Αφηρημένο

Ιστορικό

Το ενδοθήλιο δεν είναι ένα ομοιογενές όργανο. Τα ενδοθηλιακά ετερογένεια των κυττάρων έχει περιγραφεί στο επίπεδο της μορφολογίας των κυττάρων, τη λειτουργία, τη γονιδιακή έκφραση, και η σύνθεση αντιγόνου. Ως συνέπεια της γενετικής, μεταγραφικό και γύρω ποικιλομορφία περιβάλλον, τα ενδοθηλιακά κύτταρα από διαφορετικά αγγειακά έχουν διαφοροποιηθεί λειτουργίες και φαινότυπο. Ανίχνευση κυκλοφορούντων ενδοθηλιακών κυττάρων (ΧΚΕ) με κυτταρομετρία ροής είναι μια προσέγγιση που χρησιμοποιείται ευρέως σε ασθενείς με καρκίνο, και τον αριθμό, τη βιωσιμότητα και την κινητική τους είναι ένα πολλά υποσχόμενο μέσο για τη διαστρωμάτωση ασθενή που λαμβάνει αντι-αγγειογενετική θεραπεία.

Μεθοδολογία /Principal Εκτίμηση

Σήμερα ΜΑΕΚ είναι χαρακτηρισμένα ως θετικά για ένα πυρηνικό αντιγόνο δέσμευσης (DNA +), αρνητικό για τον CD45 δείκτη τηγάνι λευκοκυττάρων, και θετικά για CD31 και CD146. Μετά από μια προσέγγιση επικυρωθεί πρόσφατα στο εργαστήριο μας, μελετήσαμε την έκφραση του CD109 επί ΧΚΕ από το περιφερικό αίμα ασθενών υγιούς ατόμου και του καρκίνου. Η ενδοθηλιακή φύση αυτών των κυττάρων ελέγχθηκε με RT-PCR για την παρουσία του επιπέδου m-RNA του CDH5 (Ve-Cadherin) και CLDN5 (Claudin5), δύο ενδοθηλιακά ειδικά μεταγραφές. Πριν από τη θεραπεία, σημαντικά υψηλότερα επίπεδα CD109 + CECs και βιώσιμη CD109 + CECs βρέθηκαν σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού και ασθενείς γλοιοβλαστώματος σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες, και ο αριθμός τους μειώθηκε σημαντικά μετά τη θεραπεία. Τα υψηλότερα επίπεδα των ενδοθηλιακών συγκεκριμένες μεταγραφές εκφράζονται σε αναπτυσσόμενες ενδοθηλιακά κύτταρα CLEC14a, TMEM204, ARHGEF15, GPR116, παρατηρήθηκαν σε ταξινομημένη CD109 + CECs σε σύγκριση με διαλεγμένα CD146 + CECs, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτά τα γονίδια μπορούν να διαδραματίσουν σημαντικό ρόλο, όχι μόνο κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης, αλλά και σε ενηλίκων αγγειογένεση. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα επίπεδα του mRNA της TEM8 (προσδιορίζονται ως Antrax τοξίνη Receptor1, Antrax1) εκφράστηκαν σε CD109 + CECs + αλλά όχι στο CD146 + ΧΚΕ.

Συμπέρασμα

Όλα μαζί τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι CD109 αντιπροσωπεύουν σπάνιο πληθυσμό των κυκλοφορούντων καρκινικών ενδοθηλιακά κύτταρα, τα οποία παίζουν ένα δυνητικά χρήσιμο προγνωστικό ρόλο σε ασθενείς με γλοιοβλάστωμα. Ο ρόλος της έκφρασης CD109 σε καρκινικά ενδοθηλιακά κύτταρα σκάφος ειδικό αξίζει να εξεταστεί περαιτέρω με μελέτες γονιδιακής έκφρασης

Παράθεση:. Mancuso P, Calleri Α, Gregato G, Labanca V, QUARNA J, Antoniotti P, et al . (2014) ένας υποπληθυσμός των κυκλοφορούντων ενδοθηλιακά κύτταρα εκφράζουν CD109 και εμπλουτίζεται στο αίμα των ασθενών με καρκίνο. PLoS ONE 9 (12): e114713. doi: 10.1371 /journal.pone.0114713

Επιμέλεια: Lu-Gang Yu, το Πανεπιστήμιο του Λίβερπουλ, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 5 Μάη του 2014? Αποδεκτές: 13 Νοεμβρίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 15, Δεκεμβρίου 2014

Copyright: © 2014 Mancuso et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά στοιχεία και δικαιολογητικά στοιχεία που προέρχονται από τα αρχεία κυτταρομετρία ροής και η μελέτη της μοριακής βιολογίας είναι μέσα στο χαρτί

Χρηματοδότηση:. Υποστηρίζεται εν μέρει από AIRC (Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro), Fondazione Umberto Veronesi, και Ministero della Salute. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η αγγειογένεση παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη και την εξέλιξη του όγκου [1] – [3] και με βάση τη θεωρία ότι η στόχευση των ενδοθηλιακών κυττάρων μπορεί να είναι μια πιο αποτελεσματική στρατηγική από τη στόχευση κυττάρων όγκου, κατά την τελευταία δεκαετία πολλές αντι οι -angiogenic φάρμακα έχουν εισαχθεί στο κλινικό περιβάλλον [4] – [8].

προκειμένου να εκτιμηθεί κυκλοφορούν βιοδείκτες της αγγειογένεσης που μπορεί να προβλέψει το αποτέλεσμα να αντιαγγειογενετικές θεραπείες σε ασθενείς με καρκίνο, πολλές προσεγγίσεις έχουν δοκιμαστεί σε τόσο προκλινικές και κλινικές μελέτες [9] – [11] και μεταξύ αυτών η ποσοτικοποίηση των κυκλοφορούντων ενδοθηλιακών κυττάρων (ΧΚΕ) με κυτταρομετρία ροής έχει βρει ευρεία εφαρμογή [12] – [14].

ΜΑΕΚ είναι ώριμα ενδοθηλιακά κύτταρα απελευθερώνονται από σκάφη κατά τη διάρκεια της φυσιολογικής ενδοθηλιακών κύκλο εργασιών ή, σε ασθενείς με καρκίνο, από το αγγειακό σύστημα του όγκου, όπου πιθανόν αντανακλούν ενδοθηλιακή βλάβη ή δυσλειτουργία. Αυτά τα κύτταρα αυξάνονται σε ασθενείς με καρκίνο, σε σύγκριση με υγιή άτομα, και τις τροποποιήσεις τους, σε αριθμό και τη βιωσιμότητα έχει δείξει προγνωστική, προγνωστικών, δυναμική ή διαφυγής αξία βιοδείκτη [15] – [18].

Το ενδοθήλιο δεν είναι ομοιογενές οργάνων. Τα ενδοθηλιακά ετερογένεια των κυττάρων έχει περιγραφεί στο επίπεδο της μορφολογίας των κυττάρων, τη λειτουργία, τη γονιδιακή έκφραση, και η σύνθεση του αντιγόνου [19]. Ως συνέπεια της γενετικής, μεταγραφικό και γύρω ποικιλομορφία περιβάλλον, τα ενδοθηλιακά κύτταρα από διαφορετικά αγγειακά έχουν διαφοροποιηθεί λειτουργίες και φαινότυπο [20] – [24]. [35],

Σήμερα ενδοθηλιακούς δείκτες χρησιμοποιούνται για την ταυτοποίηση ΧΚΕ είναι CD34, CD31 και CD146, σε συνδυασμό με CD45, να αποκλείσει λευκοκύτταρα, και ένα δείκτη πυρηνική χρώση (όπως Syto 16, Hoechst ή DRAQ5) για την εξάλειψη καταμέτρηση των μη κυτταρικό ενδοθηλιακών μικροσωματιδίων [14], [25] – [26].

το γονίδιο κωδικοποιεί μια CD109 γλυκοσυλ-phosphatidylinositolanchored γλυκοπρωτεΐνη που είναι μέλος του άλφα (2) μακροσφαιρίνη /C3, C4, C5 οικογένεια του θειοεστέρα που περιέχουν πρωτεΐνες [27]. CD109 αλληλεπιδρά άμεσα με τον τύπο Ι παράγοντα μετασχηματισμού -βήτα ανάπτυξης (ΤΟΡ-β) υποδοχέα σηματοδότησης και αρνητικά διαμορφώνει ΤΟΡ-β σηματοδότηση [28]. Εκφράζεται σε έναν υποπληθυσμό των κυττάρων CD34 + [29], σε ενεργοποιημένα αιμοπετάλια και ενεργοποιημένα Τ-κύτταρα [30] και σε έναν υποπληθυσμό των ενδοθηλιακών κυττάρων [31]. Είναι ενδιαφέρον, έχει αναφερθεί ότι CD109 είναι ένας από τους 12 δείκτες ενδοθηλιακών υπερ-εκφράζεται σε ενδοθηλιακά κύτταρα όγκου [23], [24]. Προκειμένου να αποκτήσουν μια πιο ολοκληρωμένη κατανόηση της CEC φαινότυπο, ερευνήσαμε την έκφραση του CD109 επί καλλιεργημένων ενδοθηλιακών κυττάρων και CECs από το περιφερικό αίμα των ασθενών υγιούς ατόμου και του καρκίνου. Χρησιμοποιήσαμε ένα κυτταρομετρία ροής προσέγγιση επικυρωθεί στο εργαστήριο μας και η ενδοθηλιακή φύση αυτών των κυττάρων ελέγχθηκε με RT-PCR και γονιδιακή έκφραση.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Όλοι οι ασθενείς έδωσαν γραπτή συγκατάθεση πριν ένταξη στο θεραπευτικό πρωτόκολλο και για ερευνητικούς σκοπούς. Όλα κλινικής έρευνας διεξήχθησαν σύμφωνα με τις αρχές που διατυπώνονται στη Διακήρυξη του Ελσίνκι

Για ασθενείς με καρκίνο του μαστού: Η δίκη διεξήχθη στο Ευρωπαϊκό Ινστιτούτο Ογκολογίας, Μιλάνο, Ιταλία και εγκρίθηκε από το «IRCCS – Istituto Europeo. di Oncologia e Centro Cardiologico Monzino «επιτροπή ηθική και καταχωρηθεί στη βάση δεδομένων Ινστιτούτο (# 2007-006025-27)

Για τους ασθενείς γλοιοβλάστωμα:. Η δίκη διεξήχθη στο Ινστιτούτο Νευρολογικών» Carlo Besta »του Μιλάνου, Ιταλία και εγκρίθηκε από το «Regione Lombardia Sezione Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Besta» επιτροπή ηθική και καταχωρηθεί στη βάση δεδομένων Ινστιτούτο (# 1/08).

Ανίχνευση του CD109 στα ενδοθηλιακά αποικίες

για την επικύρωση από κυτταρομετρία ροής, η έκφραση του CD109 σε ενδοθηλιακά κύτταρα, in vitro ενδοθηλιακών αποικίες ελήφθησαν από το περιφερικό αίμα (ΡΒ) 10 υγιών δοτών (7 γυναίκες, 3 άνδρες) και 23 ασθενείς με καρκίνο, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32].

Εν συντομία, μονοπύρηνα κύτταρα (ΤΜΧ) απομονώθηκαν από ΡΒ χρησιμοποιώντας Ficoll-Paque φυγοκέντρηση βαθμίδωσης, επαναιωρήθηκαν σε μέσο EGM2 (Lonza, Walkersville, MD) και σπάρθηκαν πάνω κολλαγόνο Ι τρυβλία petri (35 mm, Biocoat, BD Labware, Bedford, ΜΑ) . Οι καλλιέργειες επωάστηκαν στους 37 ° C, 5% CO2, 95% σχετική υγρασία για 3-4 εβδομάδες. Το μέσο αλλάχθηκε κάθε 2 ημέρες για 7 ημέρες και στη συνέχεια δύο φορές την εβδομάδα μέχρι την πρώτη δίοδο, και καλλιέργεια παρακολουθούνται για την ανίχνευση των ενδοθηλιακών αποικίες με βάση μορφολογικά χαρακτηριστικά, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32]. Μετά από 15-20 ημέρες, τα κύτταρα αποκολλήθηκαν με θρυψίνη /ΕϋΤΑ (Gibco, BRL, UK) και χρωματίστηκαν με μονοκλωνικά αντισώματα (MoAbs) αντι- CD31-PeCy7, CD34-APC, CD45-H7, και 7-AAD (όλα από Beckman Coulter) CD146-ΡΕ (Chemicon), VEGFR-2- ΡΕ (R &?. Δ) και CD109-ΡΕ (Abcam) για κυτταρομετρία ροής μελέτες

Διαλογή των CD109 + και CD146 + κυττάρων από περιφερικό αίμα

για να εκτελέσετε μια ανάλυση μικροσυστοιχιών για τα γονίδια που εκφράζονται στα κυκλοφορούντα ενδοθηλιακά κύτταρα θετικά για CD109 (CD109 + ΧΚΕ) και CEC θετικά για CD146 (CD146 + ΧΚΕ), τριών Εισροή λέιζερ υψηλής ταχύτητας διαλογέα κυττάρων (BD) χρησιμοποιήθηκε.

εν συντομία, σε δύο διαφορετικά πειράματα, 150 ml αίματος από 8 υγιή άτομα συλλέχθηκαν και μετά ΤΜΧ απομόνωση με κλίση FICOLL-, τα κύτταρα αφαιρέθηκαν τα λευκά αιμοσφαίρια χρησιμοποιώντας αντι-CD45 αντίσωμα συζευγμένο με μαγνητικά μικροσφαιρίδια MACS (Miltenyi Biotech) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα βάφονται για Syto 16, CD45, CD31 και CD109 και στο δεύτερο πείραμα για Syto 16, CD45, CD31 και CD146.

Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας διαλογής, τα δείγματα ήταν συνεχώς ψύχεται στους 4 ° C και μία προς τα εμπρός το ύψος του παλμού διασποράς και πλευρά αναλύσεις διασποράς πραγματοποιήθηκαν για τον αποκλεισμό συστάδες κυττάρων και διπλές. Μία αμφίδρομη διαδικασία διαλογής κυττάρων διεξήχθη με Α140 um ακροφύσιο με μία πίεση 5,5 PSI, και με ποσοστό γεγονότα του 1000-1500 συμβάματα ανά δευτερόλεπτο, χρησιμοποιώντας ένα είδος καθαρή κατάσταση. Η πύλη διαλογής ήταν ζωγραφισμένο στο Syto 16 + CD45-CD31 + CD109 + κύτταρα και σε Syto 16 + CD45-CD31 + CD146 + κύτταρα. Τα δείγματα συλλέχθηκαν σε αποστειρωμένα σωληνάρια πολυπροπυλενίου που περιέχουν RPMI και χρησιμοποιήθηκαν για μοριακή ανάλυση. Καθαρότητα ήταν πάντα μεγαλύτερη από 95% με ανάκτηση 70-80%.

RT-PCR και ανάλυση γονιδιακής έκφρασης των διαλεγμένων κυττάρων CD109 + ΚΑΕ και CD146 + CECs

απομόνωση του RNA των ταξινομημένων CD109 + CECs και CD146 + CECs, διεξήχθη χρησιμοποιώντας ArcturusPicoPureRNA κιτ απομόνωσης, και cDNA δημιουργήθηκε από το συνολικό ποσό των RNA χρησιμοποιώντας το cDNA υψηλής χωρητικότητας ανάστροφης μεταγραφής kit (Applied Biosystems). Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qRT-PCR) διεξήχθη μετά από προ-ενίσχυση του cDNA (TaqManPreAmp Master Mix Kit) με ΑΒΙ Prism 7000 πλατφόρμα χρησιμοποιώντας TaqMan γονιδιακής έκφρασης Δοκιμασία για CDH5 (Ve-καδερίνη), CLDN5, (κλαουδίνης 5) VWF (Von Willebrand Factor), CD34, VCAM-1, CLEC14a, TMEM204, ARHGEF15, GPR116, ARAP3, TEM8 (υποδοχέας ANTRAX1) [33].

Χαρακτηρισμός του CD109 + CEC και CD146 + CEC φαινότυπο

Για να χαρακτηρίσουμε CD109 + CEC και CD146 + CEC φαινότυπο, χρησιμοποιήθηκε ένας συνδυασμός 10 μονοκλωνικών αντισωμάτων (Syto 16 FITC, CD146 ΡΕ, 7-AAD, CD31 PeCy7, CD34 ECD, CD13 APC, CD90 APC-AF700, CD117 APC-AF750, CD45 Pacific Blue και CD109 Ειρηνικού Πορτοκαλί). CD90 και CD 117 αγοράστηκαν από την Beckman Coulter.

Unlabeled CD109 (Abcam) ήταν συζευγμένο με Ειρηνικού πορτοκαλί, χρησιμοποιώντας το Ζήνων

R Kit τεχνολογίες σήμανσης (Life Technologies), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

CD34, CD90 και έκφραση CD117 αξιολογήθηκαν στο DNA + (Syto 16 +) CD45-CD31 + CD109 + και στο DNA + (Syto 16 +) CD45-CD31 + CD146 + κύτταρα.

για να επιβεβαιωθεί με κυτταρομετρία ροής του ενδοθηλίου φύση του CD109 + ΚΑΕ και CD146 + CECs, χρησιμοποιήσαμε Ulex europeaus λεκτίνη και Ac-LDL FITC μέχρι να λάβει.

Για Ac-LDL FITC μέχρι να λάβει, συλλέξαμε 5 ml αίματος από 5 διαφορετικούς ασθενείς με καρκίνο του μαστού, και μετά από πολυεθνικές απομόνωση με Ficoll-κλίση, τα κύτταρα επωάστηκαν με Ac-LDL FITC σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (10 μg /ml για 4 ώρες στους 37 ° C). Μετά από επώαση Ac-LDL, εμείς χρώση κυττάρων με Syto 16, CD45, CD31 και CD109 να διερευνηθεί η παρουσία του AcLDL + CD109 + κυττάρων μεταξύ CD45-Syto 16 + (εμπύρηνα) CD31 + κύτταρα. Πέντε διαφορετικά πειράματα διεξήχθησαν.

Ανίχνευση CD109 + ΚΑΕ και CD146 + CECs σε υγιή άτομα και ασθενείς με καρκίνο

Μετά από ένα πρωτόκολλο κυτταρομετρία ροής επικυρωθεί στο εργαστήριο μας για την ανίχνευση CEC (Εικ. 1), [ref 14], ο αριθμός και η βιωσιμότητα του CD109 + ΚΑΕ και CD146 + CECs αξιολογήθηκαν στο περιφερικό αίμα 50 υγιών ατόμων και 200 ​​ασθενείς με καρκίνο (66 μεταστατικό καρκίνο του μαστού και 134 ασθενείς γλοιοβλάστωμα).

φθορισμού Minus One για κάθε φθορισμός έχει αναφερθεί.

η

Εν συντομία, η πυρηνική χρώση Syto 16 χρησιμοποιήθηκε για τη διάκριση μεταξύ DNA που περιέχει κύτταρα, τα αιμοπετάλια και τα κυτταρικά υπολείμματα, και 7ΑΑΌ να προσδιορίσει την κατάσταση βιωσιμότητας των κυττάρων. Το πάνελ των MoAbs που χρησιμοποιήθηκαν περιελάμβαναν αντι-CD45 (για να αποκλείσει τα αιμοποιητικά κύτταρα), αντι-CD31 (ένα ενδοθηλιακό δείκτης διαφοροποίησης των κυττάρων), αντι-CD34 (όπως ενδοθηλιακά και των προγονικών κυττάρων σημειωτή) και αντι-CD109 ή αντι-CD146.

Μετά την επώαση των 2,5 × 10

6 συνολικά κύτταρα με MoAbs (4 ° C για 20 λεπτά) και τα κύτταρα από λύση με χλωριούχο αμμώνιο (ΝΗ

4Cl), τουλάχιστον 2 × 10

6 συνολικά κύτταρα αποκτήθηκαν στο κυτταρόμετρο ροής (FACS-Canto, BD, 2007-2010 και Navios, Beckman Coulter, από το 2010 μέχρι το Φεβρουάριο του 2013). Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα θετικά για Syto 16 (DNA) αρνητικά για CD45, και θετικά για CD31 και CD109 ή για CD31 και CD146.

Ο συνδυασμός Syto 16 και 7ΑΑΌ χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της βιωσιμότητας CEC σύμφωνα με van der Pol et al. [34]. Νεκρωτικό κύτταρα ταυτοποιήθηκαν ως Syto 16 χαμηλής /7ΑΑΌ θετικά, αποπτωτικά κύτταρα όπως Syto 16 χαμηλής /7ΑΑΌ αρνητικά και βιώσιμων κυττάρων ως Syto 16 φωτεινά /7ΑΑΌ αρνητική.

Στατιστική Ανάλυση

Οι συνεχείς μεταβλητές αναφέρονται ως μέση τιμή ± SEM. Αμφίδρομη ANOVA, ή δύο-tailed t test του Student, χρησιμοποιήθηκαν όπου ενδείκνυται. Η στατιστική σημαντικότητα ελήφθη σε ρ & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Η ενδοθηλιακή αποικίες φαινότυπο

Περιφερειακά ΤΜΧ αίματος (30 × 10

6 κύτταρα επιχρυσωμένο) που παράγονται ενδοθηλιακών αποικίες από 9 10 υγιή άτομα και από τις 14 του 23 ασθενείς. Όλα τα ενδοθηλιακά αποικίες ήταν θετικά για CD31, CD146, CD34 και VEGFR-2 και αρνητικό για CD45.

Τα ενδοθηλιακά αποικίες από όλα υγιή άτομα και από 10 ασθενείς με καρκίνο αξιολογήθηκαν επίσης για έκφραση CD109. CD109 εκφράστηκε στις 1/9 ενδοθηλιακά καλλιέργειες από υγιή άτομο (11%) και 5/10 (50%) των ενδοθηλιακών καλλιέργειες από ασθενείς με καρκίνο.

RT-PCR των ταξινομημένων CD109 + ΚΑΕ και CD146 + CECs

Διπλώστε αλλαγές των κατάντη ή up-ρυθμιζόμενα γονίδια εκφράζονται, συγκρίνοντας cDNA από CD109 + CECs να CD146 + CECs ως κύτταρα αναφοράς (Σχ. 2).

Διπλώστε αλλαγές των κατάντη ή up-ρυθμιζόμενα γονίδια είναι εξέφρασε τη σύγκριση cDNA από CD109 + στα κύτταρα CD146 +, όπως τα κύτταρα αναφοράς. Για να εξασφαλιστεί η βιολογική επαναληψιμότητα, το αίμα για τη συλλογή cDNA ελήφθησαν από 8 διαφορετικούς δότες.

Η

Σε δύο CD109 + ΚΑΕ και CD146 + CECs επιβεβαιώσαμε την έκφραση του επιπέδου του mRNA της CDH5 (Ve-καδχερίνη) και CLDN5 (κλαουδίνης V), δύο ενδοθηλιακά ειδικά μεταγραφές, υποδηλώνοντας ότι και τα δύο κύτταρα που σχετίζονται και των ενδοθηλιακών φύση [23] – [24]. Ίδια αποτελέσματα λήφθηκαν για τα επίπεδα mRNA του vWF, VCAM1 και CD34.

Τα υψηλότερα επίπεδα των ενδοθηλιακών ειδικών μεταγράφων που εκφράζονται στις αναπτυσσόμενες ενδοθηλιακά κύτταρα [33] CLEC14a, TMEM204, ARHGEF15, GPR116, παρατηρήθηκαν σε ταξινομημένη CD109 + CECs όταν σε σύγκριση με διαλογή CD146 + CECs.

Είναι ενδιαφέρον ότι, τα επίπεδα του mRNA της TEM8 (προσδιορίζονται ως Antrax τοξίνη Receptor1, Antrax1) εκφράστηκαν μόνο σε CD109 + CECs + αλλά όχι στο CD146 + ΧΚΕ.

CD109 + και CD146 + CEC φαινότυπο

Όπως φαίνεται στο Σχ. 3, μεταξύ Syto 16 + 7-AAD-CD31 + κυττάρων CD45-, εντοπίσαμε δύο διαφορετικές πληθυσμού των ΜΑΕΚ, είναι ένα θετικό για CD109 + αλλά αρνητικά για CD146, και ένα θετικό για CD146, αλλά αρνητικά για CD109. Τόσο CD146 + ΚΑΕ και CD109 + CECs ήταν αρνητικά για CD90 και CD117, για να επιβεβαιώσει αυτά τα κύτταρα είναι πιθανό διαφοροποιημένα κύτταρα και όχι πρόγονοι. CD34 ήταν θετική για το 30% των CD146 + ΚΑΕ και για το 20% των CD109 + CECs, και CD13 ήταν θετική σε 50% και 60% του CD146 + ΚΑΕ και CD109 + CECs αντίστοιχα, επιβεβαιώνοντας αυτά τα κύτταρα ενεργοποιημένα κύτταρα των αγγειογενετικών αγγείων [44].

Μετά τον αποκλεισμό από τα συντρίμμια (Α) και την επιλογή των CD45-(Β), πυρήνες (Syto 16 +) και CD31 + κύτταρα (C), CEC ταυτοποιήθηκαν ως θετικά για CD109 ή CD146 (Ε). (D): αρνητικό έλεγχο. CD109 + ΚΑΕ και CD146 + CECs αξιολογήθηκαν με κυτταρομετρία ροής για την έκφραση του CD34, CD117, CD90 και CD13.

Η

Τόσο CD146 + ΚΑΕ και CD109 + CECs ήταν θετικά για την Ulex europeaus λεκτίνη (Εικ. 4 Α-Β1). Για να αποκλειστεί η μόλυνση των επιθηλιακών κυττάρων, χρωματίσαμε εμπύρηνα (Syto 16 +) CD45-κυττάρων για EpCAM και ακόμη και αν ένα υποπληθυσμό κυττάρων EpCAM + είναι παρόν, αυτά τα κύτταρα είναι αρνητικά για έκφραση CD31 (Σχ. 4, C-C1).

EpCAM χρώσης (4C-C1) επιβεβαίωσε ότι επιθηλιακά κύτταρα, ακόμη και αν υπάρχει στο κυτταρικό διαμέρισμα DNA + CD45-είναι αρνητική για την έκφραση των CD31 υπάρχουν μόνο σε ενδοθηλιακά κύτταρα.

η

για να εξετάσει CD109 + CECs λειτουργία, πραγματοποιήσαμε Ac-LDL-up λάβει. Όπως Ac-LDL προσλαμβάνεται από μακροφάγα /μονοκύτταρα, χρησιμοποιήσαμε αυτά τα κύτταρα ως «εσωτερικός θετικός έλεγχος» για να επιβεβαιώσει δραστηριότητα ενδοκύτωση. Όπως αναφέρεται στο σχ. 5, μεταξύ των Αο-LDL + κύτταρα αμφότερα ανιχνεύθηκαν CD45 + CD31 + CD14 + (μονοκύτταρα) και CD45-CD31 + CD109 + (ενδοθηλιακά κύτταρα).

Μετά διπλοί (Α) και τα υπολείμματα (Β) του αποκλεισμού, Ac-LDL + κύτταρα ανιχνεύθηκαν (C). Μεταξύ αυτών των κυττάρων, τα κύτταρα CD45 + CD31 + και CD45-CD31 + ανιχνεύθηκαν (D). CD45 + CD31 + ήταν επίσης θετικά για CD14 (μονοκύτταρα, Ε) και CD45-CD31 + ήταν επίσης θετικά για CD109 + (ενδοθηλιακά κύτταρα, F). Ac-LDL + κύτταρα εμπύρηνα (Syto 16 +, F). Γ1, Δ1, Ε1 και F1 είναι οι αρνητικοί έλεγχοι.

Η

Ανίχνευση CD109 + CECs σε υγιή άτομα και ασθενείς με καρκίνο

Οι ασθενείς χαρακτηριστικά αναφέρονται στον Πίνακα 1.

σημαντικά υψηλότερα επίπεδα CD109 + CECs, CD146 + CECs, βιώσιμη CD109 + CECs και βιώσιμη CD146 + CECs (P = 0.0001) βρέθηκαν κατά την έναρξη σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού και ασθενείς γλοιοβλαστώματος σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες (Πίνακας 2). CD109 + CECs ήταν 26 ± 20 /mL σε υγιές άτομο (n = 50), 62 ± 43 /mL σε ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του μαστού (η = 66, ρ & lt? 0.0001) και 101 ± 84 /mL σε ασθενείς γλοιοβλάστωμα (n = 134 , p & lt? 0.0001) πριν από τη θεραπεία. Το κλάσμα των αποπτωτικών /νεκρωτική CD109 + CECs ήταν 71 ± 18% σε υγιές άτομο, το 51 ± 18% σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού και 60 ± 21 σε ασθενείς με γλοιοβλάστωμα.

Η

Μετά τη θεραπεία CD109 + CECs και βιώσιμη CD109 + CECs ήταν 52 ± 42 /mL και 15 ± 20 /mL αντίστοιχα σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού, και 64 ± 60 /mL και 35 ± 30 /mL σε ασθενείς γλοιοβλάστωμα (Πίνακας 3).

Η

CD146 + CECs ήταν 43 ± 23 /mL σε υγιές άτομο (n = 50), 103 ± 83 /mL σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού (η = 64, ρ & lt? 0.0001) και 117 ± 87 σε ασθενείς γλοιοβλάστωμα (n = 134, σ & lt? 0,0001).

Το κλάσμα των αποπτωτικών /νεκρωτικών CD146 + CECs ήταν 67 ± 20% σε υγιές άτομο, 62 ± 20% σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού και 66 ± 18 /mL σε ασθενείς με γλοιοβλάστωμα πριν από τη θεραπεία.

Μετά τη θεραπεία CD146 + CECs και βιώσιμη CD146 + CECs ήταν 96 ± 121 /mL και 41 ± 88 /mL αντίστοιχα σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού και 78 ± 84 /mL και 23 ± 31 /mL σε ασθενείς με γλοιοβλάστωμα (Πίνακας 3) .

Συζήτηση

Τα ενδοθηλιακά ετερογένεια των κυττάρων έχει περιγραφεί στο επίπεδο της μορφολογίας των κυττάρων, τη λειτουργία, τη γονιδιακή έκφραση, και η σύνθεση αντιγόνου. Επειδή τα αιμοφόρα αγγεία σε όλο το σώμα, τα ενδοθηλιακά κύτταρα εκτίθενται σε μια τεράστια ποικιλία από μικροπεριβάλλοντα ιστού, και το ευρύ φάσμα των εισόδων σήματος είναι επαρκής για να δημιουργήσει φαινοτυπική ετερογένεια μεταξύ του αγγειακού δέντρου [19], [21], [35] .

Ανίχνευση κυκλοφορούντων ενδοθηλιακών κυττάρων με κυτταρομετρία ροής είναι μια προσέγγιση που χρησιμοποιείται ευρέως σε ασθενείς με καρκίνο, και η ταυτοποίηση του αριθμού, η βιωσιμότητα και η κινητική των ενδοθηλιακών κυττάρων είναι ένα πολλά υποσχόμενο μέσο για τη διαστρωμάτωση ασθενή που λαμβάνει αντι-αγγειογενετική θεραπεία [ ,,,0],15] – [18]

Σήμερα, ΜΑΕΚ είναι απαριθμούνται από μια προσέγγιση πολυπαραμετρική κυτταρομετρία ροής συνδυάζει CD146, CD31, CD45, ένα πυρηνικό αντιγόνο δέσμευσης (Syto 16, DAPI ή HOECST) μαζί με μια κυτταρική χρώση βιωσιμότητας (. όπως 7-AAD ή αννεξίνης V).

CD109 είναι ένα γλυκοσυλοφωσφατιδυλοϊνοσιτόλης-αγκυροβολημένη επιφανείας κυττάρου γλυκοπρωτεΐνη και είναι ένας από τους 12 δείκτες ενδοθηλιακών υπερ-εκφράζεται σε ενδοθηλιακά κύτταρα όγκου [23], [24].

σε αυτό το έργο, μετά από μια προσέγγιση επικυρωθεί πρόσφατα στο εργαστήριο μας [14], θα διευθετηθεί CD109 + ΚΑΕ και CD146 + CECs και επιβεβαιώθηκε με RT-PCR, τόσο σε πληθυσμό την έκφραση του επιπέδου του mRNA της CDH5 (Ve-καδερίνη) και CLDN5 (Claudin5) δύο γονίδια εκφράζονται εκλεκτικά σε ενδοθηλιακά κύτταρα. Υψηλότερα επίπεδα CLEC14a, TMEM204, ARHGEF15, Gpr116 εκφράζεται σε αναπτυσσόμενες ενδοθηλιακά κύτταρα [33], ήταν παρόντες σε CD109 + ΧΚΕ σε σύγκριση με CD146 + ΧΚΕ, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτά τα γονίδια μπορεί να παίζουν ένα σημαντικό ρόλο όχι μόνο στις αναπτυσσόμενες ενδοθηλιακά κύτταρα, αλλά και σε ενηλίκων αγγειογένεση.

Έχουμε αποδείξει ότι CD109 + ΚΑΕ και CD146 + CECs είναι δύο διαφορετικά υποπληθυσμό των ενδοθηλιακών κυττάρων, είναι αυτά τα δύο αντιγόνα δεν εκφράζονται στα ίδια κύτταρα, ενώ CD34 (ένας δείκτης που χρησιμοποιείται σήμερα για την αναγνώριση προγονικά κύτταρα) ήταν θετική για το 20% των CD109 + ΚΑΕ και για το 30% των CD146 + CECs.

Αξιολογήσαμε τον αριθμό, τη βιωσιμότητα και την κινητική του CD109 + ΚΑΕ και του CD146 + CECs και παρατήρησε ότι τόσο υποπληθυσμό των ενδοθηλιακών κυττάρων εμπλουτίζονται στο αίμα των ασθενών γλοιοβλάστωμα και καρκίνος του μαστού, είναι περισσότερο βιώσιμες σε σύγκριση με την τιμή που παρατηρήθηκε σε υγιές άτομο, και ο αριθμός τους να μειωθεί σημαντικά μετά τη θεραπεία.

στην προηγούμενη εμπειρία μας, έχουμε αναφερθεί ότι σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού αντιμετωπίζεται με μετρονομική χημειοθεραπεία, CD146 + CEC επίπεδα μετά από δύο μήνες θεραπείας που σχετίζονται με παρατεταμένη PFS [15]. Σε μία άλλη κλινική δοκιμή, στο στήθος ασθενείς με καρκίνο που έλαβαν θεραπεία με μετρονομική χημειοθεραπεία και bevacizumab, βασική CEC επίπεδα συσχετίστηκαν επίσης με PFS [36], [37] επιβεβαιώνει ότι η ποσοτικοποίηση των CD146 + CECs είναι χρήσιμη για τον εντοπισμό των ασθενών που θα μπορούσαν να ωφεληθούν από αντιαγγειογενετικές θεραπείες [ ,,,0],38].

σε μια σειρά ασθενών με γλοιοβλάστωμα που έλαβαν θεραπεία με AZD2171, μια παν-VEGF αναστολέας της τυροσινικής κινάσης του υποδοχέα, Batchelor διαπίστωσε ότι βιώσιμη CEC επίπεδα ήταν υψηλότερα σε ασθενείς οι οποίοι παρουσίασαν εξέλιξη της νόσου κατά τη διάρκεια της θεραπείας του AZD2171 σε σύγκριση με ασθενείς χωρίς πρόοδο κατά την ημέρα 112 [39].

Εμείς πρόσφατα αναφερθεί [40], ότι σε ασθενείς γλοιοβλάστωμα που έλαβαν θεραπεία με bevacizumab και ιρινοτεκάνη ή μόνο με bevacizumab, PFS και OS ήταν σημαντικά αυξημένη σε ασθενείς με αρχική τιμή μετρήσεις του CD109 + CECs υψηλότερο από 41.1 /MLS, (1stquartile), ενώ δεν προγνωστικός παράγοντας σχετίζεται με CD146 + ΧΚΕ.

Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η CEC ετερογένεια μπορεί να αντανακλά αγγειακή πολυπλοκότητα του όγκου και ότι CD109 + CECs μπορούσε να είναι ένα δυνητικά χρήσιμο προγνωστικό δείκτη για το γλοιοβλάστωμα ασθενείς.

έχει αναφερθεί ότι CD109 υπερεκφράζεται σε αγγείωση όγκου [24], και σε αυτή τη μελέτη παρατηρήσαμε ότι όλα τα ενδοθηλιακά αποικίες από υγιή άτομα και από 10 ασθενείς με καρκίνο ήταν θετικοί για CD31, CD146, CD34 και VEGFR-2 και αρνητικό για CD45, ενώ CD109 ήταν θετική σε 1/9 ενδοθηλιακά καλλιέργειες από υγιές άτομο (11%) και στις 5/10 (50%) των ενδοθηλιακών καλλιέργειες από ασθενείς με καρκίνο.

Επιπλέον m ΚΝΑ επίπεδο TEM8, μια γλυκοπρωτεΐνη επιφανείας των κυττάρων που προσδιορίζονται ως Anthrax τοξίνη Receptor 1, ήταν ανιχνεύσιμα σε CD109 + CECs αλλά όχι στο CD146 + ΧΚΕ. Έχει αναφερθεί ότι TEM8, είναι επάνω ρυθμισμένη στα καρκινικά αγγεία [41], [42]. Σε TEM8 Knockout ποντίκια φυσιολογική αγγειογένεση και την επούλωση τραυμάτων συμβαίνουν κανονικά, αλλά σε ποντίκια που φέρουν όγκο, η ανάπτυξη του όγκου είναι μειωμένη, δείχνοντας ότι TEM8 μπορεί να απαιτούνται για την προώθηση της αγγειογένεσης των όγκων, αλλά όχι την φυσιολογική ανάπτυξη [43].

Στο σύνολό τους αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι CD109 θα μπορούσε να αποτελέσει ένα σπάνιο πληθυσμό των κυκλοφορούντων καρκινικών ενδοθηλιακά κύτταρα, τα οποία παίζουν ένα δυνητικά χρήσιμο προγνωστικό ρόλο σε ασθενείς με γλοιοβλάστωμα. Ο ρόλος της έκφρασης CD109 σε καρκινικά ενδοθηλιακά κύτταρα σκάφος ειδικό αξίζει να εξεταστεί περαιτέρω με μελέτες γονιδιακής έκφρασης.

Συμπεράσματα

Υπάρχει μια αυξανόμενη ανάγκη για τον εντοπισμό κυκλοφορούν βιολογικός δείκτης για τη διαστρωμάτωση των ασθενών που μπορούν να όφελος του αντι-αγγειογενετική θεραπεία. Στην εργασία αυτή αναφέρει ότι CD109 είναι ένας πιθανός χρήσιμο προγνωστικό δείκτη σε ασθενείς με γλοιοβλάστωμα, και ότι ο ρόλος της στην αγγειογένεση του καρκίνου πρέπει να διερευνηθεί σε διαφορετική ρύθμιση του όγκου.

Ευχαριστίες

Υποστηρίζεται εν μέρει από AIRC, (Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro), Fondazione Umberto Veronesi, και Ministero della Salute.