Αφηρημένο

Ιστορικό

Η ενεργοποίηση αυτοφαγία έχει περιγραφεί εκτενώς ως στρατηγική προ-επιβίωσης, το οποίο βοηθά να κρατήσει τα κύτταρα ζωντανά μετά από στέρηση θρεπτικών ουσιών /αυξητικών παραγόντων και άλλων αγχωτικές κυτταρικές συνθήκες . Εκτός από κυτταροπροστατευτικές επιδράσεις, αυτοφαγία μπορεί να συνοδεύει τον κυτταρικό θάνατο. κενοτόπια αυτοφαγικά μπορεί να παρατηρηθεί πριν ή κατά τη διάρκεια του κυτταρικού θανάτου, αλλά ο ρόλος της αυτοφαγία στη διαδικασία του θανάτου είναι ακόμα αμφιλεγόμενη. Μια σύνθετη αλληλεπίδραση μεταξύ αυτοφαγία και την απόπτωση έχει έρθει στο φως, λαμβάνοντας υπόψη ότι οι πολυάριθμες γονίδια, όπως το ρ53 και Bcl-2 μέλη της οικογένειας, κοινή μεταξύ αυτών των δύο οδών.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

σε αυτή τη μελέτη έδειξε ισχυρή και αμετάκλητη κυτταροτοξική δραστικότητα του σταθερού παραγώγου κουρκουμίνη

δις

-DeHydroxyCurcumin (bDHC) σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα κόλου, αλλά όχι σε ανθρώπινα κανονικά κύτταρα. Αυτοφαγία είναι προκαλείται από bDHC πριν κυτταρικό θάνατο, όπως αποδεικνύεται από αυξημένο σχηματισμό autophagosome -μετρημένες με ηλεκτρονική μικροσκοπία φθορισμού puncta LC3 και LC3 lipidation- και αυτοφαγικά ροή -μετρημένες παρεμβαίνοντας κύκλου εργασιών LC3-II. Η συσσώρευση των πολυ-ουβικουιτινωμένης πρωτεΐνες και ER-στρες συνέβη ανάντη της επαγωγής αυτοφαγία και οδήγησε σε κυτταρικό θάνατο. κυτταρικού κύκλου και αναλύσεις κηλίδος Western κατέδειξε την ενεργοποίηση ενός μιτοχονδριακού εξαρτώμενη απόπτωση, η οποία περιλαμβάνει κασπάσης 7, 8, 9 και απελευθέρωση του κυτοχρώματος C. Χρησιμοποιώντας φαρμακολογικές αναστολές και πειραμάτων RNAi, δείξαμε ότι ER-στρες που προκαλείται από αυτοφαγία έχει ένα σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση bDHC-κυτταρικό θάνατο.

Συμπέρασμα /Σημασία

Τα ευρήματά μας περιγράψει τον μηχανισμό μέσω του οποίου bDHC προωθεί όγκου επιλεκτική αναστολή του πολλαπλασιασμού, παρέχοντας αδιαμφισβήτητη απόδειξη του ρόλου της αυτοφαγία σε αντίθεση τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Basile V, Belluti S, Ferrari Ε, Gozzoli C, Ganassi S, Quaglino D, et al. (2013) δις-αφυδροξυ-κουρκουμίνη εναύσματα μιτοχονδριακού-Associated κυτταρικού θανάτου σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου μέσω της ER-στρες που προκαλείται Autophagy. PLoS ONE 8 (1): e53664. doi: 10.1371 /journal.pone.0053664

Επιμέλεια: Regine Schneider-Stock, Ινστιτούτο Παθολογίας, Γερμανία

Ελήφθη: 12, Ιουνίου, 2012? Αποδεκτές: 3 Δεκ 2012? Δημοσιεύθηκε: 11 Ιανουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Basile et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro-MFAG (αριθμός επιχορήγηση 6192 έως CI) και Fondazione Cassa di Risparmio di Vignola με CI και EF. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η απόπτωση, γνωστή και ως θάνατος τύπου Ι των κυττάρων, είναι το καλύτερο που περιγράφεται μηχανισμός κυτταρικού θανάτου και μορφολογικά χαρακτηρίζεται από συρρίκνωση κυττάρων, διόγκωση μεμβράνης, πυρηνική συμπύκνωση, και σχηματισμό αποπτωτικών σωμάτων [1]. Μια ενεργειακά εξαρτώμενη καταρράκτη μοριακών γεγονότων συντονίζει την αποπτωτική διαδικασία, η οποία μπορεί να διακριθεί σε δύο κύριες οδούς: την εξωγενή οδό του υποδοχέα θανάτου και την εγγενή μιτοχονδριακό μονοπάτι. Οι δύο οδοί φαίνεται να συνδέεται και να επηρεαστεί η μία την άλλη, και οι δύο προκαλούν την ενεργοποίηση των κασπασών 3, 6 και 7, οι πρωτεάσες στόχευση εκατό πρωτεΐνες και οδηγεί σε κυτταρικό κατεδάφιση [2].

Εκτός απόπτωση, autophagy υπήρξε περιγράφεται ως εναλλακτική λύση αυτοκαταστροφική κυτταρική διαδικασία. Αυτοφαγία έχει από καιρό γνωστό για την παροχή κυτταρική επιβίωση ακόλουθες θρεπτικές ουσίες /αυξητικούς παράγοντες στέρησης ή άλλες συνθήκες στρες, και μόλις πρόσφατα έχει συνδεθεί με κυτταρικό θάνατο. Επίσης γνωστό ως κυτταρικό θάνατο τύπου ΙΙ, η ενεργοποίηση αυτοφαγία χαρακτηρίζεται από την παρουσία αυτοφαγικά κενοτοπίων στο κυτταρόπλασμα, και η διεύρυνση του ενδοπλασματικού δικτύου (ER) και της συσκευής Golgi [3]. Double-membraned κυστίδια αυτοφαγικά ενθυλακώνουν κυτταρόπλασμα και οργανιδίων και, μετά τη σύντηξη τους με λυσοσώματα, autophagolysosomes υποβαθμίσει το περιεχόμενό τους [4]. Το κλασικό μονοπάτι αυτοφαγία ενεργεί κατάντη του mTOR (στόχος της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά) κινάσης. Όταν αυτή η κινάση Ser /Thr συνδέεται σε σύμπλεγμα πρωτεΐνης mTORC1, είναι σε θέση να καταστείλει την αυτοφαγικά μηχανημάτων. Οι 16 αυτοφαγία σχετίζονται πρωτεΐνες (ATG) έχουν περιγραφεί να συμμετέχει στην αυτοφαγία οδό [5], και η πλειοψηφία τους παίζουν ρόλο στην περίπλοκη διαδικασία του σχηματισμού και της ανάπτυξης διπλό membraned κυστίδια, κατάντη της mTORC1 [6]. Αν και η αναστολή της οδού mTORC1 είναι το πιο γνωστό μηχανισμό μέσω του οποίου επάγεται αυτοφαγία, πολλές άλλες καταρράκτες σηματοδότησης και μεταγραφικά γεγονότα μπορούν να συμμετέχουν στην ενεργοποίηση της διαδικασίας αυτοφαγικά. Συγκεκριμένα, διάφορες κινάσες ελέγχουν διάφορα στάδια αυτής της καταβολικές διαδικασία, όπως AMP-ενεργοποιημένη πρωτεϊνική κινάση, Akt, που ενεργοποιείται από μιτογόνο πρωτεΐνη κινάση (ERK, ρ38 και ΙΝΚ) και πρωτεϊνική κινάση C [7].

Η ρόλος της αυτοφαγία στο κελί επιβίωσης και όχι θάνατο των κυττάρων εξαρτάται από την κυτταρική και το πλαίσιο των ιστών, καθώς και σχετικά με τη φύση του ερεθίσματος άγχους [8]

αποπτωτικών και αυτοφαγικά κυτταρικός θάνατος δεν είναι αμοιβαία αποκλειστικές οδούς:. μπορούν επάγουν κυτταρικό θάνατο ταυτοχρόνως και συνεργατικά (για μια επισκόπηση βλέπε [9]). Οι αυτοφαγικά μορφολογίες των κυττάρων που παρατηρείται λίγο πριν ή κατά τη διάρκεια του κυτταρικού θανάτου? αν και, αν αυτοφαγία είναι ο μηχανισμός με τον οποίο τα κύτταρα στην πραγματικότητα πεθάνει και αν κυτταρικό θάνατο εκτελείται από αυτοφαγία ή με αυτοφαγία εξακολουθεί να συζητείται [10].

Η διάκριση μεταξύ αποπτωτικών και αυτοφαγικά κυτταρικού θανάτου είναι ακόμη πιο περίπλοκη από δύο σκέψεις: i) διαφόρων κυτταρικών καταπονήσεις ενεργοποιούν οδούς μεταγωγής σήματος μπορεί να προκαλέσει τόσο απόπτωση και αυτοφαγία και ii) πολλές πρωτεΐνες απαραίτητες για autophagy επίσης εμπλέκονται σε αποπτωτικό-κυτταρικό θάνατο, όπως ATG5, τον παράγοντα ρ53 μεταγραφής και τα μέλη της οικογένειας Bcl-2.

ρ53 είναι μια πολύ γνωστή oncosuppressor, ενεργοποιείται μετά από μια ποικιλία ερεθισμάτων στρες, και είναι υπεύθυνος για μεταγραφική ρύθμιση τόσο των θετικών και των αρνητικών αποπτωτικών γονιδίων. Ενώ οι προ-αποπτωτικά γονίδια, όπως Βαχ, Puma και Noxa τα πάνω ρυθμισμένα, τα αντι-αποπτωτικά αυτά, όπως Bcl-2α, τα κάτω ρυθμισμένα με πυρηνική ρ53. Επίσης κυτταροπλασματικά εντοπισμένη ρ53 έχει δειχθεί ότι είναι σημαντικά στον έλεγχο της αποπτωτικής απόκρισης, επάγοντας Bax ολιγομερισμό στα μιτοχόνδρια ή με την απελευθέρωση των προ-αποπτωτικών ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνες από αντι-αποπτωτική εταίρων τους Bcl-2 /Bcl-XL [11] .

Ο ρόλος της p53 στην καταστολή του όγκου έχει επίσης αποδοθεί στην δραστηριότητά της στη ρύθμιση αυτοφαγία. ρ53 διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της αυτοφαγία οδηγεί σε κυτταρικό θάνατο μέσω τρανσενεργοποίηση του autophagy επάγει πρωτεΐνη DRAM και αδρανοποίηση της οδού mTOR [12], [13]. Σε αντίθεση, φαρμακολογική αναστολή και αδρανοποίηση του p53 προτείνουν μια αρνητική ρύθμιση της αυτοφαγία μέσω μηχανισμών της μεταγραφής ανεξάρτητη [14].

Εκτός από την p53, τα μέλη της οικογένειας Bcl-2 είναι κοινές παίκτες της απόπτωσης και αυτοφαγία. Είναι κεντρικής σημασίας για την ρύθμιση της εξωτερικής διαπερατότητας της μιτοχονδριακής μεμβράνης (ΜΜΡ), που είναι υπεύθυνος για την αποδέσμευση μέσα στο κυτταρόπλασμα των πρωτεϊνών που μεσολαβούν τον κυτταρικό θάνατο, όπως πρωτεΐνες Cytochrome C. Bcl-2 έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλουν autophagy με την διατάραξη της Bcl -2 /Bcl-XL-Beclin-1 σύμπλοκα [15]. Δεν είναι σαφές πώς οι πρωτεΐνες Bcl-2 συμμετέχουν στην αποπτωτική

έναντι

την αυτοφαγικά διαδικασία, αλλά οι δύο διαφορετικές λειτουργίες θα μπορούσε να προσδιοριστεί με τοπικές προσαρμογές πρωτεϊνών στα μιτοχόνδρια και όχι ER [16]. Σχετικά επίπεδα του Bcl-2 και Beclin-1 προέκυψε μεταξύ των πολλαπλών κυτταρικών παραγόντων που ελέγχουν εάν αυτοφαγία συμβάλλει στην αναστολή του καρκίνου ή της επιβίωσης (που επισκοπείται στο [17]).

Διάφορα φυσικά προϊόντα και τα φάρμακα είναι σε θέση να προκαλέσουν καρκίνο κύτταρο θάνατος μέσω της ενεργοποίησης των αυτοφαγία ή στοχεύοντας τα μονοπάτια της αυτοφαγία [18]. Tamoxifen, Imatinib, ρεσβερατρόλη και κουρκουμίνη είναι παραδείγματα των μορίων ασκούν κυτταροτοξική δράση τους έναντι καρκινικών κυττάρων

μέσω

επαγωγή αυτοφαγικά κυτταρικού θανάτου [17], [18].

Η κουρκουμίνη, το δραστικό συστατικό που βρέθηκαν στο ρίζωμα του

Curcuma longa

, έχει δείξει θεραπευτική δράση έναντι διαφόρων όγκων. Μπορεί να αναστέλλουν την κυτταρική επιβίωση έναρξη, την εξέλιξη και του όγκου [19]. Ειδικότερα, τα μοντέλα ποντικού και ανθρώπου κλινικών δοκιμών απέδειξαν χημειοπροληπτική το δυναμικό της για καρκίνο του παχέος εντέρου [19]. Σε ορθοκολικού καρκινώματος κυτταρικές γραμμές, κουρκουμίνη αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσω επαγωγής μιας G2 /M διακοπή του κυτταρικού κύκλου ή απόπτωση όταν χρησιμοποιούνται σε υψηλές δόσεις [20], [21]. Επιπλέον, η διαμόρφωση των οδών κυτταρικής αποπτωτικών με κουρκουμίνη έχει παρατηρηθεί πρόσφατα σε καρκινικά κύτταρα των ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου [22].

μελέτες μικροσυστοιχιών έδειξαν ότι η κουρκουμίνη-επαγόμενη απόπτωση ρυθμίζεται από πολλαπλές οδούς σηματοδότησης [23], [24]. Η κουρκουμίνη up-ρυθμίζει τις προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών (Βαχ, Bim, Bak, Puma και Noxa) και ρυθμίζει προς τα κάτω την αντι-αποπτωτική όνες (Bcl-2 και Bcl-XL) σε διάφορες καρκινικά κύτταρα, προκαλώντας την απελευθέρωση του κυτοχρώματος C και η ενεργοποίηση της κασπάσης 3 [24]. Στο ανθρώπινο μελάνωμα, HL-60 λευχαιμίας και γαστρικά κύτταρα, κουρκουμίνη ενεργοποιεί την απόπτωση μέσω του υποδοχέα Fas /κασπάσης 8 οδού [25], [26], [27]. Εκτός από την αποπτωτική δραστικότητα, κουρκουμίνη επάγει ER στρες σε διάφορα κύτταρα όγκου ανθρώπου, μεταξύ των οποίων τα κύτταρα λιποσάρκωμα [28], μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων [29] και τα κύτταρα λευχαιμίας [30].

Η διαδικασία autophagy παίρνει μέρος στις αντι-πολλαπλασιαστική και αποπτωτικά δραστηριότητες της κουρκουμίνης, τόσο

in vitro

και

in vivo

: σε καρκινικά κύτταρα και σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού, κουρκουμίνη και ο μεταβολίτης της τετραϋδροκουρκουμίνη αναστέλλει την ανάπτυξη των κακοήθων κυττάρων με την ενεργοποίηση αυτοφαγικά-κυτταρικό θάνατο

μέσω

Akt /mTOR /p70S6K σηματοδότησης και ERK1 /2 οδών [31], [32], [33]. Σε γλοιώματος έναρξη κύτταρα, διοίκηση κουρκουμίνη αποτελέσματα στην καταστολή των όγκων λόγω της αυτοφαγία που προκαλείται από γεγονότα διαφοροποίηση [34].

Παρά κουρκουμίνη αναστολή των βασικών μοριακών οδών της ογκογένεσης, κλινικών δοκιμών αποκάλυψε χαμηλή βιοδιαθεσιμότητα, περιορισμένη κατανομή στους ιστούς και την ταχεία μεταβολισμό [35]. 90% της κουρκουμίνης αποσυντίθεται γρήγορα σε ουδέτερα και βασικές συνθήκες μέσω οξείδωσης, αναγωγής, γλυκουρονιδίωση και θείωση [28], [29]. Για να ξεπεραστούν αυτοί οι περιορισμοί, έχουν φυσικά και συνθετικά ανάλογα έχουν συντεθεί, μεταξύ των οποίων

δις

-DeHydroxyCurcumin (bDHC) (Σχ. 1Α, αριστερό πάνελ). Κύτταρα χορήγηση bDHC για 72 ώρες σε συγκεντρώσεις IC50 οδήγησε σε ελαφρά μείωση του αντι-πολλαπλασιαστική δράση σε σύγκριση με κουρκουμίνη σε ανδρογόνο-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη από κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη και των οιστρογόνων εξαρτώμενη και ανεξάρτητη από τον καρκίνο του μαστού κυτταρικές γραμμές [36], [37].

Α. Αριστερό πλαίσιο: Δομή της bDHC. Δεξιό πλαίσιο: αποτέλεσμα δόσης-απόκρισης της bDHC στην κυτταρική βιωσιμότητα κατά 24 θεραπεία ώρας, σε σύγκριση με τον έλεγχο και τα κύτταρα DMSO-θεραπεία. Ανάλυση Β PI /FACS της προόδου του κυτταρικού κύκλου μετά DMSO, κουρκουμίνη (10 μΜ) και bDHC (30 μΜ) θεραπείες για 16 και 24 ώρες (αριστερά και δεξιά πάνελ, αντιστοίχως). Τα αναφερόμενα γεγονότα είναι μέσα δέκα ανεξάρτητων πειραμάτων (Α = SubG1, Β = G0 /G1, C = S, D = G2 /M). Γ PI /BrdU διδιάστατες αναλύσεις FACS των 16 και 24 ωρών θεραπείες με DMSO, κουρκουμίνη και bDHC. Η ανάλυση περιφραγμένη να αποκλείσει τον πληθυσμό SubG1. Δ Αριστερός πίνακας: Το ποσοστό των αννεξίνης V θετικών κυττάρων κατά την κατεργασία 24 ώρες με bDHC συγκρίνεται με DMSO-και τα κύτταρα κουρκουμίνη-θεραπεία. Τα δεδομένα είναι μέσοι τριών ανεξάρτητων πειραμάτων – /+ SD. Μεσαίο πάνελ: PI /μονοπαραμετρικές ανάλυση κυτταρικού κύκλου των bDHC-κατεργασμένων κυττάρων

έναντι

bDHC-κύτταρα κυκλοφόρησε για 24 ώρες σε φρέσκο ​​μέσο. Τα συμβάντα αναφέρονται ως μέσο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (Α = SubG1, Β = G0 /G1, C = S, D = G2 /M). Δεξιά πίνακα: επίπεδα έκφρασης γ-H2AX

έναντι

ακτίνης σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με bDHC για 24 ώρες

Η

Στην έκθεση αυτή, μελετήθηκε η ογκο-εκλεκτική ανασταλτική αποτελεσματικότητα της bDHC για το. πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων ορθοκολικών καρκινικών κυττάρων. Σε σύγκριση με κουρκουμίνη, bDHC είναι περισσότερο δραστικό στην επαγωγή μια μη αναστρέψιμη κυτταροτοξική επίδραση σε HCT116 κύτταρα και LOVO, αλλά όχι σε ανθρώπινα κανονικά κύτταρα.

Η συσσώρευση των πολυ-ουβικουιτινωμένης πρωτεΐνες και η επαγωγή της ER στρες είναι ανοδικά σήματα αυτοφαγία, το οποίο ενεργοποιεί το μιτοχονδριακό-εξαρτώμενη απόπτωση. Φαρμακολογικές και μεσολάβηση RNAi αναστολή της ER-στρες και autophagy τονίζει ότι autophagy ενισχύει την αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του bDHC. Οι μελέτες μας δείχνουν ότι bDHC δρα ως προ-αυτοφαγικά κυτταροτοξικών φαρμάκων, ξετυλίγοντας θεραπευτικές δυνατότητες του στην καταπολέμηση επιλεκτικά την ανάπτυξη του όγκου.

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων και τα ναρκωτικά

Ανθρώπινο του παχέος εντέρου HCT116 καρκινώματος, HCT116 /Ε6 και HCT116 Bax – /- ήταν γενναιόδωρα παρέχεται από Bert Vogelstein (Johns Hopkins University School of Medicine, Βαλτιμόρη, MD). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Iscove κατά Dulbecco (ΙΜϋΜ), συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS). Πρωτογενής ανθρώπινων ινοβλαστών (HF) αναπτύχθηκαν σε DMEM 10% FCS, με γλουταμίνη (2 mM) και Γενταμυκίνη (55 mg /L). Ηπατική εμβρυϊκά κύτταρα ανθρώπινου επιθηλιακά WRL68 και κυττάρων αδενοκαρκινώματος κόλου LOVO διατηρήθηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FCS. χρόνος διπλασιασμού έχει εκτιμηθεί ότι είναι 16 ώρες για τα HCT116 και τα καρκινικά κύτταρα LOVO, και 24 ώρες για το HF και WRL68 φυσιολογικά κύτταρα.

Η κουρκουμίνη [1,7-δις [3-μεθοξυ-4-υδροξυ-φαινυλ] επτα-1,6-διενο-3,5-διόνη] και bDHC [1,7-δις [3-μεθοξυ-φαινυλ] επτα-1,6-διενο-3,5-διόνη] συνετέθησαν όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [20 ]. Η καθαρότητα των ενώσεων που συντίθενται, προσδιορίζεται με τεχνικές NMR και ανάλυση καύσης, ήταν & gt? 98%. Η κουρκουμίνη και bDHC προστέθηκαν στο θερμό μέσο στα 10 μΜ και 30 μΜ συγκεντρώσεις, αντίστοιχα. C3-bDHC χορηγήθηκε σε κύτταρα σε 3 μΜ συγκέντρωση. κύτταρα HCT116 επωάστηκαν με Αδριαμυκίνη (1,3 μΜ) για 48 ώρες. Για φαρμακολογικές αναστολές, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προ-θεραπεία για 1 ώρα και στη συνέχεια συν-επωάζονται με bDHC για πρόσθετα 16 ή 24 ώρες με 25 μΜ-ίτηκ (Enzo Life Sciences), 5 μΜ LEVD-fmk (Enzo Life Sciences), 3 μΜ ουορτμανίνη (Enzo Life Science), 2 μΜ κυκλοεξιμίδιο (Sigma Aldrich), 20 μΜ χλωροκίνη (Sigma Aldrich), 50 μΜ Salubrinal (Santa Cruz). Θαψιγαργίνη (Sigma Aldrich) χορηγήθηκε σε κύτταρα για 36 ώρες σε συγκέντρωση 1 μΜ.

Ανάλυση κυτταρομετρίας (FACS)

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του κυτταρικού κύκλου διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Χρώση έμμεσου φθορισμού διεξήχθη χρησιμοποιώντας αντι-φωσφο-ιστόνης Η3 (Ser10) (Cell Signaling # 9706) και ποντικού (Dako # F0313) αντισωμάτων αντι-FITC. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά φαρμακευτικές αγωγές, πλύθηκαν δύο φορές με PBS 1 ×, σταθεροποιήθηκαν σε 1% φορμαλδεΰδη για 10 λεπτά στους 37 ° C, και μετα-σταθεροποιήθηκαν με 90% μεθανόλη ο.η. στους -20 ° C. Μετά διαπερατότητας με 0,25% Triton Χ-100 σε PBS 1 × για 5 λεπτά, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με πρωτεύον αντίσωμα (1:25) ο.η. στους 4 ° C, και δευτερεύον αντίσωμα (1:50) για επιπλέον 2 ώρες στους 4 ° C. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με RNAse Α για 40 λεπτά, επωάστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (30 μg /μl) για επιπλέον 30 λεπτά στους 4 ° C στο σκοτάδι και αναλύθηκαν με κυτταρόμετρο.

Cells αποπτωτικά ταυτοποιήθηκαν με FACS χρησιμοποιώντας συζυγούς αννεξίνη V-FITC (Bender MEDSYSTEMS) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

μελέτες Κυτταρική πρόσληψη

bDHC εξήχθη από κύτταρα και μέσο καλλιέργειας όπως έχει ήδη αναφερθεί [20].

κρύσταλλο ιώδες δοκιμασία

Η αναστολή του πολλαπλασιασμού μετρήθηκε με χρώση κρυσταλλικού ιώδους και των η συγκέντρωση στην οποία κυτταρικής ανάπτυξης αναστέλλεται κατά 50% (IC50) προσδιορίστηκε μετά από αγωγή 24 ώρες με bDHC. Μετά την απομάκρυνση του μέσου καλλιέργειας κυττάρων, η κυτταρική μονοστιβάδα σταθεροποιήθηκε με μεθανόλη και βάφτηκαν με 0.05% διάλυμα κρυσταλλικό ιώδες σε 20% μεθανόλη για 30 λεπτά. Μετά πλύσεις, τα κύτταρα αφέθηκαν να στεγνώσουν. Η ενσωματωμένη χρωστική διαλυτοποιήθηκε σε όξινη ισοπροπανόλη (1 Ν HCl: 2-προπανόλη, 1:10) και προσδιορίστηκε φασματοφωτομετρικά σε μήκος κύματος 540 nm. Το εκχυλισμένο βαφή ήταν ανάλογη με τον αριθμό των κυττάρων. Ποσοστό της κυτταροτοξικότητας υπολογίστηκε με τη σύγκριση της απορρόφησης των επεξεργασμένων με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα.

πορτοκαλί της ακριδίνης χρώση

κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε αγωγή με DMSO και bDHC για 8 και 16 ώρες. Μετά από αυτό, τα κύτταρα επωάστηκαν με πορτοκαλί της ακριδίνης (1 μg /ml) για 15 λεπτά στους 37 ° C, που ακολουθείται από οπτικοποίηση με ένα Zeiss Axioskop μικροσκόπιο 40 φθορισμού (Carl Zeiss, Germany).

περιεχόμενο Ενδοκυτταρική ΑΤΡ

Προσδιορισμός των ενδοκυττάριων περιεχόμενο ΑΤΡ πραγματοποιήθηκε με χρήση ΑΤΡ CLSII κιτ δοκιμασίας βιοφωταύγειας (Roche), ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

μιτοχονδριακής μεμβράνης δυνητικών

δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης μετρήθηκε με αξιολόγηση η σύνδεση του 3,3-Dihexyloxacarbocyanineiodide (DiOC6), μια κατιονική χρωστική που δεσμεύεται με μιτοχόνδρια με πιθανούς άθικτη μεμβράνη. Τα κύτταρα σημάνθηκαν μετά DMSO ή bDHC επώαση για 16 και 24 ώρες με DiOC6 (4 ηΜ) για 40 λεπτά στους 37 ° C. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS 1 × και η ένταση φθορισμού αναλύθηκε χρησιμοποιώντας Beckman Coulter κυτταρομετρητή.

ανοσοαποτύπωσης

Τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος Laemmli 1 × για σύνολο κυτταρικών εκχυλισμάτων. Πυρηνική /εκχυλίσματα κυτταροπλασματική παρασκευάστηκαν όπως αναφέρεται στο Ref. [38]. Η ανάλυση στυπώματος Western έγινε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα: αντι-p53 DO-1 (Santa Cruz # sc-126), αντι-phospo-H3 (Ser10) (Millipore # 05-817), αντι-Η2Α οξύ-μπάλωμα (Active Motif), αντι -p21 (Upstate), αντι-ακτίνης (Santa-Cruz), αντι-PARP1 (Santa Cruz # sc-8007), αντι-γH2AX (Millipore, # 05-636), αντι-GADD153 (F168) (Santa Cruz # sc -575), αντι-τουμπουλίνης (Sigma-Aldrich), αντι-διασπάται κασπασών 3, 7, 8, 9 (Cell Signaling), αντι-κασπάση 4 4Β9 (Enzo Life Sciences), αντι-Βαχ (Ν-20) (Santa Cruz # sc-493), αντι-Bcl-2 (Santa Cruz # sc-509), αντι-Bcl-XL (Santa Cruz # sc-8392), αντι-LC3B (Sigma Aldrich # L7543), αντι-Ub (Santa Cruz # sc-8017), αντι-ATG7 (Sigma Aldrich # A2856), αντι-Beclin 1 (Sigma Aldrich # B6061) και αντι-H3 (C16) (Santa Cruz # sc-8654). αντιδραστήριο ανίχνευσης χημειοφωταύγειας έχει αγοραστεί από την Millipore (Luminata Classico και Forte Western HRP).

Απομόνωση κυτταροπλασματικό κλάσμα από τη μέθοδο διγιτονίνη λύσεως

2.000.000 κύτταρα HCT116 πλύθηκαν δύο φορές σε PBS και 1 × μετά επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διγιτονίνης λύσης (75 mM NaCl, 1 mM ΝαΗ

2 ΡΟ

4, 8 mM Να

2HPO

4, 250 mM σακχαρόζης, 190 mg /ml του διγιτονίνη, αναστολείς πρωτεάσης). Κάθε δείγμα επωάσθηκε επί πάγου για 5 λεπτά και στη συνέχεια φυγοκεντρείται στα 15.000 χ g στους 4 ° C για 30 λεπτά. Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για κηλίδωση Western με τη χρήση αντισωμάτων αντι-κυτοχρώματος C (Santa Cruz # sc-13560).

ανοσοφθορισμού

ανάλυση ανοσοφθορισμού διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20], [ ,,,0],39], με τη χρήση (sc-126 Santa Cruz #) και αντι-LC3B (Sigma Aldrich # L7543) αντισωμάτων αντι-ρ53 DO-1 αραιωμένο σε PBS 1:100 + BSA 1%. p53 κυτταρικό εντοπισμό εξετάστηκε με Zeiss Axioskop μικροσκόπιο 40 φθορισμού (Carl Zeiss, Jena, Γερμανία), οι εικόνες που συλλέγονται με μια φωτογραφική μηχανή AxioCam ΣΑΔ και AxioVision έκδοση 3.1 πακέτο λογισμικού. Η χρώση των ενδογενών LC3B αναλύθηκε με συνεστιακή μικροσκοπία (Leica DM IRE2).

Πλασμίδια και παροδική επιμόλυνση

HCT116 διαμολύνθηκαν παροδικά με Bcl-2, Bcl-XL ή πλασμίδια φορέα με FuGENE (Promega ). φορείς έκφρασης ανθρώπινη Bcl-2 και Bcl-XL προσεφέρθησαν ευγενώς από τον Μ Priault (CNRS IBGC UMR 5095, Μπορντό, Γαλλία) [40]. Τα κύτταρα ανακτήθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση για κηλίδος Western και ανάλυση του κυτταρικού κύκλου.

Μικρές παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA)

κύτταρα HCT116 διαμολύνθηκαν (Lipofectamine 2000, Invitrogen) με 200 nM ζευγών ATG7, BCN1 και μη στόχευση ελέγχου μικρών RNAs παρεμβολής (Sigma Aldrich), όπως περιγράφεται από τους Hoyer-Hansen et al. [41]. CHOP siRNA (HSC.RNAI.N004083.10.2 από IDT) ήταν ένα είδος δώρο του Α Pietrangelo (Πανεπιστήμιο της Μόντενα και της Ρέτζιο Εμίλια, Μόντενα, Ιταλία). Συνολικά εκχυλίσματα και τα δείγματα FACS παρασκευάσθηκαν μετά από 72 ώρες μετά την επιμόλυνση siRNA.

RT-PCR ανάλυση

εκχύλιση RNA, ανάδρομης μεταγραφής και ημιποσοτική PCR διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [42], [43]. Ακτίνης και LC3B ενισχύθηκαν με τα ακόλουθα ολιγονουκλεοτίδια: ακτίνης

Προς: 5′-GAGGCCCAGAGCAAGCGT-3 ‘? Actin

Rev: 5′-GCTCGAAGTCCAGGGCGACG-3 ‘? LC3B

Προς: 5′-CCTGGAGAAAGAGTGGCATTT-3 ‘? LC3B

Rev: 5′-GAAGGCAGAAGGGAGTGTGT-3 ‘

μικροσκόπιο σάρωσης ηλεκτρονίων (SEM)

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μονοστιβάδα σε καλυπτρίδες μονιμοποιήθηκαν σε 1,25% γλουταραλδεΰδη σε PBS 1 × 30. min RT και πλύθηκε σε PBS 1 × για τρεις φορές. Μετά από αφυδάτωση σε διαβαθμισμένη διαλύματα αιθανόλης, τα δείγματα ήταν κρίσιμο σημείο αποξηράνθηκε με CO

2 χρησιμοποιώντας ένα κρίσιμο σημείο μαλλιών 010 Balzer, τοποθετημένα σε στελεχών αλουμίνιο, και επιστρωμένο με καθοδική διασκόρπιση με 10 nm χρυσού παλλάδιο σε μια επικάλυψη Μονάδα Ε 500 ( πολωμένο). Οι παρατηρήσεις διεξήχθησαν με τη Philips XL-30 ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης.

Ηλεκτρονική Μικροσκοπία ανάλυση

Cells, ξύνεται από τρυβλία Petri, υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 12,000 χ g για 5 ‘στους 10 ° C. Τα προκύπτοντα σφαιρίδια στερεώθηκαν όλη τη νύκτα με 2.5% γλουταραλδεΰδη (Agar Scientific, Stensted, UK) σε ρυθμιστικό διάλυμα Tyrode, μονιμοποιήθηκαν για 2 ώρες σε 1% τετροξείδιο του οσμίου (Agar Scientific), αφυδατώθηκαν και εμπεδώθηκαν σε TLV ρητίνη (TAAB, Aldermaston, UK ). Ημίλεπτες τομές που λαμβάνονται σε ολόκληρο το πάχος του πέλλετ βάφτηκαν με μπλε τολουϊδίνης και παρατηρήθηκαν με ένα Zeiss Axiophot μικροσκόπιο φωτός (Oberkochen, Γερμανία). Εξαιρετικά λεπτές τομές χρωματίστηκαν με οξικό ουρανύλιο και κιτρικό μόλυβδο και παρατηρήθηκαν με ένα Jeol 1200 EXII ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (Jeol, Tokyo, Japan).

χρωματίνης Ανοσοκαθίζηση (μάρκας)

chips έγιναν με χρωματίνη από DMSO και bDHC επεξεργασμένα κύτταρα για 24 ώρες όπως περιγράφεται στο Martens

et al.

[44]. PCR ολιγονουκλεοτίδια αναφερθεί στο παρελθόν [43].

Στατιστική ανάλυση

Τα αποτελέσματα φαίνονται ως βοήθεια τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων +/- SD. Η στατιστική ανάλυση έγινε χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA, ακολουθούμενη από δοκιμή LSD για να προσδιοριστεί αν υπήρχαν διαφορές μεταξύ των συγκεκριμένων ομάδων.

Αποτελέσματα

Επιδράσεις της bDHC στη βιωσιμότητα και του κυτταρικού κύκλου εξέλιξη των κυττάρων HCT116

πειράματα Πλήρης δόσης-απόκρισης διεξήχθησαν σε κύτταρα HCT116 να προσδιορίσει την ικανότητα του να καταστέλλει bDHC κυτταρική ανάπτυξη. bDHC κυτταροτοξικότητα προσδιορίστηκε μέσω Κρύσταλλο Ιώδες μέθοδος ζωτική χρώση και η 50% ανασταλτική συγκέντρωση για την κυτταρική ανάπτυξη (IC50) υπολογίστηκε ίση με 30 μΜ, μετά από 24 ώρες θεραπείας (Εικ. 1Α, δεξί πάνελ).

Η επίδραση του bDHC στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου διερευνήθηκε με φθορισμό ενεργοποιημένων κυττάρων διαλογής ανάλυση (FACS) (Εικ. 1Β). κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε αγωγή για 16 και 24 ώρες με bDHC και την κατανομή σε φάσεις κυτταρικού κύκλου συγκρίθηκε με κύτταρα που κατεργάστηκαν DMSO και κουρκουμίνη. Όπως φαίνεται προηγουμένως [20], κουρκουμίνη συνελήφθη κυττάρων σε G2 /M φάση και κατά το ήμισυ του πληθυσμού στις G0 /G1 και S φάση μέσα σε 16 ώρες? ανιχνεύθηκε καμία σημαντική αύξηση των γεγονότων SubG1. Διαφορετικά, bDHC συσσωρευμένα κύτταρα, όχι μόνο σε G2 /M (από περίπου 23% των κυττάρων ελέγχου στο 37% των επεξεργασμένων κυττάρων), αλλά και σε φάση SubG1 (από 2,5% έως 10%). Με την παρατεταμένη έκθεση, εκδηλώσεις SubG1 ελαφρώς αυξημένα κατά κουρκουμίνη (από 4% έως 8,6%), ενώ μια εμφανής αύξηση ήταν ανιχνεύσιμη με τον bDHC (από 4% έως 33%).

Ένα προφίλ του κυτταρικού κύκλου στη συνέχεια δημιουργήθηκε από εκτέλεση PI /BrdU biparametric ανάλυση και χρήση επιλεκτικών περίφραξη με εξαίρεση τον πληθυσμό SubG1 (Εικ. 1Γ). Όπως ήταν αναμενόμενο, κουρκουμίνη κατά το ήμισυ του πληθυσμού φάση S και G2 διπλασίασαν κύτταρα /M. Καθώς και κουρκουμίνη, bDHC κατεργασμένα κύτταρα έδειξαν σαφή μείωση της πρόωρης πληθυσμού S (από περίπου 33% σε 5,9% και 4,8% μετά από 16 και 24 ώρες, αντίστοιχα) και η συσσώρευση G2 Μ εκδηλώσεων (/από περίπου 25% έως περίπου 42% και 50%, μετά από 16 και 24 ώρες), ενώ δεν ανιχνεύθηκαν σημαντικές μεταβολές σε εκατοστιαίες G0 /G1.

για να διακρίνουν μεταξύ G2 και μιτωτική τους πληθυσμούς, τα κύτταρα ήταν διπλή ανιχνεύτηκε με PI και ενός ειδικού αντισωμάτων κατά των μιτωτικών δείκτη φωσφο-ιστόνης H3Ser10 χρήση κυτταρομετρίας ροής (Εικ. S1 Α). Ενώ το 90% περίπου 4Ν κύτταρα ήταν θετικά για φωσφο-ιστόνης H3Ser10 εξής κουρκουμίνη θεραπεία, μόνο περίπου 2% ανιχνεύθηκαν ως μιτωτικοί πληθυσμός κατά τη χορήγηση bDHC.

Η σύγκριση μεταξύ μονοπαραμετρικές και biparametric αναλύσεις (Σχ. 1 Β και Εικ . 1C) τόνισε ότι το κύριο αποτέλεσμα της θεραπείας bDHC είναι ένα μπλοκ G2 μετά από 16 ώρες και κυτταρικό θάνατο κατά 24 ώρες.

η κυτταροτοξική δράση της bDHC εξετάστηκε με ανάλυση SEM (Σχ. S1B). Βαθιά μορφολογικές αλλοιώσεις της επιφάνειας, όπως η απώλεια ή διευρυμένη μικρολαχνών, μεμβράνη «φλύκταινες» και αποπτωτικών σωμάτων ήταν παρόντες στην bDHC επεξεργασμένα κύτταρα. Επιπλέον, μια ισχυρή αύξηση του αννεξίνης V θετικών κυττάρων ανιχνεύθηκε μετά από 24 ώρες χορήγησης bDHC (61%) σε σύγκριση με DMSO (7%) και κουρκουμίνη (24%) επεξεργασμένα κύτταρα (Εικ. 1 D, αριστερό πάνελ), υποδηλώνοντας την ενεργοποίηση του ένα αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο.

για να εξεταστεί η αναστρεψιμότητα της σύλληψης bDHC-ανάπτυξης, τα κύτταρα HCT116 θεραπεία για 24 ώρες με bDHC πλύθηκαν στη συνέχεια να αφαιρέσετε τα νεκρά κύτταρα και κυκλοφόρησε για 24 ώρες σε φρέσκο ​​μέσο. Μια μη αναστρέψιμη επίδραση στη βιωσιμότητα του κυττάρου παρατηρήθηκε, με σαφή συσσώρευση γεγονότων SubG1 (38%) και καμία αύξηση σε οποιαδήποτε άλλη φάση του κύκλου του κυττάρου (Εικ. 1 D, μεσαίο πλαίσιο).

Ομοίως με HCT116, ανθρώπινα κύτταρα LOVO αδενοκαρκινώματος κόλου παρουσίασαν εμφανή αύξηση των γεγονότων SubG1 μετά από χορήγηση bDHC για 24 ώρες (από 2,6% σε DMSO σε 27,7% σε bDHC κατεργασμένα κύτταρα) (Εικ S1c).

Σταθερά με την εμφάνιση των κυττάρων με περιεχόμενο υποδιπλοειδή SubG1 DNA, bDHC προκάλεσε την φωσφορυλίωση της παραλλαγής ιστόνης Η2ΑΧ (γ-Η2ΑΧ), η λειτουργία των οποίων συνδέεται με τον κατακερματισμό του DNA κατά την διάρκεια της απόπτωσης [45], τόσο σε HCT116 και κυττάρων LOVO (Εικ. 1 D, δεξιό πλαίσιο και το Σχ. S1c , δεξί πάνελ).

bDHC προκαλεί κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα HCT116 αλλά όχι σε ανθρώπινα φυσιολογικά κύτταρα

επόμενο αναρωτήθηκε αν bDHC είχε έναν όγκο-εκλεκτική δράση. Μη μετασχηματισμένα ανθρώπινων ινοβλαστών (HF) και ηπατική εμβρυϊκό ανθρώπινα επιθηλιακά φυσιολογικά κύτταρα (WRL68), του οποίου ο διπλασιασμός του χρόνου είναι 24 ώρες, υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 24 και 48 ώρες με bDHC 30 μΜ και κατασταλτική δράση ανάπτυξης εξετάστηκε στη συνέχεια με FACS (Σχ. 2Α και Β , αριστερά και μεσαία πλαίσια). Στην HF κύτταρα, bDHC προκάλεσε μια προοδευτική συσσώρευση S (από 19,8% έως 21,9% και από 11,4% έως 17% εντός 24 και 48 ώρες, αντίστοιχα) και G2 /M συμβάντα (από 16,8% έως 24,7% εντός 24 ωρών, από 8,5% έως 34,5% εντός 48 ωρών). χορήγηση bDHC να WRL68 οδήγησε σε αύξηση τόσο της S και G2 M εκδηλώσεις /επίσης, αλλά με διαφορετικό τρόπο από τα κύτταρα ΗΡ, μέγιστα αποτελέσματα ανιχνεύθηκαν μετά από 24 ώρες (από 14% έως 20,6% στην S φάση, και από 19,1% σε 33,7% σε G2 φάση /Μ). Είναι ενδιαφέρον, ούτε HF ούτε WRL68 κύτταρα δεσμευτεί για αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο και, με συνέπεια, καμία αύξηση της έκφρασης γ-H2AX παρατηρήθηκε κατά την αγωγή bDHC (Εικ. S1D).

Α. PI ανάλυση /FACS του HF πρόοδο του κυτταρικού κύκλου μετά DMSO και bDHC θεραπείες για 24 και 48 ώρες (αριστερή μεσαίο πλαίσιο, αντίστοιχα). PI /μονοπαραμετρικές ανάλυση κυτταρικού κύκλου του bDHC-κατεργασμένων κυττάρων

έναντι

bDHC-αποδεσμευμένα κύτταρα (δεξιά πάνελ) (Α = SubG1, Β = G0 /G1, C = S, D = G2 /M). B. Αριστερό και μεσαία πάνελ: Ανάλυση της προόδου του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων WRL68 ακόλουθες 24 και 48 ώρες από την αγωγή με DMSO ή bDHC. Δεξιό πλαίσιο: ανάλυση μονοπαραμετρικές PI /FACS κυττάρων WRL68 σε επεξεργασία με bDHC για 48 ώρες και στη συνέχεια απελευθερώνεται εντός φρέσκου μέσου επί άλλες 24 ώρες (Α = SubG1, Β = G0 /G1, C = S, D = G2 /M). Γ Ποσοτική αξιολόγηση της συγκέντρωσης bDHC με φασματοσκοπία UV-vis. Άνω αριστερό πλαίσιο: bDHC ανακτηθεί από κυτταρολύματα του HCT116 (•) και HF (▴) κυττάρων μετά από θεραπεία 24 ώρες σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (10, 20 και 30 μΜ). bDHC ανακτάται από τα σφαιρίδια κυττάρου (ng) αναφέρεται στο σύνολο των κυτταρικών πρωτεϊνών (mg), προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Bradford. Επάνω δεξιά πίνακας: Σύγκριση της κυτταρικής πρόσληψης (20 και 30 μΜ συγκεντρώσεις) σε HCT116 (μαύρα ιστογράμματα) και κύτταρα HF (γκρι ιστογράμματα). Κάτω πίνακας: bDHC ανακτώνται από τα μέσα καλλιέργειας μετά από επώαση του HCT116 (•) και HF (▴) κυττάρων με bDHC στα 10, 20 και 30 μΜ συγκέντρωση. Όλα τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν για τον έλεγχο (DMSO). ποσό φαρμάκου προσδιορίστηκε με ανάγνωση της απορρόφησης στα λ

max = 393 nm. Οι αναφερόμενες τιμές είναι ο μέσος όρος τριών ανεξάρτητων πειραμάτων -. /+ SD

Η

Για τη διερεύνηση της σταθερότητας του μπλοκ του κυτταρικού κύκλου που επάγεται σε φυσιολογικά κύτταρα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία HF με bDHC για 48 ώρες, στη συνέχεια πλένονται και απελευθερώνεται σε μέσο ελεύθερο φαρμάκου για 24 ώρες. Σε αντίθεση με HCT116, τα κύτταρα πέρασαν από HF G2 /M να φάση G1 (από 48% σε 56,3% μετά την απελευθέρωση), και καμία αύξηση του SubG1 ανιχνεύθηκε (Σχ. 2Α, δεξί πάνελ). Οι αναστρέψιμες επιπτώσεις της bDHC στα φυσιολογικά κύτταρα ήταν ακόμη πιο εμφανής σε WRL68 κύτταρα, των οποίων κυτταρικού κύκλου διανομής μετά από 48 ώρες και μετά τη θέση σε φρέσκο ​​μέσο τέλεια επικάλυψη αυτή των κυττάρων ελέγχου (Εικ. 2Β, μεσαίο και δεξί πάνελ).

Αυτά τα δεδομένα υπαινίσσονται ότι bDHC αντιστρεπτά μπλοκάρει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου των μη κακοήθων κυττάρων χωρίς επαγωγή απόπτωσης.

Με σκοπό την διαλεύκανση της φύσης της bDHC εκλεκτικότητα προς καρκινικά κύτταρα κόλου και όχι τα φυσιολογικά κύτταρα, πραγματοποιήσαμε περαιτέρω μελέτες για να εκτιμηθεί η μεταβολή της κυτταρικής πρόσληψης ως συνάρτηση της συγκέντρωσης της θεραπείας σε κυτταρικές σειρές HCT116 και HF. Δεδομένα ομαλοποιήθηκαν και παρουσιάζονται ως ng /mg ολικών πρωτεϊνών (Σχ. 2C, το άνω πάνελ) και μέσο καλλιέργειας υπολειμματικές ποσότητες (μg) (Εικ. 2C, κάτω πίνακας). πρόσληψη φαρμάκων αυξήθηκαν με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο στις δύο κυτταρικές σειρές, αλλά HCT116 αποκάλυψε μια σημαντική υψηλότερη πρόσληψη σε σύγκριση με κυτταρική σειρά HF σε 30 μΜ: 4575 ± 40

έναντι 2979 ± 21 ng

/mg συνολικής πρωτεΐνης ( Εικ. 2C, άνω δεξιά πλευρά).

bDHC που προκαλείται κυτταρικός θάνατος είναι ένα κασπάσης-εξαρτώμενη διαδικασία

για να διερευνήσει τη συμβολή των κασπασών σχετικά με την εκτέλεση της απόπτωσης, που προ-επωάστηκαν κύτταρα HCT116 με το zVAD αναστολέα ευρείας κασπάσης πριν αγωγή κυττάρων με bDHC για 24 ώρες (Σχ. 3Α, αριστερός πίνακας). Μια δραματική πτώση των γεγονότων SubG1 παρατηρήθηκε ταυτόχρονα σε προοδευτική συσσώρευση κυττάρων σε S και G2 /φάσεις Μ (από 11,7% έως 24,5% στην S φάση και από 16% έως 40% σε G2 /M, κατόπιν zVAD προεπεξεργασία) . Η αναστολή της απόπτωσης από zVAD προσδιορίζεται προφανή μείωση του φωσφορυλιωμένου Η2ΑΧ (Εικ. 3Α, δεξιό πλαίσιο και το Σχ. S2A). Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.