Αφηρημένο

Η καρκινική αναστολέας της πρωτεϊνικής φωσφατάσης 2Α (CIP2A) είναι ένα ογκογόνο παράγοντα που σταθεροποιεί την πρωτεΐνη c-Myc. CIP2A υπερεκφράζεται σε διάφορους όγκους, και τα επίπεδα έκφρασης είναι ένας ανεξάρτητος δείκτης για μακροχρόνια έκβαση. Για να καθοριστεί εάν

CIP2A

έκφραση είναι αυξημένη σε καρκίνο του παχέος εντέρου και αν θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως προγνωστικός δείκτης για την επιβίωση, αναλύσαμε

CIP2A

έκφραση του mRNA με πραγματικού χρόνου PCR σε 104 δείγματα καρκίνου του παχέος εντέρου.

CIP2A

το mRNA υπερεκφράζεται σε δείγματα καρκίνου του παχέος εντέρου και

CIP2A

επίπεδα έκφρασης συσχετίστηκε σημαντικά με το στάδιο του όγκου. Βρήκαμε ότι

CIP2A

χρησιμεύει ως ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης για την ελεύθερη νόσου και συνολική επιβίωση. Περαιτέρω, ερευνήσαμε CIP2A εξαρτώμενη επιδράσεις στα επίπεδα του c-myc, Akt και στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου κατά τρία φίμωση CIP2A χρησιμοποιώντας μικρό παρεμβαλλόμενο (SI) και μικρή φουρκέτα (sh) RNA. Η εξάντληση των CIP2A ανέστειλε ουσιαστικά την ανάπτυξη των κυτταρικών γραμμών κόλον και μειωμένα επίπεδα c-Myc χωρίς να επηρεάζει την έκφραση ή λειτουργία του ανάντη ρυθμιστικής κινάσης, Akt. Έκφραση των CIP2A βρέθηκε να εξαρτάται από την δραστηριότητα ΜΑΡΚ, συνδέοντας αυξημένα έκφραση c-Myc να απελευθερωθεί μεταγωγής σήματος στον καρκίνο του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Wiegering Α, Pfann C, Uthe FW, Otto C, Rycak L, Mader U, et al. (2013) CIP2A Επιρροές επιβίωσης στον καρκίνο του παχέος εντέρου και είναι κρίσιμης σημασίας για τη διατήρηση της Myc έκφρασης. PLoS ONE 8 (10): e75292. doi: 10.1371 /journal.pone.0075292

Επιμέλεια: Gnanasekar Munirathinam, Πανεπιστήμιο του Ιλινόις, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 23 Απριλίου, 2013? Αποδεκτές: 12 Αυγ 2013? Δημοσιεύθηκε: 1, Οκτωβρίου 2013

Copyright: © 2013 Wiegering et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. AW έχει χρηματοδότηση από το πανεπιστήμιο του Würburg για μια οθόνη σε σύγκριση με την APC ο αριθμός χρηματοδότηση είναι: IZKF Β-186. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου για τη μελέτη αυτή. Η δημοσίευση αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Γερμανικό Ίδρυμα Ερευνών (DFG) και το Πανεπιστήμιο του Wuerzburg στο πρόγραμμα χρηματοδότησης Open Access Publishing. Δεν υπάρχουν τρέχουσες εξωτερικές άλλες πηγές χρηματοδότησης για τη μελέτη αυτή

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η πιο. κοινή γαστρεντερική κακοήθεια. Υπάρχουν περίπου 664.000 νέες περιπτώσεις κάθε χρόνο σε όλο τον κόσμο. Οι μισοί από αυτούς τους ασθενείς θα πεθάνουν από αυτήν την καρκίνωμα [1]. Επί του παρόντος, η τυπική θεραπεία είναι η κύρια χειρουργική επέμβαση και, ανάλογα με το στάδιο του όγκου, επιπλέον χημειοθεραπεία [2]. Λόγω του υψηλού ποσοστού υποτροπής, οι νέες δυνατότητες στόχων και προγνωστικοί δείκτες που απαιτούνται για την αναγνώριση των ασθενών που είναι πιθανό να επωφεληθούν από επιπλέον θεραπεία.

Το 2007, Junttila και Westermarck προσδιόρισε την καρκινική αναστολέας της πρωτεϊνικής φωσφατάσης 2Α (CIP2A) ως ανθρώπινο ογκοπρωτεΐνη. CIP2A υπερεκφράζεται στο κεφάλι και το λαιμό των πλακωδών κυττάρων καρκινώματα και σε καρκινώματα του παχέος εντέρου [3]. CIP2A αναστέλλει την πρωτεϊνική φωσφατάση 2Α (ΡΡ2Α). ΡΡ2Α με τη σειρά του έχει έναν κρίσιμο ρόλο στον κύκλο εργασιών του c-Myc ογκοπρωτεΐνης, δεδομένου ότι αποφωσφορυλιώνει ΡΡ2Α c-Myc στη σερίνη-62 (S62). Η αποφωσφορυλίωση στο S62 απαιτείται για ουβικουϊτινίωση του c-myc με τη ουβικιτίνης λιγάση Fbw7 και ως εκ τούτου, εκκινεί η υποβάθμιση του c-myc [4]. Η υπερέκφραση του CIP2A αναστέλλει τη δράση ΡΡ2Α και έτσι σταθεροποιεί c-Myc. Κατά συνέπεια, αυτό προκαλεί αθανατοποίησης και κακοήθη μετασχηματισμό των ανθρώπινων κυττάρων [3]. η ίδια c-Myc παραμένει ο σημαντικότερος ογκογόνο οδηγού σε καρκίνο του παχέος εντέρου [5].

Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι CIP2A υπερεκφράζεται σε διάφορες ανθρώπινες κακοήθειες. επίπεδα έκφρασης CIP2A συσχετίζονται με τη συνολική επιβίωση (OS) και της νόσου επιβίωση χωρίς (DFS) σε γαστρικά καρκινώματα, σε ορώδες καρκίνο των ωοθηκών, σε νεφροκυτταρικό καρκίνωμα και στον καρκίνο του μαστού [6]? [7]? [8]? [9]. Στην χρόνια μυελογενή λευχαιμία (CML),

CIP2A

έκφραση στο χρονικό σημείο της διάγνωσης είναι ένας προγνωστικός δείκτης για την ανάπτυξη μιας κρίσης έκρηξη αργότερα [10]. Επιπλέον, ορισμένα ογκογόνο παράγοντες, συμπεριλαμβανομένης

Helicobacter pylori

και θηλώματος ιού 16 Ε7, ρυθμίζουν προς τα πάνω έκφραση CIP2A και αυτό μπορεί να είναι κρίσιμη για την ογκογόνο δράση τους [11]? [12].

Πρόσφατα, δύο ομάδες ανέφεραν αντικρουόμενα αποτελέσματα σχετικά με την προγνωστική επίδραση της CIP2A στον καρκίνο του παχέος εντέρου [13], [14]. Böckelman et al. μελέτησαν 752 ασθενείς, αλλά δεν μπορούσε να καθορίσει εάν η προγνωστική σημασία? σε αντίθεση Teng et al. μελέτησαν 167 ασθενείς και προσδιορίζονται έκφραση CIP2A ως προγνωστικός παράγοντας για το καρκίνωμα του παχέος εντέρου.

Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η εξέταση της σημασίας της έκφρασης CIP2A στον καρκίνο του παχέος εντέρου. Κατ ‘αρχάς, αναλύσαμε την έκφραση του

CIP2A

σε μια ομάδα ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου 104 με τεκμηριωμένη παρακολούθηση και επιβεβαίωσε υπερέκφραση του. Δεύτερον, διερευνήθηκε η σχέση μεταξύ

CIP2A

έκφρασης mRNA και κλινικο-παθολογικές μεταβλητές? Τέλος, έχουμε ως στόχο να καθορίσει τα μοριακά μονοπάτια που ρυθμίζουν την έκφραση CIP2A και, ρυθμίζονται από CIP2A. Τα δεδομένα μας υποστηρίζουν την άποψη ότι απορυθμισμένη έκφραση CIP2A είναι ένα κρίσιμο ογκογόνο εκδήλωση στο καρκίνωμα του παχέος εντέρου.

Ασθενείς και Μέθοδοι

Δείγματα Ασθενών

Εκατόν τέσσερις ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη. Όλοι οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο του Wuerzburg, στη Γερμανία, μεταξύ του 2003 και του 2012. Κανένας από τους ασθενείς είχαν υποβληθεί σε χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία πριν από τη χειρουργική επέμβαση. Θεραπείες μετά το χειρουργείο διεξήχθη σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές για τη θεραπεία του ορθοκολικού καρκίνου. Η διάγνωση επιβεβαιώθηκε με ιστοπαθολογική εξέταση των δειγμάτων. Μετά τη χειρουργική επέμβαση, τα δείγματα όγκων συλλέχθηκαν και αποθηκεύτηκαν σε υγρό άζωτο. Κλινικά δεδομένα όλων των ασθενών που συλλέχθηκαν από τα αρχεία του νοσοκομείου και τα επόμενα αρχεία συλλέχθηκαν μέσω της Comprehensive Cancer Centre Mainfranken.

Ηθική Δήλωση

Η δεοντολογική έγκριση για την έρευνα αυτή λήφθηκε από την Επιτροπή Ανθρωπίνων Έρευνας Ηθικής του Πανεπιστημίου του Βίρτσμπουργκ. Όλοι οι ασθενείς που παρέχονται ιστό του όγκου και τα δείγματα φυσιολογικού ιστού κόλον για την έρευνα αυτή υπέγραψαν ένα έντυπο συγκατάθεσης πριν την χειρουργική αφαίρεση του καρκίνου του εντέρου.

Γραμμές Κυττάρων και Cell Culture

Caco2, HCT116, και SW620 κύτταρα αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection. Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό ορό und ορός 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη.

πραγματικού χρόνου ποσοτική αντίστροφη μεταγραφή-ΡΟΚ Ανάλυση

Gene έκφραση του

CIP2A

αναλύθηκε χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου. Ολικό κυτταρικό RNA εκχυλίστηκε από τα δείγματα όγκων και κυτταρικές σειρές με RNeasy MINIKIT (Qiagen? Hilden, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Primer σετ (Qiagen) που στοχεύουν

CIP2A

RNA έχουν σχεδιαστεί από Biomers (Ulm, Γερμανία). Συμφωνήθηκε cDNA ανθρώπινου παχέος εντέρου (Pharmingen? Χαϊδελβέργη, Γερμανία) χρησίμευσε ως θετικός μάρτυρας, η οποία ανάγεται σε βασική γραμμή. Τα γονίδια housekeeping, αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (

GAPDH

) και βήτα-2 μικροσφαιρίνη (

b2MG

) χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικά πρότυπα για σχετική ποσοτικοποίηση και cDNA ελέγχου της ποιότητας. Όλες οι PCR αντιδράσεις διεξήχθησαν με ένα Opticon 2 Σύστημα DNA κινητήρα (MJ Research, Biozym? Oldendorf, Γερμανία). Σχετική ποσοτικοποίηση, με βάση την πλάσια διαφορά, υπολογίστηκε με τη μέθοδο κύκλος κατωφλίου (Ct), που εκφράζεται ως 2

-ΔΔCt (Primer αλληλουχία στον Πίνακα S1).

Ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως

Καλλιεργημένα κύτταρα ξεπλύθηκαν τρεις φορές με παγωμένο PBS, συλλέχθηκαν, λύθηκαν και απευθείας σε ρυθμιστικό δείγματος RIPA για ανάλυση ανοσοστυπώματος. Τα κυτταρικά υπολείμματα απομακρύνθηκαν με φυγοκέντρηση στα 12.000 g για 10 λεπτά στους 4 ° C, και το υπερκείμενο χρησιμοποιήθηκε ως το συνολικό προϊόν λύσης πρωτεΐνης. Για κάθε δείγμα, 10 μg του συνολικού λύματος πρωτείνης υποβλήθηκε σε ηλεκτροφόρηση 10% δωδεκυλο θειικό νάτριο-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE), που ακολουθείται από ανάλυση ανοσοστυπώματος. Τα ανοσοστυπώματα ανιχνεύθηκαν με αντισώματα έναντι CIP2A (A301-454A? Bethyl Laboratories), c-Myc C33 (C33, # 42? Santa Cruz), βήτα-ακτίνη (AC-15 /A5441? Sigma), βινκουλίνης (V9131? Sigma), ΑΚΤ, ρΑΚΤ

473 (CS-9271), η GSK3 (CS-9315), pGSK Σερίνη-9 (CS-9336), S6 (CS-2212), PS6 (CS-2215)? pmTOR (CS-2917), και mTOR (CS-2972). Όλα τα αντισώματα ήταν από τη Cell σηματοδότηση και χρησιμοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι κηλίδες απεικονίστηκαν με δευτερογενή αντισώματα (GE Healthcare) εναντίον του ποντικιού (NA9310) ή κουνέλι (NA9340) πρωτογενή αντισώματα.

Η ανοσοϊστοχημεία

Το αντίσωμα CIP2A ήταν η ίδια όπως για την ανάλυση ανοσοστυπώματος, έλεγχος ισοτόπου αντίσωμα αγοράσθηκε από eBioscience (San Diego, USA). Το δευτερεύον αντίσωμα ήταν ένα Cy3-συζευγμένο AffiniPure IgG αντι-κουνελιού σε μια αραίωση 1:200. χρώση CIP2A πραγματοποιήθηκε σε κρυοστάτη τομές του snap-κατεψυγμένα δείγματα καρκίνου του παχέος εντέρου που εκφράζουν διαφορετικά επίπεδα CIP2A mRNA με τις γειτονικές φυσιολογικό ιστό του παχέος εντέρου και 10 φυσιολογικά δείγματα του παχέος εντέρου. τμήματα κρυοστάτη (5 μm) επωάστηκαν με το πρωτογενές αντίσωμα αντίσωμα ή ελέγχου που ακολουθείται από επώαση με το δευτερεύον αντίσωμα Cy3-συζευγμένο. Τα πλακίδια επιχρωματίστηκαν με DAPI (4 ‘, 6-διαμιδινο-2-phenylindoldihydrochlorid) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Γερμανία) και καλύπτονται με πολυβινυλική αλκοόλη στερέωσης μέσο (DABCO, Sigma-Aldrich) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μία μηχανή Zeiss (Oberkochen, Γερμανία).

siRNA Η επιμόλυνση

Για να φιμώσουν την έκφραση του γονιδίου, τα κύτταρα επιμολυσμένα με μικρά RNAs παρεμβολής (siRNAs). On-στόχο συν SMART πισίνα (Dharmacon) siRNA για στόχευση CIP2A (L-014135-01-005) και ένα στοιχείο ελέγχου siRNA (D-001810-10-05) χρησιμοποιήθηκαν. Οι πισίνες siRNA (τελική συγκέντρωση 100 ηΜ) διαμολύνθηκαν στα κύτταρα με το κιτ RNAimax σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 72 ώρες αργότερα? έκφραση των πρωτεϊνών προσδιορίστηκε με ανάλυση ανοσοαποτύπωσης.

shRNA και Lentivirus

Για να φιμώσουν την έκφραση CIP2A mRNA με μικρή φουρκέτα RNA ακολουθίες (shRNA), με στόχο

CIP2A

κλωνοποιήθηκαν σε ένα φορέας λεντοϊού (plko1 puro), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ο φορέας διαμολύνθηκε παροδικά σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ μαζί με πλασμίδια πακέτο. Μετά από 48 και 72 ώρες, τα υπερκείμενα που περιέχουν τον ιό συλλέχθηκαν και διηθείται. Colon κυτταρικές γραμμές καρκίνου μολύνθηκαν με τον φακοϊό CIP2A και 24 ώρες αργότερα, τα μολυσμένα κύτταρα επιλέχθηκαν με πουρομυκίνη. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν με τα επιλεγμένα κελιά.

Colony Δοκιμασία Σχηματισμού

2.5 × 10

3 κύτταρα μολυσμένα με shRNA CIP2A ή Scr. απλώθηκαν σε έξι φρεατίων. Οι αποικίες βάφτηκαν με 0.5% κρυσταλλικό ιώδες σε 20% αιθανόλη. Φωτογραφίες τραβήχτηκαν και σχετική πυκνότητα καθορίζεται με ImageJ.

Στατιστική Ανάλυση

Η μονοπαραγοντική ανάλυση για να καθοριστεί συσχέτιση με την επιβίωση αξιολογήθηκε με καμπύλες Kaplan-Meier, και οι συγκρίσεις έγιναν με Mann-Whitney U test. Πολυπαραγοντικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με ένα μοντέλο παλινδρόμησης αναλογικού κινδύνου του Cox. P-τιμές & lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

Η έκφραση της CIP2A και κλινικοπαθολογοανατομικών μεταβλητές του καρκίνου του παχέος εντέρου Οι ασθενείς

Έκφραση

του

CIP2A

mRNA. αρχικά εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας σύνολα δεδομένων έκφρασης που προέρχονται από δημοσιευμένη ανάλυση μικροσυστοιχιών, η οποία είχε αρχικά εκτελείται για να εντοπίσει προγνωστικοί δείκτες για ορθοκολικό καρκίνωμα σύμφωνα με την κατάσταση λεμφαδένα μετάσταση [15]. Πλήρεις σειρές δεδομένων (DFS, τα στάδια του όγκου), συγκρίνοντας

CIP2A

έκφραση mRNA σε καρκίνωμα στο ότι σε συμφωνημένα παρακείμενους ιστούς, ήταν διαθέσιμα για 226 καρκινώματα.

CIP2A

έκφραση ελέγχθηκε με τη χρήση δύο ανεξάρτητων ανιχνευτές παρόντες σε αυτή τη σειρά. Εμείς δεν βρήκε καμία συσχέτιση μεταξύ

CIP2A

έκφραση και την ηλικία κατά τη διάγνωση, ή φύλου σε αυτό το σύνολο δεδομένων, αλλά

CIP2A

mRNA εκφράστηκε σε υψηλότερα επίπεδα σε παχέος καρκινικούς ιστούς από ό, τι στα συμφωνημένα γειτονικούς ιστούς σε τα δύο σύνολα ανιχνευτή (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Περιέργως, υψηλή

CIP2A

mRNA έκφραση συσχετίζεται σημαντικά με μειωμένη ελεύθερη νόσου επιβίωση (DFS) (Εικ. S1 Α, Β). Σε ξεχωριστές αναλύσεις των ασθενών στην Ένωση Διεθνούς Ελέγχου του Καρκίνου (UICC) στάδιο Ι (διήθηση όγκου προς muscularis propria), II (διήθηση όγκου πέραν muscularis propria) ή III (μετάσταση λεμφαδένα), μόνο οι ασθενείς εις το στάδιο UICC III έδειξε σημαντική συσχέτιση μεταξύ

CIP2A

έκφρασης και DFS. Σε σύγκριση, οι ασθενείς σε φάση UICC Ι και ΙΙ έδειξε μόνο μια μικρή συσχέτιση μεταξύ χαμηλής

CIP2A

έκφρασης και παρατεταμένη επιβίωση που δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Αυτό μπορεί να οφείλεται στο μικρό αριθμό των δειγμάτων και λιγότερες εκδηλώσεις υποτροπή σε σύγκριση με τους ασθενείς σε στάδιο UICC III (Εικ. S2A-C). Όπως δεν θα μπορούσε να επιτευχθεί DFS στο στάδιο UICC IV (απομακρυσμένες μεταστάσεις), δεν ήταν δυνατό να αναλύσει τη συσχέτιση των

CIP2A

έκφραση για την επιβίωση των ασθενών στο στάδιο UICC IV με αυτό το σύνολο δεδομένων.

αναλύεται

CIP2A

επίπεδα mRNA σε ένα ανεξάρτητο σύνολο των 104 δειγμάτων καρκίνου του παχέος εντέρου ιστού χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση RT-QPCR. Η έκφραση του

CIP2A

mRNA προσδιορίστηκε σε σχέση με τα δύο γονίδια καθαριότητας, βήτα-2 μικροσφαιρίνης (

b2MG

) και αφυδρογονάση γλυκεραλδεϋδης-3-φωσφορικής (

GAPDH

). Τα επίπεδα έκφρασης σε σύγκριση με τη διάμεση τιμή

CIP2A

mRNA έκφραση σε φυσιολογικό βλεννογόνο ιστό.

έκφραση CIP2A

σε σχέση με το

b2MG

ή σε σχέση με το

GAPDH

έδειξε υψηλή συσχέτιση (R

2 = 0,86) (Εικ. S3). Συνεπής με τα προηγούμενα ευρήματα σχετικά με την έκφραση CIP2A στον καρκίνο, βρήκαμε

CIP2A

έκφραση mRNA σε 93 από 104 δείγματα (89,4%) του καρκίνου να είναι τουλάχιστον τέσσερις φορές υψηλότερο από ό, τι σε φυσιολογικούς ιστούς του βλεννογόνου του παχέος εντέρου. Επιπλέον,

CIP2A

επίπεδο έκφρασης συσχετίστηκε σημαντικά με το στάδιο UICC, λέμφο μετάσταση στους λεμφαδένες, απομακρυσμένη μετάσταση, και ιστολογική διαβάθμιση όγκου (Εικ. 1). Εμείς δεν βρήκε καμία συσχέτιση μεταξύ της

CIP2A

έκφρασης και την ηλικία του ασθενούς, το φύλο ή την τοποθεσία του καρκίνου (δεξιά εναντίον αριστερό κόλον) (Πίνακας S2).

Οι πίνακες δείχνουν το πλαίσιο και μουστακιού οικόπεδα τεκμηρίωση σχετική

CIP2A

επίπεδα mRNA σε όγκους κατανεμημένες ανάλογα με το στάδιο UICC (Α) (UICC εγώ εναντίον II ρ & lt? .0001? II vs. ΙΙΙ p = 0,0046? III εναντίον IV p = 0,0002), σύμφωνα με το λεμφικό κόμβος μετάσταση (Β? Ν- vs. Ν + ρ & lt? 0,0001), σύμφωνα με μακρινή μετάσταση (C? Μ0 έναντι M1 ρ & lt? 0,0001), και σύμφωνα με ιστολογική διαβάθμιση (D: G2 εναντίον G3 p = 0,0084) .

η

CIP2A mRNA έκφραση και μετεγχειρητική επιβίωση του καρκίνου του παχέος εντέρου Οι ασθενείς

η συνολική επιβίωση (OS) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση επιβίωσης. Η συνολική επιβίωση ορίστηκε ως το χρονικό διάστημα μεταξύ χειρουργείο και το θάνατο που σχετίζεται με όγκο. αναλύσεις μονοπαραγοντική 1-, 3-, και 5-ετή OS αποκάλυψε ότι οι ασθενείς με προχωρημένο στάδιο πρωτογενούς όγκου, λέμφο μετάσταση στους λεμφαδένες, απομακρυσμένη μετάσταση, προηγμένη UICC-στάδιο, και υψηλή ιστολογική τάξεων είχε χειρότερα αποτελέσματα (Πίνακας 1). Για περαιτέρω ανάλυση, οι ασθενείς χωρίστηκαν σε δύο ομάδες, με το

CIP2A

έκφρασης παραπάνω (υψηλή) ή κάτω (χαμηλή) μέση τιμή. Οι ασθενείς με υψηλό

CIP2A

έκφραση mRNA είχαν σημαντικά χαμηλότερα OS από αυτούς με χαμηλά

CIP2A

έκφραση mRNA (Σχ. 2Α, Β). Συγκρίνοντας τους ασθενείς σε στάδια UICC I-IV ξεχωριστά με υψηλές και χαμηλές

CIP2A

έκφραση του mRNA, μόνο στο στάδιο UICC ΙΙΙ, οι ασθενείς με υψηλό

CIP2A

επίπεδα είχαν μειωμένο λειτουργικό σύστημα (Σχ. 2C, ΡΕ). Επιπλέον, μια πολυπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι ένα προηγμένο UICC σταδίου και υψηλής

CIP2A

έκφρασης (

CIP2A

παραπάνω μέση και

CIP2A

έκφραση που χρησιμοποιείται ως συνεχής δείκτης) ήταν ανεξάρτητες προγνωστικοί παράγοντες για την κακή έκβαση σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου (Πίνακας 2).

Τα γραφήματα δείχνουν Kaplan-Meier καμπύλες του OS, σύμφωνα με

CIP2A

έκφραση του mRNA. (Κόκκινο:

CIP2A

έκφραση του mRNA κάτω από διάμεση φορές την αξία έκφραση των 10,5 πάνω από το φυσιολογικό ιστό), πράσινο:

CIP2A

έκφραση του mRNA παραπάνω μέση φορές την αξία έκφραση των 10,5 πάνω από την κανονική ιστού) (Α & amp? Β) Όλοι οι ασθενείς σε σχέση με το

CIP2A

έκφραση του mRNA ρυθμίζεται σύμφωνα με γονίδιο καθαριότητας (n = 75) (Α: b2MG? Β: GAPDH) (C) ασθενείς στο Στάδιο UICC II σε σχέση με το

CIP2A

έκφραση του mRNA ρυθμίζεται σύμφωνα με γονίδιο καθαριότητας GAPDH (n = 29) (Δ) Οι ασθενείς στο στάδιο UICC ΙΙΙ σε σχέση με το

CIP2A

έκφραση του mRNA κανονικοποιημένα προς το γονίδιο καθαριότητας GAPDH (n = 21).

η

Για να ελέγξετε αν

CIP2A

έκφραση του mRNA συσχετίζεται με την έκφραση της πρωτεΐνης CIP2A στην CRC, δέκα τομές φυσιολογικού βλεννογόνου ιστού, τέσσερα δείγματα ιστού CRC που εκφράζουν χαμηλά

CIP2A

επίπεδα mRNA και πέντε δείγματα ιστών που εκφράζουν υψηλά

CIP2A

επίπεδα mRNA βάφτηκαν για την έκφραση της πρωτεΐνης CIP2A. Σε κανονικές τομές βλεννογόνου ιστού, καμία ή μόνο μια πολύ ασθενή χρώση για CIP2A μπορούσε να ανιχνευθεί (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Καρκίνοι που εκφράζουν χαμηλά επίπεδα του

CIP2A

mRNA έδειξε μία ασθενή χρώση για CIP2A πρωτεΐνη, ενώ οι καρκίνοι που εκφράζουν υψηλά

CIP2A

επίπεδα mRNA έδειξαν ισχυρή χρώση για CIP2A πρωτεΐνη. Αυτή αποτελέσματα δείχνουν ότι CIP2A πρωτεΐνη και τα επίπεδα mRNA συσχετίζονται στενά

in vivo

. (Εικ. 3).

Οι πίνακες δείχνουν αντιπροσωπευτικά παραδείγματα της χρώσης ανοσοφθορισμού, δείχνοντας πρωτεϊνική έκφραση CIP2A σε καρκινικά κύτταρα των ασθενών με χαμηλό (Α + Β) ή υψηλή

CIP2A

(C + D ) mRNA έκφραση (Α + x100 C, B + Δ x200 μεγέθυνση).

η

Επιδράσεις της CIP2A Μείωση στην κυτταρική ανάπτυξη και Myc έκφραση σε CRC

Σας περαιτέρω ήθελε να αποσαφηνίσει την επιρροή του CIP2A επί πρωτεϊνών στόχων της σε κυτταρικές σειρές CRC. Πρωτεΐνη έκφραση CIP2A ήταν αξιοσημείωτα μειωμένη σε τρεις κυτταρικές σειρές κόλου (Caco2 η HCT116 και SW620) μετά από θεραπεία με ειδικά siRNA κατά

CIP2A

. Επιπλέον, CIP2A knockdown οδήγησαν σε σημαντική μείωση στα επίπεδα c-Myc και στις τρεις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 4Α?. N = 3 για κάθε κυτταρική σειρά). Αυτό οφείλεται σε μετα-μεταγραφική ρύθμιση των επιπέδων της πρωτεΐνης c-myc, αφού ανιχνεύθηκε καμία αλλαγή στην

MYC

έκφραση mRNA (Σχήμα 4Β?. N = 3). Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι CIP2A νοκ ντάουν οδήγησε σε μειωμένη δραστηριότητα της Akt, φαίνεται από μειωμένη φωσφορυλίωση σε σερίνη 473 (pAkt

473), και ως εκ τούτου, ανέστειλε το μονοπάτι PI3K /mTOR. Ωστόσο, δεν εντοπίζονται τυχόν σημαντικές αλλαγές στη φωσφορυλιωμένη Akt μετά CIP2A νοκ ντάουν στον Caco2, HCT116 ή SW620 κύτταρα. Επιπλέον, η φωσφορυλίωση των κατάντη Akt στόχων, συμπεριλαμβανομένων pmTor, PS6, και pGsk3, δεν μεταβλήθηκε σημαντικά μετά knockdown του CIP2A (σχήμα 4Γ?. Η = 3 για κάθε κυτταρική σειρά). Συνολικά, αυτό δείχνει ότι η C-Myc πρωτείνης είναι υπό τον έλεγχο του CIP2A σε CRC, ενώ η ΡΙ3Κ /mTOR φαίνεται να είναι ανεξάρτητη από CIP2A.

(Α) ανάλυση ανοσοκηλίδος των CIP2A και πρωτεΐνης c-Myc έκφραση σε Caco2, HCT116 και SW620 κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA που στοχεύει CIP2A ή τον έλεγχο siRNA. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 72 ώρες μετά την επιμόλυνση (n = 3 για κάθε κυτταρική σειρά). (Β) σε πραγματικό χρόνο PCR ανάλυση του

CIP2A

και

c-Myc

έκφραση mRNA σε κύτταρα HCT116 επιμολυσμένα με siRNA που στοχεύει CIP2A ή ελέγχουν siRNA (n = 3). (Γ) Μείωση των CIP2A δεν αλλάζει την κατάσταση ενεργοποίησης της ΑΚΤ ή προς τα κάτω τους στόχους της. Τα πάνελ δείχνουν ανοσοστυπώματα των υποδεικνυόμενων πρωτεϊνών και φωσφορυλιωμένες πρωτεΐνες (π) σε Caco2, HCT116 και τα κύτταρα SW620 επιμολυσμένα με siRNA που στοχεύει CIP2A ή ελέγχουν siRNA όπως πριν (η = 3 για κάθε κυτταρική σειρά).

Η

επειδή τα siRNA είναι συνήθως χάνονται πάροδο του χρόνου, και να αποκλείσει εκτός στόχου επιπτώσεις, ελέγξαμε δύο διαφορετικές τα siRNAs που στοχεύουν

CIP2A

να αξιολογηθεί η ανασταλτική επίδραση της ανάπτυξης των CIP2A νοκ ντάουν. κύτταρα HCT116 μολύνθηκαν λεντοϊού με φορείς που φέρουν Τα siRNAs ενάντια

CIP2A

. αναλύσεις ανοσοστυπώματος έδειξε σημαντική knockdown του CIP2A πρωτεΐνης με αντίστοιχη μείωση των επιπέδων της πρωτεΐνης c-Myc (Σχήμα 5Α?. n = 2). Συνεπώς, ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων ήταν σημαντικά μεταβληθεί σε κύτταρα μολυσμένα με shRNA έναντι

CIP2A

(Σχήμα 5Β?. N = 2).

(Α) ανάλυση ανοσοκηλίδος των CIP2A και πρωτεΐνης c-Myc έκφραση σε κύτταρα HCT116 μολυσμένα λεντοϊού με shRNA στόχευση CIP2A ή CTR. shRNA. Οι αριθμοί κάτω από τις γραμμές δείχνουν την c-myc έκφραση πρωτεΐνης σε σχέση με τα επίπεδα του c-myc στα κύτταρα ελέγχου (n = 2). (Β) σχηματισμός αποικίας των κυττάρων HCT116 μετά από 7 ημέρες. (

Top

), την πυκνότητα των αποικιών βάφονται με κρυσταλλικό ιώδες? (

κάτω

), εκπρόσωπος των ενδεικνυόμενων πολιτισμών (n = 3).

Η

Έκφραση CIP2A είναι μεταγενέστεροι της ΜΕΚ κινάσης στο CRC

Για τον εντοπισμό πιθανών ανάντη ρυθμιστικές του

CIP2A

έκφρασης, εμείς αντιμετωπίζονται Caco2, HCT116 και τα κύτταρα SW620 με UO126, ένα καλά χαρακτηρισμένο αναστολέα Mek1 /2 [16]. Η θεραπεία με UO126 για 24 ώρες οδήγησε σε σημαντική μείωση του

CIP2A

mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης CIP2A συγκριτικά με DMSO επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 6Α, Β?. N = 3 για κάθε κυτταρική σειρά). Αυτή η επίδραση ήταν εντονότερη στα κύτταρα που έφεραν μια μετάλλαξη ΜΑΡΚ μονοπατιού, όπως SW620 (

KRAS

) και HCT116 (

KRAS

), από ό, τι στα κύτταρα Caco2 που είναι άγριου τύπου για

KRAS

.

Caco2, HCT116 και SW620 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO ή τον αναστολέα ΜΕΚ UO126 για 24 (η = 3 για κάθε κυτταρική σειρά). (Α) Ανάλυση ανοσοστυπώματος του CIP2A και η έκφραση πρωτεΐνης ρ-ΕΚΚ σε Caco2, HCT116 και SW620. (Β) σε πραγματικό χρόνο PCR ανάλυση του

CIP2A

έκφραση του mRNA (* & lt? 0,05? ** & Lt? 0.005)

Η

Συζήτηση

Πρόσφατα «Η. Καρκίνος Genome Atlas δικτύου »απέδειξε ότι απορρυθμισμένη έκφραση c-Myc είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα όλων σχεδόν των CRCs, ανεξάρτητα από το σύνολο των ειδικών μεταλλάξεων που υπάρχουν σε κάθε όγκο [5]. Για παράδειγμα, οι μεταλλάξεις στο ογκοκατασταλτικό

APC

και το ογκογονίδιο

KRAS

οδηγήσει σε προς τα πάνω ρύθμιση του

MYC

mRNA [5]. Στη μετα-μεταγραφικό επίπεδο, η απώλεια της οικογένειας miR34 από υπερμεθυλίωση, η οποία εμφανίζεται σε πάνω από το 90% όλων των CRC, σταθεροποιεί

MYC

mRNA [17], [18]. Επιπλέον, ένα μοντέλο ποντικού καρκίνου του παχέος εντέρου οδηγείται από την απώλεια του

APC

δείχνει ότι ο σχηματισμός όγκων του παχέος εντέρου εξαρτάται από την συνεχή έκφραση c-Myc [19].

Μέχρι τώρα, λίγα είναι γνωστά για τη μετα-μεταφραστική ρύθμιση των επιπέδων c-Myc σε CRC. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι

CIP2A

έκφραση είναι αυξημένη σε δείγματα καρκινώματος κόλου, σε σύγκριση με την έκφραση του σε κανονικό, παχύ έντερο ιστό, και ότι

CIP2A

έκφραση συσχετίζεται αρνητικά τόσο OS και κλινικές παθολογικές παραμέτρους. Δεδομένου ότι δεν υπάρχουν επικυρωμένες σημεία αποκοπής για

CIP2A

επίπεδα έκφρασης να διευκρινίσει υψηλή έναντι χαμηλής ομάδες έκφρασης, χρησιμοποιήσαμε το μέσο επίπεδο έκφρασης mRNA ως σημείο αποκοπής. Παρά το σχετικά μικρό αριθμό των ασθενών στη μελέτη μας, και ως εκ τούτου ένας σχετικά μικρός αριθμός του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους στην υποομάδα αναλύσεις, θα μπορούσαμε να επιδείξει μια σημαντική συσχέτιση του

CIP2A

επίπεδα με σχετιζόμενο με τον όγκο επιβίωσης.

Δύο προηγούμενες μελέτες αναλύθηκαν τα επίπεδα έκφρασης του CIP2A σε CRC και επέδειξε ενισχυμένη επίπεδα σε CRC σχέση με το φυσιολογικό βλεννογόνο, σύμφωνα με τα αποτελέσματα που αναφέρονται εδώ [13], [14]. Περαιτέρω, μια στενή συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων CIP2A και Myc έχει σημειωθεί πριν από [3], [13] και δείχνουμε εδώ ότι τα αυξημένα επίπεδα CIP2A απαιτείται για τη διατήρηση Myc έκφραση σε κυτταρικές σειρές CRC. Παραδόξως, συσχέτιση με OS παρατηρήθηκε σε μία μόνο από τις προηγούμενες μελέτες [14]. Ενώ εμείς δεν γνωρίζουμε την ακριβή αιτία για τη διαφορά, οφείλουμε να παρατηρήσουμε ότι τόσο Teng et al. [14] και μελέτη μας αποδίδεται ένα σχετικά υψηλό ποσοστό των ασθενών στη χαμηλή ομάδα έκφραση (68 και 50% αντίστοιχα), ενώ Böckelman et al. [13] ορίζεται μόνο το 15% των ασθενών με όγκους, όπως χαμηλή έκφραση CIP2A. Προτείνουμε ότι αυτές οι διαφορές στην διαστρωμάτωση των ασθενών σύμφωνα με τα επίπεδα CIP2A μπορεί να ευθύνεται για τα διαφορετικά αποτελέσματα. Η αντίληψη ότι CIP2A υπερεκφράζεται σε καρκίνο του παχέος εντέρου, ενισχύοντας έτσι τα επίπεδα πρωτεΐνης Myc και επηρεάζουν την επιβίωση σχετίζεται όγκο, είναι συνεπές με τα προηγούμενα αποτελέσματα σε άλλους συμπαγείς όγκους [6]? [7]? [8]? [9]. Μία προοπτική μελέτη θα πρέπει να αξιολογήσει εάν CIP2A έκφρασης mRNA ή επίπεδο πρωτεΐνης μπορεί να χρησιμεύσει ως προγνωστική δείκτης για την επιβίωση των ασθενών με CRC.

Έχει δειχθεί προηγουμένως ότι CIP2A σταθεροποιεί c-Myc με αναστολή ΡΡ2Α του μεσολάβηση αποικοδόμηση σε κύτταρα όγκου [3]. Συνεπής με αυτό το μοντέλο, η παρούσα μελέτη δείχνει ότι η προς τα κάτω ρύθμιση της πρωτεΐνης c-Myc παρατηρείται όταν CIP2A έχει σιγήσει με τα siRNA ή Τα siRNAs στα κύτταρα ορθοκολικού καρκινώματος. Λόγω του γεγονότος ότι χρησιμοποιήσαμε κυτταρικές σειρές που φέρουν διαφορετικές μεταλλάξεις για ογκογόνο οδό συνήθως μεταλλαχθεί σε CRC (Caco2: APC

mut, KRAS

κ.β., PI3K

κβ? HCT116: APC

κ.β., β- κατενίνης

mut, KRAS

mut, PI3K

mut? SW620: APC

mut, KRAS

mut, PI3K

κβ), θα υποθέσουμε ότι η εξάρτηση της έκφρασης της πρωτεΐνης c-Myc επί CIP2A είναι ανεξάρτητη από την παρουσία μεταλλάξεων σε WNT, ΡΙ3Κ /mTOR ή ΜΑΡΚ-οδών, αλλά αυτό θα πρέπει να αξιολογηθούν περαιτέρω. Βρήκαμε επίσης ότι shRNA μεσολάβηση εξάντληση των CIP2A σε κύτταρα καρκινώματος HCT116 παχέος εντέρου μειώνεται σημαντικά το αναπτυξιακό δυναμικό τους. Αυτό είναι σύμφωνο με αναφορές ότι η αναστολή CIP2A οδήγησε σε αναστολή της ανάπτυξης και μειωμένη κλωνογονικού δυναμικό σε αρκετές άλλες κακοήθειες [6]? [7]? . [8]

ΡΡ2Α αποφωσφορυλιώνει pAkt και CIP2A ενισχύει PI3K /mTOR σηματοδότησης αναστέλλοντας ΡΡ2Α μεσολάβηση αποφωσφορυλίωση ρΑΚΤ στο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) [20]? [21], [22]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η εξάντληση της έκφρασης CIP2A σε ορθοκολικό καρκίνο κύτταρα δεν επηρεάζει Akt σηματοδότηση, σε αντίθεση με τις παρατηρήσεις σε κύτταρα HCC. Βρήκαμε επίσης κανένα ή μόνο μικρές αλλαγές στα επίπεδα pAkt ή γνωστή κατάντη στόχους Akt. Το πιο πιθανό, ως εκ τούτου, η δραστηριότητα ΡΡ2Α προς ορισμένα από τα υποστρώματα της (Akt) διαφέρει μεταξύ των διαφόρων ιστών.

Λίγα είναι γνωστά σχετικά με το μηχανισμό βασίζεται η αυξημένη έκφραση του CIP2A σε κακοήθη κύτταρα. Στον καρκίνο του στομάχου, του

Helicobacter pylori

λοιμώξεις up-ρυθμίζουν

CIP2A

έκφρασης μέσω ενός SRC /Erk εξαρτάται οδού [11]. Η ιό των ανθρωπίνων θηλωμάτων 16Ε7 απορυθμίζει ογκοπρωτεΐνη

CIP2A

στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας [12]. Προς το παρόν είναι ασαφές τι συμβάλλει στην CIP2A υπερέκφραση στον καρκίνο του παχέος εντέρου. Δύο ευρήματα υποστηρίζουν την υπόθεση ότι η έκφραση CIP2A στον καρκίνο του παχέος εντέρου είναι κατάντη της οδού ΜΑΡΚ. Πρώτον, προηγούμενες εργασίες έδειξαν ότι η έκφραση CIP2A συσχετίζεται θετικά με την έκφραση EGFR [13]. Η οδός ΜΑΡΚ είναι ένας από τους κύριους στόχους της σηματοδότησης EGF. Δεύτερον, δείξαμε ότι CIP2A ρυθμίζεται προς τα κάτω μετά την αναστολή της οδού ΜΑΡΚ σε κυτταρικές γραμμές καρκινώματος κόλου τρία? ρύθμιση προς τα κάτω σε κυτταρικές σειρές που φέρουν ένα

KRAS

μετάλλαξη (HCT116, SW620) είναι πιο έντονη από ό, τι στην Caco2 δεν υπόθαλψη μια μετάλλαξη ΜΑΡΚ-μονοπάτι. Επαγωγή CIP2A μπορεί, ως εκ τούτου, είναι ένα κρίσιμο μεσολαβητή που συνδέει απελευθερωμένης μιτογονικής σηματοδότησης σε αυξημένη έκφραση c-Myc στο CRC.

Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης δείχνουν ότι

CIP2A

συνδέεται με ορθοκολικό καρκίνο που σχετίζονται με την επιβίωση. Υψηλή έκφραση του

CIP2A

mRNA συσχετίζεται με μειωμένη DFS και OS. Ως εκ τούτου,

CIP2A

αντιπροσωπεύει ένα νέο προγνωστικό παράγοντα για τη διάγνωση καρκίνου του παχέος εντέρου. Επιπλέον, CIP2A μπορεί να είναι ένας ελπιδοφόρος θεραπευτικός στόχος στην ανάπτυξη θεραπειών για τον ορθοκολικό καρκίνο.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Σχήμα S1.

Kaplan-Meier καμπύλες επιβίωσης χωρίς νόσο όλων των ασθενών (n = 226) σε σχέση με το

CIP2A

κατάσταση έκφρασης mRNA σε δημοσιεύεται ανάλυση μικροσυστοιχιών. (Amp A &? Β) DFS όλων των ασθενών ανάλογα με το σύνολο ανιχνευτών μικροσυστοιχιών

doi: 10.1371 /journal.pone.0075292.s001

(EPS)

Εικόνα S2..

ελεύθερη νόσου επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου στο στάδιο UICC Ι-ΙΙΙ, ομαδοποιούνται ανάλογα με

CIP2A

κατάσταση έκφρασης του mRNA. (Α) UICC Ι? (Β) UICC II? . (C) UICC III

doi: 10.1371 /journal.pone.0075292.s002

(EPS)

Εικόνα S3. ανάλυση παλινδρόμησης

Γραμμική της σχετικής

CIP2A

έκφραση του mRNA κανονικοποιημένα σε δύο γονίδια καθαριότητας, b2MG και GAPDH (n = 104? R

2 = 0.86). Η γραμμική παλινδρόμηση είναι ιδιαίτερα σημαντική (p & lt? 0.001)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0075292.s003

(PSD)

Πίνακα S1. .

Primer ακολουθίες

doi: 10.1371 /journal.pone.0075292.s004

(DOCX)

Πίνακας S2.

Χαρακτηριστικά των ασθενών με CRC και σύνδεσης μεταξύ των

CIP2A

έκφρασης και κλινικοπαθολογική μεταβλητές (lymphovascular εισβολή και τη θέση τεκμηριώθηκε για 100 ασθενείς)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0075292.s005

(DOCX)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε χριστιανική Jurowich, Christoph Isbert και Ανδρέα Thalheimer για τη συλλογή δειγμάτων όγκου.