Αφηρημένο

Μερικά ισχυρά φάρμακα χημειοθεραπείας συμπεριλαμβανομένων των παραγόντων σύνδεσης τουμπουλίνης είχε αναπτυχθεί από την φυτά φύση, όπως ποδοφυλλοτοξίνη και πακλιταξέλη. Ωστόσο, η κακή κυτταροτοξική επιλεκτικότητα, σοβαρές παρενέργειες, και περιορισμένη αποτελεσματικότητα είναι ακόμα οι μεγάλες ανησυχίες στη θεραπευτική εφαρμογή τους. Έχουμε αναπτύξει ένα πλήρως συνθετικό παράγωγο ποδοφυλλοτοξίνης ονομάζεται Ching001 και διερευνήθηκαν επιδράσεις αύξησης κατά του όγκου της και τους μηχανισμούς στον καρκίνο του πνεύμονα προκλινικά μοντέλα. Ching001 έδειξε εκλεκτική κυτταροτοξικότητα σε διαφορετικούς καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικές γραμμές αλλά όχι σε φυσιολογικά κύτταρα του πνεύμονα. Ching001 ανέστειλε τον πολυμερισμό των μικροσωληνίσκων καταλήγοντας σε μιτωτική σύλληψη όπως φαίνεται από την συσσώρευση της μίτωσης που σχετίζονται με πρωτεΐνες, survivin και aurora Β, οδηγώντας έτσι σε βλάβη του DNA και την απόπτωση. Ching001 ενεργοποιείται επίσης προ-αποπτωτική ER στρες μονοπατιού σηματοδότησης. Ενδοπεριτοναϊκή ένεση 2 mg /kg Ching001 ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου του Α549 ξενομοσχεύματος, ενώ έγχυση 0,2 mg /kg Ching001 μείωσε την ικανότητα των πνευμόνων αποικισμού των κυττάρων Α549 σε δοκιμασία πειραματική μετάσταση. Αυτά ανάπτυξη αντι-όγκου και του πνεύμονα αποικισμός επιδράσεις αναστολής ήταν ισχυρότερες από εκείνες της θεραπείας paclitaxel στην ίδια δοσολογία. Οι λεκέδες ιστού ξενομοσχεύματος όγκου επιβεβαίωσε περαιτέρω ότι Ching001 προκαλείται από μίτωση σύλληψη και απόπτωση του όγκου. Επιπλέον, οι δοκιμές αιματολογία και βιοχημεία των δειγμάτων αίματος, καθώς και εξετάσεις των ιστών έδειξε ότι η θεραπεία Ching001 δεν έδειξε εμφανή τοξικότητα οργάνων σε πειραματόζωα. Προσφέραμε προκλινικές αποδείξεις ότι τα νέα αναστολέας συνθετικά μικροσωληνίσκων Ching001, η οποία μπορεί να προκαλέσει βλάβες στο DNA και την απόπτωση μέσω επαγωγής μιτωτική σύλληψη και ER στρες, είναι μια δυνητική αντικαρκινική ένωση για την περαιτέρω ανάπτυξη φαρμάκων

Παράθεση:. Chen JY, Tang YA, Li WS, Χίου YC, Shieh JM, Wang YC (2013) ένα συνθετικό παράγωγο ποδοφυλλοτοξίνης Ασκεί αντικαρκινικές επιδράσεις επάγοντας μίτωσης και Pro-αποπτωτικά ER στρες στον Καρκίνο του πνεύμονα προκλινικά μοντέλα. PLoS ONE 8 (4): e62082. doi: 10.1371 /journal.pone.0062082

Συντάκτης: Vladimir V. Kalinichenko, Ιατρικό Κέντρο Νοσοκομείο Σινσινάτι των παιδιών, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 31 Δεκεμβρίου, 2012? Αποδεκτές: 17 Μάρτη, 2013? Δημοσιεύθηκε: 30 Απριλίου 2013

Copyright: © 2013 Chen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει με επιχορηγήσεις CMNCKU10107 από το Ιατρικό Κέντρο Chi Mei, Ταϊβάν (JMS) και NSC 101 έως 2325-B-006-008 από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο, την Ταϊβάν (YCW). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Μερικά ισχυρά φάρμακα χημειοθεραπείας είχε προέρχονται από φυτά της φύσης. Για παράδειγμα, ποδοφυλλοτοξίνη, ένα ενεργό συστατικό που καθαρίζεται από

podophyllum peltatum

[1] – [3], χρησιμοποιείται ως τυπική θεραπεία για την αφροδίσια κονδυλωμάτων [4]. Ποδοφυλλοτοξίνη αναστέλλει τον πολυμερισμό των μικροσωληνίσκων που οδηγούν σε αποτυχία μίτωση και τον κυτταρικό κύκλο σύλληψης [5] – [7]. Ημισυνθετικά παράγωγα ποδοφυλλοτοξίνης, για παράδειγμα ετοποσίδη και τενιποσίδη, χρησιμοποιούνται σήμερα αντικαρκινικά φάρμακα για τη λευχαιμία, το λέμφωμα, γλοιοβλάστωμα, πνεύμονα και των όρχεων καρκίνους [8]. Πολλά άλλα αντικαρκινικά φάρμακα που λαμβάνονται από φυσικά βότανα έχουν επίσης την ικανότητα να αναστέλλουν τη δυναμική των μικροσωληνίσκων [2], [9]. Για παράδειγμα, η ταξόλη (ή πακλιταξέλη) και οι ενώσεις αλκαλοειδές της βίνκα είναι φυσικά προϊόντα καθαρίζονται από το

Taxus brevifolia

ή

Catharanthus roseus

, αντίστοιχα. Προηγούμενες μελέτες αποκάλυψαν ότι η πακλιταξέλη και βίνκα αλκαλοειδές ενώσεις μπορεί να διακόψει τη δυναμική των μικροσωληνίσκων [9] – [13]

Αν και πολλοί παράγοντες σύνδεσης τουμπουλίνης είχαν αναπτυχθεί, ισχυρή κυτταροτοξικότητα προς τα φυσιολογικά κύτταρα, η κατάθλιψη του μυελού των οστών και αυξημένο κίνδυνο. δευτερεύουσα οξεία μυελογενή λευχαιμία περιορίζουν την κλινική τους αποτελεσματικότητα [1], [14] – [16]. Έτσι, η ανάπτυξη νέων παραγόντων με καλύτερη κυτταροτοξική επιλεκτικότητα και περιορισμένες παρενέργειες είναι σημαντική για αντικαρκινική θεραπεία. Αναπτύξαμε μία νέα πλήρως συνθετικό παράγωγο ποδοφυλλοτοξίνης με υψηλή καθαρότητα και καλή απόδοση ονομάζεται Ching001, και βρήκαν ότι Ching001 παρουσίασε ισχυρή κυτταροτοξικότητα ειδικά σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα, αλλά όχι σε φυσιολογικά κύτταρα του πνεύμονα. Ching001 ανέστειλε τον πολυμερισμό των μικροσωληνίσκων και συνέλαβε κυτταρικού κύκλου κατά τη μίτωση. Ching001 επαγόμενη απόπτωση μέσω της επαγωγής της βλάβης του DNA και της ενεργοποίησης του σηματοδότηση ER στρες. Ching001 έδειξαν αναστολή της ανάπτυξης του όγκου και την πρόληψη του αποικισμού όγκου χωρίς εμφανή παρενέργειες σε μοντέλα ξενομοσχεύματος, υποδηλώνοντας ότι θα μπορούσε να δοκιμαστεί περαιτέρω ως νέο αντιδραστήριο κατά των όγκων.

Αποτελέσματα

Ching001 Δείχνει Επιλεκτική κυτταροτοξικότητα Προς Καρκίνος αλλά όχι φυσιολογικά κύτταρα του πνεύμονα

Ching001 είναι ένα πλήρως συνθετική ένωση και η δομή του φαίνεται στην Εικ. 1Α. Η κυτταροτοξικότητα του Ching001 σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα και MRC5 φυσιολογικού πνεύμονα κυτταρική γραμμή αναλύθηκε. Η IC50 υπολογίζονται με ανάλυση παλινδρόμησης των διαφόρων κυτταρικών σειρών ήταν: CL1-0, 1,99 μΜ? CL1-5, 1,90 μΜ? Α549, 1,21 μΜ? Η1299, 2,58 μΜ? και MRC5, 8.27 μΜ για θεραπεία Ching001 στις 48 ώρες (Σχ. 1Β). Ching001 έδειξε μια επιλεκτική κυτταροτοξικότητα σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα, αλλά όχι σε φυσιολογικά ανθρώπινα κύτταρα MRC5 πνεύμονα.

(Α) Η δομή της Ching001 ένωσης. (Β) Δοκιμασία κυτταροτοξικότητας της κανονικής MRC5 πνεύμονα και διάφορα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα παρακολουθήθηκε με βαφή κυανούν τρυπανίου. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετική συγκέντρωση του Ching001 για 48 ώρες. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Οι αστερίσκοι δεικνύουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των φυσιολογικών κυττάρων MRC5 και καρκινικά κύτταρα. ***

P

& lt? 0.001. (Γ) Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της κατανομής του κυτταρικού κύκλου των κυτταρικών σειρών καρκίνου του πνεύμονα που έλαβαν θεραπεία με διάφορες δόσεις Ching001 και για διαφορετικές διάρκειες. (D) ανοσοφθορισμός για α-τουμπουλίνης (πράσινο) και DAPI πυρηνική χρώση (μπλε) μετά από 1 μΜ θεραπεία Ching001 για 2 έως 8 ώρες σε S-φάση συγχρονισμένη κυτταρικές γραμμές καρκίνου του πνεύμονα. DMSO χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος διαλύτη. Ράβδοι κλίμακας: 10 μm

Η

Ching001 Αναστέλλει μικροσωληνίσκων πολυμερισμός και καθυστερήσεις φάσης Μ Εξέλιξη

Από ποδοφυλλοτοξίνης είναι γνωστό για τη στόχευση των μικροσωληνίσκων, δομικό ανάλογο της Ching001 μπορεί επίσης να στοχεύουν μικροσωληνίσκων.. δοκιμασία συγκρότησης μικροσωληνίσκων έδειξε ότι 1 μΜ θεραπεία Ching001 μείωσε την αδιάλυτη πολυμερισμένη μορφή μικροσωληνίσκους εντός 6 h (Σχ. S1 Α). Η ανοσοφθορισμού του α-τουμπουλίνης έδειξαν σημαντική διαταραχή της οργάνωσης μικροσωληνίσκων σε σύγκριση με DMSO έλεγχο διαλύτη τόσο Α549 και CL1-5 καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα (Εικ. S1B). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι μικροσωληνίσκων είναι ο πιθανός στόχος της Ching001.

Στη συνέχεια, εξετάσαμε επίδραση της Ching001 στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Η κυτταρομετρία ροής αναλύσεις έδειξαν ότι ο πληθυσμός G2 /M φάση των επεξεργασμένων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα, συμπεριλαμβανομένων των Η1299, Α549, CL1-0, και CL1-5, αυξημένη δόση-εξαρτώμενο με 0.5 έως 1 μΜ θεραπεία Ching001 για 6 ώρες. Το G2 /M του κυτταρικού κύκλου του πληθυσμού αυξήθηκε περαιτέρω δραματικά, που συνοδεύεται από την εμφάνιση του κλάσματος υπο-G1 σε παρατεταμένη θεραπεία Ching001 για 12 ώρες (Εικ. 1 C). Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής και πολλαπλασιασμού δοκιμασία φάσης S συγχρονισμένα κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα επιβεβαίωσε επίσης ότι η θεραπεία Ching001 συνέλαβε την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου σε G2 /M φάσης, επομένως, ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό (Εικ. S2).

Για να αναλύσουμε περαιτέρω το αποτέλεσμα του Ching001 διάρκεια G2 /M σύλληψης, ανοσοφθορισμό για μικροσωληναρίου διεξήχθη σε S-φάση συγχρονισμένα κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα αντιμετωπίζονται από Ching001 (Σχ. 1D). Τα κύτταρα DMSO-αγωγή άρχισε να εισέλθουν pro-μετάφαση μετά από 2 ώρες και προχώρησε στην ανάφαση σε 4 ώρες μετά την απελευθέρωση από τη φάση S. Τα κύτταρα προχώρησε στην τελόφασης σε 6 ώρες και έφτασε αργά κυτταροκίνηση να ολοκληρώσει τη μίτωση σε 8 ώρες. Ωστόσο, Ching001 επεξεργασμένα κύτταρα εισήλθε Μ-φάσης σε 2 ώρες και παρέμεινε σε μετάφαση ακόμη και σε 8 ώρες (Εικ. 1D).

Για την παροχή μοριακή απόδειξη της σύλληψης Μ-φάση, πραγματοποιήσαμε western blot ανάλυση των βασικών πρωτεΐνες που ρυθμίζουν την κυτταρική μίτωση, συμπεριλαμβανομένων Aurora Β, survivin και φωσφορυλιωμένη πρωτεΐνη μιτωτική μονοκλωνικό 2 επιτόπια (ρ-MPM2) [17] – [19]. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι Aurora Β, survivin και ρ-MPM2 παρέμεινε υψηλό μετά τη θεραπεία σε σύγκριση με το Ching001 DMSO ελέγχου, υποδεικνύοντας σύλληψη φάσης Μ (Σχ. 2Α). Επιπλέον, η χρώση ανοσοκυτταροχημεία έδειξε ότι περίπου 15% των κυττάρων σε επεξεργασία DMSO ήταν στην Μ-φάση από την έκφραση τόσο της aurora Β και survivin, ενώ θεραπεία Ching001 αύξησε σημαντικά τον πληθυσμό των κυττάρων Μ-φάση, η οποία συν-εκφράζεται aurora Β και survivin (Σχ. 2Β). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι Ching001 συλλαμβάνει την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου σε φάση Μ.

(Α) αναλύσεις Western blot πρωτεϊνών μίτωσης που σχετίζονται μετά την 1η κατεργασία μΜ Ching001 για υποδεικνυόμενους χρόνους σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου του πνεύμονα. (Β) Δυσλειτουργία του που προκαλείται από Ching001 κυτταρικό κύκλο φάσης-Μ. Lung κυτταρικές σειρές καρκίνου αναλύθηκαν με survivin (πράσινο), aurora Β (κόκκινο), και ϋΑΡΙ (μπλε) μετά από 1 μΜ θεραπεία Ching001 για 24 ώρες. DMSO χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος διαλύτη. Ράβδοι κλίμακας: 30 μm

Η

Ching001 που προκαλείται Μιτωτικά σύλληψης οδηγεί σε βλάβη του DNA και την απόπτωση των κυττάρων του πνεύμονα Καρκίνος

Είχε αναφερθεί ότι τα λάθη στη μίτωση δημιουργούν ζημιές και τον κατακερματισμό του. DNA [20]. Οι αναλύσεις στυπώματος Western μας έδειξαν την αύξηση του δείκτη βλάβης του DNA γ-Η2ΑΧ σε καρκινικά κύτταρα μετά από θεραπεία Ching001 (Εικ. 3Α), η οποία επιβεβαιώθηκε με ανοσοφθορισμό για γ-Η2ΑΧ (Εικ. S3). Για να εξετασθεί περαιτέρω κατά πόσον η βλάβη του DNA που προκαλείται από κατεργασία Ching001 τελικά οδηγεί σε απόπτωση, PS μετατόπιση ανιχνεύθηκε με ανοσοφθορισμό μετά από θεραπεία Ching001 (Σχ. 3Β). Επιπλέον, δοκιμασία σκάλα DNA απόπτωση επαγόμενη εκτελέστηκε (Σχ. 3C). Μια ισχυρή μετάθεση PS στις 24 ώρες και επαγωγή των αποπτωτικών σκάλες DNA σε 48 ώρες σε Ching001 επεξεργασμένο Η1299, Α549, CL1-0 και CL1-5 κύτταρα υποδεικνύουν ότι βλάβη στο DNA που προκαλείται από σφάλματα κατά τη διάρκεια θεραπείας μίτωση Ching001 τελικά οδηγεί σε απόπτωση.

(Α) κηλίδας Western αναλύσεις για δείκτη βλαβών του DNA γ-H2AX μετά την 1η επεξεργασία μΜ Ching001 σε ενδεδειγμένους χρόνους. (Β) ανοσοφθορισμού για την πρόωρη-αποπτωτική μετατόπιση δείκτη PS μετά την αγωγή Ching001 για 24 ώρες. Ράβδοι κλίμακας: 30 μm. (Γ) Η αποπτωτική-ειδική κατάτμηση DNA ανιχνεύθηκε από σκάλα αναλύσεις του DNA μετά από τη θεραπεία Ching001 για 48 ώρες.

Η

Ching001 Προκαλεί Pro-αποπτωτικών ER στρες μονοπάτι σηματοδότησης

Αξίζει να σημειωθεί ότι, η δραστηριότητα του ER στρες που προκαλείται από κασπάση-4 αυξήθηκε σε ένα χρονο-εξαρτώμενο τρόπο με Η1299 και καρκινικές κυτταρικές γραμμές Α549 πνεύμονα μετά από θεραπεία Ching001 (Σχ. 4Α). Για να διερευνηθούν οι μηχανισμοί της θεραπείας Ching001 επί προ-αποπτωτική επαγωγή ER στρες, Western Blot για πρωτεΐνες που ρυθμίζουν την απόπτωση συμπεριλαμβανομένου ER στρες μονοπατιών σηματοδότησης διεξήχθησαν. Η ενεργοποίηση των ER στρες ήταν εμφανής από την αυξημένη έκφραση του ρ-PREK, ρ-eIF2α, ρ-JNK, GADD153 και κασπάσης-4 μετά τη θεραπεία Ching001 (Εικ. 4Β). Επιπλέον, η θεραπεία Ching001 μείωσε την έκφραση των αντι-αποπτωτικών παράγοντα Bcl-2 και αύξησε την έκφραση των προ-αποπτωτικών παράγοντας Bax, που οδηγεί σε απόπτωση μέσω διάσπασης της απόπτωσης δήμιου κασπάσης-3 (Σχ. 4Α). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι Ching001 επαγόμενη απόπτωση, τουλάχιστον εν μέρει, μέσω μονοπατιού σηματοδότησης ER στρες.

(Α) Η δραστικότητα κασπάσης-4 αυξημένο χρόνο-εξαρτώμενο μετά την 1η κατεργασία μΜ Ching001 τόσο Α549 και ο καρκίνος του πνεύμονα Η1299 κυττάρων γραμμές σε χρόνους που υποδεικνύονται. **:

P

& lt? 0,01, ***:

P

& lt? 0.001. (Β) αναλύσεις Western blot ER στρες που σχετίζονται με σηματοδότηση πρωτεΐνες (κηλίδες πάνω από τη γραμμή τελεία) και την απόπτωση που σχετίζονται σηματοδότησης πρωτεΐνες (κηλίδες κάτω από τη γραμμή τελεία) μετά την επεξεργασία Ching001 στους χρόνους που υποδεικνύονται.

Η

Ching001 εκθεμάτων

στο

vivo

ξενομοσχεύματος αναστολή ανάπτυξης από Μίτωση σύλληψης και απόπτωση χωρίς επαγωγή της απόπτωσης σε περιβάλλοντα ιστό του ξενομοσχεύματος

προσδιορισμός του όγκου ξένου μοσχεύματος έγινε για να δοκιμαστεί η ικανότητα αναστολής της ανάπτυξης του όγκου του Ching001

στο

vivo

. Ενδοπεριτοναϊκή ένεση 0,4 mg /kg Ching001 για πέντε φορές κατά τη διάρκεια της αρχικής πορείας της θεραπείας έδειξαν την επίδραση αναστολής της ανάπτυξης του όγκου, η οποία ήταν παρόμοια με 4 mg /kg θεραπεία με πακλιταξέλη, ένας γνωστός αναστολέας μικροσωληναρίων (Εικ. 5Α, αριστερό πλαίσιο). Ο ρυθμός ανάπτυξης όγκου ανεστάλη περαιτέρω κατά την επεξεργασία με 2 mg /kg Ching001. Καμία σημαντική απώλεια σωματικού βάρους σε θεραπεία ζώα σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου βρέθηκε (Εικ. 5Α, δεξιά πλευρά).

(Α) ICR-άτριχων ποντικών που φέρουν τις καθιερωμένες όγκους Α549 (~ 50 mm

3) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Ching001 (0,4 mg /kg ή 2 mg /kg) μέσω ενδοπεριτοναϊκής ένεσης σε day1, day3, day5, Ημέρα 7, και day9 (όπως υποδεικνύεται από τα κεφάλια βέλος). Ένας γνωστός αναστολέας μικροσωληνίσκων, πακλιταξέλη (4 mg /kg), χρησιμοποιήθηκε για σύγκριση. Οι όγκοι των όγκων (αριστερά) και το σωματικό βάρος (δεξιά) μετρήθηκαν σε κάθε άλλη μέρα μέχρι day35. Σημεία, σημαίνει? μπαρ, ± SEM. *:

P

& lt? 0,05, **:

P

& lt? 0,01, ***:

P

& lt? 0.001. (Β) Η ενεργοποιημένη κασπάση-3 IHC χρώση του ιστού του όγκου του ICR-γυμνούς ποντικούς που λαμβάνονται από την ομάδα διαλύτη ελέγχου και επεξεργασίας Ching001 (2 mg /kg) ομάδα. Αρχική μεγέθυνση × 200. (Γ) Η ανοσοφθορισμού ιστός του survivin (πράσινο), aurora Β (κόκκινο), και ϋΑΡΙ (μπλε) του ξενομοσχεύματος όγκου από ποντικούς ελέγχου και διαλύτη Ching001 ποντίκια με αγωγή (2 mg /kg). Τα βέλη υποδεικνύονται τα μιτωτικά κύτταρα στον όγκο ελέγχου διαλύτη. Η διευρυμένη αριθμός αντιπροσωπεύει παρεκκλίνουσα χρωμοσώματα μετά τη θεραπεία Ching001. Ράβδοι κλίμακας:. 30 μm

Η

Για να διερευνηθεί αν Ching001 επαγόμενη απόπτωση καρκινικών

στο

vivo

, ανοσοϊστοχημεία (IHC) χρώση των ενεργοποιημένων κασπάσης-3 πραγματοποιήθηκε. Βρήκαμε μια αυξημένη έκφραση του ενεργοποιημένου κασπάσης-3 σε ξενομοσχεύματα όγκου από ομάδα που έλαβε αγωγή Ching001 σύγκριση με διαλύτη ομάδα που έλαβε αγωγή (Σχ. 5Β). Επιπλέον, η Ching001 κατεργασμένα κύτταρα όγκου φαίνεται να συρρικνώθηκε στον πυρήνα και διοχετεύθηκε στην εμφάνιση, που αντιπροσωπεύουν αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε ξενομοσχεύματος οζίδιο (Εικ. S4A), ενώ ούτε ιστολογικές ή αποπτωτικό φαινότυπο παρατηρήθηκε σε περιβάλλοντα υγιή ιστό του ξενομοσχεύματος (Σχ. S4B ). Για να διερευνηθεί κατά πόσο Ching001 που προκαλείται από τη μίτωση σύλληψη

στο

vivo

, ανοσοφθορισμό ιστό της survivin και aurora Β διεξήχθη. Τα αποτελέσματα έδειξαν μια αύξηση του πληθυσμού των κυττάρων που συν-εκφράζεται survivin και aurora Β Ching001 αντιμετωπίζονται ιστό του όγκου σε σύγκριση με το διαλύτη θεραπεία ιστού (Εικ. 5C). Είναι σημαντικό, παρεκκλίνουσα διάταξη χρωμόσωμα παρατηρήθηκε σε Ching001 αντιμετωπίζονται ξενομόσχευμα (διευρυμένη ένθετο στο Σχ. 5C). Αυτές

στο

vivo

αποτελέσματα επιβεβαιώνουν με

στο

vitro

δεδομένα που Ching001 προκαλεί μίτωση σύλληψη, βλάβη χρωμοσωμάτων, και την απόπτωση.

Ching001 Αναστέλλει τον Καρκίνο αποικισμός Δυνατότητα

στο

vivo

χωρίς να επηρεάζεται η κανονική ζωτική λειτουργία

Για να επαληθεύσετε την

στο

vivo

αναστολή του αποικισμού δυναμικό της Ching001, διεξήχθησαν πειραματικές μελέτες μετάστασης των ζώων. Α549 κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα εγχύθηκαν ενδοφλεβίως στην ουραία φλέβα-ποντικών. Οι ποντικοί έλαβαν 0,2 mg /kg Ching001, το ένα δέκατο της δόσης που χρησιμοποιείται για μελέτες σε ζώα ανάπτυξη κατά του όγκου, ενδοπεριτοναϊκώς κάθε δεύτερη ημέρα από την ημέρα 1 έως την ημέρα 35. DMSO χρησίμευσε ελέγχου ως διαλύτη και 0,2 mg /kg πακλιταξέλης συμπεριλήφθηκε ως μία θετικός μάρτυρας. Επιπλέον, τα κύτταρα Α549 προκατεργάστηκαν με 1 μΜ Ching001 πριν την ένεση ουράς φλέβα διεξήχθησαν επίσης. Αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε) λεκέδες έδειξε σημαντικά λιγότερες οζίδια όγκων στους πνεύμονες των ποντικών που έλαβαν ενδοπεριτοναϊκά με Ching001 ή paclitaxel σε σύγκριση με τον έλεγχο διαλύτη DMSO. οζίδια όγκων σπάνια βρέθηκαν σε ιστούς των πνευμόνων από ποντικούς ενδοφλέβια ένεση με Ching001 προεπεξεργασμένα καρκινικά κύτταρα (Εικ. 6Α, αριστερό πάνελ). Ο μέσος αριθμός των οζιδίων όγκου στους πνεύμονες ήταν 88, 29, 18 και 2 σε DMSO, 0,2 mg /kg αγωγή με πακλιταξέλη, 0.2 mg θεραπεία /kg Ching001, και ομάδες προ-επεξεργασίας Ching001, αντίστοιχα (Σχ. 6Α, πάνω δεξιά πάνελ ). Δεν υπήρχε σημαντική απώλεια σωματικού βάρους σε όλα τα ζώα υποβλήθηκαν σε αγωγή (Σχ. 6Α, κάτω δεξιά πλαίσιο). Όλη η ανάλυση βιοχημεία των δειγμάτων αίματος από πειραματόζωα δεν έδειξε εμφανή δυσμενείς επιδράσεις στις λειτουργίες του ήπατος και των νεφρών σε σύγκριση με τον έλεγχο διαλύτη (Σχ. 6Β). Επιπλέον, η Η &? Χρώση Ε δεν παρουσιάζουν σημαντική διαταραχή οργάνων στην καρδιά, τους νεφρούς, το ήπαρ και πνεύμονα αποκόπηκαν από Ching001 αγωγή ποντίκια (Σχ S5.). Τα δεδομένα δείχνουν ότι η θεραπεία Ching001

στο

vitro

ή

στο

vivo

αναστέλλουν πνεύμονα αποικισμού. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η συνεχής επεξεργασία των Ching001 για 35 ημέρα δεν δείχνουν ανιχνεύσιμη τοξικότητα από ζώα που υπέστησαν αγωγή.

(Α) κύτταρα Α549 (1 × 10

6) ήταν φλέβα της ουράς με ένεση στα ποντίκια BALB /c. Οι ποντικοί έλαβαν 0,2 mg /kg Ching001 ή 0,2 mg /kg ενδοπεριτοναϊκώς πακλιταξέλη κάθε δεύτερη μέρα για πέντε εβδομάδες όπως υποδεικνύεται από τα κεφάλια βέλος στην κάτω δεξιά πάνελ. Κύτταρα προεπεξεργασία με 1 μΜ Ching001 πριν την ένεση στην φλέβα της ουράς πραγματοποιήθηκαν επίσης. DMSO χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος διαλύτη. Η Η &? Ε-χρώση του πνευμονικού ιστού (αριστερά), ποσοτικός προσδιορισμός των οζιδίων του όγκου στους πνεύμονες (άνω δεξιά), και το σωματικό βάρος (κάτω δεξιά) του Α549 ενέθηκαν ποντικοί απεικονίζονται. Τα κόκκινα βέλη υποδεικνύονται οι θέσεις των οζιδίων του όγκου στον πνευμονικό ιστό. Αρχική μεγέθυνση × 100. *:

P

& lt? 0,05. (Β) Οι αιματολογικές και βιοχημικές εξετάσεις του αίματος από δοκιμάστηκαν ποντίκια. Στις δοκιμές αιματολογίας, WBC, RBC και αιμοπεταλίων ελέγχθηκαν. Στις δοκιμές βιοχημεία, GOT, GPT, λευκωματίνη, και ολική χολερυθρίνη-χρησιμοποιούνται ως δείκτες της ηπατικής λειτουργίας? BUN και κρεατινίνης ως δείκτες της νεφρικής λειτουργίας. Τα δεδομένα έδειξαν ότι η θεραπεία Ching001 προκάλεσε καμία εμφανή αλλαγή στις λειτουργίες του ήπατος και των νεφρών σε σύγκριση με τα ζώα DMSO-θεραπεία.

Η

Συζήτηση

Για την ανάπτυξη αντικαρκινικών φαρμάκων με καλύτερη αποτελεσματικότητα και περιορισμένη πλευρά -effects, σχεδιάσαμε μια πλήρως συνθετική ένωση Ching001 και εξέτασε τις δραστηριότητες κατά του όγκου του

στο

vitro

και

στο

vivo

στο μοντέλο του καρκίνου του πνεύμονα . Ching001 έδειξε ειδική κυτταροτοξικότητα έναντι διαφόρων ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών πνεύμονα σε δοσολογίες σε υπο-μικρομοριακό εύρος χωρίς εμφανή κυτταροτοξικότητα έναντι φυσιολογικού ανθρώπινου πνεύμονα γραμμή. Οι μελέτες σε ζώα έδειξαν ότι η Ching001 ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου και του εποικισμού

στο

vivo

χωρίς σημαντικές παρενέργειες σε δοκιμάζονται ποντίκια. Η μοριακή ρόλος του Ching001 στην αναστολή της ανάπτυξης του όγκου με τη μεσολάβηση, τουλάχιστον εν μέρει, από μικροσωληνίσκους de-πολυμερισμού που οδηγεί σε μίτωση σύλληψη και βλάβη του DNA. Τα γεγονότα αυτά σε συνδυασμό με την επαγωγή ER στρες, οδήγησαν τελικά σε απόπτωση των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα

στο

vitro

και

στο

vivo

(Εικ. 7 ).

Rapid εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου είναι ένα από τα χαρακτηριστικά της πολλαπλασιασμένο καρκινικών κυττάρων. Αναστολή της μικροσωληνίσκων πολυμερισμού με Ching001 συλλαμβάνει εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου φάσης-Μ και οδηγεί σε βλάβη του DNA. Επιπλέον, η θεραπεία Ching001 προκάλεσε την ενεργοποίηση του ER στρες μονοπατιού σηματοδότησης μέσω της ενεργοποίησης των PERK και κασπάσης-4 καταρράκτη σηματοδότησης. Η παρατεταμένη διακοπή της φάσης-Μ και ενεργοποιημένων στρες ER σηματοδότησης ακολούθως διεγείρει απόπτωση στο κύτταρο του καρκίνου αντιμετωπίζονται με Ching001.

Η

κηλίδα western μας αναλύει ανιχνεύεται μία παρατεταμένη έκφραση του ρ-MPM2 αντιπροσωπεύουν είσοδο του κυτταρικού κύκλου φάσης-Μ [18], [19], υποδεικνύοντας ότι Ching001 επεξεργασμένα κύτταρα αποχώρησε από την G2 και προηγήθηκε στο Μ φάση. Επιπλέον, Aurora Β και survivin ελέγχουν τη διάταξη και τον διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων κατά τη μίτωση. Η αποδόμηση του aurora Β και survivin σε Μ-φάση διευκολύνει την λήξη της μίτωσης [17]. Παρατηρήσαμε μια αυξημένη συν-έκφραση των aurora Β και survivin σε αμφότερες τις κυτταρικές και ζωικά δείγματα, γεγονός που υποδηλώνει ότι Ching001 αναστέλλει την έξοδο από το Μ-φάση. α-τουμπουλίνης ανοσοφθορισμό των συγχρονισμένων κυττάρων φάσης S μας έδειξε ένα διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη μετάφαση. Όλα μαζί, τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν την υπόθεση ότι Ching001 συλλαμβάνει τον κυτταρικό κύκλο στη φάση Μ που μπορεί να οφείλεται στην αναστολή της μικροσωληνίσκων πολυμερισμού και διατάραξη της ατράκτου οργάνωσης μικροσωληνίσκων. Παρατείνει τη σύλληψη Μ-φάση στα κύτταρα οδηγεί σε αποτυχία του χρωμοσώματος διαχωρισμού και του επακόλουθου θανάτου από μίτωση [21]. τρέχουσα κυτταρικά και ζωικά αποτελέσματα μας παρέχουν ενδείξεις ότι η θεραπεία Ching001 επάγει σύλληψης φάσης Μ που ακολουθείται από βλάβη του DNA και αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο.

Η αποτυχία της πυρηνικής μετανάστευση και διάσπαση θα μπορούσε να διαταράξει την ομοιόσταση του ER [22]. αισθητήρες ER διαμεμβράνης είναι γνωστή ως PERK και IRE1α συνέχεια θα ενεργοποιείται με φωσφορυλίωση η οποία στη συνέχεια ενεργοποιεί την κασπάση-4 [23]. θεραπεία Ching001 αύξησε την έκφραση των δεικτών στρες ER και απόπτωση δείκτες σε 6-12 ώρες. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι Ching001 επαγόμενη καρκινικού κυττάρου απόπτωση μπορεί να προκληθεί ταυτόχρονα μέσω επαγωγής των ελαττωμάτων μίτωσης και ενεργοποίηση ER στρες σε πρώιμα χρονικά σημεία. Επιπλέον, δεν υπάρχει εμφανής ενεργοποίηση της εγγενούς πρωτεΐνης σηματοδότηση της αποπτώσεως κασπάσης-9 και εξωγενών σηματοδοτήσει απόπτωση πρωτεΐνη κασπάση-8 παρατηρήθηκαν μετά την αγωγή Ching001 (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), υποδεικνύοντας ότι Ching001 επάγεται καρκινικών κυττάρων απόπτωση είναι μέσω ER στρες. Εξασθένηση της ER-απόπτωση που προκαλείται από Ching001 σε αισθητήρες ER γκρέμισε κύτταρα αξίζει περαιτέρω έρευνα

ποδοφυλλοτοξίνη είναι το φυσικό ανάλογο προϊόν Ching001 [5] -. [7]. ενώσεις παράγωγο ποδοφυλλοτοξίνης χρησιμοποιούνται στην κλινική θεραπεία του καρκίνου παρουσιάζουν συχνά αντίσταση οφείλεται σε ανώμαλη έκφραση και μετάλλαξης των ειδικών β-τουμπουλίνης ισοτύπων κατά τη διάρκεια της θεραπείας [24]. Επιπλέον, η αντίσταση paclitaxel έχει επίσης αναφερθεί ότι συσχετίζεται με αυξημένη έκφραση του ρ-γλυκοπρωτεϊνών [25], [26]. Αξίζει να σημειωθεί ότι η θεραπεία Ching001 έδειξαν παρόμοια κυτταροτοξική δράση σε διάφορα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα που εκφράζουν διαφορετικά επίπεδα του p-γλυκοπρωτεΐνες (Εικ. 1 Β και Εικ. S6). Επιπλέον, η θεραπεία Ching001 έδειξε μια ισχυρή κυτταροτοξική δραστικότητα έναντι ενός ανθρώπινου επιδερμικού κυτταρική σειρά καρκίνου ετοποσίδη ανθεκτική (Εικ. S7). Είτε Ching001 είναι μία ισχυρή ένωση για τη θεραπεία της Ταξάνια- ή ετοποσίδης-ανθεκτικά κύτταρα warrants περαιτέρω μελέτες.

Εν κατακλείδι, Ching001 εμφανίζει αύξηση κατά του όγκου και την αποτελεσματικότητα της αναστολής αποικισμού χωρίς δυσμενείς επιπτώσεις σε προκλινικές δοκιμές μας. Αυτά τα αποτελέσματα υπογραμμίζουν το θεραπευτικό δυναμικό των Ching001 στη θεραπεία του καρκίνου. Συνθετική ένωση Ching001 υψηλής καθαρότητας και αποδίδουν με τον καρκίνο του κυττάρου-ειδική κυτταροτοξικότητα είναι ένας πιθανός υποψήφιος για να δοκιμαστεί ως επικεφαλής φαρμακευτική ένωση για τη θεραπεία του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Όλα τα ζώα ελήφθησαν από το Εθνικό Κέντρο Εργαστήριο ζώων (Δημοκρατία της Κίνας, Ταϊβάν) με την έγκριση των Θεσμικών Φροντίδα ζώων και Επιτροπή Χρήσης (IACUC), Εθνική Cheng Kung University (IACUC έγκριση Νο 98099) και διατηρήθηκαν σε παθογόνο χωρίς προϋποθέσεις. Η έγκριση της μελέτης από την επιτροπή ιδρύματος επιτροπή δεοντολογίας και ηθικής επιβεβαιώθηκε από το Εθνικό Πανεπιστήμιο Cheng Kung.

Γραμμή κύτταρο, κύτταρο Πολιτισμού και συγχρονισμός

Κανονική MRC5 ανθρώπινου πνεύμονα επιθηλιακών κυττάρων και του ανθρώπινου πνεύμονα αδενοκαρκίνωμα γραμμές CL1-0, και CL1-5 ελήφθησαν από τον Dr. PC Yang (Παθολογική Κλινική, Εθνικό Πανεπιστήμιο της Ταϊβάν Νοσοκομείο, Ταϊβάν) [27]. Τα ανθρώπινα μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα σειρές Η1299 καρκινικών κυττάρων και Α549 ελήφθησαν από την American Type Cell Culture. Οι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές επιδερμικό καρκίνο ΚΒ και κύτταρα ΚΒ-7D δόθηκαν από τον Dr. Jang-Yang Chang από το Εθνικό Ινστιτούτο Ερευνών Υγείας, Ταϊνάν, Ταϊβάν. ΚΒ κυτταρική σειρά αγοράστηκε πρωτότυπο από την American Type Cell Culture και ΚΒ-7D είναι μια ετοποσίδη ανθεκτική κυτταρική γραμμή που προέρχεται από την κυτταρική σειρά ΚΒ [28]. Όλα τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ (Gibco, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) με 10% FBS (Gibco) και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Gibco) και επωάζονται στους 37 ° C σε 5% CO

2 υγροποιημένη ατμόσφαιρα. Για το συγχρονισμό των κυττάρων σε S-φάση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 2 mg /ml aphidicolin (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) για 24 ώρες και απελευθερώνεται εντός του κυτταρικού κύκλου πριν από τη θεραπεία Ching001.

ενώσεις που χρησιμοποιούνται

το παράγωγο ποδοφυλλοτοξίνης, Ching001, παρασκευάζεται από την συν-συγγραφέας W.-S. Li. Αίτηση για την ένωση αποστέλλεται στην [email protected].

Η κυτταροτοξικότητα Δοκιμασία

Cells (3 × 10

4) σπάρθηκαν σε δίσκους καλλιέργειας 6 φρεατίων και διαφορετική συγκέντρωση Ching001 (0.5, 1, 3, 5 μΜ) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο για 48 ώρες. Ο αριθμός των κυττάρων και η βιωσιμότητα προσδιορίστηκαν με βαφή κυανούν τρυπανίου και καταμέτρηση των κυττάρων.

μικροσωληνίσκων Συνέλευση Δοκιμασία

δοκιμασία συγκρότησης μικροσωληνίσκων διεξήχθη σύμφωνα με την προηγούμενη μελέτη [29]. Κύτταρα (1 χ 10

6) σπάρθηκαν πάνω σε τρυβλία καλλιέργειας 100 mm και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 1 μΜ Ching001 ή ελέγχου DMSO για 6 έως 48 ώρες. Το υπερκείμενο κλάσμα συνολικά κυτταρολύματα συλλέχθηκαν ως διαλυτή αβ-τουμπουλίνης διμερή και ποσοτικά με δοκιμασία Bradford. Το ίζημα συλλέγεται ως αδιάλυτη πρωτεΐνη περιέχει πολυμερισμένο μικροσωληνίσκοι που έβρασε με ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος πρωτεΐνης για να διαλυθεί πρωτεΐνες. Περίπου 50 μg του διαλυτού προϊόντα λύσης πρωτεΐνης χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος φόρτωσης, και ίσος όγκος αδιάλυτα προϊόντα λύσης πρωτεΐνης χρησιμοποιήθηκαν για α-τουμπουλίνης ανοσοκαθήλωση. Όλα τα αντισώματα και οι συνθήκες αντίδρασης τους που χρησιμοποιούνται παρατίθενται στον Πίνακα S1.

κυτταρομετρίας ροής

CL1-0, CL1-5, Α549 και Η1299 κύτταρα (1 × 10

6) ήταν συλλέχθηκαν μετά από 6 έως 12 ώρες με αγωγή 0.5 μΜ ή 1 μΜ Ching001, πλένεται δύο φορές με ισορροπημένο διάλυμα άλατος του Hank (Sigma-Aldrich) και -20

oC αιθανόλη στερέωση όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα επωάστηκαν με παρεμβολής στο DNA ιωδιούχου προπιδίου (Sigma-Aldrich) σε 37

oC για 1 ώρα με 1 μg /ml RNase Α και 0.1% Triton-Χ100. Περίπου 3 × 10

4 κύτταρα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας FACScalibur όργανο (BD Biosciences, San Jose, CA) για την ανάλυση της κατανομής κυτταρικού κύκλου.

Ανοσοκυτοχημεία χρώσης

Τα κύτταρα (1 × 10

4) σπάρθηκαν σε πλάκες θάλαμο και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με Ching001 ή DMSO ελέγχου για 48 ώρες. Τα κατεργασμένα κύτταρα υβριδοποιήθηκαν με αντίσωμα α-τουμπουλίνης και DAPI μετά τη σταθεροποίηση. Αντισώματα του survivin και aurora Β χρησιμοποιήθηκαν για χρώση μιτωτική κυττάρων. αντίσωμα αντι-PS χρησιμοποιήθηκε για ανίχνευση πρώιμο στάδιο απόπτωσης. Τα κύτταρα στη συνέχεια φωτογραφήθηκαν κάτω από ομοεστιακό μικροσκόπιο OLYMPUS FV1000. Οι λεπτομερείς διαδικασίες και τα αντισώματα που περιγράφονται στον Πίνακα S1.

Ανάλυση Western Blot

Δείγματα που περιέχουν ίσες ποσότητες πρωτεΐνης (50 μg) διαχωρίστηκαν σε 10% SDS-PAGE και ηλεκτροστυπώθηκαν σε Immobilon-P μεμβράνες (Millipore). κηλίδα Western διεξήχθη για να μετρηθεί το επίπεδο έκφρασης πρωτεΐνης. Οι λεπτομερείς διαδικασίες και τα αντισώματα που περιγράφονται στον Πίνακα S1.

DNA Ladder Δοκιμασία

Κύτταρα (1 χ 10

6) υποβλήθηκαν σε αγωγή με έλεγχο DMSO ή 3 έως 5 μΜ Ching001 για 24 έως 48 h, το DNA εκχυλίζεται με τη χρήση ρυθμιστικού διαλύματος εκχύλισης DNA (ρυθμιστικό φωσφορικού-κιτρικού 0,2 μΜ, ρΗ 7,8? 37

oC, 1 ώρα αντίδρασης), που ακολουθείται από RNase Α και πρωτεϊνάση Κ θεραπεία. Ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης χρησιμοποιήθηκε για σκάλα DNA αναλύσεις.

Caspase-4 Δοκιμασία Δραστηριότητα

δοκιμασία δραστικότητας κασπάσης-4 διεξήχθη με κασπάση-4 κιτ δοκιμασίας δραστικότητας (GeneTex, Irvine, CA). Εν συντομία, περίπου 200 μg συνολικά κυτταρολύματα με έλεγχο DMSO ή θεραπεία Ching001 για 6 έως 48 ώρες χρησιμοποιήθηκαν για την δοκιμασία. Η δραστηριότητα της κασπάσης-4 προσδιορίστηκε με διάσπαση του LEVD-AFC υπόστρωμα και ανιχνεύεται με συσκευή ανάγνωσης ELISA (Εχ /Em: 400/505).

Ποσοτική ανάστροφης μεταγραφάσης-αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR qRT-)

Η έκφραση του mRNA της p-γλυκοπρωτεΐνης γονίδια της οικογένειας

ABCB1

και

ABCG2

είχαν εντοπιστεί από qRT-PCR σε κανονικές και καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικών σειρών. Ολικό RNA εκχυλίστηκε από διαφορετικά πνεύμονα ανθρώπινες κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA). Περίπου 4 μg του RNA ήταν μεταγραφεί αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας αντίστροφη μεταγραφάση SuperScript (Invitrogen). Ποσοτική RT-PCR διεξήχθησαν για την ανίχνευση του επιπέδου έκφρασης του mRNA των γονιδίων στόχων χρησιμοποιώντας το ™ PCR Πραγματικού χρόνου System StepOnePlus (Applied Biosystems, Foster City, CA) με

GAPDH

ως εσωτερικός έλεγχος. Οι εκκινητές για το

ABCB1

είναι: 5′-νόημα AAATTGGCTTGACAAGTTGTATATGG-3 ‘, αντινόημα 5′-CACCAGCATCATGAGAGGAAGTC-3’? για

ABCG2

: νόημα 5′-TCATCAGCCTCGATATTCCATCT-3 ‘, 5′-αντίθετης φοράς GGCCCGTGGAACATAAGTCTT-3’? για

GAPDH

: νόημα 5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3 ‘, 5′-αντίθετης φοράς TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3’. Τα δείγματα cDNA ενισχύθηκαν με τη χρήση του SYBR Green (Applied Biosystems) και την κατάσταση θερμικών κύκλων που αποτελούνται από 95 ° C για 10 λεπτά που ακολουθείται από 45 κύκλους στους 95 ° C για 3 δευτερόλεπτα και 60 ° C για 30 sec. όριο κύκλου (Ct), ο αριθμός κλασματική κύκλου κατά την οποία η ποσότητα του ενισχυμένου στόχου φτάσει σε ένα σταθερό όριο προσδιορίστηκαν. Οι κανονικοποιημένες αναλογίες των γονιδίων στόχων υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας ΔΟΙ [ΔCt = Ct

-target γονίδιο – Ct

-GAPDH]. Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως φορές διαφορές σε σχέση με IMR90 φυσιολογική έκφραση των γονιδίων του πνεύμονα με βάση τους υπολογισμούς των 2

-ΔΔCt. (ΔΔCt = ΔCt

-lung κυτταρική σειρά – ΔΟΙ

-IMR90)

ΜΤΤ κυτταροτοξικότητας Ανάλυση

Διαφορετικές συγκεντρώσεις Ching001 προστέθηκαν σε κάθε πλάκα και επωάστηκαν για 48 ώρες. βιωσιμότητες κυττάρου κάτω από διαφορετικές συγκεντρώσεις της ένωσης θεραπείας προσδιορίσθηκαν με 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλ τετραζόλιο (ΜΤΤ, Sigma, St. Louis, ΜΟ) δοκιμασίας. Στην χωρίς θεραπεία ελέγχου, χρησιμοποιήθηκε 0.1% μέσο DMSO που περιέχουν.

In vivo

ξενομοσχεύματος όγκου Σχηματισμός Δοκιμασία

ICR-Foxn1 γυμνά ποντίκια (ηλικίας 5 εβδομάδων) ήταν αποκτήθηκαν από το Εθνικό Κέντρο Εργαστήριο ζώων με την έγκριση των Θεσμικών Φροντίδα ζώων και Επιτροπή Χρήσης (IACUC), Εθνική Cheng Kung University (IACUC έγκριση Νο 98099), και μεγάλωσε σε ένα συγκεκριμένο παθογόνο ελεύθερο περιβάλλον. κύτταρα Α549 (5 × 10

6) έλαβαν υποδόρια ένεση ως ξενομόσχευμα σε ποντίκια και αφέθηκαν να αναπτυχθούν έως 50 mm

3 οζίδιο όγκου μέσα σε 2 εβδομάδες. Οι ποντικοί στη συνέχεια ενδοπεριτοναϊκά ένεση με 0.4 mg /kg, ή 2 mg /kg Ching001, ή 4 mg /kg paclitaxel ως θετικό έλεγχο, ή τον έλεγχο διαλύτη (αιθανόλη: Cremophore: DDH

2O = 2:01:07) την ημέρα 1, 3, 5, 7, 9. ο όγκος του ξενομοσχεύματος και το βάρος των ποντικών μετρήθηκαν και προσδιορίστηκαν ποσοτικά κατά τη διάρκεια 35 ημερών της θεραπείας φαρμάκου. Ο όγκος ξενομόσχευμα υπολογίστηκε ως (μήκος Χ πλάτος τετράγωνο) /2 σε mm

3. Κύρια όργανα συμπεριλαμβανομένης της καρδιάς, των πνευμόνων, του ήπατος, των νεφρών, και ξενομοσχεύματος οζίδιο αποκόπηκαν και χρωματίστηκαν με Η &?. Ε για περαιτέρω επιβεβαίωση

In vivo

πειραματική μετάσταση Δοκιμασία

Η ποντίκια BALB /c αποκτήθηκαν και μεγάλωσε μετά από κατάλληλη άδεια θεσμικό συμβούλιο επιθεώρησης, όπως περιγράφεται παραπάνω. Α549 (1 × 10

6) κύτταρα εγχύθηκαν ενδοφλεβίως εντός της ουράς φλέβα ποντικών BALB /c, τα οποία στη συνέχεια ενδοπεριτοναϊκά δεδομένο ελέγχου DMSO, 0,2 mg /kg Ching001 ή 0,2 mg /kg πακλιταξέλη κάθε δεύτερη μέρα για πέντε εβδομάδες .