Αφηρημένο

Τα καρκινικά κύτταρα έχουν μια απαίτηση σε σίδηρο και πολλές πειραματικές μελέτες, καθώς και κλινικές μελέτες, έχουν δείξει ότι οι χηλικές ενώσεις του σιδήρου είναι πιθανοί παράγοντες αντι-καρκίνου. Ο συνδέτης, 2-βενζοϋλπυριδίνης 4-αιθυλο-3-θειοημικαρβαζόνη (Bp4eT), εμφάνισε και ισχυρή αντι-νεοπλασματική και αντι-ρετροϊική ιδιότητες. Σε αυτή τη μελέτη, Bp4eT και ταυτοποιήθηκε πρόσφατα αμιδραζόνης του και ημικαρβαζόνης μεταβολίτες εξετάστηκαν και συγκρίθηκαν σε σχέση με την αντι-πολλαπλασιαστική δράση τους έναντι καρκινικών κυττάρων (HL-60 ανθρώπινη προμυελοκυτταρική λευχαιμία,-7 MCF ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα του μαστού, καρκίνωμα ανθρώπινου κόλου HCT116 και Α549 ανθρώπινα αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα), μη καρκινικά κύτταρα (H9c2 cardiomyoblasts νεογέννητου αρουραίου προερχόμενα και 3Τ3 ινοβλάστες εμβρύου ποντικού) και την αλληλεπίδρασή τους με ενδοκυτταρικές δεξαμενές σιδήρου. Bp4eT επιδείχθηκε ότι είναι ένας πολύ ισχυρός και εκλεκτικός αντινεοπλαστικού παράγοντα που επάγει την φάση S διακοπή του κυτταρικού κύκλου, μιτοχονδριακή αποπόλωση και απόπτωση σε κύτταρα MCF-7. Αμφότερες ημικαρβαζόνη και αμιδραζόνης μεταβολίτες παρουσίασαν τουλάχιστον 300 φορές μείωση στην κυτταροτοξική δραστικότητα από Bp4eT τόσο προς τον καρκίνο και φυσιολογικές κυτταρικές σειρές. Οι μεταβολίτες έχασαν επίσης τη δυνατότητα να:

(1)

προωθήσει την οξειδοαναγωγική ανακύκλωση του σιδήρου?

(2)

δεσμεύουν και την κινητοποίηση του σιδήρου από ασταθή ενδοκυτταρική πισίνες? και

(3)

αποτρέψει

πρόσληψη 59Fe από

59Fe-επισημασμένα τρανσφερίνης από τα κύτταρα MCF-7. Ως εκ τούτου, η μελέτη αυτή αποδεικνύει ότι η υψηλής δραστικότητας συνδέτη, Bp4eT, μεταβολίζεται σε μη-τοξικές και φαρμακολογικά αδρανείς ανάλογα, η οποία πιθανότατα συμβάλλουν στην ευνοϊκό φαρμακολογικό προφίλ της. Τα ευρήματα αυτά είναι σημαντικά για την περαιτέρω ανάπτυξη αυτού του υποψήφιου φαρμάκου και να συμβάλει στην κατανόηση των σχέσεων δομής-δραστικότητας των παραγόντων αυτών

Παράθεση:. Potůčková E, Ρο J, Machacek Μ, Sahni S, Stariat J, Sestak V, et al. (2015)

In Vitro

Χαρακτηρισμός των φαρμακολογικές ιδιότητες του Αντικαρκινικού χηλικοποιητή, Bp4eT, και φάση Ι μεταβολίτες. PLoS ONE 10 (10): e0139929. doi: 10.1371 /journal.pone.0139929

Επιμέλεια: Ashley Ι Μπους, του Πανεπιστημίου της Μελβούρνης, στην Αυστραλία

Ελήφθη: 1, Ιουνίου 2015? Αποδεκτές: 19 Σεπτεμβρίου 2015? Δημοσιεύθηκε: 13 Οκτωβρίου 2015

Copyright: © 2015 Potůčková et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση: η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Ίδρυμα της Τσεχίας Science (επιχορήγηση 13-15008S? www.gacr.cz).. D.R.R. ευχαριστεί το Εθνικό Συμβούλιο Υγείας και Ιατρικής Έρευνας της Αυστραλίας για μια Senior Principal Research Fellowship και επιχορηγήσεις έργου. DSK εκτιμηθεί μια NHMRC RD Wright Κατάρτισης Fellowship και Grant έργου (www.nhmrc.gov.au)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο σίδηρος είναι ένα απαραίτητο συμπαράγοντα για τη δραστηριότητα πολλών ενζύμων ζωτικής σημασίας για τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, συμπεριλαμβανομένων αναγωγάσης ριβονουκλεοτιδίου, το οποίο καταλύει την βαθμίδα περιορισμού του ρυθμού στη σύνθεση του DNA [1]. Καθώς τα καρκινικά κύτταρα είναι γενικά πιο μεταβολικά ενεργά από το κανονικό αντίστοιχά τους, απαιτούν μεγαλύτερες ποσότητες σιδήρου [2]. Ως εκ τούτου, η στόχευση του σιδήρου σε καρκινικά κύτταρα χρησιμοποιώντας ειδικά χηλικά αντιδραστήρια είναι μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική για την ανάπτυξη νέων αντικαρκινικών παραγόντων [3]. Η τάξη Θειοημικαρβαζόνη της χηλικές ενώσεις σιδήρου έχουν δείξει υψηλή αντι-νεοπλασματική αποτελεσματικότητα τόσο

in vitro

και

in vivo

μελέτες και μερικοί παράγοντες είναι επίσης στη φάση Ι και ΙΙ των κλινικών δοκιμών [4,5, 6,7].

Ο συνδέτης, 2-βενζοϋλπυριδίνης 4-αιθυλο-3-θειοημικαρβαζόνη (Bp4eT, Σχήμα 1), αρχικά συντίθεται και χαρακτηρίζεται από West

κ.ά.

. [8]. Αργότερα αποδείχθηκε ότι είναι ένα χηλικοποιητή του σιδήρου που κατείχε ένα χαμηλό, θετικός Fe

3 + /2 + οξειδοαναγωγικό δυναμικό [9], η οποία είχε ως αποτέλεσμα το σχηματισμό τοξικών δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) τόσο σε διάλυμα [9] και σε καρκινικά κύτταρα [10]. Στην πραγματικότητα, Bp4eT έδειξε υψηλή αντι-πολλαπλασιαστική δραστικότητα κατά των ανθρώπινων κυττάρων neuroepithelioma SK-Ν-ΜΟ με χαμηλή τοξικότητα σε φυσιολογικά ανθρώπινα MRC-5 ινοβλάστες [10]. Εκτός από την αντικαρκινική δράση της, Bp4eT έδειξαν ισχυρή αναστολή του HIV-1 μεταγραφή με αποτελεσματικότητα συγκρίσιμη με εκείνη ενός κλινικώς χρησιμοποιούνται αντι-ρετροϊικού παράγοντα, roscovitin, και παρουσίασαν χαμηλή κυτταροτοξικότητα του ανθρώπινου Τ κυττάρου λεμφοβλάστης-όπως κυτταρική γραμμή, CCRF- . CEM [11]

Bp4eT, 2-βενζοϋλπυριδίνης 4-αιθυλο-3-θειοημικαρβαζόνη? Bp4eA?

Ν

3

-αιθυλ-

Ν

1

– [φαινυλ (πυριδινο-2-υλο) μεθυλενο] formamidrazone? Bp4eS, 2-βενζοϋλπυριδίνης 4-ethylsemicarbazone.

Η

Σε όρους φαρμακοκινητική του, Bp4eT δείχθηκε να διαπερνούν εύκολα συρρέουσες μονοστοιβάδες κυττάρων Caco-2, με χαρακτηριστικά παρόμοια με διαπερατότητα κοινή στόματος χορηγούμενα φάρμακα, υποδεικνύοντας βιοδιαθεσιμότητα μέσω αυτής της θεραπευτικής οδού [12,13]. Merlot

et al

. αποκάλυψε ότι η κυτταρική πρόσληψη του

14C-Bp4eT σε κύτταρα neuroepithelioma SK-N-MC επιτεύχθηκε με τη μεσολάβηση παθητικής διάχυσης και ότι το σύμπλοκο Fe-Bp4eT ήταν απομονωμένος μέσα στα κύτταρα σε μεγαλύτερο βαθμό από ό, τι εκείνη της ελεύθερης ρίζας συνδέσεως Bp4eT [14,15 ]. Περαιτέρω μελέτες αποκάλυψαν ότι

14C-επισημασμένο Bp4eT αποβλήθηκε γρήγορα από ποντίκια

μέσω

ούρα και αποβλήθηκε πιο αργά

μέσω

τα περιττώματα, με τις κύριες περιοχές της

14C- Bp4eT εναπόθεση είναι τα όργανα που σχετίζονται με απέκκριση

e

.

g

., τη χοληδόχο κύστη, λεπτό έντερο και το παχύ έντερο [15].

Ο μεταβολισμός και η φαρμακοκινητική της Bp4eT ήταν περαιτέρω μελετήθηκε σε αρουραίους με χρήση ευαίσθητης μεθόδου LC-MS [16,17,18]. Κατ ‘αρχάς, καταδείχθηκε ότι Bp4eT υπήρχε ως ένα μίγμα δύο ενδομετατρέψιμα

E

και

Ζ

ισομερή και στα δύο υδατικά μέσα και το πλάσμα, ενώ η

Z

μορφή ήταν κυρίαρχη στο η στερεά κατάσταση [16,17,18]. Δεύτερον, Bp4eT απεκαλύφθη να υφίσταται μεταβολισμό

μέσω

οξείδωση του ημίσεως θειοκαρβονυλ της τόσο

in vitro

και

in vivo

, με αποτέλεσμα την παραγωγή του αναλόγου ημικαρβαζόνης (2- βενζοϋλπυριδίνης 4-ethylsemicarbazone? Bp4eS, Σχήμα 1) και το παράγωγο αμιδραζόνη (

N

3

-ethyl-

N

1

-[phenyl(pyridin-2-yl)methylene]formamidrazone; Bp4eA, Σχήμα 1) [17]. Ο μεταβολίτης αμιδραζόνης περαιτέρω υδροξυλιώνεται

in vivo

, αλλά η συγκεκριμένη εντοπισμός της ομάδας υδροξυλίου στο δακτύλιο φαινυλίου δεν μπορούσαν να ταυτοποιηθούν [17].

Ο μεταβολίτης Bp4eS ανιχνεύθηκε ως δύο

E

/

Z

ισομερή που ήταν, σε αντίθεση με την μητρική ένωση, μη ενδομετατρέψιμα [18]. Φαρμακοκινητικές έρευνες αποκάλυψαν ότι μετά από ενδοφλέβια χορήγηση του Bp4eT, η έκθεση αρουραίων σε μεταβολίτη, Bp4eS, ήταν μόνο μικρές σε σχέση με Bp4eT [18]. Αντίθετα, η μεταβολική μετατροπή των χορηγούμενων Bp4eT στο μεταβολίτη Bp4eA φαίνεται να είναι ένα σημαντικό βιομετατροπή, όπως η έκθεση της ήταν 20% αυτής της μητρικής ένωσης [18].

Εξετάζοντας τις βιολογικές ιδιότητες των μεταβολιτών του φαρμάκου είναι ένα σημαντικό βήμα στην ανάπτυξη φαρμάκων, δεδομένου ότι οι μεταβολίτες μπορούν να συμβάλουν σημαντικά στις φαρμακολογικές ιδιότητες του μητρικού φαρμάκου [19,20] και μπορεί επίσης να παρουσιάζουν ενδιαφέρον για περαιτέρω ανακάλυψη φαρμάκων. Ως εκ τούτου, για τον καλύτερο χαρακτηρισμό Bp4eT ως μια πολλά υποσχόμενη υποψήφιου φαρμάκου, αξιολογήσαμε το

in vitro κυτταροτοξική

δραστηριότητες της ίδιας Bp4eT και δύο κύριοι μεταβολίτες της, Bp4eA και Bp4eS, σε τέσσερις ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές και δύο μη καρκινικό κύτταρο γραμμές. Όπως αποσιδήρωσης είναι ένα βασικό χαρακτηριστικό στον μηχανισμό δράσης των Bp4eT, εξετάσαμε την ικανότητα των Bp4eT και των μεταβολιτών της να:

(i)

δεσμεύει σίδηρο από την πισίνα ασταθούς σιδήρου (LIP) των καρκινικών κυττάρων?

(ii)

να κινητοποιήσει κυτταρικό

59Fe? και

(iii)

εμποδίζει την κυτταρική πρόσληψη του

59Fe από

59Fe

2-τρανσφερίνης. Η ικανότητα των συμπλοκών σιδήρου Bp4eT και των μεταβολιτών της για την προώθηση του σχηματισμού ROS διερευνήθηκε επίσης με χρήση της ανάλυσης οξείδωση ασκορβικού. Επιπλέον, την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και η λειτουργία του κυτταρικού θανάτου μετά την έκθεσή τους σε Bp4eT και οι μεταβολίτες της προσδιορίστηκαν επίσης.

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικά

Bp4eT συντέθηκε σύμφωνα με Kalinowski

et al

. [9] και οι μεταβολίτες της συντέθηκαν όπως περιγράφεται από Stariat

et al

. [17,18]. Συστατικών για διάφορα ρυθμιστικά διαλύματα και άλλες χημικές ουσίες (

e

.

g

., Διάφορα άλατα σιδήρου) αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) ή Penta (Πράγα, Τσεχία Δημοκρατία) και ήταν από τα υψηλότερα φαρμακευτική ή αναλυτικής καθαρότητας διαθέσιμες

καλλιέργειας κυττάρων

το ανθρώπινο MCF-7 αδενοκαρκινώματος του μαστού κυτταρική σειρά αγοράστηκε από την Ευρωπαϊκή Συλλογή Καλλιεργειών κυττάρων (ECACC?. Salisbury, ΗΝΩΜΈΝΟ ΒΑΣΊΛΕΙΟ). Ανθρώπινα HL-60 κύτταρα προμυελοκυτταρικής λευχαιμίας, κύτταρα ανθρώπινου καρκινώματος HCT116 ορθοκολικού, ανθρώπινο πνεύμονα Α549 κύτταρα αδενοκαρκινώματος, η κυτταρική σειρά H9c2, που προέρχονται από εμβρυϊκά καρδιακό ιστό αρουραίου, και 3Τ3 ινοβλάστες εμβρύου ποντικού ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC? Manassas, VA, USA). Η MCF-7, HCT116, Α549, 3Τ3 και H9c2 κυτταρικούς τύπους καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco τροποποιημένο μέσο Eagle (DMEM? Lonza, Βασιλεία, Ελβετία). Στην περίπτωση των κυττάρων MCF-7, DMEM χρησιμοποιήθηκε χωρίς ερυθρό φαινόλης. DMEM συμπληρώθηκε με 10% (ν /ν) απενεργοποιημένο με θέρμανση ορό εμβρύου βοός (FBS? Lonza), 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη διάλυμα (Lonza) και 10 mM ρυθμιστικό HEPES (ρΗ 7.0-7.6? Sigma-Aldrich). Η κυτταρική γραμμή HL-60 διατηρήθηκε σε μέσο RPMI (Sigma-Aldrich) συμπληρωμένου με 10% θερμοαπενεργοποιημένο FBS και 1% στρεπτομυκίνη διάλυμα πενικιλλίνης /. Όλες οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε 75 cm

2 φιάλες καλλιέργειας ιστού (ΤΡΡ, Trasadingen, Ελβετία) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2. Υπο-συρρέοντα προσκολλημένα κύτταρα, ή την αναστολή της HL-60 κύτταρα, υπο-καλλιεργήθηκαν κάθε 3-4 ημέρες.

μελέτες κυτταροτοξικότητας

Για πειράματα κυτταροτοξικότητας, τα καρκινικά κύτταρα σπάρθηκαν σε μια πυκνότητα του 5000 (MCF-7), 10000 (HL-60) ή 2.000 κύτταρα /φρεάτιο (HCT116 και Α549) σε πλάκες 96 φρεατίων (ΤΡΡ) για 24 h /37 ° C πριν από την προσθήκη των εξεταζόμενων παραγόντων. Τα μη καρκινικά κύτταρα, 3Τ3 και H9c2 κύτταρα, καλλιεργήθηκαν για 24 h /37 ° C σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 10.000 κύτταρα /φρεάτιο, το μέσο στη συνέχεια άλλαξε σε ελεύθερο ορού και πυροσταφυλικό-free DMEM (Sigma- Aldrich) και επωάστηκαν με τα κύτταρα για άλλες 24 ώρες /37 ° C. Οι κυτταροτοξικές επιδράσεις των Bp4eT και των μεταβολιτών της μελετήθηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις μετά από μία επώαση 72 h /37 ° C. Προκειμένου να βοηθηθεί η διάλυση των λιπόφιλων προσδέματα, 0,1% διμεθυλοσουλφοξείδιο (ν /ν) (DMSO? Sigma-Aldrich) ήταν παρούσα στο μέσο καλλιέργειας όλων των ομάδων. Σε αυτή τη συγκέντρωση, DMSO δεν είχε επίδραση επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού ή της βιωσιμότητας.

Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία ΜΤΤ (Sigma-Aldrich) σύμφωνα με την προηγουμένως καθιερωμένες μεθόδους [21,22]. Η οπτική πυκνότητα του διαλυτού ΜΤΤ μετρήθηκε σε λ = 570 nm, αφαιρώντας το υπόβαθρο λ = 690 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη πλακός Tecan άπειρο 200Μ (Tecan Group, Männedorf, Ελβετία). Η βιωσιμότητα ή τον πολλαπλασιασμό των πειραματικών ομάδων εκφράζεται ως ποσοστό των μη επεξεργασμένων ελέγχων (100%).

Calcein-ΑΜ δοκιμασία για την εκτίμηση της ταχύτητας διείσδυσης της κυτταρικής μεμβράνης και την πρόσβαση στην ασταθή πισίνα σιδήρου

Αυτά τα πειράματα διεξήχθησαν σύμφωνα με Glickstein

κ.ά.

. [23] με ελαφρές τροποποιήσεις. Τα κύτταρα MCF-7 εμβολιάστηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων (10,000 κύτταρα /φρεάτιο) και αφέθηκαν να προσκολληθούν για 24 h /37 ° C. Τα κύτταρα φορτώθηκαν με σίδηρο χρησιμοποιώντας την κυτταρική δότη σιδήρου, κιτρικού σιδηροαμμωνίου (530 μg /mL) [24], 24 ώρες πριν από το πείραμα, και στη συνέχεια πλένονται. Για να αποφευχθεί τυχόν παρεμβολή, ιδίως όσον αφορά τις διάφορες ιχνοστοιχεία, το μέσο αντικαταστάθηκε με ρυθμιστικό ADS (παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας Millipore νερό συμπληρωμένο με 116 mM NaCl, 5,3 mM ΚΟΙ, 1 mM ΟαΟ

2, 1,2 mM MgSO

4 , 1,13 mM Ν &

2 ΡΟ

4, 5 mM ϋ-γλυκόζη, και 20 mM HEPES, ρΗ 7,4). Τα κύτταρα φορτώθηκαν στη συνέχεια με 2 μΜ του κυττάρου διαπερατό καλσεΐνης πράσινο ακετοξυμεθυλ εστέρα (calcein-ΑΜ? Molecular Probes, Oregon, USA) για 30 λεπτά /37 ° C και πλένεται. Cellular εστεράσες διασπούν τις ομάδες ακετοξυμεθυλ να σχηματίσει την ένωση κυτταρική μεμβράνη αδιαπέραστη από καλσεϊνη πράσινο [23]. Ο φθορισμός καλσεΐνης πράσινο σβήνεται μετά από δέσμευση του σιδήρου [23]. Η ενδοκυτταρική φθορισμού (λ

ex = 488 nm? Λ

em = 530 nm) καλσεΐνης πράσινου ακολουθείται τότε ως συνάρτηση του χρόνου (10 λεπτά μετά την προσθήκη 10 μΜ Bp4eT ή των μεταβολιτών της) στους 37 ° C χρησιμοποιώντας τον αναγνώστη πλάκας Tecan Άπειρο 200M. Η αποτελεσματικότητα αποσιδήρωσης των μεταβολιτών στα κύτταρα εκφράστηκε ως ποσοστό της αποτελεσματικότητας της μητρικής χηλικοποιητή, Bp4eT (100%).

Παρασκευή

59Fe

2-τρανσφερίνης

Ανθρώπινο τρανσφερίνης (Sigma) επισημάνθηκε με

56Fe ή

59Fe (PerkinElmer, Massachusetts, USA) για την παραγωγή

56Fe

2-τρανσφερίνης ή

59Fe

2-τρανσφερίνης (

59Fe

2-Tf), αντίστοιχα, με μία τελική ειδική δραστικότητα 500 pCi /pmol Fe, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24,25]. Χωρίς περιορισμούς

59Fe απομακρύνθηκε με εξαντλητική διαπίδυση έναντι κενού μεγάλη περίσσεια 0,15 Μ NaCl ρυθμισμένο σε ρΗ 7,4 με 1,4% NaHCO

3 με πρότυπες μεθόδους [24,25].

Η επίδραση του Bp4eT και οι μεταβολίτες της για την κινητοποίηση κυτταρική

59Fe.

για να εξεταστεί η ικανότητα των μελετηθεί ενώσεων να κινητοποιήσει κυτταρικό

59Fe από κύτταρα MCF-7, πειράματα εκροή σιδήρου διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας καθιερωμένες τεχνικές [21,22] . Εν συντομία, μετά συρρέουσες προ-επισήμανση MCF-7 κύτταρα σε πλάκες 6 φρεατίων με 0,75 μΜ

59Fe

2-Tf για 3 ώρες /37 ° C, τα κύτταρα πλύθηκαν τέσσερις φορές με παγωμένο PBS και εν συνεχεία επωάζονται με 25 μΜ του Bp4eT ή των μεταβολιτών της για 3 ώρες /37 ° C. Το μέσο που περιέχει υπερκείμενη κυκλοφόρησε

59Fe ακολούθως μεταγγίστηκε από τα κύτταρα. Η ραδιενέργεια μετρήθηκε σε αμφότερα τα κύτταρα και το υπερκείμενο χρησιμοποιώντας έναν μετρητή γ-σπινθηρισμού (Wallac Οδηγός 3, Turku, Φιλανδία).

Επίδραση των υπό μελέτη παραγόντων σχετικά με την πρόληψη της κυτταρικής πρόσληψης

59Fe από

59Fe

2-τρανσφερίνης.

Η ικανότητα των χηλικοποιητών για την πρόληψη της κυτταρικής πρόσληψης

59Fe από

59Fe

2-τρανσφερίνης εξετάστηκε χρησιμοποιώντας πρότυπες τεχνικές [26,27]. Εν συντομία, συρρέοντα MCF-7 κύτταρα σε πλάκες 6 φρεατίων επωάστηκαν με 0,75 μΜ

59Fe

2-Tf για 3 ώρες /37 ° C υπό την παρουσία Bp4eT ή των μεταβολιτών της (25 μΜ). Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν τέσσερις φορές με παγωμένο PBS και το επίπεδο της εσωτερικεύονται

59Fe προσδιορίστηκε με επώαση του μονοστιβάδα κυττάρων επί 30 λεπτά /4 ° C με τη γενική πρωτεάση, προνάση (1 mg /mL? Sigma-Aldrich ). Τα κύτταρα στη συνέχεια απομακρύνθηκαν από το μονοστιβάδα με μια πλαστική σπάτουλα πάνω σε πάγο και φυγοκεντρήθηκαν επί 1 λεπτό /12,000 χ

g

/4 ° C. Το υπερκείμενο αποτελεί δεσμευμένη σε μεμβράνη, προνάση ευαίσθητα

59Fe που κυκλοφόρησε από την πρωτεάση, ενώ η προνάση-αναίσθητη κλάσμα αντιπροσωπεύει εσωτερικεύεται

59Fe [21,26,27]. Το ποσό της εσωτερικεύεται

59Fe εκφράστηκε ως ποσοστό

59Fe εσωτερικεύεται από (μη επεξεργασμένα) κύτταρα ελέγχου.

οξείδωση Ασκορβικό δοκιμασία

Ο προσδιορισμός της οξείδωσης ασκορβικό χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η δραστικότητα οξειδοαναγωγής των συμπλοκών σιδήρου των χηλικοποιητών χρησιμοποιώντας ένα καθιερωμένο πρωτόκολλο [26,28]. Εν συντομία, 100 μΜ ασκορβικό οξύ παρασκευάστηκε αμέσως πριν από το πείραμα και επωάζονται είτε μόνο του ή σε παρουσία 10 μΜ FeCl

3 σε μια 50-πλάσια μοριακή περίσσεια (500 μΜ) του κιτρικού και των χηλικοποιητών. Οι χηλικοί παράγοντες δοκιμάστηκαν σε ισοδύναμα δέσμευσης σιδήρου (ΙΒΕ) 0.1 (περίσσεια του σιδήρου), 1 (πλήρως συντονισμένη σύμπλοκα σιδήρου-χηλικοποιητή) και 3 (περίσσεια ελεύθερου χηλικού παράγοντα). Η ελάττωση της απορρόφησης στα λ = 265 nm μετρήθηκε μετά από 10 και 40 λεπτά επώασης σε θερμοκρασία δωματίου χρησιμοποιώντας τον αναγνώστη πλάκας Tecan άπειρη 200M. Η μείωση της απορρόφησης μεταξύ των δύο χρονικών σημείων υπολογίστηκε και εκφράστηκε ως ποσοστό του ελέγχου χωρίς τον παράγοντα χηλίωσης.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Για να εξεταστεί η επίδραση των παραγόντων επί του κυτταρικού κύκλου, MCF -7 κύτταρα σπάρθηκαν σε 60 mm τρυβλία Petri σε πυκνότητα 240.000 κύτταρα /τρυβλίο και επωάστηκαν με Bp4eT ή των μεταβολιτών της για 72 h /37 ° C. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν, στερεωμένο με αιθανόλη και χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) για 30 λεπτά /37 ° C, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29]. Τα κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ροή Accuri C6 κυτταρόμετρο (Becton Dickinson and Company, San Jose, CA USA). ιωδιούχου προπιδίου ενθουσιασμένοι με λ

ex = 488 nm και φθορισμού αναλύθηκαν σε λ

em = 585 nm (FL-2) με συνολικά 10.000 συμβάντα που συλλέγονται ανά ανάλυση.

αξιολογήσεων μικροσκόπιο φθορισμού

δείκτες που χρησιμοποιούνται για την εκτίμηση autophagy /απόπτωση /νέκρωση στα κύτταρα και οι μεταβολές του λυσοσωμικών και μιτοχονδριακής μορφολογίας MCF-7 παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Eclipse Ti ανεστραμμένο μικροσκόπιο επιφθορισμού (Nikon, Tokyo, Japan), που είναι εξοπλισμένα με ένα ψυχόμενο ψηφιακό φωτογραφική μηχανή ZYLA 5.5 sCMOS (Andor Τεχνολογίας, Μπέλφαστ, Ηνωμένο Βασίλειο), και τα ΝΑΚ-Στοιχεία C 4.1 του λογισμικού (Laboratory Imaging, Πράγα, Τσεχική Δημοκρατία). Τα κύτταρα MCF-7 εμβολιάστηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων με καλυπτρίδες στον πυθμένα σε πυκνότητα 150.000 κύτταρα /φρεάτιο και επωάστηκαν όπως περιγράφεται ανωτέρω, παρουσία ή απουσία 10 ή 100 ηΜ Bp4eT.

Για αξιολογούν το μηχανισμό κυτταρικού θανάτου μετά από επώαση με Bp4eT, τριπλή χρώση με monodansyl καδαβερίνη (MDC? 50 μΜ? λ

ex = 390 nm? λ

em = 455 nm? Sigma-Aldrich), αννεξίνη V-FITC ( 5 μL /mL? λ

ex = 495 nm? λ

em = 519 nm? Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), και ιωδιούχο προπίδιο (5 μg /mL? λ

ex = 560 nm? λ

em = 630 nm) χρησιμοποιήθηκε. MDC είναι ένας δείκτης της αυτοφαγοσώματα και λυσοσώματα και τα αποτελέσματα σε μπλε φθορισμό [30,31]. Ως θετικός έλεγχος για αυτοφαγία, κύτταρα MCF-7 επωάστηκαν με 1 ηΜ ραπαμυκίνη (Sigma-Aldrich) για 30 λεπτά /37 ° C, η οποία είναι μια καθιερωμένη επαγωγέας autophagy [30]. Annexin V έχει υψηλή συγγένεια με φωσφατιδυλοσερίνη, το οποίο μετατοπίζεται προς την επιφάνεια και των δύο πρώιμου και όψιμου σταδίου αποπτωτικά κύτταρα [32,33]. Έτσι, αννεξίνη V-FITC χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης της απόπτωσης όταν τα αποπτωτικά κύτταρα είχαν πράσινη φθορίζουσα κυτταροπλασματικές μεμβράνες. ιωδιούχο προπίδιο είναι ένα νεκρωτικό δείκτη, ή ένας δείκτης προχωρημένο στάδιο απόπτωσης, καθώς δεν διεισδύει στα κύτταρα με ανέπαφη κυτταροπλασματικές μεμβράνες [34]. Τα κύτταρα επωάστηκαν με αυτούς τους ανιχνευτές για 10 λεπτά /37 ° C, πλύθηκαν με φρέσκο ​​μέσο καλλιέργειας και τις εικόνες που συλλαμβάνονται χρησιμοποιώντας το μικροσκόπιο που περιγράφονται παραπάνω.

Για να προσδιοριστεί η επίδραση της Bp4eT στη μιτοχονδριακή μορφολογία, τα κύτταρα επωάστηκαν με Mitotracker

® Πράσινη FM (0.25 μΜ? λ

ex = 490 nm? λ

em = 516 nm? Molecular Probes) για 10 λεπτά /37 ° C. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλένονται με φρέσκο ​​μέσο και οι εικόνες συλλαμβάνονται χρησιμοποιώντας το μικροσκόπιο που περιγράφεται παραπάνω.

Western ανάλυση κηλίδος

καθιερωμένα πρωτόκολλα χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή κυτταρολύματα και εκτελέσει την ανάλυση ανοσοστυπώματος [35]. Πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιούνται περιλαμβάνουν: LC3 κουνέλι (Cat #: MBPM036? 1:. 2.000) από Abacus (Brisbane, Αυστραλία) και το ποντίκι β-ακτίνης από Sigma-Aldrich (Cat #:: A1978, 1 10,000.). Τα ακόλουθα δευτερογενή αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν: υπεροξειδάση αρμορακίας (HRP) αντι-κουνελιού (Cat #:. A6154, 1: 1,0000) και αντι-ποντικού (Κατ. #: A4416, 1: 10.000) αντισώματα από τη Sigma-Aldrich . Για να εξασφαλιστεί η ίση φόρτωση πρωτεϊνών, οι μεμβράνες ανιχνεύτηκαν για β-ακτίνη.

αξιολογήσεων δραστηριότητα Κασπάσης

Για να αξιολογηθεί η επίδραση των ενώσεων επί της δραστικότητας της κασπάσης, τα κύτταρα MCF-7 επωάστηκαν με 100 ηΜ Bp4eT ή των μεταβολιτών της για 3, 24 ή 72 ώρες /37 ° C σε πλάκες 96 φρεατίων, όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα κύτταρα στη συνέχεια λύθηκαν με την προσθήκη 100 μL ψυχρού ρυθμιστικού λύσης (100 mM HEPES, 10 mM CHAPS, 10 mM D-L-διθειοθρεϊτόλη, ρΗ 7.4) σε 100 μL μέσου σε κάθε φρεάτιο. Τα υλικά λύσεως καταψύχθηκαν αμέσως στους -80 ° C. Τα αποψυγμένα προϊόντα λύσης χρησιμοποιήθηκαν για να εκτιμηθεί η δραστικότητα της κασπάσης με τη χρήση κιτ φωταύγειας για κασπάσες 3/7, 8 και 9 (Promega, Madison, WI, USA). Η φωταύγεια μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τον αναγνώστη πλάκας Tecan Άπειρο 200M. δραστηριότητα κασπάσης στις πειραματικές ομάδες διορθώθηκε σύμφωνα με την κυτταρική βιωσιμότητα της κάθε ομάδας και εκφράζεται ως ποσοστό της δραστηριότητας του μη επεξεργασμένου ελέγχου (100%).

Ανάλυση δεδομένων και στατιστική

SigmaStat για παράθυρα 3.5 (Systat Software, San Jose, CA, USA) πακέτο στατιστικού λογισμικού χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των αποτελεσμάτων. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD ενός δεδομένου αριθμού πειραμάτων. Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μια μονόδρομη ANOVA με Bonferroni

post-hoc

δοκιμής ή του Student

t-test

. Τα αποτελέσματα θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές όταν

σ

& lt? 0.05. Τα IC

50 τιμές υπολογίστηκαν με τη χρήση CalcuSyn λογισμικού 2.0 (Biosoft, Cambridge, UK). Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας multicycle AV Software (Systems Flow Phoenix, San Diego, CA, USA).

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Bp4eT μεταβολίζεται σε ενώσεις με τουλάχιστον 300 φορές μείωση σε κυτταροτοξικότητα έναντι τόσο του καρκίνου και μη καρκινικών κυττάρων

Η κυτταροτοξική δραστικότητα του Bp4eT συγκρίθηκε με Bp4eA (που χρησιμοποιείται ως ένα μίγμα

E

και

Z

ισομερή) και Bp4eS (σε δύο ισομερείς μορφές:

E-

Bp4eS και

Ζ-

Bp4eS). Η

E

και

Ζ

ισομερή Bp4eS εξετάστηκαν χωριστά, όπως ήταν και οι δύο ανιχνευθεί

in vivo

σε προηγούμενες μελέτες [18], και ως εκ τούτου, είναι βιολογικά σημαντική. Ωστόσο, αυτά τα δύο ισομερή δεν είναι αλληλομετατρέψιμα και είναι ξεχωριστές ενώσεις οι οποίες μπορούν να απομονωθούν και να αναλυθούν [18]. Σε αντίθεση, Bp4eA αλληλομετατρέπει εύκολα μεταξύ του

E

και

Z

ισομερείς μέλη [18], και λόγω αυτής της εγγενούς φυσική ιδιότητα, μόνο το μίγμα αυτών των ισομερών μπορεί να αξιολογηθεί. Σε αυτές τις μελέτες, τα αποτελέσματα των παραγόντων σε καρκινικά κύτταρα μελετήθηκαν χρησιμοποιώντας ανθρώπινα HL-60 προμυελοκυτταρικής λευχαιμίας, MCF-7 ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα μαστού, ανθρώπινου καρκινώματος HCT116 ορθοκολικού και ανθρώπινες κυτταρικές σειρές πνεύμονα αδενοκαρκίνωμα Α549, καθώς και δύο μη-καρκινικές κύτταρο- τύπους, δηλαδή αρουραίου H9c2 cardiomyoblasts, και 3Τ3 ινοβλάστες ποντικού.

Μετά από 72 ώρες επώασης, η μητρική ένωση, Bp4eT, έδειξε πολύ ισχυρή κυτταροτοξική δράση έναντι HL-60, MCF-7 και HCT116 κύτταρα, όπου το IC

50 τιμές κυμαίνονταν από 3 έως 15 ηΜ (Πίνακας 1 και το Σχήμα 2Α). Η αντικαρκινική δράση των Bp4eT προς αυτές τις κυτταρικές σειρές ήταν σημαντικά μεγαλύτερη από εκείνη των κλινικώς χρησιμοποιούνται χηλικοποιητές, δεφεροξαμίνη ή deferasirox, τα οποία έχουν IC

50 τιμές στο εύρος μΜ έναντι καρκινικών κυττάρων [9,36,37,38] . Το IC

50 αξία των Bp4eT εναντίον κυττάρων Α549 ήταν μέτρια (IC

50 = 0.593 ± 0.148 μΜ) και ήταν συγκρίσιμες με τις κυτταροτοξικές επιδράσεις της Bp4eT κατά H9c2 cardiomyoblasts (IC

50 = 0,524 ± 0,157 μΜ? Τραπέζι 1). Το IC

50 αξία του Bp4eT έναντι 3Τ3 ινοβλάστες (IC

50 = 1.309 ± 0.337 μΜ? Πίνακας 1) ήταν δύο φορές μεγαλύτερη από αυτή που παρατηρήθηκε με κύτταρα H9c2. Στην πραγματικότητα, 3Τ3 ινοβλάστες ήταν το πιο ανθεκτικό από όλα τα κυτταρικών τύπων για κάθε παράγοντα που εξετάστηκαν. Επιπλέον, η κυτταροτοξικότητα των Bp4eT έναντι 3Τ3 ινοβλάστες ήταν παρόμοια με αυτή που παρατηρήθηκε προηγουμένως έναντι ανθρώπινου MRC-5 κύτταρα ινοβλαστών, με IC

50 τιμές που κυμαίνονται από 0,7 έως & gt?. 6 μΜ [9,10,39]

Για τον προσδιορισμό της αντι-πολλαπλασιαστική δραστηριότητα, τις καρκινικές κυτταρικές γραμμές (

i

.

e

., HL-60, MCF-7, HCT116 και Α549) και μη -cancer κυτταρικές γραμμές (

i

.

e

., H9c2 και 3Τ3) επωάστηκαν με τους παράγοντες επί 72 ώρες /37 ° C και ο πολλαπλασιασμός συνέχεια αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ. Τα αποτελέσματα είναι μέσες ± SD (

n ≥

4 πειράματα).

Η

Ο θεραπευτικός δείκτης υπολογίστηκε με διαίρεση της IC

50 σε φυσιολογικά κύτταρα από το IC

50 ελήφθη σε νεοπλασματικά κύτταρα και αυτός ο δείκτης λειτούργησε ως μέτρο της επιλεκτικότητας του παράγοντα προς τα καρκινικά κύτταρα (Πίνακας 2). Σημαντικά, οι θεραπευτικοί δείκτες Bp4eT προς HL-60, MCF-7 και κύτταρα καρκίνου HCT116 ήταν υψηλές (34,9 έως 436,3? Πίνακας 2), υποδεικνύοντας την επιλεκτικότητα των Bp4eT έναντι αυτών του καρκίνου-τύπους. Αυτό είναι σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες που αποδεικνύουν την ισχυρή και επιλεκτική αντι-νεοπλασματική δράση του Bp4eT [9,40]. Όπως περιγράφεται παραπάνω, η επιλεκτικότητα του Bp4eT έναντι κυττάρων Α549 ήταν χαμηλή, με αποτέλεσμα θεραπευτικούς δείκτες του 0,9 έως 2,2 (Πίνακας 2).

Η

Οι μεταβολίτες Bp4eT επέδειξε αξιοσημείωτη μείωση στην κυτταροτοξικότητα εναντίον τόσο του καρκίνου και μη -cancerous κυτταρικές σειρές (Πίνακας 1 και Σχήμα 2) και IC

50 τιμές τους ήταν & gt? 300 φορές υψηλότερη σε σχέση με το μητρικό παράγοντα. Η αμιδραζόνη, Bp4eA, το οποίο αναγνωρίσθηκε ως ο κύριος μεταβολίτης της Bp4eT [18], ήταν γενικά πιο κυτταροτοξική κατά των καρκινικών κυττάρων (με την εξαίρεση των κυττάρων HCT116) από την μεταβολίτη ημικαρβαζόνης, Bp4eS. Τα IC

50 τιμές του Bp4eA εναντίον καρκινικών κυττάρων κυμαινόταν από 52 να 207 μΜ (Πίνακας 1). Επιπλέον, η κυτταροτοξικότητα των Bp4eA έναντι μη καρκινικών κυττάρων ήταν χαμηλότερο σε σύγκριση με τα καρκινικά κύτταρα που εξετάστηκαν, με IC

50 τιμές των 416,1 ± 122,1 μΜ και 1027,4 ± 203,9 μΜ για H9c2 και 3Τ3 κύτταρα, αντίστοιχα. Αυτό αντικατοπτρίζεται και στις θεραπευτικές δείκτες Bp4eA, η οποία κυμάνθηκε 2,0 έως 19,7 (Πίνακας 2). Σημαντικά, οι τοξικές συγκεντρώσεις Bp4eA έναντι φυσιολογικά κύτταρα δεν επιτεύχθηκαν στο πλάσμα κατά τη διάρκεια προηγούμενων φαρμακοκινητική μελέτη μας, όπου η υψηλότερη συγκέντρωση του Bp4eA επιτεύχθηκε ήταν & lt? 1 μΜ μετά από 300 λεπτά μετά το

i

.

ν

. χορήγηση Bp4eT [18]. Αυτό υποδηλώνει σαφώς ότι τα επίπεδα Bp4eA στο πλάσμα ήταν σε μη τοξικές συγκεντρώσεις.

Τόσο η μη ενδομετατρέψιμα

E

και

Ζ

ισομερή του μεταβολίτη Bp4eS είχαν προηγουμένως εντοπιστεί σε χαμηλές συγκεντρώσεις (& lt? 0,02 μΜ) στο πλάσμα [18]. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι Bp4eS γενικά είχαν φτωχότερες αντι-πολλαπλασιαστική δραστικότητα από Bp4eA (Πίνακας 1 και Σχήμα 2), με IC

50 τιμές που κυμαίνονται μεταξύ 46 να 536 μΜ σε καρκινικά κύτταρα και 343 μΜ και & gt? 1 mM σε μη καρκινικά H9c2 και 3Τ3 κύτταρα, αντίστοιχα. Παραδόξως, κάθε κυτταρική σειρά έδειξαν διαφορετική ευαισθησία στο

E

και

Ζ

ισομερή Bp4eS. Αν και HL-60 και H9c2 κυττάρων ήταν σημαντικά (

σ

& lt? 0.001) πιο ευαίσθητα στην

Ζ

ισομερές, HCT116 και Α549 κύτταρα ήταν σημαντικά (

σ

& lt? 0,01) πιο ευαίσθητα στην

E

ισομερές του Bp4eS (Πίνακας 1). Σε αντίθεση, τα κύτταρα MCF-7 ήταν περίπου εξίσου ευαίσθητες τόσο στο

E

και

Z

ισομερή Bp4eS (Πίνακας 1). Σε σχέση με Bp4eT, οι θεραπευτικές δείκτες του

E

και

Ζ

ισομερή Bp4eS ήταν γενικά χαμηλή, ιδιαίτερα ενάντια σε κύτταρα H9c2 και κυμάνθηκε από 0,6 έως & gt? 21.6 (Πίνακας 2). Καθώς το

E

και

Z

ισομερή Bp4eS ανιχνεύθηκαν μόνο σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις στο πλάσμα [18], και δεδομένου ότι τα κυτταροτοξικά αποτελέσματά τους συμβαίνουν μόνο σε υψηλές συγκεντρώσεις, μπορεί να προταθεί ότι Bp4eS θα παρουσιάζουν χαμηλά αντι-πολλαπλασιαστική δραστικότητα κατά των καρκινικών κυττάρων και τοξικότητα σε φυσιολογικά κύτταρα

in vivo

.

Η ικανότητα των Bp4eT μεταβολιτών χηλικού άλατος σιδήρου από την ασταθή πισίνα σιδήρου, να κινητοποιήσει κυτταρικό

59Fe και την πρόληψη των κυτταρικών

πρόσληψη 59Fe από

59Fe

2-τρανσφερίνης είναι αμελητέα σε σύγκριση με Bp4eT

Η ικανότητα της Bp4eT και των μεταβολιτών της να χηλικού άλατος σιδήρου από το χείλος σε κύτταρα MCF-7 ερευνήθηκε σε αυτή τη μελέτη χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό καλσεΐνης-ΑΜ, ως αποσιδήρωσης και εξάντληση πιστεύεται ότι παίζουν ένα ρόλο στην αντικαρκινική δράση των θειοσεμικαρβαζονών [3,9]. Η μητρική ένωση, Bp4eT (10 μΜ), έδειξε μια εξαρτώμενη από το χρόνο αύξηση του φθορισμού, λόγω της ικανότητας του να Bp4eT χήλωση σιδήρου από calcein-ΑΜ σε MCF-7 κύτταρα (σχήμα 3Α). Αντιθέτως, η προσθήκη των μεταβολιτών Bp4eT είχε σχεδόν καμία επίδραση στην καλσεΐνη-ΑΜ φθορισμού (Σχήμα 3Α). Όταν εκφράζεται ως ποσοστό του φθορισμού Bp4eT σε

t

= 600 s, ο μεταβολίτης, Bp4eA, έδειξε μόνο 5.9% της αποτελεσματικότητας αποσιδήρωσης του Bp4eT, ενώ και τα δύο ισομερή του Bp4eS κατέδειξε ≤1.0% του φθορισμού του Bp4eT (Σχήμα 3Β).

Η αποτελεσματικότητα του Bp4eT ή των μεταβολιτών της να χηλικού άλατος σιδήρου από το χείλος των κυττάρων MCF-7 μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό καλσεΐνης-ΑΜ. (Α) Ο φθορισμός του ελεύθερου calcein μετά την προσθήκη 10 μΜ Bp4eT ή των μεταβολιτών της για 10 λεπτά /37 ° C. (Β) ένταση φθορισμού της ελεύθερης καλσεϊνης παρουσία μεταβολιτών σε

t

= 600 s εκφράστηκε ως ποσοστό του φθορισμού του ελεύθερου calcein παρουσία Bp4eT. Τα αποτελέσματα του (Α) και (Β) είναι μέσες ± SD (

n

= 6 πειράματα). Η στατιστική σημαντικότητα (ANOVA): ***

σ

& lt? 0,001 σε σύγκριση με Bp4eT. (Γ) εκροής του

59Fe διαμεσολαβείται από μέσο ελέγχου ή μέσο που περιέχει τους παράγοντες (25 μΜ) μετά από επώαση 3 ώρες /37 ° C των κυττάρων MCF-7 με προεπισημαίνονται

59Fe-τρανσφερίνης. (Δ) Η πρόσληψη

59Fe από

59Fe

2-τρανσφερίνης από κύτταρα MCF-7 με την παρουσία του μέσου ελέγχου ή μέσο που περιέχει τους παράγοντες (25 μΜ) προσδιορίσθηκαν μετά από 3 ώρες /37 ° C επώαση. Τα αποτελέσματα του (Γ) και (Δ) είναι μέσες ± SD (

n ≥

3 πειράματα). Η στατιστική σημαντικότητα (ANOVA): ***

σ

& lt? 0,001 σε σύγκριση με το (μη επεξεργασμένα) ομάδα ελέγχου. (Ε) Η δοκιμασία οξείδωσης ασκορβικό χρησιμοποιήθηκε για την εξέταση του σχηματισμού οξειδοαναγωγικά δραστικά σύμπλοκα. Bp4eT και οι μεταβολίτες του ανιχνεύθηκαν σε ισοδύναμα δέσμευσης σιδήρου (ΙΒΕ) 0.1 (περίσσεια σιδήρου στο χηλικοποιητή)? 1 (πλήρως ολοκληρωμένο κέλυφος συντονισμού)? και 3 (περίσσεια χηλικοποιητή να διευθετήσουν). Οι χηλικοποιητές, DFO και EDTA, χρησιμοποιήθηκαν ως αντι-οξειδωτικό ή προ-οξειδωτική τους ελέγχους, αντίστοιχα. Τα δεδομένα εκφράζονται ως ποσοστό της ομάδας ελέγχου χωρίς χηλικοποιητή στο ίδιο IBE (100%). Τα αποτελέσματα του (Ε) είναι μέσες ± SD (

n ≥

3) πειράματα. Η στατιστική σημαντικότητα (ANOVA): ***

σ

& lt? 0,001 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (σίδηρος με ασκορβικό) στην ίδια IBE. κύτταρα (F) MCF-7 επωάστηκαν για 72 h /37 ° C με 100 ηΜ Bp4eT ή των μεταβολιτών της, Bp4eA και Bp4eS. Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου σε επεξεργασία με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας ιωδιούχο προπίδιο. ποσοτικοποίηση Φάση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας multicycle Software AV. Τα αποτελέσματα (F) είναι μέση τιμή ± SD (

ν

≥ 3 πειράματα). Η στατιστική σημαντικότητα (ANOVA): *

σ

& lt? 0.05, **

σ

& lt? 0,01, ***

σ

& lt? 0,001 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου.

Η

Επιπλέον, Bp4eT κατέδειξε υψηλό

59Fe αποτελεσματικότητα κινητοποίηση και ήταν σε θέση να μεσολαβήσει την απελευθέρωση 46,4% της συνολικής κυτταρικής

59Fe (Σχήμα 3C). Κανένα από τα μεταβολιτών Bp4eT οδήγησε σε σημαντική απελευθέρωση των κυτταρικών

59Fe και ήταν συγκρίσιμα με τον μη επεξεργασμένο μάρτυρα (3,5% του συνόλου των

59Fe? Σχήμα 3C).

Η ικανότητα των Bp4eT και των μεταβολιτών της για την πρόληψη της κυτταρικής πρόσληψης του

59Fe από

59Fe

2-τρανσφερίνης μετά από 3 ώρες /37 ° C επώαση εξετάσθηκε επίσης σε κύτταρα MCF-7. Είναι σημαντικό, η μητρική χηλικού παράγοντα, Bp4eT, κατέδειξαν υψηλή αποτελεσματικότητα αποσιδήρωσης

59Fe και ανέστειλε την εσωτερικευμένη πρόσληψη

59Fe στο 11,5% του ελέγχου (Σχήμα 3D). Όπως παρατηρείται στην

δοκιμασία εκροής 59Fe, τόσο Bp4eA και Bp4eS έδειξε κακή αποτελεσματικότητα αποσιδήρωσης

59Fe και την ικανότητά τους να αναστέλλουν

πρόσληψη 59Fe ήταν συγκρίσιμο με το μη επεξεργασμένο μάρτυρα (Εικόνα 3D).