Abstract

Ακτινοθεραπεία είναι η θεραπεία επιλογής για συμπαγείς όγκους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παγκρέατος, αλλά η αποτελεσματικότητα της θεραπείας περιορίζεται από την αντίσταση ακτινοβολίας. Αντοχή σε χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία σχετίζεται με μειωμένη μιτοχονδριακή αναπνοή και φάρμακα που διεγείρουν μιτοχονδριακή αναπνοή μπορεί να μειώσει αντίσταση ακτινοβολίας. Οι στόχοι αυτής της μελέτης ήταν να αξιολογήσει το δυναμικό της (-) – επικατεχίνη να διεγείρει μιτοχονδριακή αναπνοή σε καρκινικά κύτταρα και να ευαισθητοποιεί τα καρκινικά κύτταρα επιλεκτικά στην ακτινοβολία. Διερευνήθηκε η φυσική ένωση (-) – επικατεχίνη για επιδράσεις στη μιτοχονδριακή αναπνοή και αντίσταση ακτινοβολίας του παγκρέατος και του γλοιοβλαστώματος καρκινικά κύτταρα χρησιμοποιώντας ένα ηλεκτρόδιο οξυγόνου τύπου Clark, δοκιμασίες κλωνογονική επιβίωση, και κηλίδα Western αναλύσεις. (-) – Επικατεχίνη διεγερμένα μιτοχονδριακή αναπνοή και την κατανάλωση οξυγόνου στα κύτταρα Panc-1. Ανθρώπινη φυσιολογικούς ινοβλάστες δεν επηρεάστηκαν. (-) – Επικατεχίνη ευαισθητοποιημένα κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 Panc-1, U87, και με μέσο αυξητικό συντελεστή ακτινοβολίας (REF) των 1.7, 1.5 και 1.2, αντίστοιχα. (-) – Επικατεχίνη δεν ευαισθητοποιεί τα φυσιολογικά κύτταρα ινοβλαστών σε ιοντίζουσα ακτινοβολία με μια REF 0,9, γεγονός που υποδηλώνει καρκινικών κυττάρων επιλεκτικότητα. (-) – Επικατεχίνη ενισχυμένη φωσφορυλίωση Chk2 και επαγωγή ρ21 όταν συνδυάζονται με ακτινοβολία στον καρκίνο, αλλά όχι κανονικά κύτταρα. Στο σύνολό τους, (-) – επικατεχίνη radiosensitized τα καρκινικά κύτταρα, αλλά όχι τα φυσιολογικά κύτταρα, και μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη υποψήφιος για τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος, όταν συνδυάζονται με ακτινοβολία

Παράθεση: Elbaz HA, Lee I, Antwih DA, Liu. J, Hüttemann Μ, Zielske SP (2014) Επικατεχίνη Διεγείρει τη δραστηριότητα των μιτοχονδρίων και ευαισθητοποιεί επιλεκτικά τα καρκινικά κύτταρα σε ακτινοβολία. PLoS ONE 9 (2): e88322. doi: 10.1371 /journal.pone.0088322

Επιμέλεια: Gabriele Multhoff, Technische Universitaet Muenchen, Γερμανία

Ελήφθη: 7 Αυγούστου του 2013? Αποδεκτές: 13 του Ιανουαρίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 6, Φλεβάρη του 2014

Copyright: © 2014 Elbaz et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την Angelika Burger κοινή μεταδιδακτορικής έρευνας από το Ινστιτούτο Καρκίνου Karmanos (SPZ και MH), τα κεφάλαια εκκίνησης από το Τμήμα Ακτινοθεραπευτικής Ογκολογίας, Πολιτειακό Πανεπιστήμιο Wayne (SPZ) και ΝΙΗ χορηγούν GM089900 (ΜΗ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι ένα προσωρινό δίπλωμα ευρεσιτεχνίας (# 61 /817.226? (-) – επικατεχίνη ως Ένωση θεραπεία του καρκίνου Ενίσχυση) έχει υποβληθεί. Οι συγγραφείς δεν έχουν άλλα ανταγωνιστικά συμφέροντα. Οι συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι το γεγονός αυτό δεν μεταβάλλει την προσκόλλησή τους σε όλες τις πολιτικές ONE PLoS σχετικά με την κοινοχρησία των δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Ακτινοθεραπεία είναι ιδανικό για πολλές συμπαγείς όγκους, λόγω της εντοπισμένης κυτταροτοξική δράση του. αντίσταση ακτινοβολίας, ωστόσο, είναι ένα κοινό πρόβλημα το οποίο είναι υπεύθυνο για την επανεμφάνιση των όγκων σε ασθενείς με καρκίνο [1]. Το αποτέλεσμα Warburg, στην οποία μιτοχονδριακή αναπνοή καταστέλλεται ακόμη και με την παρουσία οξυγόνου, και αερόβια γλυκόλυση διεγείρεται, πιστεύεται ότι μεσολαβεί αντίσταση στη χημειοθεραπεία και την ακτινοθεραπεία σε στερεούς όγκους [2], [3]. Επεξεργασία με ιοντίζουσα ακτινοβολία διεγείρει μιτοχονδριακή αναπνοή και αυξάνει αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) παραγωγή των καρκινικών κυττάρων [4].

Προηγούμενες αναφορές έχουν δείξει μειωμένο κίνδυνο καρκίνου σε ασθενείς που καταναλώνουν τακτικά φρούτα και λαχανικά [5]. Τα φλαβονοειδή είναι μια πανταχού παρούσα τάξη πολυφαινολικών ενώσεων που υπάρχουν σε φρούτα και λαχανικά και περιλαμβάνει αρκετές ομάδες ενώσεων, όπως φλαβανόλες, φλαβόνες, φλαβονόλες, ισοφλαβόνες, φλαβανόνες, ανθοκυανιδίνες, και προανθοκυανιδίνες [4], [6]. Μια σειρά από ευεργετικές επιπτώσεις στην υγεία, όπως η πρόληψη του καρκίνου συνδέονται με φλαβονοειδή στη διατροφή [7]. Επιπλέον, τα φλαβονοειδή δείχθηκε ότι ευαισθητοποιεί τα καρκινικά κύτταρα στη χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία, αλλά έχουν τις περισσότερες φορές έχει αποδειχθεί ότι εμφανίζουν ραδιοπροστατευτικών αποτελέσματα επί κανονικών ιστών [8] – [11]. (-) – Επικατεχίνη είναι ένα μονομερές flavanol που είναι μια φυσική ένωση που βρίσκεται σε πολλά φρούτα και λαχανικά, ιδιαίτερα σε κακάο και πράσινο τσάι [6], [12], και παρουσιάζει πολλές ευεργετικές επιδράσεις στην υγεία του ανθρώπου [13]. Μια πρόσφατη μελέτη από την ομάδα μας έδειξε ότι η (-) -. Επικατεχίνη τονωθεί μιτοχονδριακή αναπνοή και αυξημένο μιτοχονδριακό μάζας σε ποντίκια [14]

Η ικανότητα της flavanol (-) – επικατεχίνη για την τόνωση μιτοχονδριακή αναπνοή και την αύξηση των μιτοχονδρίων μάζα σε ένα μοντέλο ποντικού [14], μαζί με μια προηγούμενη μελέτη που δείχνει ότι η ακτινοβολία διεγείρει μιτοχονδριακή αναπνοή σε καρκινικά κύτταρα [4], μας οδηγούν να υποθέσουμε ότι η (-) – επικατεχίνη μπορεί να ευαισθητοποιήσουν καρκινικά κύτταρα σε ακτινοθεραπεία, επειδή και οι δύο την εξουδετέρωση του μεταβολισμού Warburg. Οι στόχοι αυτής της μελέτης ήταν να εξεταστεί η ικανότητα του (-) – επικατεχίνη να διεγείρει μιτοχονδριακή αναπνοή σε καρκινικά κύτταρα και να εξεταστεί η ικανότητα του (-) – επικατεχίνη να ευαισθητοποιεί τα καρκινικά κύτταρα επιλεκτικά στην ακτινοβολία. Εμείς εδώ δείχνουν ότι η (-) – επικατεχίνη διεγείρεται κυτοχρώματος

γ

οξειδάση (COX) δραστηριότητα και μιτοχονδριακή αναπνοή σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Επιπλέον, (-) – επικατεχίνη ευαισθητοποιημένα παγκρεατικό καρκίνο και γλοιοβλαστώματος κύτταρα, αλλά όχι φυσιολογικών ινοβλαστών, σε ακτινοβολία. (-) – Επικατεχίνη σε συνδυασμό με ιονίζουσα ακτινοβολία διεγείρονται Chk2 (σημείο ελέγχου κινάσης 2) φωσφορυλίωση, έκφραση ρ21, και αυξημένη απόπτωση, σε καρκινικά κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η (-) -. Επικατεχίνη εκθέματα η δυνατότητα να βελτιώσει το θεραπευτικό αποτέλεσμα για τους ασθενείς με καρκίνο με αύξηση συμβατική ακτινοθεραπεία

Υλικά και Μέθοδοι

(-) – Επικατεχίνη

(-) – Επικατεχίνη ελήφθη από την Sigma-Aldrich ως ένωση HPLC-καθαρισμένο από πράσινο τσάι (καθαρότητα ≥98%) (# E4018). Ένα διάλυμα αποθέματος 2 mM του (-) – επικατεχίνη έγινε σε PBS και δείγματα φυλάχτηκαν στους -80 ° C. Τα αποτελέσματα των πρόσφατα παρασκευασμένο (-) – επικατεχίνη ήταν συνεπή με -80 ° C αποθέματα κατά τη διάρκεια αυτής της μελέτης. Δοκιμές για την παραγωγή δραστικών μορφών οξυγόνου στα κύτταρα με (-) – επικατεχίνη προϊόντα-διάσπασης μετά από αποθήκευση στους -80 ° C ήταν αρνητική. πυροσταφυλικό νάτριο σε DMEM που χρησιμοποιούνται για καλλιέργεια κυττάρων χρησιμεύει σαν ένα αποτελεσματικό καθαριστή των πιθανών οξειδωτικών από φαρμακοτροφίμων όπως (-) -. επικατεχίνη [15]

Κύτταρα και κυτταρική καλλιέργεια

Panc-1 κύτταρα, ΜΙΑ κύτταρα PaCa-2, κύτταρα U87, και η ανθρώπινη φυσιολογική ινοβλάστες αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection και χρησιμοποιούνται σε χαμηλές δίοδο (Manassas, VA). U87 κύτταρα είναι ένα μοντέλο κυτταρική σειρά για την ανθρώπινη γλοιοβλαστώματος-αστροκύτωμα. Panc-1 κύτταρα και τα κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 είναι μοντέλο κυτταρικές σειρές για το καρκίνωμα ανθρώπινης παγκρεατικής επιθηλιακά. Οι ινοβλάστες είναι ένα μοντέλο κυτταρική γραμμή για τα φυσιολογικά ανθρώπινα κύτταρα. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν και διατηρήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (ϋΜΕΜ) (υψηλή γλυκόζη, με πυροσταφυλικό) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) και 2 mM L-γλουταμίνη σε απουσία αντιβιοτικών. Οι ινοβλάστες περάστηκαν μετά διαστάσεως με άλλες κυτταρικές γραμμές 0,05% θρυψίνη /ΕϋΤΑ και διαχωρίστηκαν με 0,25% θρυψίνη /ΕϋΤΑ. Οι κυτταρικές γραμμές συνήθως διαλογή για μυκοπλασματική μόλυνση και βρέθηκε να είναι αρνητικό.

Η κατανάλωση οξυγόνου

Η κατανάλωση οξυγόνου προσδιορίστηκε με μέτρηση της δραστικότητας της COX η οποία αντιπροσωπεύει το 90% όλων των κυτταρικών κατανάλωση οξυγόνου. δραστηριότητα COX αναλύθηκε σε Panc-1 κύτταρα με ένα ηλεκτρόδιο οξυγόνου μικρο-Clark-τύπου σε κλειστό θάλαμο (Oxygraph Σύστημα? Hansatech, Norfolk, UK) στους 25 ° C. Panc-1 κύτταρα σπάρθηκαν σε Τ-150 φιάλες και την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα κατεργάστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις της (-) – επικατεχίνη για 1 ώρα, στη συνέχεια συλλέχθηκαν και διαλυτοποιήθηκαν σε 10 mM HEPES (ρΗ 7,4), 40 mM KCl, 1% Tween-20, 1 μΜ ολιγομυκίνη, 1 mM PMSF, 10 mM KF, 2 mM EGTA, και 1 mM Να

3νο

4. δραστηριότητα COX μετρήθηκε με την παρουσία 20 mM ασκορβικό και 200 ​​κυτοχρώματος μΜ υποστρώματος

γ

από την καρδιά αγελάδα (Sigma-Aldrich). Η κατανάλωση οξυγόνου καταγράφηκε σε έναν υπολογιστή και αναλύονται με το λογισμικό Oxygraph. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με το κιτ προσδιορισμού πρωτεΐνης DC (Bio-Rad, Hercules, CA,). δραστηριότητα COX ορίζεται ως nanomols O

2 καταναλώνονται ανά λεπτό ανά χιλιοστόγραμμο ολικής πρωτεΐνης.

Κλωνογόνος επιβίωση δοκιμασία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε φιάλες Τ-25 σε 5 × 10

5 κύτταρα ανά φιάλη. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα εξετέθησαν σε 0-200 μΜ (-) – επικατεχίνη για 1 ώρα και στη συνέχεια ακτινοβολούνται με 0-8 Gy με Pantak μονάδα orthovoltage 320 kV σε 0.86 Gy ανά λεπτό και 10 mA. Εικοσιτέσσερις ώρες μετά την ακτινοβόληση, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, μετρήθηκαν και επιστρώθηκαν σε προκαθορισμένα κλωνική πυκνότητες. Δύο εβδομάδες αργότερα, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με μίγμα μεθανόλης /οξικού οξέος (7:01) και βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες. καταμέτρηση των αποικιών έγινε με το χέρι και τα δεδομένα αναλύθηκαν με προσδιορισμό του κλάσματος που επιβιώνουν σε κάθε δόση της ακτινοβολίας. Καμπύλες επιβίωσης κυττάρων προσαρμόστηκαν σε ένα γραμμικό-τετραγωνική μοντέλο και ακτινοβολία παράγοντες ενίσχυσης (REF) προκύπτουν ως η περιοχή κάτω από τον έλεγχο (χωρίς φάρμακο) καμπύλη διαιρούμενο με το εμβαδόν κάτω από την δοκιμή (με φάρμακο) καμπύλη [16].

Western blot ανάλυση

τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 0-200 μΜ (-) – επικατεχίνη για 1 ώρα και στη συνέχεια ακτινοβολούνται με 0 ή 6 Gy. Εικοσιτέσσερις ώρες μετά την ακτινοβόληση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν σε 1% SDS, τη διακοπή πρωτεάσης και φωσφατάσης Inhibitor Cocktail, Φωσφατάσης Inhibitor Cocktail 3 (Sigma, Cat. Νο Ρ 0044), Φωσφατάσης Κοκτέιλ Αναστολέα 2 (Sigma, Cat. Νο Ρ 5726), 10 mM, ρΗ 7,4, 2 mM Na

3νο

4, 1 mM NaF, και 1,7 mM Να

4P

2O

7. Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη προσδιορίσθηκε με τη χρήση μίας ανιχνεύσεως BCA (Thermo Scientific). Δείγματα για φωσφο-Chk2 (Thr68) και ρ21 μετουσιώθηκαν με βρασμό με 2 × ρυθμιστικό Laemmli συμπληρωμένο με 10% β-μερκαπτοαιθανόλη, ενώ τα δείγματα για μιτοχονδριακών πρωτεϊνών αναμείχθηκαν με 2 χ ρυθμιστικό Laemmli συμπληρωμένο με 10% β-μερκαπτοαιθανόλη και αναταράσσεται επί ένα rocker σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Τριάντα μg πρωτεΐνης φορτώθηκαν ανά φρεάτιο χρησιμοποιώντας 4-20% πηκτές mini-PROTEAN® TGX ™ προκατασκευασμένων (Bio-Rad) και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF χρησιμοποιώντας ένα σύστημα Trans-Blot Turbo Plus (Bio-Rad). Μετά τη μεταφορά, οι μεμβράνες αποκλείσθηκαν με 5% άπαχο ξηρό γάλα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια επωάζονται όλη τη νύχτα με το πρωτογενές αντι-Ρ-Chk2 (Thr68), αντι-ρ21, αντι-κασπάση 3 αντι-β-ακτίνης, αντι- GAPDH (1:1000-1:5000? Cell Signaling Technologies, Boston, ΜΑ), οξειδωτική φωσφορυλίωση (OxPhos) συμπλόκου Ι NDUFB6 υπομονάδα, OxPhos συγκρότημα II υπομονάδας 70 kDa Fp, OxPhos συγκρότημα πυρήνα III υπομονάδα Ι, κυτόχρωμα c, OxPhox συγκρότημα IV υπομονάδα Ι, ή OxPhos συγκρότημα υπομονάδας V α (1:2000-1:8000? MitoSciences, Eugene, OR). Οι μεμβράνες πλύθηκαν με ρυθμισμένο με Tris αλατούχο διάλυμα με 0.1% Tween-20 (ΤΒδ-Τ), επωάστηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα αντι-ποντικού ή αντι-κουνελιού (1:4000? Cell Signaling Technologies) πλύθηκαν και πάλι και επωάστηκαν με SuperSignal West Pico χημειοφωταύγειας Υπόστρωμα για έκθεση σε φιλμ ακτίνων χ. Οι ζώνες πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Ποσότητα Μια εκδοχή 4.6.7 (Bio-Rad).

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές. Κλωνογόνος πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση GraphPad Prism έκδοση 6 (GraphPad Software για την επιστήμη, Inc, San Diego, CA) με το Mann-Whitney test, t-test του Student, ή μονόδρομη ANOVA, όπου ενδείκνυται. Post-hoc τεστ πολλαπλών συγκρίσεων Bonferroni για διεξήχθη σε σημαντικά αποτελέσματα ANOVA. Τα αποτελέσματα θεωρούνται σημαντικές όταν ρ & lt? 0,05. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν ± SEM

Αποτελέσματα

. (-) – Επικατεχίνη διεγείρει μιτοχονδριακή αναπνοή

Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι η (-) – επικατεχίνη διεγείρει μιτοχονδριακή αναπνοή σε κανονική μυς ποντικών ιστούς [14]. Για να εξεταστεί εάν (-) – επικατεχίνη θα μπορούσε να τονώσει μιτοχονδριακή αναπνοή σε καρκινικά κύτταρα, εξετάσαμε τη δραστικότητα της COX με την αξιολόγηση του ρυθμού κατανάλωσης οξυγόνου σε κύτταρα Panc-1. COX μεταφέρει ηλεκτρόνια από το κυτόχρωμα

γ

(Cytc) στο μοριακό οξυγόνο, και «επιβαρύνσεις» τα μιτοχόνδρια με άντληση πρωτονίων κατά μήκος της εσωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης που χρησιμοποιούνται αργότερα για την ΑΤΡ γενιάς. Η αντίδραση Cytc /COX είναι το προτεινόμενο περιοριστικό του ρυθμού στάδιο της αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων in vivo [17], [18], ελέγχοντας έτσι το συνολικό ποσοστό της κυτταρικής αναπνοής. (-) – Επικατεχίνη διεγείρεται δραστικότητα COX σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα όταν χρησιμοποιούνται σε συγκεντρώσεις έως και 200 ​​μΜ (Σχήμα 1Α, ρ & lt? 0,05). Στα 200 μΜ (-) -. Επικατεχίνη, μιτοχονδριακή αναπνοή αυξήθηκε κατά 59% από το 15,7 να 25,0 nmol O

2 /λεπτό ανά χιλιοστόγραμμο πρωτεΐνης

(Α) Η κατανάλωση οξυγόνου από την οξειδάση του κυτοχρώματος c (COX) από Panc-1 κύτταρα που εκτίθενται σε διαφορετικές συγκεντρώσεις επικατεχίνη – (-). Ο κύκλος εργασιών ορίζεται ως καταναλώνεται O

2 (nM) /(min · ολικής πρωτεΐνης (mg)). Οι ρυθμοί αναπνοής αυξήθηκε κατά (-) – επικατεχίνη σε συγκέντρωση-εξαρτώμενο τρόπο. * Ρ & lt? 0,05, σε σύγκριση με 0 μΜ (-) – επικατεχίνη. (Β) Η κατανάλωση οξυγόνου από την οξειδάση του κυτοχρώματος c (COX) από ανθρώπινη φυσιολογική ινοβλάστη κύτταρα (HNF) που εκτίθεται σε 0 ή 100 μΜ (-) – επικατεχίνη. ρυθμούς αναπνοής δεν αυξάνονται από 100 μΜ (-) -. επικατεχίνη

Η

Για να προσδιοριστεί αν η διέγερση του μιτοχονδριακή αναπνοή με (-) – επικατεχίνη θα μπορούσε να συμβεί σε κανονικές, μη καρκινικών κυτταρικών τύπων, εμείς αντιμετωπίζονται τα ανθρώπινα φυσιολογικούς ινοβλάστες (HNF) με επικατεχίνη και μετριέται δραστηριότητα COX. Δεν παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση στην O

2 κατανάλωση παρατηρήθηκε μετά από 100 μΜ θεραπεία (Εικ. 1Β). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η (-) – επικατεχίνη εκλεκτικότητα διεγείρει μιτοχονδριακή αναπνοή σε καρκινικά κύτταρα

. (-) – Επικατεχίνη ευαισθητοποιεί τα καρκινικά κύτταρα σε ιοντίζουσα ακτινοβολία

Αυξημένη μιτοχονδριακή αναπνοή λόγω (-) – επικατεχίνη η θεραπεία μπορεί να αντιστρέψει το μεταβολισμό Warburg και έτσι να ευαισθητοποιήσει τα καρκινικά κύτταρα στην ακτινοβολία. Για να ελεγχθεί αυτό, εξετάσαμε την επίδραση της (-) – επικατεχίνη σε κλωνογόνο επιβίωση του PACA-2 κυτταρικές γραμμές καρκίνου ΜΙΑ Panc-1, U87, και. (-) – Επικατεχίνη σημαντικά ενισχυμένη ακτινοευαισθησία σε κύτταρα Panc-1 σε δόσεις από 2 έως 8 Gy (ρ = 0,0001, Σχήμα 2Α).. Σε κύτταρα U87, (-) – επικατεχίνη επίσης ενισχυθεί σημαντικά ραδιοευαισθησία σε δόσεις από 2 έως 8 Gy (ρ = 0,0001, Σχήμα 2Β.). Παρόμοια αποτελέσματα βρέθηκαν στην κυτταρική γραμμή ΜΙΑ PaCa-2, στην οποία το (-) – επικατεχίνη παρήγαγαν σημαντική ραδιοευαισθητοποίηση σε κάθε εξεταζόμενη δόση (ρ = 0,0001, Σχήμα 2C.). Καμπύλες επιβίωσης κυττάρων ταιριάζουν σε μία γραμμική τετραγωνική μοντέλο. Σε Panc-1 κύτταρα, το κλάσμα επιβίωσης στα 2 Gy ήταν 98%, ενώ (-) – επικατεχίνη αγωγή μείωσε σημαντικά τον το κλάσμα που επιβίωσαν έως 58% (p = 0,001). Σε κύτταρα U87, ο επιζών κλάσμα σε 2 Gy ήταν 79% και (-) – επικατεχίνη σημαντικά μειωμένη επιβίωση έως 51% (p = 0.021). Σε κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2, ο επιζών κλάσμα σε 2 Gy ήταν 67%, ενώ (-) – επικατεχίνη θεραπεία μείωσε σημαντικά το κλάσμα που επιζούν στο 2 Gy σε 52% (ρ = 0,029). Η ενίσχυση της ακτινοβολίας που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο ή αυξητικό συντελεστή ακτινοβολίας (REF) ήταν 1,7 για Panc-1, 1,5 για U87, και 1,2 για τα κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η (-) -. Επικατεχίνη radiosensitizes καρκίνων πολλών τύπων in vitro

(Α) (-) – Επικατεχίνη ευαισθητοποιεί Panc-1 κύτταρα σε ακτινοβολία με μέσο REF = 1,7 (Β) (-) -Epicatechin ευαισθητοποιεί κύτταρα U87 σε ακτινοβολία με μέσο REF του 1,5. (C) (-) -. Επικατεχίνη ευαισθητοποιεί ΜΙΑ PaCa-2 κύτταρα σε ακτινοβολία με μέσο REF = 1.2

Η

(-) – Επικατεχίνη δεν ευαισθητοποιήσει κύτταρα HNF στην ακτινοβολία

για να ελεγχθεί αν (-) – επικατεχίνη ραδιοευαισθητοποίηση είναι επιλεκτική για καρκινικά κύτταρα, εξετάσαμε την επίδραση της (-) – επικατεχίνη σε κύτταρα HNF. (-) – Επικατεχίνη στα 20 μΜ δεν ευαισθητοποιήσει κύτταρα HNF σε ακτινοβολία με ένα REF 0,9 (Σχήμα 3Α). Ούτε (-) – επικατεχίνη και μόνο μείωση κλωνογόνο επιβίωση των κυττάρων HNF (Σχήμα 3Β). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η (-) – επικατεχίνη είναι επιλεκτική για καρκινικά κύτταρα και έτσι δεν μπορεί να αυξήσει την τοξικότητα φυσιολογικό ιστό όταν συνδυάζονται με ακτινοβολία

(Α) 20 μΜ. (-) – Επικατεχίνη δεν ευαισθητοποιήσει κύτταρα στην ακτινοβολία HNF (REF = 0.9). (Β) (-) – Επικατεχίνη μόνη της δεν αναστέλλει το σχηματισμό αποικιών σε HNF (p & gt? 0,05).

Η

Επίδραση της (-) – επικατεχίνη στην αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων (ETC)

έκφραση της πρωτεΐνης

Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η αυξημένη μιτοχονδριακή αναπνοή μέσω της (-) – επικατεχίνη εφαρμογή είναι συσχετισμένη με μια μικρή αλλά σημαντική αυξητική ρύθμιση των πρωτεϊνικών συμπλόκων ETC in vivo [14]. Πραγματοποιήσαμε ανάλυση στυπώματος Western για όλες OxPhos συμπλοκών χρησιμοποιώντας αντισώματα για ένα βασικό υπομονάδα του κάθε συμπλόκου (NDUFP, 70 kDa FP, core1, COX1, ΑΤΡ συνθετάση α) σε Panc-1 κύτταρα κατεργασμένα με 0-200 μΜ (-) – επικατεχίνη πριν με την έκθεση σε 0 ή 6 Gy. (-) – Επικατεχίνη μόνο του δεν μετέβαλε σημαντικά την έκφραση οποιασδήποτε από τις πρωτεΐνες ETC σε κύτταρα Panc-1 (Σχήμα 4Α-Β). Συνδυάζοντας (-) – επικατεχίνη με 6 Gy είχαν μέτρια επίδραση στην συμπλόκου Ι (NDUFP) στα 200 μΜ και πολύπλοκες III πυρήνας υπομονάδα 1 στα 100 μΜ (Σχήμα 4Α και C, ρ = 0.0006). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η (-) -. Επικατεχίνη, σε αυτή την κυτταρική σειρά καρκίνου, δεν προκαλεί μεγάλες αλλαγές στο μιτοχονδριακό επίπεδα σύμπλοκα OxPhos ή μεσολαβούν ραδιοευαισθητοποίηση μέσω των μεγάλων αλλαγών στα επίπεδα των ρυθμιστικών υπομονάδων ETC

(Α) αντιπροσωπευτική κηλίδα για έκφραση πρωτεΐνης σε κύτταρα ETC Panc-1 που υποβλήθηκαν σε αγωγή με 0-200 μΜ (-) – επικατεχίνη και 0 ή 6 Gy. (Β) (-) – Επικατεχίνη μόνη της δεν αλλάζει σημαντικά ETC έκφραση της πρωτεΐνης. Τα επίπεδα πρωτεΐνης κανονικοποιούνται με το μη επεξεργασμένο μάρτυρα. (Β) (-) – Επικατεχίνη επαγόμενη ελάχιστες αλλαγές στην έκφραση της πρωτεΐνης ETC όταν συνδυάζεται με 6 Gy. Οι τιμές ομαλοποιήθηκαν σε 6 Gy μόνο, και * ρ & lt? 0,05 σε σχέση με 6 Gy /0 μΜ (-) – επικατεχίνη

Η

(-) – Επικατεχίνη και ακτινοβολία διεγείρει οδοφράγματος κινάση 2 φωσφορυλίωση και ρ21 έκφρασης. σε Panc-1 αλλά όχι HNF κύτταρα

η φωσφορυλίωση του οδοφράγματος πρωτεϊνικής κινάσης 2 (ρ-Chk2) σε θρεονίνη 68 και την υπερέκφραση του ρ21 εμπλέκονται στην απόκριση βλάβης του DNA και ραδιοευαισθητοποίηση [19], [20]. Αναλύσαμε έκφραση ρ21 και φωσφορυλίωση Chk2 σε Panc-1 κύτταρα επεξεργασμένα με 0 ή 20 μΜ (-) – επικατεχίνη μετά από έκθεση σε 0 ή 6 Gy. (-) – Επικατεχίνη μόνη της δεν προκαλεί καμία αλλαγή στα επίπεδα ρ21 ή Chk2 φωσφορυλίωση 24 ώρες μετά τη θεραπεία. Ωστόσο, ο συνδυασμός της (-) – επικατεχίνη και 6 Gy θεραπεία διεγείρεται έκφραση ρ21 (Σχήμα 5Α, p = 0,0005) και φωσφορυλίωση Chk2 (Σχήμα 5Β, p = 0,042). Η έκφραση του ρ21 αυξήθηκε 62% και Ρ-Chk2 επίπεδα (Thr68) αυξήθηκε κατά 43% σε ακτινοβολημένα κύτταρα επεξεργασμένα με (-) – επικατεχίνη, σε σύγκριση με τα κύτταρα που έλαβαν μόνο ακτινοβολία

(Α). (-) – επικατεχίνη διεγείρει την έκφραση του p21. Τα επίπεδα πρωτεΐνης σε 20 μΜ (-) – επικατεχίνη επεξεργασμένων δειγμάτων ομαλοποιήθηκαν σε δείγματα που κατεργάζονται με 6 Gy. (Β) 20 μΜ (-) – επικατεχίνη διεγείρει φωσφορυλίωση Chk2. Επίπεδα πρωτεϊνών στο (-) – επικατεχίνη δείγματα αντιμετωπίζονται ομαλοποιήθηκαν σε δείγματα τα οποία υποβλήθηκαν σε αγωγή με 6 Gy, και * ρ & lt? 0,05

Η

Στη συνέχεια διερευνήθηκε P-Chk2 και ρ21 σε κύτταρα HNF μετά τη θεραπεία με. (-) – επικατεχίνη και ακτινοβολία επειδή τα κύτταρα HNF δεν radiosensitized (Εικ. 3). Σε αντίθεση με Panc-1 καρκινικών κυττάρων, ο συνδυασμός (-) – επικατεχίνη συν 6 θεραπεία Gy μειώνεται ρ21 έκφραση κατά 15% (Εικ. 6Α, p = 0.03). Chk2 φωσφορυλίωση ήταν αμετάβλητη (Εικ. 6Β). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η (-) -. Επικατεχίνη radiosensitizes καρκινικών κυττάρων με διαταραχές του κυτταρικού κύκλου και του σημείου ελέγχου αποκρίσεις σε ακτινοβολία

(Α) (-) – Επικατεχίνη αναστέλλει την έκφραση του p21. Τα επίπεδα πρωτεΐνης σε 20 μΜ (-) – επικατεχίνη επεξεργασμένων δειγμάτων ομαλοποιήθηκαν σε δείγματα που κατεργάζονται με 6 Gy, και * ρ & lt? 0.05. (Β) 20 μΜ (-) – επικατεχίνη δεν διεγείρει φωσφορυλίωση Chk2. Επίπεδα πρωτεϊνών στο (-) – επικατεχίνη δείγματα αντιμετωπίζονται ομαλοποιήθηκαν σε δείγματα τα οποία υποβλήθηκαν σε αγωγή με 6 Gy

Η

. (-) – Επικατεχίνη και ακτινοβολία διεγείρουν τη διάσπαση της κασπάσης 3 σε Panc-1 κύτταρα

κασπάσης 3 είναι κρίσιμη για την εκτέλεση της απόπτωσης. Για να εξεταστεί η πιθανότητα ότι η (-) – επικατεχίνη ευαισθητοποιεί τα καρκινικά κύτταρα στην ακτινοβολία με διέγερση απόπτωσης, εκτελέσαμε ανάλυση κηλίδος Western για προ-κασπάσης 3 και διασπασμένη κασπάση 3 σε Panc-1 κύτταρα εκτέθηκαν για 72 ώρες για να μηδέν ή 20 μ (-) -epicatechin και 0 ή 6 Gy ακτινοβολίας. Panc-1 κύτταρα που εκτίθενται σε (-) – επικατεχίνη έδειξαν αυξημένη προ-κασπάσης 3 έκφρασης και κύτταρα κατεργασμένα (-) – επικατεχίνη και /ή 6 Gy έδειξαν αυξημένη κασπάσης 3 διάσπασης σε σύγκριση με τα δείγματα εκτίθενται σε 6 Gy μόνο (Εικ. 7). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η (-) -. Επικατεχίνη radiosensitizes παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα με διέγερση έκφρασης κασπάσης 3 και απόπτωση

κύτταρα Panc-1 εκτέθηκαν σε 0 ή 20 μΜ (-) – επικατεχίνη για 1 ώρα, στη συνέχεια εκτίθεται σε 6 Gy ακτινοβολίας, και επωάστηκαν για 72 ώρες. (-) – Επικατεχίνη διεγείρει προ-κασπάσης 3 έκφρασης και διάσπαση

Η

Συζήτηση

. (-) – Επικατεχίνη διεγείρεται μιτοχονδριακή αναπνοή σε Panc-1 κύτταρα όπως φαίνεται από την αύξηση των ποσοστών της κατανάλωσης οξυγόνου . Ενώ (-) – επικατεχίνη ευαισθητοποιημένα γλοιοβλάστωμα και παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα στην ακτινοβολία, δεν ευαισθητοποιούν κύτταρα HNF, υποδεικνύοντας ότι η επίδραση ραδιοευαισθητοποίηση του (-) – επικατεχίνη είναι ειδικά για καρκινικά κύτταρα. (-) – Επικατεχίνη διεγερμένα μιτοχονδριακή αναπνοή και εμφάνισαν ραδιοευαισθητοποίηση σε κύτταρα Panc-1 σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Συνδυάζοντας (-) – επικατεχίνη με 6 Gy διεγείρεται φωσφορυλίωση Chk2, έκφραση ρ21, και επάγεται μεγαλύτερη διάσπαση της κασπάσης 3. Οι επιδράσεις αυτές παρατηρήθηκαν κατά προτίμηση σε καρκινικά κύτταρα αλλά όχι φυσιολογικά κύτταρα (HNF)

Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται εδώ. είναι νέα και σημαντική για τρεις λόγους. Πρώτον, (-) – επικατεχίνη ευαισθητοποιημένα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα σε ακτινοβολία. Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι τυπικά ανθεκτικό σε συμβατικές θεραπευτικές παρεμβάσεις [21] και ραδιοευαισθητοποίησης φάρμακα μπορούν έτσι να είναι χρήσιμα για να ξεπεραστεί αυτό το εμπόδιο θεραπευτική. Δεύτερον, οι περισσότεροι τύποι καρκίνου του παγκρέατος χαρακτηρίζονται από μεταλλάξεις Kras [22] και τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η (-) – επικατεχίνη radiosensitizes μεταλλαγμένο Panc-1 και ΜΙΑ PaCa-2 κυτταρικές σειρές Kras. Τρίτον, δείξαμε ότι η (-) – επικατεχίνη ευαισθητοποιημένα κύτταρα καρκίνου αλλά όχι κύτταρα HNF σε ακτινοβολία, η οποία είναι συνεπής με προηγούμενες μελέτες και δείχνει καρκινικού κυττάρου εκλεκτικότητα [9], [10], [23]. Επιπλέον, η καινοτομία των αποτελεσμάτων μας είναι εμφανής στην παρουσίαση διεγερμένα μιτοχονδριακή αναπνοή σε καρκινικά κύτταρα σε συγκεντρώσεις οι οποίες είναι περισσότερο θεραπευτικά σχετικές και που δεν έχουν δοκιμαστεί σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Η βιοδιαθεσιμότητα της (-) – επικατεχίνη όταν χορηγείται από του στόματος ως μέρος ενός εκχυλίσματος τροφής όπως το πράσινο τσάι ή κακάο μπορεί να είναι ένα ζήτημα, λόγω της περιορισμένης απορρόφησης του εντέρου. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε καθαρισμένο (-) – επικατεχίνη ένωση και οραματίζονται μια πιο άμεση διαδρομή από θεραπευτική χορήγηση in vivo που μπορεί να επιτρέψει μεγαλύτερες συγκεντρώσεις στο πλάσμα. Αξίζει να σημειωθεί ότι προηγούμενες μελέτες μας έχουν δείξει βιολογικές επιδράσεις μετά από στοματική χορήγηση της καθαρής ένωσης [14]. Αν και αυτή η μελέτη έδειξε μια επίδραση της (-) – επικατεχίνη σε φυσιολογικό ιστό, ενώ η τρέχουσα μελέτη δεν, οι διαφορές στα μοντέλα και τύπους κυττάρων που μελετήθηκαν είναι βαθιές και μπορεί να ευθύνεται για αυτή την διαφορά. Μεταβολισμός, σηματοδότηση, και ισομορφές ETC είναι πιθανό διαφορετικούς μεταξύ μυϊκών κυττάρων και ινοβλαστών.

Τόνωση της μιτοχονδριακής αναπνοής σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα δεν μπορούν να απαιτούν απαραιτήτως αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης ETC. Πολυάριθμες μελέτες έχουν δείξει ότι η COX αποφασιστικά ρυθμίζεται από φωσφορυλίωση τόσο τα καταλυτικά και ρυθμιστικές υπομονάδες [24]. Ως εκ τούτου, η διέγερση της μιτοχονδριακής αναπνοής από (-) – επικατεχίνη σε καρκινικά κύτταρα θα μπορούσε να διαμεσολαβείται από ένα μηχανισμό σηματοδότησης που μένει να διευκρινιστεί. (-) – Επικατεχίνη αποδείχθηκε ότι αναστέλλει ΜΑΡΚ /ΕΚΚ [25], [26] και ΜΑΡΚ δείχθηκε να συνδέσουν με EGFR και μετατοπίζονται στα μιτοχόνδρια όπου συνδέεται με COX [27] υποδηλώνοντας μια πιθανή μηχανισμός σηματοδότησης για το (-) -epicatechin μεσολάβηση ρύθμιση της μιτοχονδριακής αναπνοής

Συνδυάζοντας. (-) – επικατεχίνη με επαγόμενη από την ακτινοβολία Chk2 φωσφορυλίωση σε κύτταρα Panc-1. Chk2 φωσφορυλίωση στη θρεονίνη 68 παρουσιάζεται μετά από έκθεση σε ακτινοβολία ως μέρος της απάντησης βλάβη του DNA [28], [29]. Αρκετές μελέτες δείχνουν την εμπλοκή του p21 σε ραδιοευαισθητοποίησης σε διάφορους τύπους καρκίνου [19], [20], [30]. Επιπλέον, οι μελέτες δείχνουν ότι η φωσφορυλίωση της Chk2 σε θρεονίνη 68 και αυξημένη έκφραση p21 μειώνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσω επαγωγής γήρανση [31] – [33]. Η ικανότητα της (-) – επικατεχίνη να διεγείρει φωσφορυλίωση Chk2 και έκφραση p21 θα μπορούσαν ενδεχομένως να εξηγούν, τουλάχιστον εν μέρει, ένας μηχανισμός με τον οποίο (-) – επικατεχίνη προκαλεί ραδιοευαισθητοποίηση και αναστολή των κλωνογόνων επιβίωσης σε κύτταρα Panc-1. Σε επιπλέον, (-) – επικατεχίνη διεγείρεται διάσπαση της κασπάσης 3, με ή χωρίς ακτινοβολία και αυτό θα μπορούσε να δώσει διαφορετική εξήγηση για ραδιοευαισθητοποίηση σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα

. (-) – Επικατεχίνη διεγερμένα μιτοχονδριακή αναπνοή και ανέστειλαν κλωνογονική επιβίωση σε παγκρεατικά τα καρκινικά κύτταρα. Όταν συνδυάζεται με ακτινοβολία, (-) – επικατεχίνη radiosensitized καρκίνο του παγκρέατος και κύτταρα γλοιοβλαστώματος, αλλά όχι τα κύτταρα HNF. (-) – Επικατεχίνη τονωθεί φωσφορυλίωση Chk2 και της έκφρασης p21 πάνω από το επίπεδο που έχει επιτευχθεί από την ακτινοβολία και μόνο. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η (-) – επικατεχίνη είναι επιλεκτικό στην ευαισθητοποίηση των καρκινικών κυττάρων στην ακτινοβολία και την καθιστά μια πολλά υποσχόμενη υποψήφια ως μια νέα θεραπευτική τροπικότητα για τη θεραπεία του παγκρέατος ή άλλων καρκίνων

.