Αφηρημένο

Ιστορικό

BORIS

/

CTCFL

είναι ένα paralogue του

CTCF

, ο κύριος επιγενετική ρυθμιστής των γονιδιωμάτων των σπονδυλωτών. BORIS κανονικά εκφράζεται μόνο σε γεννητικά κύτταρα, αλλά ενεργοποιούνται ανωμάλως σε πολλές μορφές καρκίνου. Ενώ πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι BORIS είναι ένας μεταγραφικός ενεργοποιητής των όρχεων-ειδικών γονιδίων, λίγα είναι γενικά γνωστό για τις βιολογικές και μοριακές λειτουργίες του.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι

BORIS

εκφράζεται ως 23 ισομορφές σε βλαστικής σειράς και καρκινικά κύτταρα. Οι ισομορφές αποτελούνται από εναλλακτικές Ν- και C-άκρα σε συνδυασμό με ποικίλους αριθμούς δακτύλων ψευδαργύρου (ZF) στην περιοχή πρόσδεσης του DNA. Τα σχέδια της

BORIS

έκφραση ισομορφή είναι διακριτές στο φύτρο και καρκινικά κύτταρα. έκφραση ισομορφή ενεργοποιείται με ρύθμιση προς τα κάτω του

CTCF

, ρυθμίζεται προς τα πάνω με μείωση της CpG μεθυλίωσης προκαλείται από αδρανοποίηση των DNMT1 ή DNMT3b, και καταστέλλονται από την ενεργοποίηση του

p53

. Μελέτες εκτοπικά εκφραζόμενη ισομορφών έδειξε ότι όλα μεταφράζονται και εντοπισμένες στον πυρήνα. Χρησιμοποιώντας την όρχεις ειδικά σουλφοτρανσφερασών σερεβροσίδη (

CST) η

IGF2 /Η19

περιοχή ελέγχου αποτύπωση (ICR)

υποκινητή και, δείχθηκε ότι η πρόσδεση της BORIS ισομορφών στο DNA τους στόχους

στο vitro

είναι ευαίσθητα σε μεθυλίωση και εξαρτάται από τον αριθμό και την ειδική σύνθεση του ZF. Η ικανότητα να δεσμεύει το DNA στόχο και την παρουσία ενός ειδικού μακράς άμινο άκρο (N258) σε διάφορες ισομορφές είναι αναγκαίες και επαρκείς για την ενεργοποίηση

CST

μεταγραφής. αναλύσεις συγκριτική αλληλουχία αποκάλυψε μια εξελικτική έκρηξη σε θηλαστικά με ισχυρή διατήρηση των BORIS ισοπρωτεΐνες μεταξύ των πρωτευόντων θηλαστικών.

Συμπεράσματα

Το εκτεταμένο ρεπερτόριο συγκολλημένα

BORIS

παραλλαγές σε ανθρώπους που προσδίδουν ξεχωριστή DNA δεσμευτικές και μεταγραφικές ιδιότητες ενεργοποίησης και διαφορικών προτύπων αυτών της έκφρασης μεταξύ των γεννητικών κυττάρων και νεοπλαστικών κυττάρων δείχνουν ότι το γονίδιο εμπλέκεται σε μια σειρά από λειτουργικά σημαντικές πτυχές τόσο φυσιολογική γαμετογένεσης και την ανάπτυξη του καρκίνου. Επιπλέον, μια έκρηξη στη διαφοροποίηση ισομορφή μπορεί να συνδέεται εξελικτικά με μοναδικές πτυχές των πρωτευόντων ειδογένεσης

Παράθεση:. Pugacheva EM, Suzuki Τ, Pack SD, Kosaka-Suzuki Ν, Yoon J, Vostrov ΑΑ, et al. (2010) Η δομική πολυπλοκότητα του Ανθρώπου

BORIS

Gene στο Γαμετογένεση και τον καρκίνο. PLoS ONE 5 (11): e13872. doi: 10.1371 /journal.pone.0013872

Επιμέλεια: Sebastian Δ Fugmann, Εθνικό Ινστιτούτο Γήρανσης, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2 Ιούλ, 2010? Αποδεκτές: 11 Οκτ, 2010? Δημοσιεύθηκε: 8 Νοεμβρίου, 2010

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της δήλωσης Creative Commons Public Domain που ορίζει ότι, μόλις τοποθετηθεί στο δημόσιο τομέα, το έργο αυτό μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο σκοπό

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή υποστηρίζεται από την εντός των τειχών ερευνητικό πρόγραμμα του NIAID και από την εντός των τειχών επιχορήγηση από ΝΙΗ Γραφείο του AIDS Research για AVS και DL Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

εισαγωγή

BORIS

(αδελφός του ρυθμιστή της Τυπωμένες τοποθεσίες) είναι ένα παράλογο του πολυλειτουργικού

CTCF

γονίδιο, το οποίο εμπλέκεται στην ανάγνωση επιγενετικές σημάτων, ενεργοποίησης της μεταγραφής γονιδίων και καταστολή, απενεργοποίηση Χ-χρωμοσώματος, σχηματισμός χρωματίνη βρόχο μέσω διμερισμό και στην παγκόσμια τρισδιάστατη οργάνωση γονιδιώματος [1], [2], [3], [4], [5]. Ενώ οι δύο πρωτεΐνες μοιράζονται έναν κεντρικό 11 δακτύλου ψευδαργύρου (ZF) πεδίο σύνδεσης ϋΝΑ, έχουν διακριτές αμινο- και καρβοξυ-άκρα [2], [6]. Σε φυσιολογικούς ιστούς, οι δύο παράλογων γονίδια δείχνουν αλληλοαποκλειόμενες πρότυπα έκφρασης:

BORIS

mRNA είναι άφθονα σε άνδρες γεννητικά κύτταρα, ιδιαίτερα σε πρωτογενή σπερματοκύτταρα και στρογγυλά σπερματίδια, όπου

CTCF

, η οποία εκφράζεται παντού σε σωματικά κύτταρα, καταστέλλεται [2]. BORIS δρα ως μεταγραφικός ενεργοποιητής πολλαπλών γονιδίων στόχων όρχεις-ειδικά κατά τη διάρκεια της σπερματογένεσης, ενώ CTCF καταστέλλει τους ίδιους στόχους στα σωματικά κύτταρα [7], [8], [9]. Σε γεννητικά κύτταρα, BORIS προτάθηκε να συμμετέχουν στην επαναφορά της αποτύπωσης στο

IGF2 /Η19

περιοχή ελέγχου αποτύπωση (ICR) [10]. Σε αντίθεση, CTCF είναι η γνωστή αναγνώστη και προστάτης των

IGF2 /Η19

σήματα αποτύπωση σε σωματικά κύτταρα [11], [12], [13], [14], [15]. Ο διαχωρισμός των

BORIS

και

CTCF

έκφραση σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων στα θηλαστικά ελέγχεται αυστηρά. Κανονικά, CTCF, p53, και CpG μεθυλίωση καταστολή

BORIS

μεταγραφή σε σωματικά κύτταρα, περιορίζοντας αποτελεσματικά την έκφραση του να όρχεων γεννητικών κυττάρων [8], [16], όπου η απουσία CTCF [2], καθώς και διάφορα κύματα γονιδίωμα-ευρεία απομεθυλίωση δημιουργήσει τις προϋποθέσεις για

BORIS

ενεργοποίηση.

BORIS

είναι έκτροπα ενεργοποιείται σε πολλούς τύπους καρκινικών κυττάρων, η έκφρασή της που συμπίπτει με την απώλεια της CpG μεθυλίωσης, η πρώτη επιγενετική μεταβολή προσδιορίζονται σε καρκινικά κύτταρα [2], [6], [17]. Η ανώμαλη έκφραση του

BORIS

σε καρκινικά κύτταρα ενδέχεται αποτελέσματα σε διαγωνισμό μεταξύ πρωτεϊνών BORIS και CTCF για δέσμευση σε θέσεις δέσμευσης στόχου CTCF DNA (CTSes). BORIS μπορεί να παρεμβαίνει με τις λειτουργίες CTCF σε καρκινικά κύτταρα και όχι μόνο λόγω του ότι έχουν την ταυτόσημη ZF περιοχή σύνδεσης και επικαλυπτόμενων εξειδίκευση δέσμευσης DNA, αλλά και λόγω διακριτή αμινο- και καρβοξυ-άκρα τα οποία πιθανόν προσδίδουν ένα διακριτό σύνολο μοριακών λειτουργίες [2] . Πράγματι, τόσο CTCF και BORIS δεσμεύουν το

MAGE Α1

υποκινητή, αλλά με αντίθετες αποτελέσματα: ενώ CTCF δρα ως μεταγραφικός καταστολέας, BORIS λειτουργεί ως ενεργοποιητής [8]. Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε επίσης ότι BORIS και CTCF εκτελούν διάφορες λειτουργίες της μεταγραφής κατά τη σύνδεση με τον υποκινητή του ποντικιού όρχεων ειδικές

CST

παραλλαγή ματίσματος [9]. Εν κατακλείδι, αν και μοριακές λειτουργίες του BORIS στον καρκίνο απομένει να μελετηθεί σε βάθος, παρεκκλίνουσα συν-έκφραση του

CTCF

και

BORIS

είναι ένα από τα γονιδιακής έκφρασης υπογραφές χαρακτηριστικό πολλών μορφών καρκίνου [6 ].

Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η εξελικτική εμφάνιση του

BORIS

στο amniotes συνέβησαν πριν την απόκλιση των ερπετών και θηλαστικών και θα μπορούσε να αποδοθεί σε μια αρχική επικάλυψη ολόκληρου του

CTCF

αλληλουχία [18]. Ενώ BORIS εκφράζεται ευρέως στα ερπετά και Μονοτρήματα, η έκφραση φάνηκε να γονάδων ειδικά σε μαρσιποφόρα και eutherians, υποδεικνύοντας ότι BORIS έγινε λειτουργικά εξειδικευμένων κατά τη διάρκεια της εξέλιξης των θηλαστικών σε συνεννόηση με την εξέλιξη της γονιδιωματικής αποτύπωσης [18]. Ενώ

CTCF

είναι εξαιρετικά διατηρημένη από Drosophila στους ανθρώπους [18], [19], [20],

BORIS

κωδικοποίησης και μη-κωδικοποίησης ακολουθίες είναι εξελικτικά πλαστικά [18]. Πράγματι, μια σύγκριση της αμινο- και καρβοξυ-άκρα του ανθρώπινου

BORIS

με ορθόλογα σε άλλα είδη αποκαλύπτει σχετικά χαμηλή ομοιότητα, 32,3% και 23,7%, αντίστοιχα, ενώ το αντίστοιχο ομοιότητα του ανθρώπινου

CTCF

με άλλα ορθόλογα είναι 90,1% και 80,7%, αντίστοιχα. Παρ ‘όλα αυτά, η περιοχή BORIS ZF έχει 80.4% ταυτότητα με ορθόλογα του, παρόμοια με την διατήρηση 99,5% για CTCF zfs [18]. Η ταχεία εξέλιξη του

BORIS

δεν περιορίζεται σε αλληλουχίες που κωδικοποιούν πρωτεΐνη. Είναι αξιοσημείωτο ότι η δομή του τόπου ως σύνολο είναι σημαντικά διαφορετικά ακόμη και μεταξύ ποντικών και ανθρώπων, η οποία μπορεί να προτείνει ένα εξειδικευμένο σύνολο λειτουργιών ή /και ισομορφές ματίσματος. Το ανθρώπινο

BORIS

γονίδιο εκτείνεται σε πάνω από 29 kb σε 20q13 και αποτελείται από 11 εξώνια, 10 εκ των οποίων οι κωδικοποίησης [2]. Αυτό μπορεί να επιτρέψει την παραγωγή ενός αριθμού διαφορετικών ισομορφών με εναλλακτικό μάτισμα. Εξελικτικά, εναλλακτικό μάτισμα είναι το πιο ευρέως χρησιμοποιούμενο μηχανισμό για την αύξηση της κωδικοποίησης ικανότητα των μεταγραφών mRNA για να επιτρέψει την παραγωγή διαφορετικών πρωτεϊνών ισομορφών με ξεχωριστές δραστηριότητες.

Τα πρώτα στοιχεία για εναλλακτικές

BORIS

μεταγραφές προήλθε από η πρόσφατη απόδειξη ότι η ανθρώπινη

BORIS

εκφράζεται από τουλάχιστον τρεις εναλλακτικές υποστηρικτές χρησιμοποιώντας πέντε διακριτές 5 ‘UTRs [16]. Στην παρούσα μελέτη, η οποία χαρακτηρίζεται 23

BORIS

παραλλαγές ματίσματος με διακριτά προφίλ έκφρασης σε φυσιολογικό βλαστικής σειράς και τα καρκινικά κύτταρα, ενώ επιδεικνύουν επίσης δράση δεσμεύσεως απόκλιση DNA και ποικίλες μεταγραφικές ιδιότητες. Έτσι,

BORIS

εκφράζεται ως ρεπερτόριο εναλλακτικών μεταγραφές και πρωτεΐνες, υποδεικνύοντας ότι εναλλακτικό μάτισμα παράγει ένα πολύπλοκο μηχανισμό για BORIS μεσολάβηση λειτουργία στο βλαστικής σειράς και καρκινικά κύτταρα.

Αποτελέσματα

Πολλαπλές

οι BORIS

μεταγραφές εκφράζονται σε ανθρώπινους όρχεις, ES κύτταρα και κυτταρικές σειρές από διάφορα είδη καρκίνων

Είμαστε στο παρελθόν έδειξαν ότι η έκφραση του

BORIS

περιορίζεται σε όρχεις ιστούς και καρκινικά κύτταρα, με την έκφραση εξαρτάται από την κατάσταση μεθυλίωσης CpG εναλλακτικών

BORIS

υποκινητές [8], [16]. Κατά την ανάλυση

CTCF

και

BORIS

έκφρασης σε ανθρώπινους όρχεις, τα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα (ES), καθώς και αρκετές καρκινικές κυτταρικές σειρές με RT-PCR, ήμασταν σε θέση να ενισχύσουν το πλήρους μήκους ZF- που κωδικοποιεί τις περιοχές των δύο γονιδίων. Μόνο μια ενιαία ζώνη PCR ειδική για το

CTCF

τομέα ZF ανιχνεύθηκε σε όλους τους τύπους κυττάρων που εξετάστηκαν? Ωστόσο, πολλαπλές ζώνες PCR παράχθηκαν από τους εκκινητές ενίσχυσης του

BORIS

περιοχή που αντιστοιχεί στην περιοχή ZF (Εικ. 1Α). Αναλύσεις αλληλουχίας των κλωνοποιημένων

BORIS

PCR προϊόντων που εντοπίζονται μια σειρά από εναλλακτικές μεταγραφές με διαφορετικούς συνδυασμούς της ZF εξόνια που δημιουργήθηκαν λόγω της χρήσης εναλλακτικών θέσεων ματίσματος (Εικ. 1Α). Η αφθονία και την κατανομή των

BORIS

απομαγνητοφώνηση των παραλλαγών που διέφεραν μεταξύ καρκινικές κυτταρικές σειρές και σε όρχεις, γεγονός που υποδηλώνει διακριτούς μηχανισμούς ρύθμισης των

BORIS

γονίδιο στην κανονική βλαστική και καρκινικά κύτταρα.

(Α) Ολικά RNAs από την ενδεικνυόμενη κυτταρικές σειρές και όρχεις ιστό αναλύθηκαν με RT-PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές σχεδιασμένους για να ενισχύσουν το πλήρους μήκους

CTCF

και

BORIS

ZFS τομείς. Οι αλληλουχίες των εκκινητών φαίνονται στον Πίνακα S1. Nested PCR διεξήχθη με 20 και 35 κύκλους για πρώτο και δεύτερο γύρο, αντίστοιχα. Οι πηγές του RNA δείχνεται πάνω από κάθε γέλης. Βέλη δείχνουν προς την ενιαία

CTCF

απομαγνητοφώνηση και πολλαπλές

BORIS

εναλλακτικές μεταγραφές. (Β) Η στρατηγική 3 ‘RLM-RACE για την κλωνοποίηση εναλλακτικό μάτισμα

BORIS

μορφές. Τρεις

Οι BORIS

εναλλακτικές υποστηρικτές και 12 εξώνια με μη κωδικεύουσες αλληλουχίες (λευκά κουτιά) ή ακολουθίες κωδικοποίησης (γκρι κουτιά) που φαίνεται. Ολικό RNA από ενήλικους ανθρώπινους όρχεις και την κυτταρική σειρά Κ562 υποβλήθηκε σε επεξεργασία με κιτ GeneRacer PCR για την ενίσχυση των cDNA πλήρους μήκους. Ο πρώτος γύρος της PCR πραγματοποιήθηκε με τρία προς τα εμπρός ειδικών γονιδίων (GSP) εκκινητές Α, Β, και Γ που έχουν σχεδιαστεί για τον εντοπισμό του mRNA που εκφράζεται από τα αντίστοιχα εναλλακτικά

BORIS

προαγωγούς Α, Β ή C, αντίστοιχα. Το 3 ‘GeneRacer εκκινητή συνδέεται με το πολυ Α ουρά χρησιμοποιήθηκε ως αντίστροφος εκκινητής. l μΐ του μίγματος του πρώτου γύρου PCR χρησιμοποιήθηκαν ως πρότυπο για να εκτελέσει ένθετη PCR με τρία προς τα εμπρός ένθετα γονιδίου-ειδική (NGSP) εναρκτήρες A1, B1 και C1. (C) 3 ‘RLM-RACE διεξήχθη επί ανθρώπινους όρχεις και την κυτταρική γραμμή Κ562. Πολλαπλές

BORIS

μεταγραφές ανιχνεύτηκαν στα δύο δείγματα. Τα προϊόντα PCR του ένθετη PCR που φαίνεται διαχωρίστηκαν σε πηκτές αγαρόζης 1%. Μ είναι ο δείκτης μεγέθους.

Η

Γνωρίζοντας ότι CpG υπομεθυλίωση εμπλέκεται σε

BORIS

ενεργοποίησης [2], [8], [16], συγκρίναμε

BORIS

έκφραση στο κόλον HCT116 κυτταρική σειρά καρκίνου σε κύτταρα HCT116 σε επεξεργασία με 5aza-dC, και να HCT116 που φέρει διπλό knockout (ϋΚΟ) του

DNMT3b

και

DNMT1

[21]. Μια δραματική μείωση στο CpG μεθυλίωση σε HCT116 ϋΚΟ και τα κύτταρα HCT116 σε επεξεργασία με 5aza-dC, που περιγράφηκε προηγουμένως [21], συσχετίζεται με την εμφάνιση των πολλαπλών

BORIS

-ειδικές προϊόντα RT-PCR (Σχ. 1Α), η οποία απουσίαζαν στη γονική HCT116 κυτταρική γραμμή. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα ανθρώπινα κύτταρα ES βρέθηκαν να εκφράζουν τουλάχιστον δύο εναλλακτικές

BORIS

μεταγραφές, επιβεβαιώνοντας

BORIS

έκφρασης σε κυτταρικές γραμμές ES, όπως καταδεικνύεται προηγουμένως με ανοσοφθορισμό [22]. Ως εκ τούτου συμπεράνουμε ότι ενώ

CTCF

εκφράζεται ως ένα ενιαίο προϊόν μετεγγραφής σε ανθρώπινους όρχεις και καρκίνους,

BORIS

εκφράζεται ως πολλαπλές ισομορφές στους όρχεις, κύτταρα ES και σε καρκινικές κυτταρικές σειρές, συγκεκριμένα σε κύτταρα με αυξημένη υπομεθυλίωσης του DNA.

Είκοσι τρεις εναλλακτικό μάτισμα είναι

BORIS

ισομορφών που εκφράζονται σε όρχεις και σε καρκινικά κύτταρα

με αφορμή την προηγούμενη αναγνώριση μας από πέντε εναλλακτικών 5′-UTR μάτισμα

BORIS

παραλλαγές που δημιουργούνται από τρεις εναλλακτικές

BORIS

υποκινητές (Α, Β και Γ) [16], πραγματοποιήσαμε μια οθόνη πλήρους μήκους εναλλακτικό μάτισμα

BORIS

μεταγραφές σε ανθρώπινους όρχεις και καρκίνου κυτταρική γραμμή Κ562, τα κύτταρα με τα υψηλότερα επίπεδα του

BORIS

έκφρασης. Για την απομόνωση πλήρους μήκους

BORIS

εναλλακτικές μεταγραφές, χρησιμοποιήσαμε την προσέγγιση 3′-RLM-RACE που φαίνεται στο Σχήμα 1Β. Εμείς ενισχυμένο πολλαπλές

BORIS

RT-PCR προϊόντα που μετά κλωνοποιήθηκαν και αλληλουχήθηκαν (Εικ. 1 C). Από αυτό, εντοπίσαμε 19 προηγουμένως άγνωστη

BORIS

παραλλαγές ματίσματος (Εικ. 2). Οι δύο κύριες πηγές της ετερογένειας στο

BORIS

mRNAs ήταν η χρήση των εναλλακτικών φορέων και των θέσεων ματίσματος. Παρατηρήσαμε επίσης διαφορική χρήση των διακριτών 5′- και 3′-UTRs καθώς και εναλλακτικών πλαισίων μετάφραση στα αμινο- και καρβοξυ-τερματικές περιοχές κωδικοποίησης. Ευθυγράμμιση του

BORIS

γονιδιωματικής αλληλουχίας με εναλλακτικές μεταγραφές αποκάλυψε ότι τα όρια εξονίου-ιντρονίου είχαν κλασικό ακολουθίες θέσης ματίσματος (Πίνακας S4). Οι περισσότερες από τις εναλλακτικές

BORIS

μεταγραφές κατείχε μια ουρά polyA που βρίσκεται 20-30 bp προς τα κάτω από το κανονικό σήμα πολυαδενυλίωσης, ΑΑΙΙΑΑΑ (S1 File), υποδεικνύοντας ότι

BORIS

ισομορφές φθάσει στο στάδιο της έκφρασης, όπως ώριμο mRNA.

(Α) Σχηματική απεικόνιση του

BORIS

γονίδιο με τρεις εναλλακτικές υποστηρικτές και δεκαέξι εξώνια που χρησιμοποιούνται για την παραγωγή του 23 mRNAs ισομορφή. Τα εξώνια μεγέθη εμφανίζονται στο πλαίσιο του καθεστώτος, με ελάχιστο και μέγιστο αριθμό των νουκλεοτιδίων για τις εναλλακτικές εξώνια. Τα κωδικόνια έναρξης και διακοπής για ORF που αναφέρονται ως ATG και στάση, αντίστοιχα. Η πρώτη

BORIS

μεταγραφή αντιπροσωπεύει το αρχικά κλωνοποιημένο

BORIS

μορφή, που ορίζεται εδώ ως

B0

? του

BORIS

μεταγραφές φαίνονται παρακάτω είναι νέα κλωνοποιημένα ισομορφές. Στα αριστερά είναι τα ονόματα των

BORIS

ισομορφές, που αντιστοιχεί σε σχηματική αναπαράσταση δίνεται μεταγραφές. Στη δεξιά πλευρά, οι έξι

BORIS

υποοικογένειες, χωρίζονται με βάση παρόμοια άκρα 3 ‘, υποδεικνύονται. Οι κόκκινες και μπλε γραμμές στο πάνω ή το κάτω μέρος του σχηματική αναπαράσταση των ισομορφών απεικονίζουν τις θέσεις των Taqman ανιχνευτές. Οι αμετάφραστες περιοχές αντιπροσωπεύονται από ανοιχτά παράθυρα. Εσώνια (λεπτές γραμμές) δεν εμφανίζονται σε ακριβή κλίμακα. (Β) Το εναλλακτικό μάτισμα δημιουργεί μια νέα ZF στο

C6

ισομορφή. συγκρίσεις αλληλουχίας αμινοξέων της ZF 4

B0

και νέες εναλλακτικές ZF 4/9 του

C6,

που συνδυάζει το πρώτο μισό της ZF 4 και το δεύτερο μισό της ZF 9. (C) εναλλακτικό μάτισμα δημιουργεί μια νέα κωδικοποίηση διαχωριστικό ανάμεσα ZFS 5 και 6 στο

Α3

ισομορφή.

Η

το

BORIS

ισομορφές κατηγοριοποιήθηκαν ανάλογα με τη χρήση προωθητή (Σχ. 2Α ). Ισομορφές οδηγείται από υποκινητή Α περιλαμβάνονται

BORIS Α1

,

Α2

,

Α3, Α4, Α5

, και

A6

. Σε σύγκριση με το αρχικά περιγράφεται

BORIS

μεταγραφή [2], η οποία τώρα ορίζεται ως B0

BORIS

ισομορφή, ισομορφές

Α1

και

Α2

περιέχονται εναλλακτική UTRs 5 ‘, αλλά κωδικοποιημένο το ίδιο πολυπεπτίδιο BORIS (Σχ. 2Α, Πίνακας S3). Ισομορφή

A3

είχε αρκετά νέα χαρακτηριστικά που διακρίνονται από

B0

συμπεριλαμβανομένης μιας μακράς μη κωδικοποίησης 5 ‘UTR και τον αποκλεισμό από το εξώνιο 6 οφείλεται σε εναλλακτικό μάτισμα. Αυτό είχε ως αποτέλεσμα την παρουσία μόνο 9 ZFS, παρά το 11

BORIS B0

, αλλά και παρήγαγε ένα νέο μεγάλο διαχωριστικό μεταξύ ZF5 και ZF8 (Εικ. 2Α, C). Για ισομορφές

Α4

και

C2

, τα οποία αμφότερα κωδικοποιούν το ίδιο πολυπεπτίδιο, ORFs συνεχιστεί εσώνιο 4 μέχρι μία εναλλακτική κωδικόνιο λήξης ως αποτέλεσμα την περικοπή του τομέα ZF, ενώ ταυτόχρονα παράγει μια εναλλακτική COOH-άκρο . Ισομορφές

Α5

και

A6

τόσο κωδικοποιούνται 10 Πλήρης ZFS και το μισό του ZF11, το οποίο εναλλακτικά ματισμένες από εξόνιο 8 στο νέο εξώνια 9a ή 9a (1), αντίστοιχα, με αποτέλεσμα δύο εναλλακτικές καρβοξυ -termini. Η ισομορφή

Β1

έχει τα ίδια 10 κωδικοποιητικά εξώνια ως

BORIS B0

πρωτότυπο, αλλά διέθετε ένα πρόσθετο εξώνιο 11, το οποίο κωδικοποιείται μια εναλλακτική καρβοξυ-άκρο. Επιπλέον, ορισμένες ισομορφές είχε εναλλακτική αμινο-άκρα λόγω της χρήσης διαφορετικών κωδικονίων έναρξης, οι οποίες προκύπτουν από εναλλακτικό μάτισμα του εξονίου Eb στο εξώνιο 2 (σε

Β3

και

Β4

) ή εξόνιο 3 (στο

Β2, Β5, Β6, Β7

).

Οι περισσότεροι ήταν αναμενόμενο, μόνο 7 από 23

BORIS

ισομορφές κωδικοποιούσε πλήρους μήκους 11 ZF πρόσδεσης στο DNA τομέα, με τον αριθμό των ZF στις άλλες ισομορφές που κυμαίνονται από 1 έως 10 (S1 File, Πίνακας S3). Όπως φαίνεται από τα ακόλουθα παραδείγματα, οι μειώσεις του αριθμού των zfs προέκυψε από την χρησιμοποίηση των εναλλακτικών θέσεων ματίσματος και κωδικόνια τερματισμού. Η ισομορφή

C5

είχε μόνο ένα ZF και μια εναλλακτική καρβοξυ-άκρο που προκύπτει από μάτισμα από το μέσο του εξονίου 3 σε εξώνιο 10b. Ενώ ισομορφή

C8

περιέχονται όλα τα 11 εξώνια, η παρουσία ενός επιπλέον εξόνιο 6α με ένα κωδικόνιο τερματισμού εντός πλαισίου οδήγησε σε μόλις έξι ZFS. Αξίζει να σημειωθεί ότι, μάτισμα από εξόνιο 4 στο εξόνιο 8 στο ισομορφή

C6

δημιούργησε ένα νέο υβριδικό της ZF που αποτελείται από το ήμισυ της ZF 4 και το μισό της ZF 9. Αυτό αυξάνει την πιθανότητα ότι το νέο ZF θα μπορούσε να προσδώσει νέες ιδιότητες δέσμευσης στο DNA αυτή η ισομορφή (Εικ. 2Β). Τέλος, ορισμένα εναλλακτικά εξόνια, όπως 5α σε

Β6, Β7, C7

, και

C9

, διατήρησε ιντρονικές ακολουθίες που ενσωματώνονται πρόωρη κωδικόνια τερματισμού, και ως εκ τούτου δεν μπορεί να παράγει σταθερή πρωτεΐνη λόγω της ανοησίες μεσολάβηση mRNA αποσύνθεσης (NMD) μονοπάτι, μια δυνατότητα που θα πρέπει να ελεγχθούν πειραματικά.

χαρακτηριστικά στοιχεία του

BORIS

εναλλακτικές παραλλαγές και εξελικτική διατήρηση τους σε ανθρώπους και μη ανθρώπινα πρωτεύοντα

το 23

BORIS

παραλλαγές ματίσματος mRNA έχουν τη δυνατότητα να κωδικοποιήσουν 17 διαφορετικά πολυπεπτίδια που έχουμε ορίσει ως πρωτεΐνες ισομορφή BORIS 1 έως 17. για να κατηγοριοποιήσει τις ισομορφές, η εναλλακτική αμινο- και καρβοξυ-άκρα ονομάστηκαν σύμφωνα με τον αριθμό των υπολειμμάτων αμινοξέων ανάντη και κατάντη της περιοχής ZF, αντίστοιχα (Πίνακας S3). Για παράδειγμα, N258 υποδηλώνει μία αμινο-άκρο με κατάλοιπα 258 αμινοξέων ανοδικά της περιοχής ZF που κωδικοποιείται σε πολλές

BORIS

ισομορφών συμπεριλαμβανομένης

B0, B1, Α3, Α4, Α5, Α6, C3, C4, C5, C6, C7 /C9

και

C8

. Αξίζει να σημειωθεί ότι, N24 και Ν53, ακρωτηριασμένες εκδοχές του N258, δεν έχουν διαφορές αμινοξέων με N258 εντός των 24 και 53 αμινοξέα ανοδικά από ZF1. Έντεκα εναλλακτική καρβοξυ-άκρα βρίσκονται σε διακριτές ισομορφές που ορίζονται ως «C», με τον αριθμό τους αντιστοιχεί με τον αριθμό των κωδικονίων κατάντη του τελευταίου ZF. Για παράδειγμα,

Β1

έχει C132,

C3

έχει C97,

C5

έχει C53, κλπ (File S1, Πίνακας S3).

Για να η αναζήτηση για ομολογία με γνωστές πρωτεΐνες ή τομείς, οι έντεκα μοναδική εναλλακτική λύση C-άκρα συγκρίθηκαν με BLAST με αλληλουχίες αμινοξέων GenBank. Μόνο μία εναλλακτική καρβοξυ-άκρο, C97, έδειξε σημαντική ομοιότητα με πολλαπλές πρωτεΐνες μη BORIS, συμπεριλαμβανομένων αρκετών που εμπλέκονται στις διαδικασίες της μεταγραφής ή της μετάφρασης (Εικ. S2). Αυτό το πρόσφατα αναγνωρισμένη υποθετικό πεδίο είναι μια προηγουμένως μη χαρακτηρισμένα συστατικό ενός γνωστού ελικάση-όπως τομέα (COG0553). Περαιτέρω αναλύσεις εναλλακτικών 3’UTRs ορισμένων ισομορφών αποκάλυψε την παρουσία ειδικών επαναληπτικών στοιχείων DNA. Για παράδειγμα, ένα μέρος της 3’UTR για το

Β6

και

C7

ισομορφές ανήκει σε Alu-J συναίνεση. Το 3’UTR της ισομορφής

Β1

είναι επίσης εξαιρετικά επαναλαμβανόμενες στην ανθρώπινη και πρωτευόντων γονιδιώματα. Ισομορφές

C3, Β2, Β3, C4, C5

, και

C8

έχει το πρωτεύον ειδικό επαναλαμβανόμενο στοιχείο του DNA, MER1 [23] στην 3’UTRs τους.

το γεγονός ότι

οι BORIS

ισομορφές συντηρημένα σε άλλα είδη προτείνει βιολογική σημασία τους. Για παράδειγμα, όλα τα χαρακτηριστικά της ανθρώπινης

BORIS

ισομορφές είναι πολύ συντηρημένες στους πιθήκους

Pan troglodytes

και

Macaca mullata,

με συντηρημένες θέσεις ματίσματος και οι αντίστοιχες πρωτεΐνες ταυτότητες που κυμαίνονται από 96 % έως 100% και από 53% έως 97%, αντίστοιχα (Εικ. 3). Μεταξύ των πιο συντηρημένη C-άκρα είναι: C95 (με τις ταυτότητες των 99% και 89% σε χιμπατζή και μακάκους, αντίστοιχα), C97 (97% και 91%), C68 (98% και 96%), C35 (100% και 97%), και C24 (96% και 96%). C132 είναι εντόνως διατηρημένο στο χιμπατζή (96%), αλλά σε μικρότερο βαθμό σε μακάκους (53%). Αν και η εναρμόνιση των ανθρώπινων

BORIS

ισομορφές με την γονιδιωματική θέση του ποντικιού αποκάλυψε αρκετές υποθετικές ποντίκι BORIS καρβοξυ-τέρματα (C95, C90, C35, και C34), τα επίπεδα ομολογία ήταν μάλλον χαμηλή, που κυμαίνεται από 9% έως 42% . Αυτό υποδηλώνει ότι ο ρυθμός της

BORIS

εξέλιξη στα θηλαστικά ήταν αρκετά γρήγορη και η πολυπλοκότητα των

BORIS

τόπου πιθανό συνέπεσε με την εμφάνιση των πρωτευόντων. Το γεγονός ότι ο ποντικός

Boris

locus δεν έχει το ίδιο φάσμα των ισομορφών όπως ανθρώπους ή άλλα πρωτεύοντα μπορεί να σχετίζεται με πρωτευόντων ειδικών εξέλιξη των αλληλουχιών ιντρονίου του

BORIS

loci [18]. Μένει να εξακριβωθεί αν τα ποντίκια έχουν εναλλακτικές

Μπόρις

ισομορφή είδη. Αν υπάρχουν, θα πρέπει να αναμένεται ότι θα είναι διαφορετικές από εκείνες των ανθρώπων παρά τη διατήρηση των θέσεων ματίσματος. Η εμφάνιση των ισομορφών σε πρωτεύοντα θηλαστικά μπορεί έτσι να αποδοθεί στην υποθετική εσονικές ενισχυτές ματίσματος.

(Α) Ποσοστό ταυτότητα του ανθρώπου (

H.sapiens

) BORIS ισομορφών C-τέρματα σε υποθετικές εναλλακτικές αμινοξύ ακολουθίες εκείνες του χιμπατζή (

P.troglod.

), μακάκος (

M.mulatta

), και το ποντίκι (

M.mus

.). Έντεκα εναλλακτικές C-άκρα βρίσκονται σε διακριτές ισομορφές ορίζονται από τον αριθμό των κωδικονίων κατάντη του τελευταίου ZF. Ο πίνακας δείχνει τα ονόματα των BORIS ισομορφών με αντίστοιχη C-άκρα και την ταυτότητά τους σε ποσοστό. (Β) Ευθυγράμμιση της BORIS εναλλακτικών C-τέρματα στον άνθρωπο, χιμπατζή, μακάκος και το ποντίκι. Οι εναλλακτικές αλληλουχίες αμινοξέων της ανθρώπινης, χιμπατζή, μακάκος και ποντικού ευθυγραμμίζονται με ClustalW (Vector ΝΤΙ). παραλλαγές ματίσματος Ανθρώπινα BORIS είναι πολύ συντηρημένες σε πρωτεύοντα, αλλά όχι σε ποντίκια. αλληλουχίες αμινοξέων για μερικά από BORIS εναλλακτικών C-άκρα (C132, C97, C68, C53, C36, C30, C24) είναι εντελώς απούσα σε ποντίκια. Κίτρινο τονίζεται αλληλουχίες είναι 100% ίδια με την ανθρώπινη αλληλουχία αμινοξέων? το μπλε επισήμανση δείχνει συντηρητικές αντικαταστάσεις σε σχέση με τα ανθρώπινα ομόλογες αλληλουχίες BORIS. Τελείες δείχνουν προσθήκες ή διαγραφές.

Η

Εναλλακτικές

Οι BORIS

μεταγραφές εκφράζονται σε φυσιολογικά αρσενικά και θηλυκά γονάδες

Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι η έκφραση του

BORIS B0

σε φυσιολογικούς ανθρώπινους ιστούς περιορίζεται σε όρχεις [2]. Για την ανάλυση των προτύπων

BORIS

έκφραση ισομορφή σε όρχεις, σχεδιάσαμε μία σειρά εκκινητών και ανιχνευτών Taqman για να ενισχύσουν τις εναλλακτικές μεταγραφές από qRT-PCR. Μόνο 8 από 23

BORIS

ισομορφές θα μπορούσαν να διακριθούν ειδικά από qRT-PCR, επειδή οι περισσότερες ισομορφές μοιράζονται ακολουθίες, καθιστώντας αδύνατο για το σχεδιασμό εκκινητών και ανιχνευτών που θα ανιχνεύουν κάθε

BORIS

ισομορφή ως ξεχωριστό είδος . Κατά συνέπεια, έχουμε λειτουργικά διαιρείται τις 23 ισομορφές σε έξι υποοικογένειες (SF1 να SF6) βασίζεται στη μοναδική 3 ‘τερματικές ακολουθίες τους, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν για να σχεδιάσουν 6 ανιχνευτές Taqman για qRT-PCR (Σχ. 2Α, Υλικά και Μέθοδοι). Μεταξύ 13 και 13 ενήλικα εμβρυϊκούς ιστούς που εξετάστηκαν, η έκφραση των έξι

BORIS

υποοικογένειες ανιχνεύθηκε μόνο σε ενήλικους όρχεις και σε εμβρυϊκά ωοθήκη, αλλά τα σχετικά επίπεδα έκφρασης ισόμορφου ήταν αναπαραγώγιμα διαφορετικές στους δύο ιστούς (Σχ. 4Α ,ΣΙ). Σε ενήλικους όρχεις, και τα έξι υπο-οικογένειες εκφράστηκαν σε συγκρίσιμα επίπεδα, με SF1 είναι η πιο διαδεδομένη ομάδα, που εκφράζεται σε περίπου 1,3 έως 3 φορές υψηλότερα επίπεδα από ό, τι τα άλλα πέντε υποοικογένειες (Σχ. 4Α). Αντίθετα, SF3 ήταν η πιο διαδεδομένη μορφή σε εμβρυϊκά ωοθήκες (σχ. 4Β), που εκφράζεται σε επίπεδα περίπου 4 φορές υψηλότερη από ό, τι SF1 και SF4, και 11- έως 127-φορές υψηλότερη από ό, τι στις ομάδες SF6, SF2, και SF5 ( Σχ. 4Β). Ενώ μεταξύ των ενήλικων ιστών μόνο όρχεις ήταν ισχυρώς θετικός για

BORIS

ισομορφές, αυτά εκφράστηκαν σε πολύ χαμηλά αν και αναπαραγώγιμα επίπεδα σε αρκετούς ιστούς του εμβρύου πίνακα, συμπεριλαμβανομένων των όρχεων, του δέρματος, και σπλήνα (Εικ. 4Β). Αυτό υποδηλώνει ότι

BORIS

ισομορφών μπορεί να είναι λειτουργικά ενεργό έξω από την βλαστική κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης.

ανάλυση qRT-PCR του

BORIS

έκφραση ισομορφή σε κανονικό ενήλικα άνθρωπο (Α) και εμβρύου (Β) ιστούς, αντίστοιχα, προσδιορίστηκε ποσοτικά από την προσέγγιση απόλυτη ποσοτικοποίηση. Το 23

BORIS

ισομορφές χωρίστηκαν σε 6 υπο-οικογένειες με βάση το μοναδικό 3 ‘άκρου αλληλουχίες τους για να καταστεί δυνατός ο σχεδιασμός της Taqman ανιχνευτές (Υλικό και Μέθοδοι). (C)

BORIS

έκφραση ισομορφή στην ανθρώπινη φυσιολογική ενήλικους όρχεις αναλύονται από

in situ υβριδισμού

, RNA FISH. Για τις δοκιμασίες FISH, οι ανιχνευτές για έξι

BORIS

υποοικογένειες (SF1-SF6) σημάνθηκαν με διγοξυγενίνη-11-dUTP με PCR και ατομικά υβριδοποιήθηκαν σε ανθρώπινους όρχεις φορμαλδεΰδη ενηλίκων. Τα πλακίδια επωάστηκαν με αντι-DIG αντισώματα όλη τη νύχτα και στη συνέχεια οπτικοποιήθηκαν με δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με ροδαμίνη-. Για τον εντοπισμό σπερμογονίων και σπερματοκύτταρα, πραγματοποιήσαμε ανοσοχρώση με αντισώματα έναντι SCP3 (κόκκινο) και Ε-καδερίνης (ανοιχτό πράσινο), αντίστοιχα. Συγχωνευθείσας εικόνες DAPI-βάφονται πυρήνες (μπλε) και

BORIS

ισομορφή RNA (κόκκινο) που λαμβάνονται με μεγέθυνση 20x? εικόνες υψηλότερης μεγέθυνσης είναι 63X. Βέλη με γράμματα δείχνουν: SG-σπερμογονίων, Sc – σπερματοκύτταρα, St – σπερματίδια (μικρά, επιμήκη κύτταρα με επιμήκεις πυρήνες, αντίστοιχα). Ο έλεγχος (CTR) είναι χρώση με δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με ροδαμίνη μόνο. ​​

Η

Για τον προσδιορισμό των συγκεκριμένων τύπων κυττάρων που εκφράζουν

BORIS

ισομορφές σε ενήλικους όρχεις, θα πραγματοποιηθεί RNA

in situ υβριδισμό χρησιμοποιώντας

σταθερό παρασκευάσματα των φυσιολογικών ανθρώπινων όρχεων. Η ανοσοχρώση των όρχεων με αντισώματα προς SCP3 και Ε-καδερίνης χρησιμοποιήθηκε για τη διάκριση σπερμογονίων και σπερματοκύτταρα, αντίστοιχα, ενώ σπερματίδια ταυτοποιήθηκαν μορφολογικά ως μικρά και επιμήκη κύτταρα με επιμήκεις πυρήνες (Εικ. 4C, E-cad, SCP3). Μετά τον υβριδισμό με έξι επισημασμένο PCR ανιχνευτές σχεδιασμένους να ανιχνεύουν ειδικά κάθε μία από τις έξι

BORIS

υποοικογένειες, ισομορφή μεταγραφές ανιχνεύτηκαν σε σχεδόν όλα τα στάδια της σπερματογένεσης (Εικ. 4C). Και οι έξι

BORIS

υποοικογένειες μεταγραφή ήταν λιγότερο άφθονα στο κυτταρόπλασμα σπερμογονίων από σπερματοκυττάρων, ενώ σπερματίδια ήταν άκρως θετικό για

BORIS

SF2 και οριακά θετικό για SF5 και SF6. Έτσι, SF2, SF5 και SF6 φαίνεται να χαρακτηρίσει τα μεταγενέστερα στάδια της σπερματογένεσης από σπερματοκυττάρων να σπερματίδια. Μια προηγούμενη μελέτη [2] χρησιμοποιώντας το κοτόπουλο αντι-BORIS αντίσωμα και ένα 5 ‘άκρο-σημασμένο

BORIS

καθετήρα, τόσο ειδικά για το τέρμα N258, έδειξε ότι η έκφραση του

BORIS B0

ισομορφή ήταν περιορίζεται κυρίως σε σπερματοκύτταρα. Η παρούσα εργασία συμπληρώνει την προηγούμενη εκτίμησή μας για

BORIS

μεταγραφή εντοπισμού, παρέχοντας στοιχεία για την έκφραση όλων των έξι

BORIS

υποοικογένειες σε ενήλικες ανθρώπινους όρχεις. Η φαινομενική διαφορική έκφραση των επιμέρους υπο-οικογένειες κατά τη διάρκεια της εξέλιξης από νωρίς για να μεταγενέστερα στάδια της σπερματογένεσης δείχνει ότι η έκφραση του

BORIS

ισομορφές ρυθμίζεται αναπτυξιακά.

BORIS

ισομορφές κωδικοποιούν τον καρκίνο του υποθετικού -testis αντιγόνα

Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι το

BORIS B0

ισομορφή είναι ασυνήθιστα εκφράζεται σε πολλούς τύπους ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων τόσο των πρωτογενών καρκίνων και καρκινικές κυτταρικές σειρές, το οποίο χαρακτηρίζεται ως κωδικοποιεί μια υποθετική καρκινογόνες αντιγόνο όρχεις (CTA) [6], [8], [24], [25], [26]. Για να κατανοήσουμε τη σημασία του που ανακαλύφθηκαν πρόσφατα πολλαπλές

BORIS

ισομορφές στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου, ελέγξαμε το NCI-60 καρκίνου του πίνακα κυτταρική σειρά με RT-PCR και διαπίστωσε ότι περίπου το 70% αυτών των κυτταρικών σειρών που εκφράζονται μεταγραφές μερικοί ισομορφές (Εικ. 5Α). Οι περισσότερες από τις θετικές γραμμές, ωστόσο, εξέφρασαν επίπεδα

BORIS

μεταγραφές που ήταν αρκετά χαμηλή σε λιγότερο από 500-1.500 μεταγραφές ανά 50 ng του συνολικού RNA. Παρ ‘όλα αυτά, τα επίπεδα ήταν επαρκή για να ανιχνεύσουν δύο διαφορετικά πρότυπα του

BORIS

έκφραση ισομορφή. Το πρώτο πρότυπο, παράδειγμα στο σχήμα 5Β για την κυτταρική γραμμή Κ562, σχετίστηκε με πάνω από 20.000

BORIS

μεταγραφές (άθροισμα όλων των έξι

BORIS

υποοικογένειες) ανά 50 ng ολικού RNA. Σε αυτό το υποσύνολο των κυτταρικών σειρών (8 από 60, 13% του πίνακα NCI-60), SF1 μεταγραφές ήταν παρόντες στα υψηλότερα επίπεδα, κατά μέσο όρο περίπου 3 φορές υψηλότερη από τα επίπεδα για SF2, 10 φορές υψηλότερη από ό, τι για SF3 και SF4, 50 φορές υψηλότερη από ό, τι για SF6, και πάνω από 100 φορές υψηλότερη από ό, τι για SF5 (Εικ. 5Β). Οι κυτταρικές γραμμές που δείχνουν αυτό το μοτίβο έκφρασης προήλθαν από διαφορετικούς ιστούς, συμπεριλαμβανομένων των ωοθηκών, του πνεύμονα, του μαστού, του αίματος, και του δέρματος, που δείχνει ότι η έκφραση του

BORIS

ισομορφές δεν συνδέεται ειδικά με καρκίνους του ιδιαίτερη προελεύσεων.

(Α) Η

οι BORIS

υποοικογένειες απορυθμίζεται σημαντικά σε καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα. Για φυσιολογικά κύτταρα (Ν) – την έκφραση του

BORIS

ισομορφές αναλύθηκε σε 13 ιστούς και 4 πρωτογενείς κυτταρικές γραμμές. Για τα κύτταρα όγκου (Τ) – αναλύθηκαν τα καρκινικές κυτταρικές σειρές NCI-60. 59 από τις κυτταρικές σειρές καρκίνου NCI-60, 13 φυσιολογικούς ιστούς, και 4 κανονικές πρωτογενείς κυτταρικές σειρές αναλύθηκαν από την απόλυτη προσέγγιση ποσοτικοποίηση με κανονικοποίηση με τα επίπεδα του GAPDH, και σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας μια λογαριθμική κλίμακα. Επίπεδα

BORIS

έκφραση ισομορφή διαφέρουν σημαντικά (από 0 έως 60000 μεταγραφές ανά 50 ng του συνολικού RNA). Κόκκινες γραμμές δείχνουν μέσες τιμές για κάθε

BORIS

υποοικογένεια. (Β) Το πρώτο πρότυπο του

BORIS

έκφραση ισομορφή σε NCI-60 τα καρκινικά κύτταρα, όπως αντιπροσωπεύεται από την κυτταρική σειρά καρκίνου του Κ562. (Γ) Το δεύτερο μοτίβο του

BORIS

ισομορφών έκφραση σε NCI-60 του πίνακα εξηγείται από την κυτταρική σειρά καρκίνου Ovcar3. (D-J)

BORIS

ισομορφών έκφραση αναλύονται με RPA. Δείγματα ολικού RNA που λαμβάνεται από νεφρό, όρχεις και κυτταρική γραμμή Κ562 υβριδοποιήθηκαν με

32Ρ-σημασμένο αντιπληροφοριακό RNA ανιχνευτές. Τα θραύσματα που προστατεύονται RNase (κεφαλές βελών) ανιχνεύθηκαν μόνο σε όρχεις και Κ562, αλλά όχι στο νεφρό. Η πρώτη λωρίδα σε κάθε πηκτή είναι ένας έλεγχος, ένα άπεπτο ανιχνευτή που επωάστηκε με RNA ζύμης. (D) RPA με ριβοανιχνευτή SF1 /SF5 αποδίδει 154 bp και 40 bp θραύσματα, που αντιστοιχεί σε SF1 και SF5, αντίστοιχα. (ΝΤΟ).