμό PBS και μονιμοποιήθηκαν σε ένα διάλυμα ρΗ 7,2 που περιέχει 2,5% γλουταραλδεΰδη, 0.1 Μ ρυθμιστικό κακοδυλικού νατρίου, μετά σταθερό με 1% ΟΣΟ

4 (τετροξείδιο οσμίου) σε ρυθμιστικό κακοδυλικού νατρίου 0,1 Μ. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS, αφυδατώθηκαν με ακετόνη και ενσωματώθηκαν σε Εροη. Εξαιρετικά λεπτές τομές (70 nm) βάφτηκαν με οξικό ουρανύλιο και κιτρικό μόλυβδο, και παρατηρήθηκαν σε ένα Zeiss 900 ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Για μιτοχόνδρια μορφομετρία, είκοσι ηλεκτρονικές μικρογραφίες λήφθηκαν από κάθε δείγμα και αναλύεται για μορφολογία. Μετρήσεις εκάστου μιτοχονδρίου προφίλ περιοχή στην υπέρλεπτες τομές έγιναν χρησιμοποιώντας Image J (ΝΙΗ) λογισμικού.

Πυρηνικού Μαγνητικού Ressonance (NMR) για μεταβολομική Ανάλυση

μεταβολομική διαλογή των κυττάρων Η460 πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στο [19] με λίγες τροποποιήσεις. Εν συντομία, τα μέσα καλλιέργειας των μη επεξεργασμένων και NaB επεξεργασμένα Η460 κύτταρα αντικαταστάθηκαν από ελεύθερο γλυκόζης ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με D- [U-

13C] 5 mM γλυκόζη και τα κύτταρα επωάστηκαν για 1 ώρα. Μετά την επώαση, το μέσο απομακρύνθηκε και περίπου 3 × 10

7 κύτταρα εναιωρήθηκαν σε ελεύθερο γλυκόζης ϋΜΕΜ που περιέχει 10% οξείδιο του δευτερίου. Μονοδιάστατη

φάσματα 13C ανέπαφων κυττάρων Η460 μεταβολίτες ελήφθησαν στους 25 ° C. Φάσματα Η460 κύτταρα μεταβολιτών αποκτήθηκαν με Brucker DRX 400 MHz χρησιμοποιώντας έναν καθετήρα τριπλού συντονισμού (TXI). Spectra επεξεργασία και ανάλυση διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας Topspin 2.0 και εκχώρηση μεταβολίτη έγινε με σύγκριση χημική μετατόπιση γνωστοί μεταβολίτες κατατεθεί στο Human μεταβολιτών Database v 1.0.

Στατιστική Ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Graph pad Prism 5. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέσο ± SEM για

n

ανεξάρτητα πειράματα. Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε από φοιτητή

t

δοκιμής,

μονόδρομη

ANOVA και

αμφίδρομη

ANOVA.

Αποτελέσματα

το βουτυρικό νάτριο και τριχοστατίνη Α ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Η460 και επάγεται μορφολογικές αλλαγές συμβατή με μια διαδικασία διαφοροποίησης

Αρχικά, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς για να αξιολογηθεί ΝΑΒ και TSA επιδράσεις στη βιωσιμότητα των κυττάρων για να καθορίσει τις καλύτερες πειραματικές συνθήκες για τη μελέτη επιδράσεις HDACis επί του μεταβολισμού της ενέργειας χωρίς παρεμβολές που προκαλούνται από κυτταροτοξικότητα. Όπως παρατηρήθηκε με μικροσκοπία αντίθεσης φάσης, τα κύτταρα Η460 κατεργάζεται με NaB εμφάνισαν διακριτή διαφορές σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Η μορφολογία παρατηρήθηκε ήταν συμβατό με αυτό των διαφοροποιημένων κυττάρων, υποδηλώνοντας ότι μπορεί να έχουν NaB εξουδετερωθούν ρυθμιστικές οδούς που σε καρκινικά κύτταρα θα οδηγούσε σε αποδιαφοροποίηση. Τα αποτελέσματα στο Σχήμα 1 δείχνουν περαιτέρω ότι η θεραπεία με 10 mM NaB παράγονται κύτταρα που ήταν λιγότερο συρροή και είναι ελαφρώς πιο επιμήκεις από τα μη επεξεργασμένα όνες (Σχήμα 1 C και D). Είναι ενδιαφέρον ότι η μορφολογία των κυττάρων σε επεξεργασία Η460 NaB έμοιαζαν κύτταρα Α549, ένα περισσότερο διαφοροποιημένο καρκίνο του πνεύμονα που δεν δείχνει μορφολογικές αλλαγές μετά από επεξεργασία NaB (Σχήμα 1Α και Β). Αυτές οι αλλαγές στο σχήμα του κυττάρου ήταν πιθανώς σχετίζονται με την αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού, δεδομένου ότι η επεξεργασία των κυττάρων με NaB παρήγαγε μία έντονη ανακατανομή του F-ακτίνης όπως αποκαλύφθηκε με χρώση με επισημασμένο ροδαμινο phaloidin (Σχήμα S1? Μέθοδος S2). Με βάση αυτή την παρατήρηση το ερώτημα αν 10 mM NaB μπορούσαν να έχουν κυτταροτοξικές επιδράσεις στις καλλιέργειες αυξήθηκε. Πειράματα που περιλαμβάνουν απλή καταμέτρηση των κυττάρων διεξάγεται σε 24 και 48 ώρες, έδειξε μια εξαρτώμενη από τη δόση επίδραση επί του πολλαπλασιασμού (Σχήμα S2A). Στις 24 ώρες, η θεραπεία με 10 mM NaB προκάλεσε μία μείωση κατά 50% σε σχέση με τα κύτταρα που δεν έχουν εκτεθεί στο HDACi. Στις 48 ώρες επώασης, ο αριθμός των ζωντανών κυττάρων σε 10 mM NaB ήταν περίπου 10%. κύτταρα Η460 επωάζονται με NaB σε συγκεντρώσεις 1, 3 και 10 mM στη συνέχεια εξετάστηκαν για βιωσιμότητα με χρήση της ανάλυσης ΜΤΤ. Τα αποτελέσματα (Σχήμα S2B) έδειξε μια μέτρια επίδραση στις 24 ώρες αποδίδοντας σχεδόν το 80% βιωσιμότητα σε 10 mM ΝΑΒ και περίπου 30% βιωσιμότητα μετά από 48 ώρες επώαση με την ίδια συγκέντρωση. Ουσιαστικά, τα ίδια αποτελέσματα ελήφθησαν όταν αυτά τα πειράματα επαναλήφθηκαν με TSA, χρησιμοποιώντας συγκεντρώσεις που εκτείνονται 0.02-1 μΜ, εκτός από το ότι στην υψηλότερη συγκέντρωση, TSA φάνηκε να είναι πιο τοξικά από NaB (Σχήμα S2D-Ε). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ΝΑΒ και TSA, παρόλο που ανήκουν σε διαφορετικές χημικές τάξεις, κοινόχρηστη παρόμοια αποτελέσματα. Αν και ο αριθμός των κυττάρων ήταν σαφώς μειωθεί ως αποτέλεσμα της δράσης ΝΑΒ και TSA, οι κύριες επιδράσεις των δύο αναστολέων θα μπορούσαν ασφαλώς να ερμηνευθεί ως αναστολή του πολλαπλασιασμού, παρά μια άμεση τοξική επίδραση. Προκειμένου να ελεγχθεί αν τα επεξεργασμένα κύτταρα είχαν καταστραφεί από τις HDACis, γαλακτική αφυδρογονάση απελευθέρωση προσδιορίστηκε μετά από θεραπεία για 24 και 48 ώρες με ΝΑΒ και TSA (σχήμα S2F) σε διάφορες συγκεντρώσεις. Γαλακτικής αφυδρογονάσης απελευθέρωση δεν επηρεάστηκε σημαντικά από ΝαΒ στις 24 ώρες (Σχήμα S2C). Στις 48 ώρες και μόνο σε μία συγκέντρωση από 10 mM έκαναν θεραπεία NaB σημαντικά επαγόμενη απελευθέρωση γαλακτικής αφυδρογονάσης. Επιπλέον, η επιθεώρηση των επεξεργασμένων κυττάρων με μικροσκόπιο φθορισμού μετά από χρώση με DAPI (Σχήμα S1) αποκάλυψε άθικτα πυρήνες και χρωματίνης, ένα αποτέλεσμα το οποίο θα υποστηρίξει τη φθορά των κυττάρων. Λόγω του ευρέος φάσματος των δραστηριοτήτων του ΝαΒ, διεξήχθησαν πειράματα για να ελέγξει εάν η θεραπεία των κυττάρων Η460 με αυτού του αναστολέα θα μπορούσε να επηρεάσει τη διανομή των κυττάρων κατά μήκος των κύριων σταδίων του κυτταρικού κύκλου. Αυτά τα πειράματα διεξήχθησαν με την ποσοτικοποίηση επεξεργασμένα και μη επεξεργασμένα κύτταρα μέσω ενεργοποιημένων με φθορισμό κυτταρική διαλογή. Τα αποτελέσματα στο Σχήμα S3A δείχνουν ότι μετά από μια θεραπεία 24 ώρες, τα περισσότερα κύτταρα, περίπου το 80%, βρέθηκαν στην φάση G0 /G1 του κυτταρικού κύκλου με ταυτόχρονη μείωση της φάσης S. Η επώαση των κυττάρων με 0,2 μΜ TSA για 24 ώρες παρήγαγε ένα παρόμοιο προφίλ (Σχήμα S3b). Λαμβάνοντας υπόψη αυτά τα αποτελέσματα, η θεραπεία των 10 mM NaB για 24 ώρες επαγόμενη διαφοροποίηση και την αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης, αλλά δεν ήταν τοξικό για Η460 κύτταρα. Έτσι, τα πειράματα με μακροχρόνια επώαση των κυττάρων με τις HDACis δεν επεκτάθηκαν πέραν των 24 ωρών.

Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C υγροποιημένο επωαστή που περιέχει 5% CO

2 και φωτογραφήθηκαν κάτω από έντονο πεδίο χρησιμοποιώντας την σύστημα τεκμηρίωσης του ανεστραμμένο μικροσκόπιο Nikon TS100. κύτταρα (Α) Α549 μη επεξεργασμένων. κύτταρα (Β) Α549 σε επεξεργασία με 10 mM NaB για 24 ώρες. (Γ) Η460 κύτταρα. (D) Η460 κύτταρα κατεργασμένα με 10 mM NaB για 24 ώρες.

Η

βουτυρικό νατρίου μειώθηκαν γαλακτικό απελευθέρωση των κυττάρων Η460, μείωσε την έκφραση της GLUT 1 και αυξημένη GLUT 3 έκφραση

Αναφορικά ο μεταβολισμός της ενέργειας, ένα από τα κύρια χαρακτηριστικά του εξαιρετικά πολλαπλασιαστικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων του όγκου, είναι στροφή τους να αναερόβια γλυκόλυση [3], [20], [21]. Η επιλεκτική πίεση, κατά περίπτωση, την παραγωγή ενός τέτοιου αλλαγμένο φαινότυπο πρέπει να προκύπτει από τους ρυθμιστικούς μηχανισμούς που με κάποιο τρόπο είναι σε θέση να ανιχνεύει την ενέργεια κατάσταση των κυττάρων. Ως εκ τούτου, ως ένα πρώτο βήμα για την αποκάλυψη μεταβολικές οδούς που πλήττονται από ΝΑΒ και TSA, εμείς ερώτησε εάν αυτές οι HDACis θα μπορούσαν να επηρεάσουν άμεσα την γλυκολυτική ροή των κυττάρων Η460. Αυτή η σειρά πειραμάτων άρχισε με την μέτρηση της ποσότητας του γαλακτικού σε ένα μέσο καλλιέργειας μετά από επώαση των κυττάρων με 3 και 10 mM NaB για 24 ώρες. Η ποσότητα του γαλακτικού που απελευθερώνεται στη συνέχεια παρακολουθείται σε τακτά χρονικά διαστήματα για μια περίοδο 60 λεπτών. Τα αποτελέσματα φαίνονται στο Σχήμα 2Α. Οι τιμές που παρατηρήθηκαν στην απελευθέρωση γαλακτικού ήταν παρόμοιες με εκείνες που παρατηρήθηκαν με Pereira da Silva [19]. Μπορεί να φανεί ότι NaB μειωμένη γαλακτικό απελευθέρωσης σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Ένα παρόμοιο μοτίβο αναστολής της απελευθέρωσης γαλακτικής ελήφθη μετά από επώαση των κυττάρων με 0,2 μΜ TSA για 24 ώρες (Σχήμα S4A). Μετά από 60 λεπτά. επώαση, TSA-κατεργασμένα κύτταρα απελευθερώνονται περίπου το 60% της ποσότητας του γαλακτικού που απελευθερώνεται από τους ελέγχους. διακυμάνσεις Lactate θα μπορούσαν να προκύψουν ως συνέπεια της διαταραχές σε οποιοδήποτε στάδιο της γλυκολυτικής οδού. Λαμβάνοντας υπόψη ότι στην παρούσα εργασία τα πειράματα έγιναν με κύτταρα σε καλλιέργεια, γαλακτικό ανακύκλωση μέσω γλυκονεογένεση αποκλείστηκε. Μια πιθανή μοίρα για γαλακτικό θα μπορούσε να είναι οξειδωτικό μεταβολισμό των κυττάρων, με την προϋπόθεση βέβαια ότι τα μιτοχόνδρια των κυττάρων του όγκου ήταν λειτουργικά. Ως εκ τούτου, γαλακτικό απελευθέρωση προσδιορίστηκε μετά από επώαση των κυττάρων Η460 με NaB για 24 ώρες που ακολουθείται από προσθήκη αντιμυκίνη Α Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως η αναλογία μεταξύ γαλακτικού απελευθέρωσης υπό την παρουσία και απουσία του αντιμυκίνη Α, φαίνονται στην Εικόνα 2Β. Μετά από 60 λεπτά. με ΝΑΒ και αντιμυκίνη Α, γαλακτικό απελευθέρωση σταθεροποιήθηκαν έξω παρουσιάζοντας μια διπλή αύξηση σε σχέση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. 0.2 μΜ TSA προκάλεσε παρόμοια απόκριση με αντιμυκίνη A μετά από 60 λεπτά. επώασης (Σχήμα S4B). Εκτός δείχνει ότι το οξειδωτικό μεταβολισμό είναι σε λειτουργία το Η460 κύτταρα, και υποτίθεται ότι αυξήθηκε το HDACi επεξεργασμένα κύτταρα, αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν επίσης την ερμηνεία που ΝΑΒ και TSA επηρέασε πράγματι το γλυκολυτικό ροή. Ωστόσο, η πρόσληψη γλυκόζης από τα κύτταρα του όγκου θα μπορούσε να συνιστά αφ ‘εαυτού βηματοδότη για όλη τη γλυκολυτική οδό. Ως εκ τούτου, τα πειράματα σχεδιάστηκαν για να ελεγχθεί αν NaB είχαν οποιαδήποτε επίδραση στην έκφραση των GLUT 1 και GLUT 3 χρησιμοποιώντας qRT-PCR. Τα αποτελέσματα στο Σχήμα 2C δείχνει ότι NaB επωάζεται στους 3 και 10 mM επί 24 ώρες μείωσε την έκφραση της GLUT 1 (1,6 και 4, αντίστοιχα) και αυξημένη GLUT 3 έκφρασης (2.9X) σε Η460 κύτταρα.

Μετά την 24 ώρες της θεραπείας με 3 mM ή 10 mM NaB, Η460 κύτταρα επωάστηκαν με μέσο γλυκόζη συμπληρωμένο. Δείγματα των υπερκείμενα συλλέχθηκαν κάθε 10 λεπτά και επωάστηκαν σε ρυθμιστικό hidrazine ρΗ 9,2, με μία περίσσεια NAD

+ και γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH) για τη μέτρηση του γαλακτικού κυκλοφορήσει. (Α) Κινητική γαλακτικού απελευθέρωση και την εκπροσώπηση του γαλακτικού απελευθέρωσης μετά από 60 λεπτά (ένθετο). (Β) Μετά από 30 λεπτά επώασης με γλυκόζη, 2 μg /ml αντιμυκίνη Α προστέθηκε στην καλλιέργεια. Δείγματα του υπερκειμένου λήφθηκαν σε διαστήματα 10 λεπτών και γαλακτικό απελευθερώθηκε μετρήθηκε. Η αναλογία παραγωγής γαλακτικού του Η460 κυττάρων παρουσία και απουσία αντιμυκίνη Α μαρτυρά την διέγερση επί της παραγωγής γαλακτικού οξέος όταν οξειδωτική φωσφορυλίωση ανεστάλη με την προσθήκη αυτού του φαρμάκου (που υποδεικνύεται από το μαύρο βέλος). Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM? Ν = 4, Ρ * & lt? 0.05. (C) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 3 mM ή 10 mM NaB για 24 ώρες και GLUT 1 και (D) έκφραση GLUT 3 προσδιορίστηκε με Real Time PCR. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε για να ομαλοποιήσει τα ποσά cDNA. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM? Ν = 3, * P & lt? 0,05? ** P & lt?. 0.01

Η

Το βουτυρικό νάτριο αυξημένη μιτοχόνδρια δεσμεύεται δραστηριότητας εξοκινάση

Η παρατηρούμενη μείωση των GLUT 1 και αυξημένη έκφραση των GLUT 3 (Σχήμα 2C) προταθεί ότι ένα αντισταθμιστικό μηχανισμό πρόσληψη γλυκόζης ήταν λειτουργική στα κύτταρα. Έτσι, ρωτήσαμε αν δραστηριότητα Χονγκ Κονγκ, ένα σημαντικό στοιχείο στην κινητική της πρόσληψης γλυκόζης και γλυκολυτικής ροής, θα μπορούσε να παίξει ένα ρόλο. Για να διερευνηθεί αυτό, η δραστηριότητα HK διεξήχθη και η έκφραση των ισομορφών HK αξιολογήθηκε με qRT-PCR. Το Σχήμα 3Α δείχνει ότι, ως αποτέλεσμα της επώασης των κυττάρων Η460 με 10 mM NaB για 24 ώρες, η δραστηριότητα των μιτοχονδρίων δεσμεύεται HK αυξήθηκε το διπλάσιο εκείνο των μη επεξεργασμένων ελέγχων. Σε αντίθεση, NaB δεν επηρέασε την δραστηριότητα του κυτοσολικού HK. Η ενδοκυτταρική θέση του HK μου επιβεβαιώθηκε επίσης με ανοσοφθορισμό. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο (Σχήμα S5? Μέθοδος S2). Σε αυτά τα πειράματα, η ανίχνευση της mitofusin (ΜΕΚ) Ι και ΙΙ, πρωτεΐνες που αγκυρώνονται στα μιτοχόνδρια και συμμετέχουν στην διατήρηση της μορφολογίας και της σύντηξης τους, διεξήχθη το ίδιο παρασκεύασμα έτσι ώστε να παρέχουν δείκτες για τις οργανίδια. Σύγκριση των πλακών ΜΕΚ (χρωματίζονται με κόκκινο χρώμα) στο Χονγκ Κονγκ (χρωματίζονται με πράσινο χρώμα), έδειξε ότι και οι δύο πρωτεΐνες συν-εντοπίζεται στα μιτοχόνδρια. Η υψηλότερη ενζυματική δραστικότητα που παρατηρείται στο Σχήμα 3Α θα μπορούσε να αντανακλά μια αυξημένη έκφραση του HK που προκαλείται μετά από μια μακροχρόνια επώαση των κυττάρων με NaB. Αυτή η πιθανότητα ερευνήθηκε με προσδιορισμό έκφρασης HK Ι και II χρησιμοποιώντας HK qRT-PCR σε κύτταρα Η460 εκτέθηκαν σε 3 και 10 mM NaB για 24 ώρες. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο Σχήμα 3Β. Και οι δύο συγκεντρώσεις των NaB αύξησε σημαντικά την έκφραση του HK I. Αντιστρόφως, NaB προκάλεσε μία μείωση στην έκφραση του HK II. Στα πειράματα μετρήσεως της εκφράσεως HK II (Σχήμα 3Β), οι τιμές που λαμβάνονται μετά την επώαση των κυττάρων με 3 και 10 mM NaB δεν ήταν σημαντικά διαφορετικές. Επιβεβαίωση ότι ΝαΒ προκάλεσε μια αυξημένη έκφραση του Χονγκ Κονγκ Ι ελήφθη από πειράματα προσδιορισμού του πραγματικού ποσού των μεταφρασμένων Χονγκ Κονγκ μέσω της δυτικής κηλίδες. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο Σχήμα 3C. Μπορεί να φανεί ότι η επεξεργασία των κυττάρων Η460 με 10 mM NaB για 24 ώρες αύξησε σαφώς την ένταση και την έκταση της ζώνης που αντιστοιχεί στο HK Ι που σχετίζεται με μιτοχόνδρια. Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκε μεταβολή στην ποσότητα του HKII. Σε αντίθεση, κυτοσολική HK Ι και II ήταν ελάχιστα ανιχνεύσιμη στους ελέγχους και τα επεξεργασμένα κύτταρα. Η μεγαλύτερη ποσότητα HK φαίνεται στο Σχήμα 3Γ δεν θα μπορούσε να εξηγηθεί από την αυξημένη διαθεσιμότητα του μιτοχονδριακού δέκτη εξοκινάση, την VDAC, δεδομένου ότι οι ποσότητες της πρωτεΐνης αυτής δεν μεταβλήθηκε σημαντικά κατά την κατεργασία με NaB. Ενώ αποδείχθηκε σαφώς η επίδραση του ΝαΒ επί της έκφρασης των ισομορφών ΗΚ, ο αναστολέας δεν επηρέασε τη δραστικότητα της είτε ΡΥΚ ή LDH. Τα αποτελέσματα φαίνονται στον Πίνακα 1. Το γεγονός ότι 10 mM NaB δεν επηρέασε αυτά τα γλυκολυτικά ένζυμα ενισχύει την ιδέα ότι η HDACi είναι μερικώς επιλεκτικό αποτέλεσμα του να διαμορφώνει τις ισομορφές δραστηριότητα HK.