Αφηρημένο

Ιστορικό

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι μια πολύ επιθετική ασθένεια με ζοφερή πρόγνωση? ιδιόμορφο είναι το μικροπεριβάλλον του όγκου που χαρακτηρίζεται από εκτεταμένη ινωτικές στρώμα, το οποίο ευνοεί την ταχεία εξέλιξη του όγκου. Αναφέραμε προηγουμένως ότι οι ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος έχουν μια επιλεκτική παραποιήσει Th2 στην αντι-καρκινοεμβρυονικού αντιγόνου (CEA) CD4

+ Τ κυτταρική ανοσία, η οποία συσχετίζεται με την παρουσία ενός κυρίαρχου GATA-3

+ λεμφοειδή όγκου διήθηση. Αυτό έχει αρνητικές επιπτώσεις τόσο στην αποτελεσματική ανοσία κατά του όγκου και περαιτέρω ευνοεί ινωδογένεση. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να αξιολογηθεί κατά πόσον η Th2 πόλωση του ΟΕΑ-ειδικών CD4

+ Τ κύτταρα από ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος είναι σταθερή ή μπορεί να επανέλθει με ανοσορρυθμιστικά κυτοκίνες.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Αξιολογήσαμε πρώτα την επίδραση των IL-12 και IL-27, σαν απλούς παράγοντες είτε σε συνδυασμό, για την πόλωση του CEA-ειδικών Th2 CD4

+ Τ κυτταρικών κλώνων από παγκρεατικό ασθενή με καρκίνο. Βρήκαμε ότι μόνο ο συνδυασμός IL-12 και IL-27 τροποποιημένη την πόλωση των Th2 τελεστών τόσο από μείωση της IL-5, GM-CSF και IL-13 και την επαγωγή της παραγωγής ΙΡΝ-γ, η οποία διήρκεσε μετά την αφαίρεση κυτοκίνης. Δεύτερον, αξιολογήσαμε την επίδραση της συνδυασμένης θεραπείας επί πολύκλωνα CEA-ειδικά CD4

+ Τ κύτταρα σε προσδιορισμούς επαναδιέγερση σύντομο χρόνο. Σε συμφωνία με τα δεδομένα που ελήφθησαν με τους κλώνους, βρήκαμε ότι η συνδυασμένη θεραπεία με διαμόρφωση λειτουργικά την πόλωση Th2 του CEA-ειδικά CD4

+ Τ κύτταρα και ενισχυμένη προϋπάρχουσα Th1 τύπου ανοσία.

Συμπεράσματα /Σημασία

Συλλογικά, τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι οι αντιγόνο όγκου ειδικό Th2 CD4

+ Τ κυττάρων σε καρκίνο του παγκρέατος προικισμένα με λειτουργική πλαστικότητα. . Ως εκ τούτου, τοπική-περιφερειακή κυτοκίνες παράδοσης ή στοχευμένη θεραπεία που βασίζεται σε αντισώματα ή μόρια που κατευθύνονται προς το στρώμα του όγκου μπορεί να βελτιώσει την ασυλία αντι-όγκου και βελτίωση της ίνωσης, χωρίς συστηματική τοξικότητα

Παράθεση: Τάσι E, Μπράγκα Μ, Longhi R , Gavazzi F, Parmiani G, Di Carlo V, et al. (2009) Μη πλεονάζων ρόλος για την IL-12 και IL-27 στη ρύθμιση της Th2 Πόλωση του καρκινοεμβρυονικού αντιγόνου ειδικά CD4 Τ κυττάρων από καρκίνο του παγκρέατος ασθενείς. PLoS ONE 4 (10): e7234. doi: 10.1371 /journal.pone.0007234

Επιμέλεια: Derya Unutmaz, New York University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 17, Ιουλίου, 2009? Αποδεκτές: 9 Σεπτέμβρη του 2009? Δημοσιεύθηκε: 2, Οκτωβρίου 2009

Copyright: © 2009 Τάσι et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από την Ευρωπαϊκή Κοινότητα (DC-ΘΗΡΑ), το Υπουργείο Υγείας της Ιταλίας, το Υπουργείο του Πανεπιστημίου της Ιταλίας και της Επιστημονικής Έρευνας και το Ίδρυμα Rich (Έργο LDP παγκρέατος Cancer Research). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του παγκρέατος (PC) είναι μια πολύ επιθετική ασθένεια με ζοφερή πρόγνωση [1]. Ιδιόμορφη είναι η μικροπεριβάλλον του όγκου, η οποία αποτελείται από ινοβλάστες, παγκρεατικών αστεροειδή κύτταρα, ενδοθηλιακά κύτταρα, το ανοσοποιητικό και ενδοκρινή κύτταρα και εξάπλωση περινευρικό και πιστεύεται να διαδραματίζει ενεργό ρόλο στην εξέλιξη της νόσου και την επιθετικότητα [2].

Πρόσφατα [3], διερευνήσαμε την ποιότητα του αντι-όγκου CD4

+ Τ κυττάρου αποκρίσεις σε ασθενείς PC που υποβάλλονται σε χειρουργική εκτομή, συγκρίνοντας την αντι-καρκινοεμβρυονικού (CEA) και αντι-ιική CD4

ανοσία + Τ κυττάρων. Βρήκαμε ότι το αντι-ΟΕΑ CD4

+ Τ κυτταρική ανοσία ήταν παρούσα σε ένα σημαντικά χαμηλότερο αριθμό ασθενών PC σε σύγκριση με φυσιολογικούς δότες. Το πιο σημαντικό, ενώ CD4

+ Τ κύτταρα από φυσιολογικούς δότες που παράγεται κοκκιοκύτταρα κυρίως παράγοντα διέγερσης αποικιών μακροφάγων (GM-CSF) και την προ-φλεγμονώδη (

δηλαδή

, Th1) κυτοκίνης ιντερφερόνης-γ (IFN-γ ), CD4

+ Τ κύτταρα από τους ασθενείς που παράγονται κυρίως ιντερλευκίνη (IL) -5 και IL-13, επιδεικνύοντας μια λοξή προς μια αντι-φλεγμονώδη (

δηλαδή

, Th2) τύπου. Αντιθέτως, η έκταση της αντι-ιικής CD4

+ Τ ανοσία κυττάρων ήταν συγκρίσιμη μεταξύ των δύο ομάδων και έδειξε τύπου Th1. Σε συμφωνία με την Th2 παραποιήσει παρατηρείται στα κυκλοφορούντα CEA ειδικά CD4

+ Τ κύτταρα, ανοσοϊστοχημική ανάλυση των λεμφοκυττάρων που διεισδύουν σε όγκο παρουσίασαν σημαντικά μεγαλύτερο αριθμό GATA-3

+ (Th2) σε σύγκριση με το T-bet

+ (Th1) λεμφοειδή κύτταρα, υποστηρίζοντας μια Th2 παραποιήσει επίσης στη θέση του όγκου.

έχει δειχθεί ότι η ίνωση, η οποία είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα στον υπολογιστή, συνδέεται στενά με την ανάπτυξη των αποκρίσεων Th2 μέσω της ενεργοποίησης με Th2 κυτοκίνες της σύνθεσης κολλαγόνου από ινοβλάστες και ταυτόχρονη μειωμένη αποικοδόμηση του κολλαγόνου σε απουσία Th1 κυτοκινών [4]. Ως εκ τούτου, η παρουσία του GATA-3

+ λεμφοειδή κύτταρα, τα οποία παρατηρήσαμε [3] στον παγκρεατικό μικροπεριβάλλον του όγκου, θα μπορούσε να συμβάλει περαιτέρω στην ίνωση και οι τοπικές θεραπείες που αποσκοπούν στη μείωση της παρουσίας των Th2 κυτοκινών μπορεί να είναι ευεργετική.

Μεταξύ των διαφόρων παραγόντων που προάγουν CD4

+ Τ κύτταρα πόλωση, κυτοκίνες έχουν καθοριστικό ρόλο [5]. IL-12, ένα προϊόν της φαγοκύτταρα και δενδριτικά κύτταρα σε απόκριση προς μικροβιακή διέγερση, έχει ένα σημαντικό ρόλο στην προώθηση Th1 πόλωση και στην ενίσχυση της CD4

+ Τ πολλαπλασιασμό κυττάρων [6]. Επιπλέον, η IL-12 έχει δειχθεί ότι επάγει αντιστροφή της Th2 πόλωση σε ανθρώπινα αλλεργιογόνο ειδικά κύτταρα Th2 [7], [8] και, σε συνέργεια με IL-18, για να διεγείρουν την παραγωγή ΙΡΝ-γ από μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC ) από λέπρα ασθενείς λεπρωματώδη [9]. IL-27, ένα πρόσφατα ταυτοποιημένο μέλος της οικογένειας IL-12 [10], επίσης διεγείρει τον πολλαπλασιασμό και συνεργεί με την IL-12 στην πρόκληση της παραγωγής ΙΡΝ-γ από παρθένα CD4

+ Τ κύτταρα [10], [11]. Πιο πρόσφατα, έχει δειχθεί [12] ότι η IL-27 αναστέλλει την Th2 πόλωση του αφελή ποντικού CD4

+ Τ κυττάρων και καταστέλλει κυτοκινών Th2 παραγωγή από

in vitro

πολωμένα κύτταρα Th2.

στην παρούσα μελέτη διερευνήθηκε η δυνατότητα να επανέλθει η πόλωση Th2 του

bona fide in vivo

γεμάτοι CEA-ειδικά CD4

+ Τ κύτταρα από ασθενείς με PC χρησιμοποιώντας IL-12 και IL-27 ως ανοσορυθμιστικά παράγοντες. Βρήκαμε ότι η παρουσία της IL-27 μόνο ήταν αρκετή για να αναστέλλουν την IL-5 και έκκριση IL-13, ενώ η IL-12 που διεγείρεται έντονα παραγωγή ΙΡΝ-γ με μικρές συνέπειες για Th2 έκκριση κυτταροκινών? ο συνδυασμός των δύο κυτοκινών επήγαγε μία λειτουργική διαμόρφωση της πόλωσης Th2.

Υλικά και Μέθοδοι

Θέματα και κυτταρικές σειρές

PBMC ελήφθησαν από δύο ασθενείς PC (pt # 15 και σημ # 43) και ένα υγιή δότη (ND # 11) από μία ομάδα από θέματα στα οποία έχουμε προηγουμένως ανιχνευθεί αντι-ΟΕΑ CD4

+ Τ κύτταρα [3]. Οι ασθενείς συντάχθηκαν πριν από την επέμβαση και σταδιοποίηση της νόσου ήταν T3N1M0 στις δύο περιπτώσεις. Η Επιτροπή Θεσμικών Δεοντολογίας (Comitato Etico Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor, Istituto Scientifico Ospedale San Raffaele) ενέκρινε το πρωτόκολλο της μελέτης και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους δότες πριν από τη δειγματοληψία αίματος. EBV μετασχηματισμένες λεμφοβλαστοειδείς κυτταρικές σειρές (LCL) που χρησιμοποιούνται και των ανθρώπινων λευκοκυττάρων αντιγόνο τους (HLA) Τύπος -DR ήταν: SKP-LCL (β1 * 0405, * 1401? Β3 * 02), που ιδρύθηκε το εργαστήριο μας από έναν υγιή δότη? BM21 (β1 * 1101? Β3 * 0202) και Pitout (β1 * 0701? Β4 * 0101), παραχωρήθηκε ευγενικά από τον Κ Fleischhauer (San Raffaele Επιστημονικό Ινστιτούτο, Μιλάνο). LCL καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (BioWhittaker) το οποίο περιέχει 2 mM L-γλουταμίνη, 100 μονάδες /ml πενικιλίνη, 50 mg /ml στρεπτομυκίνη (BioWhittaker), και 10% FCS (BioWhittaker).

Σύνθεση CEA πεπτιδίων

CEA

99-111, CEA

117-129, CEA

177-189 /355-367, CEA

425 – 437, CEA

568-582, και CEA

666-678 αλληλουχίες συντέθηκαν με τη μέθοδο σταδιακής στερεάς φάσης όπως περιγράφεται προηγουμένως [13]? Τα πεπτίδια λυοφιλοποιήθηκαν, ανασυστάθηκαν σε DMSO (Sigma-Aldrich) σε 10 mg /ml και αραιώνονται σε RPMI 1640, όπως απαιτείται.

In vitro

πολλαπλασιασμός των CD4

+ Τ κυτταρικών κλώνων

Τα πολύκλωνα CEA

177-189 /355-367 ειδικά CD4

+ Τ κύτταρα από pt # 15, που λαμβάνεται μετά από 13 ημέρες από την βραχυπρόθεσμη καλλιέργεια με το συγκεκριμένο πεπτίδιο και αυτόλογα CD4

+ -depleted PBMC ως κύτταρα που παρουσιάζουν αντιγόνο (APC), κλωνοποιήθηκαν με περιοριστική αραίωση όπως περιγράφεται στο [14]. Οι κλώνοι καλλιεργήθηκαν σε Χ-νίνο 15 (BioWhittaker) συμπληρωμένο με 5% θερμο-απενεργοποιημένο ομαδοποιημένο ανθρώπινο ορό (BioWhittaker), πενικιλλίνη (100 U /ml? BioWhittaker), στρεπτομυκίνη (50 mg /ml? BioWhittaker), και IL-2 (250 IU /ml? Proleukine, Novartis). Οι κλώνοι επαναδιεγείρονται κάθε 15-21 ημέρες με φυτοαιμαγλουτινίνη (ΡΗΑ) (0,5 μg /ml? Sigma-Aldrich) και ακτινοβολήθηκε αλλογενή PBMC

CD4

+ Τ κυτταρικών κλώνων δοκιμασία διέγερσης

CD4

+ Τ κύτταρα (10

4 /φρεάτιο) καλλιεργήθηκαν εις τριπλούν σε πλάκες πυθμένα 96-U με την παρουσία ακτινοβολημένων LCL (5 × 10

4 /φρεάτιο), ή ακτινοβολημένα αυτόλογα ή ΗΙΑ-DRβ3 * 02 συμφωνημένα PBMC (10

5 /φρεάτιο) ως APC πάλλονται με το CEA

177-189 /355-367 πεπτιδίου (10 μg /ml), ή την καθαρισμένη πρωτεΐνη CEA (30 μg /ml, ΒίοδρΗοίίϊε), ή φυσιολογικό ανθρώπινο IgG (30 μg /ml, Venimmun Ν, Aventis Behring), ως αρνητικός έλεγχος. Σε πειράματα αναστολής χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθες μονοκλωνικά αντισώματα (mAbs) (Beckton Dickinson): αντι-HLA-DR (100 ng /ml), αντι-HLA-DP (3 μg /ml) και αντι-HLA-DQ (125 ng /ml). Σε πειράματα τιτλοδότησης πεπτιδίου, προστέθηκαν οι ακόλουθες συγκεντρώσεις πεπτιδίου: 20-10-5-1-0,5-0,1-0,05-0,01 και 0.005 μg /ml. Στα πειράματα με ανοσορυθμιστικές κυτοκίνες, ανασυνδυασμένη ανθρώπινη IL-12 και /ή IL-27 (R &? D Systems Inc.) προστέθηκαν στις ακόλουθες συγκεντρώσεις: IL-12, ως μονοθεραπεία (5-20 ng /ml)? IL-27, ως μονοθεραπεία (0,01-1-10-100 ng /ml)? σε συνδυασμό IL-12 και IL-27 θεραπεία (5 ng /ml + 100 ng /ml, αντίστοιχα). Μετά από 48 ώρες, υπερκείμενο από κάθε φρεάτιο απομακρύνθηκε και συνενώθηκαν για κυτοκίνες «ανίχνευση με ELISA, σύμφωνα με τους κατασκευαστές« οδηγίες: GM-CSF (όριο ευαισθησίας: 31,25 pg /ml) και αυξητικό παράγοντα μετασχηματισμού (TGF) -β1 ( όριο ευαισθησίας: 62,5 pg /ml) (Biosource International Inc.)? IFN-γ, IL-5 και IL-13 (όριο ευαισθησίας: 15,6 pg /ml) (Mabtech) και IL-17 (eBioscience) (όριο ευαισθησίας: 7,8 pg /ml). IFN-γ, παράγοντα νέκρωσης όγκου (TNF) -α, IL-10, IL-4, IL-5 και την απελευθέρωση της IL-2 προσδιορίστηκε επίσης με τη χρήση της κυτταρομετρίας Array Beads (CBA) Human Th1-Th2 κυτοκίνες Kit (όριο ευαισθησίας :. 20 pg /ml), (Becton Dickinson), ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή

Βραχυπρόθεσμες τον πολιτισμό και την απελευθέρωση κυτοκινών δοκιμασία

τα καθαρισμένα CD4

+ Τ κύτταρα διεγέρθηκαν μία φορά

in vitro

παρουσία των πεπτιδίων CEA όπως περιγράφηκε προηγουμένως [3]. Εν συντομία, CD4

+ Τ κύτταρα (3 χ 10

4 /φρεάτιο), καθαρισμένη από το σύνολο των PBMC με μαγνητικά σφαιρίδια (Miltenyi Biotec), επιστρώθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πέντε επαναλήψεις για κάθε συνθήκη και καλλιεργήθηκε σε X -VIVO 15 συμπληρωμένο με πενικιλλίνη (100 U /ml), στρεπτομυκίνη (50 mg /ml) και 3% απενεργοποιημένο με θερμότητα ενωμένο ανθρώπινο ορό (μέσο καλλιέργειας ιστού, TCM), με την παρουσία ακτινοβολημένων CD4

+ – εξαντλημένο PBMC ως APC, σε CD4

+: αναλογία APC του 1:03. Ερεθίσματα ήταν: ΡΗΑ (10 μg /ml? Sigma-Aldrich), ως θετικός έλεγχος? CD4

+ Τ κύτταρα παρουσία του APC μόνο, ως βασική γραμμή (τυφλό)? και κάθε μονό πεπτίδιο (10 μg /ml). Προστέθηκαν Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη IL-12 (5 ng /ml) και IL-27 (100 ng /ml), όπου ενδείκνυται. Κατά την ημέρα 7, ένα δεύτερο μέσο από κάθε φρεάτιο απομακρύνθηκε και αναπληρώνονται με φρέσκο ​​TCM που περιείχε IL-2 (25 IU /ml), και IL-12 και IL-27, όπου υποδεικνύεται, χωρίς περαιτέρω διέγερση αντιγόνου. Την ημέρα 14, το υπερκείμενο συλλέχθηκε για IFN-γ, IL-5, IL-13 και την απελευθέρωση GM-CSF με ELISA, όπως περιγράφηκε παραπάνω.

Η κυτταρομετρία ροής

κυτταροφθορισμομετρική αναλύσεις διεξήχθησαν σε ένα FACSCalibur και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό FlowJo (Tree Star, Inc.). Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν: αντι-CD3-ΑΡΟ, αντι-CD4-PerCP, αντι-CCR4-ΡΕ, αντι-CCR5-FITC (Pharmingen) και αντι-CRTH2-ΡΕ (Miltenyi Biotec). ΤΟΚνβ έκφραση προσδιορίστηκε με το κιτ IO Δοκιμή Beta Mark (Immunotech), ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Αποτελέσματα

Χαρακτηρισμός της CEA

177-189 /355-367 συγκεκριμένες Th2-κυτοκινών παραγωγή CD4

+ κλώνους κυττάρων Τ

έχουν αναφερθεί στο παρελθόν ότι οι ασθενείς PC έχουν μια Th2 παραποιήσει σε αντι-ΟΕΑ CD4 ανοσία

+ Τ κυττάρων ενώ διατηρεί μια ανέπαφη ρεπερτόριο των αντι-ιικών κυττάρων Th1 [3 ]. Για να χαρακτηρίσουμε καλύτερα την λειτουργία αυτής της αντι-ΟΕΑ απάντηση που κλωνοποιούνται με περιοριστική CEA αραίωση

177-189 /355-367 ειδικά πολύκλωνα CD4

+ Τ κύτταρα από pt # 15, που λαμβάνεται μετά από μια

in vitro

βραχυπρόθεσμη εκ νέου διέγερση των CD4

+ Τ κυττάρων με αυτόλογα APC πάλλονται με το σχετικό πεπτίδιο? μια δοκιμασία που προηγουμένως έδειξε να μην ευνοούν

in vitro

εκκίνηση [15]. Πολυκλωνικά κύτταρα που παράγονται υψηλά επίπεδα IL-5 και πολύ λίγο από GM-CSF, αλλά όχι ΙΡΝ-γ [3], γεγονός που υποδηλώνει την παρουσία του

in vivo

γεμάτοι CD4

+ Τ κύτταρα με χαρακτηριστικά Th2. Δύο κλώνοι που λαμβάνονται, η οποία εξέφρασε την ίδια υποδοχέα Τ κυττάρων (TCR) νβ αλυσίδα,

δηλαδή

το νβ17 (Σχ. 1Ε), και ως εκ τούτου, εμείς τους που χρησιμοποιούνται αδιάφορα στα ακόλουθα πειράματα είναι

καλόπιστους

το ίδιο κλώνο.

Προφίλ της κυτοκίνης που εκκρίνεται (Α)

. CD4

+ Τ κύτταρα καλλιεργήθηκαν με ακτινοβολημένο APC παρουσία ή την απουσία του αντίστοιχου πεπτιδίου σε μία δοκιμασία διέγερσης 2-ημερών και η συγκέντρωση των υποδεικνυόμενων κυτοκινών στα υπερκείμενα προσδιορίστηκε είτε με CBA (άνω πάνελ) ή ELISA (κάτω πίνακας). Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον έξι πειραμάτων? για προσδιορισμούς ELISA, τα δεδομένα είναι μέσα διπλούν προσδιορισμού ± SD.

περιορισμού HLA (Β)

. CD4

+ Τ κύτταρα καλλιεργήθηκαν με ακτινοβολημένα αυτόλογα PBMC ή HLA-DR συμφωνημένα LCL, όπως υποδεικνύεται, με την παρουσία ή την απουσία του αντίστοιχου πεπτιδίου (10 μg /ml) και με την απουσία ή την παρουσία του αντι-HLA -DR, αντι-HLA-DP και αντι-HLA-DQ mAbs: μετά από 2 ημέρες ελέγχθηκε IL-5. Πάνω πίνακας:% αναστολή υπολογίστηκε με βάση την IL-5 έκκριση από CD4

+ Τ κύτταρα με την παρουσία του σχετικού πεπτιδίου (2 ng /ml επί 0 ng /ml του επιπέδου υποβάθρου). Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά δύο (άνω πάνελ) και τέσσερις (κάτω πίνακας) πειράματα και είναι μέσα διπλούν προσδιορισμού ± SD. Απαντήσεις σημαντικά υψηλότερο από τα κενά (

δηλαδή

, τα βασικά επίπεδα της έκκρισης κυτοκινών από CD4

+ Τ κυττάρων παρουσία του LCL μόνο) υποδεικνύονται ως: ***, ρ & lt? 0.001 (προσδιορίζεται με μη ζευγαρωμένα με μονόπλευρο t test Student).

Οι καμπύλες δόσης-απόκρισης (C)

. CD4

+ Τ κύτταρα καλλιεργήθηκαν με τιτλοποιημένες δόσεις του αντίστοιχου πεπτιδίου σε παρουσία ακτινοβολημένων APC σε μία ανίχνευση διεγέρσεως 2-ημερών και εξετάστηκαν για IL-5 και την απελευθέρωση IL-13. Τα δεδομένα είναι μέσα διπλούν προσδιορισμού ± SD.

Αναγνώριση της φυσικής πρωτεΐνης (D)

. CD4

+ Τ κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε παρουσία ακτινοβολημένων PBMC, όπως APC, παλμική είτε με το σχετικό πεπτίδιο (10 μg /ml) ως θετικός έλεγχος, ή την καθαρισμένη πρωτεΐνη CEA (30 μg /ml) ή ανθρώπινη IgG ( 30 μg /ml) ως αρνητικός έλεγχος σε μία δοκιμασία διέγερσης 2-ημερών και εξετάστηκαν για IL-13 απελευθέρωσης. Τα δεδομένα είναι μέσα διπλούν προσδιορισμού ± SD. Απαντήσεις σημαντικά υψηλότερο από τα κενά (

δηλ

, τα βασικά επίπεδα της έκκρισης κυτοκινών από CD4

+ Τ κύτταρα με την παρουσία PBMC μόνο.) Υποδεικνύονται ως: **, 0.001 & lt? Ρ & lt? 0,05? ***, Ρ & lt? 0.001 (προσδιορισμένη με μη ζευγαρωμένα με μονόπλευρο t test Student).

έκφραση ΤΟΚνβ (Ε)

. Η δοκιμή έγινε με το κιτ IO Δοκιμή Beta Mark. Τεταρτημόρια που βασίζονται σε χρώση έλεγχο ισοτόπου.

Η επιφανειακή έκφραση των Th2 (CRTH2 και CCR4) και Th1 (CCR5) δείκτες (F)

. Γεμιστά ιστογράμματα αντιπροσωπεύουν ισοτόπου ελέγχους? ανοιχτή δείγματα ιστογράμματα βάφονται με τα αναφερόμενα δείκτες.

Η

Ο χαρακτηρισμός του CEA

177-189 /355-367 ειδικά CD4

+ T κλώνοι απεικονίζεται στο Σχήμα 1. CD4

+ κλώνους κυττάρων Τ που παράγεται κυρίως IL-5, IL-13 και GM-CSF, ενώ κυκλοφόρησαν χαμηλή ποσότητα IL-4, και IFN-γ και όχι IL-2, TNF-α, ΤΟΡ-β1, IL-10 ή IL-17 (Εικ. 1Α). Παρά το γεγονός ότι τα κύτταρα παράγουν μικρή ποσότητα της IL-4, αυτό το πρότυπο της έκκρισης κυτοκινών είναι συνεπής με μια πόλωση Th2.

Για να προσδιορίσετε το στοιχείο περιορισμού δοκιμάσαμε για πρώτη φορά την αναγνώριση από CD4

+ Τ κύτταρα του πεπτιδίου φορτωμένο αυτόλογα APC εν απουσία ή παρουσία αντι-HLA-DR, αντι-HLA-DP και αντι-HLA-DQ mAbs. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Β (άνω πάνελ), η προσθήκη του αντι-DR mAb ανέστειλε (65,5%) IL-5 παραγωγή από CD4

+ Τ κύτταρα, καταδεικνύοντας ότι ένα μόριο HLA-DR παρουσίασε το πεπτίδιο. Για τον προσδιορισμό του παρουσιάζοντας αλληλόμορφο HLA-DR, τα κύτταρα στη συνέχεια προκλήθηκαν με το σχετικό πεπτίδιο σε παρουσία LCL που εκφράζουν διαφορετικούς συνδυασμούς των HLA-DRβ1, β3 και β4 αλληλόμορφα που εκφράζεται από τον ασθενή (υποδεικνύεται στο Σχ. 1 Β) και δοκιμάστηκαν για IL-5 απελευθέρωση. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Β (κάτω πίνακας), CD4

+ Τ κύτταρα αναγνώρισαν το πεπτίδιο σε συνδυασμό με HLA-DRβ3 * 02, το οποίο είναι το αλληλόμορφο μοιράζεται μεταξύ του ασθενούς και των δύο παρουσιάζοντας LCL (BM21 και SKP).

Πραγματοποιήσαμε επίσης καμπύλη τιτλοδότησης πεπτιδίου στο οποίο CD4

+ Τ κύτταρα προκλήθηκαν με την αύξηση της συγκέντρωσης του αντίστοιχου πεπτιδίου (Σχ. 1 C). Τα πειράματα έδειξαν την έκφραση από τον κλώνο ενός TCR πολύ χαμηλή συγγένεια.

Είμαστε στο παρελθόν έδειξαν ότι CEA ακολουθία επαναλαμβάνεται στις θέσεις 177-189 και 355-367 περιέχει

in vitro

φυσικά επεξεργασμένο επιτόπιο παρουσιάζονται σε συνδυασμό με διάφορα αλληλόμορφα HLA-DR [16]. Για την επιβεβαίωση αυτών των δεδομένων, οι κλώνοι CD4

+ Τ κυττάρων προκλήθηκαν με την πρωτεΐνη CEA ή φυσιολογικό ανθρώπινο IgG, ως αρνητικός έλεγχος, και προσδιορίστηκαν για IL-13 απελευθέρωσης. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1D, CD4

+ Τ κύτταρα που παράγονται ειδικά IL-13 με την παρουσία του πεπτιδίου και, το σημαντικότερο, με την παρουσία του CEA αλλά όχι της πρωτεΐνης μάρτυρα (

δηλαδή

, ανθρώπινη IgG), αποδεικνύοντας ότι αν και το CEA

177-189 /355-367 ειδικά CD4

+ Τ κυτταρικών κλώνων φέρουν ένα χαμηλό TCR συγγένεια αναγνωρίζουν το ξένο επιτόπιο.

Τέλος, για να εξακριβώσει αν το προφίλ Th2 κυτταροκινών συσχετίστηκε με τα φαινοτυπικά δείκτες των κυττάρων Th1 και Th2, οι κλώνοι ελέγχθηκαν για την έκφραση του CCR5, η οποία εκφράζεται κατά προτίμηση από κύτταρα Th1 [17] και του CRTH2 και CCR4, του οποίου η έκφραση χαρακτηρίζει Th2 κύτταρα [17], [18]. Όπως αναμένεται από το προφίλ κυτοκίνης, CD4

+ Τ κυττάρων που εκφράζεται επί της επιφάνειας τους, τόσο CRTH2 και CCR4 ενώ η έκφραση CCR5 απουσίαζε (Εικ. 1 F).

συνδυασμένη IL-27 και IL-12 θεραπεία αναστέλλει την έκκριση του Th2 κυτοκινών και διεγείρει την παραγωγή ΙΡΝ-γ από CEA ειδικά CD4

+ Τ κύτταρα

Στη συνέχεια εξετάσαμε τη δυνατότητα να ρυθμίζουν την πόλωση του CEA

177-189 /355-367-ειδική Th2 κύτταρα από τις ανοσορυθμιστικές κυτοκίνες IL-27 και IL-12.

για το σκοπό αυτό αξιολογήσαμε πρώτα ως αποτέλεσμα την αύξηση των συγκεντρώσεων της IL-27 ή IL-12, σαν απλούς παράγοντες, για την παραγωγή από τα CD4

+ Τ κύτταρα Th1 και Th2 κυτοκίνες με την παρουσία του σχετικού πεπτιδίου. Η προσθήκη της IL-27 μειώθηκαν κατά δοσοεξαρτώμενο τρόπο-IL-5 και IL-13 της παραγωγής, ενώ δεν παρατηρήθηκε επίδραση για IL-4 και ΙΡΝ-γ (Σχ. 2Α). Η προσθήκη IL-12 έφθασε αποτέλεσμα πλατώ του ήδη στην δόση των 5 ng /ml (Σχήμα 2Β).: IL-5 παραγωγή μειώθηκε επίσης με την παρουσία IL-12, ενώ, διαφορά με την IL-27, με την επίδραση στην IL-13 ήταν οριακή ως επί IL-4. Είναι σημαντικό ότι, και στη διαφορά με την IL-27, η παραγωγή ΙΡΝ-γ ήταν έντονα αυξημένη (Σχ. 2Β). Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι αμφότερες οι κυτοκίνες επηρεάζουν την λειτουργία τελεστή της

κλώνους κυττάρων Τ + CEA-ειδικά CD4 αλλά ούτε IL-27 ούτε IL-12, σαν απλούς παράγοντες, ήταν ιδανικοί στη ρύθμιση Θ πόλωση τους.

(Α).

CD4

+ Τ κύτταρα καλλιεργήθηκαν με το σχετικό πεπτίδιο και ακτινοβολήθηκε LCL ως APC σε παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων της IL-27 (0-0,1-1-10- 100 ng /ml)? Μετά από 2 ημέρες η απελευθέρωση κυτοκινών αξιολογήθηκε από CBA (IL-5 IL-4, και IFN-γ) ή ELISA (IL-13). Τα δεδομένα για την IL-13 είναι μέσα διπλούν προσδιορισμού ± SD. CD4

(Β)

.

+ Τ κύτταρα καλλιεργήθηκαν και εξετάστηκαν, όπως περιγράφηκε παραπάνω, με την παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων της IL-12 (0-5-20 ng /ml). Το βασικό επίπεδο κυτταροκινών έκκριση του CD4

+ Τ κυττάρων παρουσία του LCL μόνο αφαιρέθηκε από τις τιμές δείγματος και περιλαμβάνεται μεταξύ 0 και 0018 ng /ml. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών πειραμάτων.

Η

Δεύτερον, αξιολογήσαμε την επίδραση της συνδυασμένης θεραπείας με τις δύο κυτοκίνες (Σχ. 3). Όταν χρησιμοποιείται σε 5 ng /ml, IL-12, ως μονοθεραπεία, προκάλεσε 61% αναστολή της IL-5 και δεν είχε καμία επίδραση επί της IL-13 και GM-CSF, ενώ η παραγωγή ΙΡΝ-γ είχε σχεδόν μια 10 φορές αύξηση . IL-27 θεραπεία και μόνο στην υψηλότερη συγκέντρωση έδειξε 78%, 30% και 53% αναστολή της IL-5, IL-13 και GM-CSF, αντίστοιχα? ενώ μόνο 1,4-πλάσια αύξηση στην παραγωγή ΙΡΝ-γ. Όταν χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό, στις καλύτερες συγκεντρώσεις, μια συνεργική επίδραση παρατηρήθηκε στην αναστολή της IL-5 (91%) και IL-13 (48%), ενώ, όπως αναμένεται από τα αποτελέσματα των μεμονωμένων παραγόντων, έκκριση GM-CSF δεν ανεστάλη περαιτέρω και ΙΡΝ-γ παραγωγή δεν αυξήθηκε περαιτέρω.

CD4

+ Τ κύτταρα καλλιεργήθηκαν με το σχετικό πεπτίδιο σε απουσία (βασική) ή με την παρουσία IL-12 (5 ng /ml), ως μονοθεραπεία? ή IL-27 (100 ng /ml), ως μονοθεραπεία? ή σε συνδυασμό IL-12 και IL-27 σε μια δοκιμασία διέγερσης 2-ημερών και στη συνέχεια εξετάστηκαν για την απελευθέρωση κυτοκινών από CBA (IL-5 και ΙΡΝ-γ) ή ELISA (IL-13 και GM-CSF). Τα δεδομένα για την IL-13 και GM-CSF είναι μέσα διπλούν προσδιορισμού ± SD. Το βασικό επίπεδο κυτταροκινών έκκριση του CD4

+ Τ κυττάρων παρουσία του LCL μόνο αφαιρέθηκε από τις τιμές δείγματος και περιλαμβάνεται μεταξύ 0 και 0006 ng /ml. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά πέντε πειραμάτων.

Η

Διαμόρφωση των Th2 πόλωσης από την IL-12 και IL-27 διαρκεί μετά την απομάκρυνση των κυτοκινών

Για να επαληθεύσετε αν η ρύθμιση της Th2 πόλωσης που λαμβάνεται με την συνδυασμένη αγωγή με IL-12 και IL-27 ήταν σταθερή, σχεδιάσαμε ένα πείραμα στο οποίο CEA-ειδικά CD4

+ Τ κύτταρα πρώτα διεγείρονται με το σχετικό πεπτίδιο σε απουσία ή παρουσία της IL-12 και IL- 27 (5 και 100 ng /ml, αντίστοιχα). Δεύτερον, κύτταρα διεγερμένα απουσία των κυτοκινών διατηρήθηκαν σε καλλιέργεια για 14 ημέρες σε TCM συν IL-2 και χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Κύτταρα κατεργασμένα με τις κυτοκίνες χωρίστηκαν σε δύο κλάσματα και καλλιεργήθηκαν κάτω από διαφορετικές συνθήκες για τις ακόλουθες 14 ημέρες: σε μία κατάσταση οι κυτοκίνες απομακρύνθηκαν μετά από 2 ημέρες και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν όπως οι έλεγχοι σε TCM συν IL-2, στις άλλες κυτοκίνες προϋπόθεση διατηρήθηκαν σε καλλιέργεια όλη την ώρα και αντικαθίσταται κάθε δύο έως τρεις ημέρες. Την ημέρα 14, τα κύτταρα από κάθε μία από τις τρεις προϋποθέσεις ελέγχθηκαν σε μια δοκιμασία διέγερσης 2-ημερών με το σχετικό πεπτίδιο και απελευθέρωσης κυτοκινών που δοκιμάστηκαν. Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν δείχνονται στο Σχήμα 4. Τα κύτταρα ελέγχου επιβεβαίωσαν παραγωγή της IL-5, IL-13 και χωρίς ΙΡΝ-γ, ενώ τα κύτταρα διατηρούνται σε καλλιέργεια συνεχώς με τις κυτοκίνες επιβεβαιωθεί 98% και 74% αναστολή της IL-5 και IL- 13 παραγωγής, αντίστοιχα, και αύξηση 11-πλάσια για ΙΡΝ-γ. Σημαντικά, τα κύτταρα στα οποία οι κυτοκίνες απομακρύνθηκαν μετά από 2 ημέρες καλλιέργειας έδειξε ακόμη 70% και 47% αναστολή στην IL-5 και IL-13 παραγωγή, αντίστοιχα, και ένα 5-πλάσια αύξηση στην απελευθέρωση ΙΡΝ-γ.

(Α)

. CD4

+ Τ κύτταρα καλλιεργήθηκαν με το σχετικό πεπτίδιο και είτε αριστερά χωρίς αγωγή (πεπτίδιο) ή αγωγή για 2 ημέρες με συνδυασμένες IL-12 (5 ng /ml) και IL-27 (100 ng /ml) και στη συνέχεια πλένονται και αφεθεί χωρίς θεραπεία (IL-12 + IL-27 (2-ημέρες)) ή σε αγωγή συνεχώς με IL-12 και IL-27 στις ίδιες δόσεις για 2 εβδομάδες (IL-12 + IL-27 (14 ημέρες)). Την ημέρα 14, τα κύτταρα ελέγχθηκαν με την παρουσία ή την απουσία του σχετικού πεπτιδίου και του ειδικού IL-5, IL-13 και ΙΡΝ-γ απελευθέρωση στο υπερκείμενο δοκιμάστηκε με ELISA. Τα δεδομένα είναι μέσα διπλούν προσδιορισμού ± SD. Το βασικό επίπεδο κυτταροκινών έκκριση του CD4

+ Τ κυττάρων παρουσία του LCL μόνο αφαιρέθηκε από τις τιμές δείγματος και είχε ως εξής: IL-5 (0.093 ± 0.006 ng /ml), IL-13 (0468 ± 0028 ng /ml) και IFN-γ (0 ng /ml). Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τεσσάρων πειραμάτων. (

Β

). Η επιφανειακή έκφραση του CRTH2, CCR4 CCR5 με CD4

+ Τ κυττάρων μετά από επεξεργασία με συνδυασμένο IL-12 + IL-27. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα σε αγωγή για 2 ημέρες και στη συνέχεια αφεθεί χωρίς θεραπεία για μία επιπλέον εβδομάδα. Γεμιστά ιστογράμματα αντιπροσωπεύουν ισοτόπου ελέγχους? δείγματα ανοιχτό ιστογράμματα βάφονται με τα αναφερόμενα δείκτες.

Η

Για να εξακριβωθεί αν η συνδυασμένη θεραπεία επηρέασε επίσης τον φαινότυπο Th2 επιφάνεια, CD4

+ Τ κύτταρα, τα οποία είχαν εκ νέου διεγερθεί με την παρουσία του ο κυτοκίνες για 2 ημέρες και στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν για περαιτέρω επτά ημέρες σε απουσία των κυτοκινών, ελέγχθηκαν ως προς την έκφραση του CRTH2, CCR4 και ΟΟΚ5. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4Β, τα κύτταρα, διατηρώντας CRTH2 και CCR4 όπως στην απουσία της θεραπείας (Εικ. 1 F), απέκτησε την έκφραση της CCR5.

Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η διαφοροποίηση των Th2 πόλωση του CEA -ειδικές CD4

+ Τ κυτταρικών κλώνων που ελήφθησαν με τη συνδυασμένη θεραπεία είναι διαρκής, αν και με μειωμένη απόδοση, ακόμη και μετά την απομάκρυνση των κυτοκινών και συνδέεται με λειτουργικά και φαινοτυπικά χαρακτηριστικά του Th0 ή και των δύο κυττάρων Th1 και Th2.

IL-12 και IL-27 ενισχύει συνδυασμός Th1 και ρυθμίζει Th2 πόλωση της αυθόρμητης αντι-ΟΕΑ CD4

+ Τ κυτταρικές αποκρίσεις

για να επαληθευτεί η επίδραση της συνδυασμένης IL-12 και IL-27 θεραπεία για την πόλωση του CEA-ειδικά CD4

+ Τ κυττάρων σε ένα περισσότερο φυσιολογικό περιβάλλον και σε πολυκλωνικά επίπεδο, CD4

+ Τ κύτταρα από τον ασθενή (pt # 43) και φυσιολογικό δότη (ND # 11) εξετάστηκαν σε μία 14-ημερών

in vitro

εκ νέου διέγερσης δοκιμασίας για την αναγνώριση των σχετικών πεπτιδίων σε απουσία ή παρουσία των δύο ανοσορυθμιστικές κυτοκίνες (Εικόνα 5). Όπως έχει ήδη αναφερθεί σε [3], ελλείψει των κυτοκινών ανοσορρυθμιστικής CD4

+ Τ κύτταρα από pt # 43 παρήγαγε IL-5 με την παρουσία του CEA

425-437? IL-13 με την παρουσία του CEA

568 έως 582? GM-CSF παρουσία CEA

568-582 και ΙΡΝ-γ παρουσία CEA

568-582 και, αν και σε πολύ χαμηλότερο αλλά σημαντικό επίπεδο, του CEA

177-189 /355 -367 (Εικ. 5,

αριστερό πάνελ

s, γκρι μπάρες

). Ο συνδυασμός των IL-12 και IL-27 σχεδόν καταργηθεί IL-5 (99% αναστολή) και IL-13 (76% αναστολή), ενώ επάγεται

de novo

ΙΡΝ-γ έκκριση με την παρουσία του CEA

425-437, ενισχυμένη (9-πλάσια αύξηση) της παραγωγής ΙΡΝ-γ παρουσία CEA

177-189 /355-367 και επιβεβαιώθηκε ΙΡΝ-γ, ενώ έντονα μειωμένη IL-13 (98% αναστολή) και GM- ΚΠΣ (80% αναστολή) παραγωγής με την παρουσία του CEA

568-582 (Εικ. 5,

αριστερό πάνελ

s, μαύρες μπάρες

). Όπως έχει ήδη αναφερθεί [3], ελλείψει των ανοσορυθμιστικές κυτοκίνες CD4

+ Τ κύτταρα από ND # 11 έδειξαν σημαντική πολλαπλασιασμό [3] και πολύ μικρή ποσότητα της έκκρισης ΙΡΝ-γ παρουσία CEA

99- 111, ενώ δεν παρατηρήθηκε σημαντική παραγωγή της IL-5 και GM-CSF παρουσία οποιουδήποτε πεπτιδίου (Εικ. 5,

δεξί πάνελ

s, γκρι μπάρες

). απελευθέρωση IL-13 δεν έχει ελεγχθεί. θεραπείας κυτοκίνης αυξάνεται έντονα (23-φορές αύξηση) απελευθέρωση IFN-γ εναντίον CEA

99-111, ενώ, όπως ήταν αναμενόμενο, καμία επίδραση στην IL-5 και GM-CSF παραγωγή παρατηρήθηκε (Εικ. 5,

δεξιά πίνακα

s, μαύρες μπάρες

). Σε αμφότερες τις περιπτώσεις, οι δύο κυτοκίνες επαγόμενη διαφοροποίηση των Th2 ή ενίσχυση των αποκρίσεων Th1 που ήταν ήδη παρόντες, αν και σε πολύ χαμηλό επίπεδο, με την απουσία του συνδυασμού κυτοκινών, ενώ δεν υπήρχε καμία ένδειξη

de-novo

ειδική αναγνώριση του CEA πεπτιδίων.

CD4

+ Τ κύτταρα από pt # 43 και # 11 ND καλλιεργήθηκαν σε πέντε αντίγραφα, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι, με τις ανταποκρίνεται πεπτίδια CEA, απουσία ( γκρι μπάρες) ή παρουσία (μαύρες ράβδοι) της συνδυασμένης θεραπείας με IL-12 (5 ng /ml) συν IL-27 (100 ng /ml). Μετά από 14 ημέρες, IL-5, IL-13, GM-CSF και ΙΡΝ-γ απελευθέρωσης ελέγχθηκε με ELISA. Τα στοιχεία που καταγράφονται είναι μέσα εις διπλούν προσδιορισμού ± SD. Οι διακεκομμένες γραμμές τον προσδιορισμό του βασικό επίπεδο έκκρισης κυτοκινών υπό την παρουσία μόνο APC. Ν.Ο. = Δεν προσδιορίστηκε.

Η

Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η IL-12 και IL-27 προώθησης της λειτουργικής διαφοροποίησης των Th2 τύπου και ενίσχυση των προϋπαρχόντων αποκρίσεις αντι-CEA τύπου Th1.

Συζήτηση

στην παρούσα μελέτη, αναφέρουμε ότι η σύνδεση των ανοσοτροποποιητικών κυτταροκινών IL-12 και IL-27 είναι σε θέση να διαμορφώνουν τη λειτουργική πόλωση των αντι-ΟΕΑ Th2 CD4

+ Τ κύτταρα από ασθενείς PC και να ενισχυθεί η προϋπάρχουσα τύπου Th1 αντι-ΟΕΑ CD4

+ Τ κύτταρα.

δείχνουν ότι η θεραπεία με IL-27 ως μοναδικός παράγοντας ανέστειλε τόσο την IL-5 και IL-13 απελευθέρωσης με CEA-ειδικά κύτταρα Th2. Αυτό επιβεβαιώνει στο ανθρώπινο σύστημα η προηγούμενη έκθεση που περιγράφονται IL-27, όπως είναι σε θέση να καταστείλει Th2 κυτοκινών παραγωγής από

in vitro

κύτταρα Th2 πολωμένη ποντίκι [12]? αλλά, σε διαφορά με την έκθεση αυτή, το σύστημά μας με την οποία ασχολούμαστε με το

bona fide in vivo

πολωμένο CD4

+ Τ κύτταρα IL-27 δεν είχε καμία επίδραση στην έκκριση IFN-γ. Σημαντικά, έχουμε αποκάλυψε επίσης μια νέα λειτουργία για την IL-27, η οποία είναι η αναστολή της παραγωγής GM-CSF. Όταν η IL-12 χρησιμοποιείται ως μοναδικός παράγοντας, έντονα αυξημένη παραγωγή IFN-γ, ενώ είχε μόνο ένα οριακό αποτέλεσμα στην καταστολή της απελευθέρωσης του Th2 κυτοκινών, και της IL-13, ιδίως καμία επίδραση στο GM-CSF. Αυτό είναι επίσης στη διαφορά με προηγούμενες αναφορές [7], [8], στην οποία η IL-12 απεδείχθη να επανέλθει πόλωση των ανθρώπινων αλλεργιογόνο ειδικών κυττάρων Th2 επάγοντας ΙΡΝ-γ και η αναστολή της IL-4 παραγωγή. Πράγματι, στην περίπτωση των κλώνων μας IL-4, η οποία ωστόσο δεν έχει παραχθεί σε μεγάλες ποσότητες, δεν ανεστάλη ούτε από την IL-27 ούτε IL-12. Το μόνο Th2 κυτοκίνη που επηρεάζονται από την IL-12 ήταν IL-5? Αυτή η λειτουργία επίσης αναφερθεί στο παρελθόν για τους κλώνους Τ κυττάρων που λαμβάνονται από την βρογχοκυψελιδική πλύση των ασθματικών ασθενών [19].

Συλλογικά, δείχνουμε ότι στο σύστημά μας IL-12 και IL-27 έχουν μη περιττές ρόλους στη ρύθμιση της πόλωση των καθιερωμένων CEA ειδικής Th2 CD4

+ Τ κύτταρα και ότι η διαφοροποίηση της λειτουργικής και φαινοτυπική Th2 πόλωση των αντι-καρκινικών CD4

+ τελεστές σε ένα είδος Th0 λήφθηκε μόνο με την παρουσία της συνδυασμένης συνεργική θεραπεία με οι δύο κυτοκίνες. Διαμόρφωση της παραγωγής κυτοκινών »ήταν, τουλάχιστον στην περίπτωση των κλώνων, κυρίως λειτουργικά με την επαγωγή μιας μάλλον περίεργο φαινότυπο όπου CCR4, CRTH2 και έκφραση CCR5 συνυπήρχαν (

δηλαδή

, όχι τυπικά είτε Th1 ή Th0 κύτταρα). Προκαταρκτικά πειράματα (τα δεδομένα δεν φαίνονται), στις οποίες αξιολογήθηκε η παραγωγή κυτοκινών »στο επίπεδο του ενός κυττάρου με ενδοκυτταρική χρώση, ανέφερε ότι:

i

) IL-27 μόνο του δεν επηρέασε το ποσοστό της IL-5 και IL-