Αφηρημένο

Υπάρχει σημαντική ανάγκη για την ταυτοποίηση νέων στόχων του καρκίνου του προστάτη των ναρκωτικών, διότι τρέχουσες θεραπείες ορμονικής τελικά αποτύχει, οδηγώντας σε μια ανθεκτικών στα φάρμακα και θανατηφόρα ασθένεια που ονομάζεται ευνουχισμό ανθεκτικά καρκίνο του προστάτη. Για την ταυτοποίηση λειτουργικώς τα γονίδια που, όταν σιγήσει, μειώνουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του προστάτη ή να επάγει κυτταρικό θάνατο σε συνδυασμό με αντιανδρογόνα, χρησιμοποιήσαμε ένα RNA παρεμβολής που βασίζεται μικρή φουρκέτα οθόνη barcode RNA σε LNCaP κύτταρα καρκίνου ανθρώπινου προστάτη. Εμείς εντοπίστηκαν και επικυρώθηκαν τέσσερα υποψήφια γονίδια (

ΑΚΤ1

,

PSMC1

,

STRADA

, και

TTK

) ότι η εξασθενημένη ανάπτυξη όταν σιγήσει σε υποδοχέα ανδρογόνων θετικό κυττάρων καρκίνου του προστάτη και ενίσχυσε τα αντιπολλαπλασιαστικά αποτελέσματα του αντιανδρογόνα. Η αναστολή της ΑΚΤ με έναν αναστολέα φαρμακολογική επάγεται επίσης απόπτωση όταν συνδυάζεται με αντιανδρογόνα, σύμφωνα με πρόσφατες ενδείξεις για ΡΙ3Κ και AR μονοπάτι αλληλοπαρεμβολών σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Ανάκτηση της φουρκέτες με στόχο μια γνωστή οδό του καρκίνου του προστάτη επικυρώνει τη χρησιμότητα της shRNA διαλογής βιβλιοθήκης στον καρκίνο του προστάτη ως μια ευρεία στρατηγική για τον εντοπισμό νέων στόχων υποψήφιο φάρμακο

Παράθεση:. Dahlman KB, Parker JS, Shamu Τ, ο Ιερώνυμος H, Chapinski C, Carver Β, et al. (2012) Ρυθμιστές του καρκίνου του προστάτη Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού και Βιωσιμότητας ταυτοποιηθούν με διαλογή Short-φουρκέτα RNA Βιβλιοθήκη. PLoS ONE 7 (4): e34414. doi: 10.1371 /journal.pone.0034414

Επιμέλεια: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 20 του Σεπτέμβρη 2011? Αποδεκτές: 27 Φεβ 2012? Δημοσιεύθηκε: 11 Απριλίου 2012 |

Copyright: © 2012 Dahlman et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από AACR-Amgen, Inc. υποτροφία στην Κλινική και Μεταγραφική Έρευνα (KBD)? Προστάτη Ίδρυμα Καρκίνου (www.pcf.org) (BSC)? Ιατρικό Ινστιτούτο Howard Hughes (www.hhmi.org) (CLS)? Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου (www.cancer.gov) (CLS). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. CLS είναι ένα συν-εφευρέτης του MDV3100 και κατέχει απόθεμα στο Medivation. KBD υποστηρίχθηκε από AACR-Amgen, Inc., ενώ το έργο αυτό εκτελείται. JSP απασχολείται από ανάλυση της έκφρασης. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές σχετικά με την κοινοχρησία δεδομένων και υλικών. Οι υπόλοιποι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του προστάτη είναι η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στις αμερικανικές άνδρες με κατ ‘εκτίμηση 217.730 νέες περιπτώσεις και πάνω από 32.000 θανάτους από η ασθένεια το 2010 [1]. Ενώ οι περισσότεροι πρώιμο στάδιο εντοπισμένη ασθένεια μπορεί να αντιμετωπιστεί επιτυχώς με θεραπεία με ακτινοβολία ή /και τη χειρουργική επέμβαση, οι άνδρες που παρουσιάζουν με μεταστατικό καρκίνο τελικού σταδίου έχουν μια μέση επιβίωση 3-7 ετών [2]. Επιπλέον, όσο το 50% των ασθενών που έλαβαν θεραπεία με εντοπισμένη νόσο θα πρέπει τοπική υποτροπή ή απομακρυσμένες μεταστάσεις [2].

Οι τρέχουσες θεραπείες για υποτροπιάζον ή μεταστατική νόσο περιλαμβάνουν τη στόχευση των υποδοχέων των ανδρογόνων (AR) σηματοδότηση μέσω της χρήσης των αντιανδρογόνα , όπως βικαλουταμίδη, και φάρμακα που εμποδίζουν την παραγωγή των ανδρογόνων στους όρχεις και τα επινεφρίδια, όπως αγωνιστές ορμόνης απελευθέρωσης γοναδοτροπίνης και κετοκοναζόλη [3]. Αν και αυτές οι τρέχουσες θεραπείες ορμονικής έχουν πρώτες επιπτώσεις στη μείωση της επιβάρυνσης του όγκου, πολλοί άνδρες γίνονται ανθεκτικά σε αυτές τις θεραπείες και να αναπτύξουν τον ευνουχισμό ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη (CRPC). Οι άνδρες με CPRC έχουν κακή πρόγνωση και λογαριασμό για την πλειοψηφία των θανάτων από τη νόσο.

Οι άνδρες με CPRC συχνά παρουσιάζουν αύξηση σε υποδοχέα όγκου ανδρογόνων (AR) επίπεδα [4]. AR είναι ένα kDa υποδοχέας 110 πυρηνικών ορμονών που, σε απόκριση στα ανδρογόνα, ενεργοποιεί τη μεταγραφή των γονιδίων στόχων που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, τη διαφοροποίηση και την επιβίωση. Στην προστατική αυλού επιθήλιο, AR ρυθμίζει τη διαφοροποίηση και τον πολλαπλασιασμό, και AR σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη προάγει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου [5]. Προηγούμενη εργασία στο εργαστήριο μας δείχνει ότι αυτό το αυξημένο επίπεδο AR είναι αναγκαία και επαρκής για την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη σε CRPC και η λειτουργία του είναι απαραίτητη για τη διατήρηση της ανάπτυξης του όγκου [6]. Εκτός από CRPC,

AR

εκφράζεται σε όλα σχεδόν τα όγκους του προστάτη και απαιτείται για την διατήρηση του όγκου [4], [7], [8]. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η σηματοδότηση AR διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην ορμόνη ευαίσθητη και CRPC και παραμένει ένας σημαντικός στόχος για προστάτη θεραπευτικές του καρκίνου.

Ταυτοποίηση νέων προσεγγίσεων για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη είναι μια περιοχή έντονης θεραπευτική ανάπτυξη . Πρόσφατα οξική αμπιρατερόνη εγκρίθηκε βασίζεται σε ένα σημαντικό όφελος επιβίωσης σε ασθενείς με CRPC, και τα νέα αντιανδρογόνα, MDV3100 και ARN-509, έχουν εισαχθεί με ελπιδοφόρα αποτελέσματα? Ωστόσο οι περισσότεροι όγκοι επίκτητη ανθεκτικότητα σε αυτά τα θεραπευτικά μέσα [9] – [13]. Μέχρι σήμερα μεταξύ χημειοθεραπευτικούς παράγοντες μόνο ο ταξάνες docetaxel και καμπαζιταξέλη έχει αποδειχθεί ότι βελτιώνουν τη συνολική επιβίωση σε ασθενείς με CRPC [14] – [16]. Ως αποτέλεσμα της έλλειψης μέσων που στηρίζουν προστάτη παλινδρόμησης του καρκίνου, ο καρκίνος του προστάτη νέα θεραπευτικούς στόχους δικαιολογούν την περαιτέρω έρευνα.

Για να αποκαλύψει το δυναμικό του καρκίνου του προστάτη θεραπευτικούς στόχους, πραγματοποιήσαμε μια αμερόληπτη multiplex οθόνη shRNA που εντοπίζονται ρυθμιστές του καρκίνου του προστάτη κυτταρικής βιωσιμότητας με την παρουσία της βικαλουταμίδης. Τέσσερα γονίδια επικυρώθηκαν για να ενισχύσει τα αντιπολλαπλασιαστικά αποτελέσματα των αντι-ανδρογόνα σε μια κυτταρική γραμμή καρκίνου του προστάτη όταν σιγήσει. Αυτά τα δεδομένα παρέχουν μια γενική στρατηγική για να προσδιορίσει τους στόχους φάρμακο για τον καρκίνο του προστάτη.

Αποτελέσματα

shRNA multiplex οθόνη για τον εντοπισμό ρυθμιστών της βικαλουταμίδης ευαισθησία

Για να εντοπιστούν γονίδια που, όταν σιωπήσουν , να μειώσει τη βιωσιμότητα των κυττάρων μόνη ή σε συνδυασμό με το αντιανδρογόνο, βικαλουταμίδη, χρησιμοποιήσαμε μια οθόνη shRNA πολυπλεξίας παρεμβολή RNA που βασίζεται σε χρήση ενός προηγουμένως επικυρωθεί βιβλιοθήκη (Σχήμα 1Α). Αυτή η τεχνολογία χρησιμοποιεί μοναδικά γραμμωτό κωδικό Τα siRNAs, που εκφράζεται από ένα φορέα ρετροϊού, του οποίου η αφθονία μετά χειρισμού των κυττάρων μπορεί να ταυτοποιηθεί με μικροσυστοιχιών [17]. Η βιβλιοθήκη αποτελείται από ~6,000 Τα siRNAs που στοχεύουν κινάσες, γονίδια που εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, και άλλα γονίδια που είναι γνωστό ότι εμπλέκεται στον καρκίνο [17]. Η ανάλυση των δεδομένων έκφρασης από 147 δείγματα όγκων του προστάτη [18] έδειξε ότι το 97% των γονιδίων στοχεύει Τα siRNAs στη βιβλιοθήκη ανιχνεύονται σε τουλάχιστον 50% των όγκων. Αξιοποιήσαμε την ανδρογόνων υποδοχέων (AR) κυτταρική σειρά -θετικό LNCaP για την οθόνη, επειδή υποβάλλονται σε διακοπή της ανάπτυξης όταν έλαβαν θεραπεία με τον ανταγωνιστή βικαλουταμίδης AR, αυξάνονται σχετικά γρήγορα και εύκολα μολυνθεί με ρετροϊό (Σχήμα S1). AR-αρνητικά PC3 καρκίνου του προστάτη κύτταρα ανθρώπινου χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος ευαισθησίας αντιανδρογόνο (Σχήμα S1). Συσχέτιση μεταξύ βιολογικών πειραμάτων αντίγραφο σε κάθε κυτταρική γραμμή ήταν υψηλό και δεν άλλαξε σε μεταγενέστερα χρονικά σημεία ή με τη θεραπεία με βικαλουταμίδη (Πίνακας S1).

(Α) Σχηματική απεικόνιση της οθόνης shRNA. Λεπτομέρειες μπορείτε να βρείτε στην ενότητα Υλικά και Μέθοδοι. (Β) Ένα heatmap δημιουργήθηκε με βάση την ομαδοποίηση ανιχνευτές που είχαν εξαντληθεί ή εμπλουτισμένο (log2 βικαλουταμίδης /όχημα ≤ +/- 0,58 και ρ-value≤0.01) στην βικαλουταμίδης (0,4 υΜ και 1.0 υΜ) κύτταρα κατεργασμένα LNCaP σε T = 1 και t = 2 σε σύγκριση με τα κύτταρα που υποστεί αγωγή με έκδοχο στις ίδιες χρονικές στιγμές. Το γονίδιο στόχος shRNA που συνδέεται με κάθε ιχνηλάτη υποδεικνύεται στα δεξιά της Heatmap. γονίδια-στόχοι που εμφανίζονται περισσότερες από μία φορά στο heatmap δείχνουν ότι περισσότερα από ένα ανιχνευτή άνοιξε για το εν λόγω γονίδιο.

Η

αναλύσεις μικροσυστοιχιών απεκάλυψε ότι 23 ανιχνευτές, που συνδέεται με 15 γονίδια, ήταν μοναδικά φτωχό σε υπό θεραπεία με βικαλουταμίδη LNCaP κύτταρα, σε σύγκριση με τα κύτταρα υπό αγωγή με όχημα (log2 βικαλουταμίδης /οχήματος ≤-0.58, p≤0.01) (Σχήμα 1 Β, Πίνακας 1 και η Εικόνα S2). Δεν παρατηρήθηκαν διαφορές σε εξαντλημένα ανιχνευτές παρατηρήθηκαν στα υψηλής και χαμηλής βικαλουταμίδη δόσεις ή νωρίς και αργά χρονικά σημεία (ημέρα 8 ή την ημέρα 21)? Ως εκ τούτου, τα δεδομένα συνδυάστηκαν για τις αναλύσεις. Από τα 15 γονίδια που εντοπίστηκαν, οι 11 ήταν κινάσες (

TTK

,

MAST3

,

CIT

,

PRKACG

,

IGF1R

,

TSSK2

,

VEGFβ

,

ΜΑΡΚΑΡΚ5

,

ABL2

,

PLK2

, και

ΑΚΤ1

) γνωστά να διαθέτουν λειτουργίες στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου ή την βιωσιμότητα των κυττάρων (Πίνακας 1). Αυτή η υψηλή συχνότητα των επισκέψεων ανάκτηση κινάσης μπορεί να είναι σχετικές με τη βιολογία των κυττάρων καρκίνου του προστάτη, αλλά επίσης πιθανό αντανακλά μια μεροληψία στην επιλογή των γονιδίων για τη βιβλιοθήκη shRNA. Τα υπόλοιπα 4 γονίδιο επιτυχίες έχουν διαφορετικές λειτουργίες: δέσμευσης καλμοδουλίνης (

STRN3

), ενεργοποίησης ΟΤΡάσης (

RABGAP1

), κινάση προσαρμογείς (

STRADA

), ή ασχολούνται με την πρωτεασώματος (

PSMC1

). Μια παράλληλη οθόνη διεξήχθη επίσης στην κυτταρική σειρά ανδρογόνο-ανεξάρτητες, PC3, και, κυρίως, κανένας από τους ανιχνευτές φτωχού σε LNCaP κύτταρα εξαντλήθηκαν σε κύτταρα PC3 με την παρουσία της βικαλουταμίδης χρησιμοποιώντας την ίδια cut-off, παρέχοντας στοιχεία για την εξειδίκευση σε ευαίσθητα κύτταρα αντιανδρογόνο (Πίνακας S2).

Η

Εκκαθάριση των υποψηφίων γονιδίων

Για να εξετάσει περαιτέρω αυτά τα 15 υποψήφια γονίδια, που απασχολούνται ανεξάρτητη τεχνολογία νοκ ντάουν (siRNA επιμόλυνση με τη χρήση siRNA που στοχεύουν ακολουθίες διαφορετικές από εκείνες που χρησιμοποιείται στην οθόνη shRNA) σε ένα δεύτερο AR εξαρτώμενη κυτταρική γραμμή (VCAP), η οποία έχει αποδειχθεί ότι είναι ανθεκτικά σε βικαλουταμίδη αλλά ευαίσθητη στην αντιανδρογόνο δεύτερη γενιά MDV3100 [19]. Αποσιώπηση των γονιδίων επιβεβαιώθηκε με qRT-PCR (Σχήμα 2Β). Ως θετικός έλεγχος, κύτταρα vCap επιμολύνθηκαν με AR siRNAs και, όπως αναμένεται, αποσιώπηση του AR μειωμένη βιωσιμότητα κυττάρων (Σχήμα 2Α). Αποσιώπηση του

ΑΚΤ1

,

STRADA

,

PSMC1

, και

TTK

ενίσχυσε την επίδραση αναστολής της ανάπτυξης των MDV3100 στα κύτταρα vcap (Εικόνα 2Α, αριστερό πάνελ ), σύμφωνα με τα αποτελέσματα που παρατηρούνται με βικαλουταμίδη στην αρχική οθόνη στα κύτταρα LNCaP. Είναι ενδιαφέρον, φίμωση

ΑΚΤ1

και

PSMC1

στα κύτταρα vcap μειώθηκε επίσης τη βιωσιμότητα των κυττάρων απουσία αντιανδρογόνο (Εικόνα 2Α, αριστερό πάνελ).

γονίδια υποψήφιων στόχων από την οθόνη LNCaP ανιχνευτές που είχαν εξαντληθεί με την παρουσία της βικαλουταμίδης επιλεκτικά στοχοθετημένες χρησιμοποιώντας siRNAs. (Α, αριστερό πάνελ), κύτταρα vCap επιμολύνθηκαν με siRNAs που άνοιξε στην οθόνη LNCaP φάρμακο και επωάστηκαν με 1 υΜ MDV3100 ή όχημα, και ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων μετρήθηκε 6 ημέρες μετά την αγωγή. (Α, δεξιός πίνακας), κύτταρα vCap επιμολύνθηκαν και κατεργάστηκε όπως στο (Α, αριστερό πάνελ), εκτός δραστικότητα Caspase 3/7 μετρήθηκε μετά από 3 ημέρες θεραπείας.

PLK1

siRNA διαμόλυνση χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Οι διακεκομμένες γραμμές δείχνουν το επίπεδο της αναστολής της ανάπτυξης ή την απόπτωση που επάγεται από MDV3100, για σύγκριση. NT, μη στόχευση siRNA. (Β) σίγηση Gene (10-50%) επιβεβαιώθηκε με RT-qPCR 6 ημέρες μετά την επιμόλυνση των κυττάρων VCAP με το siRNA SMARTpools. Οι αντιδράσεις έγιναν εις τριπλούν και κανονικοποιήθηκαν ως προς RPL27 για κάθε cDNA και στη συνέχεια κανονικοποιούνται να υποστεί αγωγή με έκδοχο NT. Πρότυπο σφάλμα της μέσης τιμής υπολογίστηκε. Bic, βικαλουταμίδη.

Η

Στη συνέχεια εξέτασε την επίδραση της αποσιώπησης

ΑΚΤ1

,

STRADA

,

PSMC1

, και

TTK

σχετικά με την απόπτωση, χρησιμοποιώντας το

PLK1

siRNAs ως θετικός μάρτυρας. Αποσιώπηση του

AR

,

ΑΚΤ

, και

STRADA

σε συνδυασμό με επαγόμενη MDV3100 θεραπεία vcap κυτταρική απόπτωση πάνω από τα siRNA ελέγχου (ΝΤ) που έλαβαν θεραπεία με MDV3100 (Εικόνα 2Α, δεξί πάνελ ). Με την εξαίρεση του AR, κανένα από τα siRNAs που εξετάστηκαν επαγόμενη απόπτωση απουσία MDV3100 (Σχήμα 2Α, δεξί πλαίσιο). Αν και φίμωση του

TTK

σε συνδυασμό με MDV3100 δεν προκάλεσε απόπτωση πάνω από τα κύτταρα NT με MDV3100, ο συνδυασμός μείωσε τον αριθμό των βιώσιμων κυττάρων περισσότερο από MDV3100 μόνος στα κύτταρα ΝΤ (Σχήμα 2Α, αριστερό πάνελ). Στο σύνολό τους,

ΑΚΤ

,

STRADA

, και

TTK

siRNAs συνεργούν με MDV3100 να μειώσει τη βιωσιμότητα των κυττάρων vcap. Λαμβάνοντας υπόψη ότι η

ΑΚΤ1

και

STRADA

αποσιώπηση μειώνει τη βιωσιμότητα των κυττάρων, τουλάχιστον εν μέρει, οφείλεται σε αυξημένη απόπτωση όταν συνδυάζεται με MDV3100,

TTK

φαίνεται να λειτουργεί μέσω ενός εναλλακτικού μηχανισμού αναστολής της ανάπτυξης . Παρά το γεγονός ότι

PSMC1

δεν σκόραρε στα κύτταρα PC3 στην αρχική οθόνη βιβλιοθήκης shRNA, siRNA νοκ ντάουν του

PSMC1

μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων PC3, αυξάνοντας την πιθανότητα ότι αυτά τα αντιπολλαπλασιαστικά αποτελέσματα μπορεί να μην είναι ειδικά για AR-θετικού καρκίνου του προστάτη κύτταρα (Σχήμα S3). Για το λόγο αυτό, δεν επιδιώκουν περαιτέρω χαρακτηρισμό του

PSMC1

.

Η υπερέκφραση του

TTK

σχετίζεται με αυξημένη πιθανότητα βιοχημικής υποτροπής

Για να διερευνήσουν αν

ΑΚΤ1

,

STRADA

, και

TTK

μεταβάλλονται σε ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη, εκτιμήσαμε την κατάσταση αριθμού αντιγράφων και την έκφραση αυτών των γονιδίων σε ένα προηγουμένως αναφέρθηκαν από ανθρώπινο προστάτη το σύνολο δεδομένων του καρκίνου [18]. Από τους 218 όγκους του προστάτη, 34,4% είχε μειωμένη έκφραση του

STRADA

, 18,3% παρουσίασαν υπερέκφραση του

TTK

, 11,7% είτε υπερεκφράζεται ή είχαν μειωμένη έκφραση του

ΑΚΤ1

, και 15,6% των όγκων υπερεκφράζονται ή είχαν ενισχυμένο

AR

(Πίνακας 2). Η υπερέκφραση ορίστηκε ως ζ-score≥2 και μειωμένη έκφραση ορίστηκε ως βαθμολογία-z & lt? 2, σε σύγκριση με την έκφραση σε φυσιολογικά δείγματα προστάτη. Σε αντίθεση με

AR

,

STRADA

,

TTK

, και

ΑΚΤ1

έδειξε λίγα στοιχεία της γονιδιακής ενίσχυσης ή απώλεια σε ανθρώπινους όγκους του προστάτη. Ο μεγάλος αριθμός των όγκων του προστάτη με αλλαγές στο

STRADA

,

TTK

, και

ΑΚΤ1

έκφραση μας οδήγησε να εξετάσουμε την αντιστοιχία τους με βιοχημική υποτροπή. Είναι ενδιαφέρον ότι, η υπερέκφραση του

TTK

παρουσίασαν σημαντική συσχέτιση με βιοχημικής υποτροπής (p = 0,003) (Σχήμα 3). έκφραση TTK δεν συσχετίζονται σημαντικά με τα ακόλουθα κλινικά χαρακτηριστικά:. χειρουργικών περιθώριο, την κατάσταση των λεμφαδένων, σπερματοδόχο κύστη, το σκορ Gleason, ειδικό αντιγόνο του προστάτη θεραπεία (PSA), σημαίνει PSA, ή εξωκαψική επέκταση (Πίνακας S3)

Kaplan Meier πλοκή του κινδύνου της βιοχημικής υποτροπής σε ασθενείς (n = 131) με TTK υπερεκφράζουν όγκους του προστάτη (n = 20? πράσινη γραμμή) σε σχέση με εκείνους που δεν έχουν TTK υπερεκφράζουν (n = 111? μπλε γραμμή) όγκους (p = 0,003, ημερολόγιο τεστ rank).

η

Αποκλεισμός ΑΚΤ συνεργάζεται με βικαλουταμίδη να προκαλέσει LNCaP κυτταρικής απόπτωσης

για να διερευνήσουν περαιτέρω το δυναμικό ρόλο των γονιδίων αυτών ως θεραπευτικοί στόχοι για τον καρκίνο του προστάτη, γυρίσαμε στη φαρμακολογική αναστολέων. Αξιολογήσαμε τον αριθμό των βιώσιμων κυττάρων LNCaP χρησιμοποιώντας έναν αναστολέα ΑΚΤ1 /2 με την παρουσία και απουσία βικαλουταμίδης. Η θεραπεία με βικαλουταμίδη ή τον αναστολέα ΑΚΤ μείωσε τον αριθμό των βιώσιμων κυττάρων κατά 10% και 45%, αντίστοιχα (Σχήμα 4Α). Σε αντίθεση, συνδυάζοντας τις ενώσεις μειώνεται πολλαπλασιασμό των κυττάρων κατά 100% και απόπτωση που επάγεται όπως φαίνεται από την αύξηση της διάσπασης της ΡΑΚΡ (Σχήμα 4Β). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η ΑΚΤ μπορεί να είναι ένας θεραπευτικός στόχος για τον καρκίνο του προστάτη σε συνδυασμό με θεραπεία αντι-ανδρογόνου, συνεπής με πρόσφατες ενδείξεις που χρησιμοποιούν αναστολείς ΡΙ3Κ [20].

(Α) αριθμός των βιώσιμων κυττάρων LNCaP αγωγή επί 5 ημέρες με όχημα , βικαλουταμίδη (1 μΜ), /2 αναστολέα Akt1 (1 υΜ), ή ένας συνδυασμός βικαλουταμίδης και αναστολέα ΑΚΤ. (Β) Η απόπτωση μετρήθηκε σε κύτταρα LNCaP με ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα ΡΑΚΡ σε κύτταρα LNCaP αντιμετωπίζονται όπως στο (Α). Αναστολή της φωσφορυλιωμένη Akt (pAkt (Ser473)) και φωσφορυλιωμένη S6 (PS6) μετρήθηκε επίσης. Ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Συζήτηση

Οι τρέχουσες θεραπείες για τον καρκίνο του προστάτη περιλαμβάνουν αντιανδρογόνα, όπως βικαλουταμίδη και MDV3100. Παρά το γεγονός ότι σχεδόν όλοι οι ασθενείς έχουν αρχικές απαντήσεις σε αυτά τα φάρμακα, πολλοί όγκοι γίνονται ανθεκτικοί σε αυτές τις θεραπείες, με αποτέλεσμα CRPC. Λόγω του σημαντικού ρόλου που διαδραματίζει AR σε πρωτοπαθή καρκίνο του προστάτη και CRPC, AR παραμένει ένα σχετικό θεραπευτικό στόχο. Ταυτοποίηση νέων προσεγγίσεων για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης θεραπείες συνδυασμού με αντιανδρογόνα, είναι μια περιοχή θεραπευτική ανάπτυξη. Ως εκ τούτου, εκτελέσαμε μια αμερόληπτη multiplex οθόνη shRNA για τον εντοπισμό ρυθμιστών της βιωσιμότητας του προστάτη καρκινικών κυττάρων. Ο στόχος μας ήταν να προσδιοριστούν τα γονίδια που θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν για τα νέα στοχευμένη θεραπεία.

Από την οθόνη shRNA και

in vitro

siRNA πειράματα επικύρωσης σε μια ανεξάρτητη κυτταρική γραμμή, εντοπίσαμε και επικυρώνονται

ΑΚΤ1

,

STRADA

, και

TTK

ως υποψήφια γονίδια που συνεργούν με αντιανδρογόνα (Σχήμα 1 και Σχήμα 2). Παρά το γεγονός ότι

ΑΚΤ1

,

STRADA

, και

TTK

σκόραρε ως αναστολείς του πολλαπλασιασμού των κυττάρων LNCaP στα πλαίσια της βικαλουταμίδης, επικύρωση με siRNAs στην ίδια γραμμή κυττάρων αποκάλυψε ότι μπορούν μειώνουν την κυτταρική βιωσιμότητα σε απουσία βικαλουταμίδης (Σχήμα S4A). Η επίδραση αυτή ήταν ειδική για LNCaP και δεν παρατηρήθηκε σε κύτταρα PC3 AR-αρνητικό. Μία εξήγηση για αυτή τη διαφορά στο φαινότυπο είναι η δύναμη του shRNA knockdown στην οθόνη έναντι του siRNA στα πειράματα επικύρωσης, αφού siRNAs γενικά επιτευχθεί μεγαλύτερη knockdown από το Τα siRNAs σε MOI≤0.5. Πράγματι, τα siRNAs έκανε παρουσιάζουν ένα υψηλό επίπεδο γονιδιακής αποσιώπησης στα πειράματα επικύρωσης (Σχήμα S4B).

Θα είναι ενδιαφέρον να κατανοήσουμε το μηχανισμό με τον οποίο η αναστολή της

ΑΚΤ1

, em

STRADA

ή

TTK

ενισχύει τη δράση αντι-ανδρογόνο. Μια πιθανότητα είναι μέσω της ρύθμισης AR-εξαρτώμενη μεταγραφή, αλλά δεν καταφέραμε να παρατηρήσει μια μείωση στα επίπεδα του mRNA της

AR

ή AR-στόχο γονίδια (

TMPRSS2

,

FKBP5

,

NKX3.1

, ή

KLK3

) όταν αυτά τα γονίδια σιγήσει σε κύτταρα LNCaP (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μια άλλη δυνατότητα είναι η διαταραχή της σηματοδότησης στιχομυθία οδού, όπως φαίνεται και από τα πρόσφατα στοιχεία για την αμοιβαία αρνητική ανάδραση ως εξήγηση για τη συνέργεια που παρατηρείται με συνδυασμένη αναστολή PI3K /AR μονοπατιού [20].

TTK, επίσης γνωστή ως μονοπολική άξονα 1 (MPS1), είναι ένα σερίνης /θρεονίνης και τυροσίνης κινάσης που έχει ενοχοποιηθεί για την διατήρηση του σημείου ελέγχου συγκροτήματος άξονα και είναι αναγκαία για τη σωστή χρωμόσωμα διαχωρισμό κατά τη διάρκεια της μίτωσης [21], [22]. TTK έχει ιδιαίτερο ενδιαφέρον επειδή άλλοι έχουν αναφέρει ότι η μείωση των επιπέδων του

TTK

ευαισθητοποιημένα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα σε υπο-θανατηφόρες δόσεις της ταξόλης, ενώ μη καρκινογενής κύτταρα δεν θα μπορούσαν να ευαισθητοποιηθεί σε ταξόλη [23]. Εδώ διαπιστώνουμε ότι η αποσιώπηση

TTK

οδήγησε στην ευαισθητοποίηση των κυττάρων vcap σε ένα ισχυρό αντι-ανδρογόνο. Το γεγονός ότι το 18% των ανθρώπινων όγκων του προστάτη υπερεκφράζουν TTK και ότι αυτοί οι όγκοι έχουν ένα διαφορετικό κλινικό αποτέλεσμα υποδηλώνει ότι οι αναστολείς TTK σε συνδυασμό με αντιανδρογόνα μπορεί να παρουσιάζει ενδιαφέρον.

STE20 σχετίζονται άλφα προσαρμογέα κινάση, ή STRADA, είναι ένα pseudokinase που έχει αναφερθεί ότι απαιτείται για τη σωστή δράση του καταστολέα όγκων, ήπατος κινάση Β1 (LKB1) [24].

απαιτείται για τη λειτουργία του καταστολέα LKB1 όγκου STRADA

? Ως εκ τούτου, σίγηση του

STRADA

μπορεί να αναμένεται να προωθήσει ογκογένεση. Το εύρημά μας ότι

STRADA

παρουσίασαν μειωμένη έκφραση σε ένα μεγάλο ποσοστό των ανθρώπινων καρκίνων του προστάτη είναι σύμφωνο με ένα ρόλο καταστολέα όγκου (Πίνακας 2). Ωστόσο, είναι πιθανό ότι STRADA έχει λειτουργίες ανεξάρτητη της σηματοδότησης LKB1 /ΑΜΡΚ που προάγουν την αναστολή της ανάπτυξης σε κάποια κυτταρικά περιβάλλοντα. Ο πιθανός ρόλος του STRADA στην πρόοδο του καρκίνου του προστάτη και η δυνατότητα LKB1 λειτουργιών /ΑΜΡΚ ανεξάρτητο απαιτούν επιπλέον προσοχή.

Akt1 είναι μία κινάση σερίνης-θρεονίνης που αναμεταδίδει σήματα από φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης 3 ‘κινάσης (ΡΙ3Κ) με φωσφορυλίωση του κατάντη στόχοι και απορρύθμισης της οδού αυτής είναι γνωστό ότι συμβάλλουν στην εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη [25], [26]. Είναι γνωστό ότι η οδός ΡΙ3Κ /Akt διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην βιωσιμότητα των κυττάρων καρκίνου του προστάτη και ογκογένεση και είναι που επί του παρόντος υπό διερεύνηση ως θεραπευτικός στόχος [27], [28]. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η ΑΚΤ /ΡΙ3Κ μονοπατιού ρυθμίζει την ανάπτυξη των κυττάρων LNCaP και ότι η έκφραση του ουσιαστικά δραστικής ΑΚΤ μπορούν να μπλοκάρουν βικαλουταμίδης επαγόμενη αναστολή της ανάπτυξης [27], [29], [30]. Επιπλέον, Akt1 έχει αποδειχθεί ότι αλληλεπιδρά με AR [31]. Η απώλεια της λειτουργίας του ομολόγου φωσφατάσης και tensin (ΡΤΕΝ), ένας αρνητικός ρυθμιστής του μονοπατιού ΡΙ3Κ /ΑΚΤ, παρουσιάζεται στο 50% τουλάχιστον του προχωρημένου καρκίνου του προστάτη του ανθρώπου [32] – [34]. Αυτή η απώλεια της ΡΤΕΝ αποτελέσματα λειτουργίας σε αυξημένη έκφραση του φωσφορυλιωμένου Akt και την επακόλουθη ενεργοποίηση των κατάντη στόχων που εμπλέκονται στην κυτταρική επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό [35], [36]. Η αναστολή της ΑΚΤ χρησιμοποιώντας siRNAs ή επαγόμενη φαρμακολογική αναστολέα της απόπτωσης σε συνδυασμό με βικαλουταμίδη ή MDV3100 στο AR-εξαρτώμενου καρκίνου του προστάτη κύτταρα (Σχήμα 2Α, δεξί πλαίσιο και Σχήμα 4). Ως αποτέλεσμα των αναφερόμενων ρόλους του Akt1 σε προστάτη ογκογένεση του καρκίνου, η οδός ΡΙ3Κ /ΑΚΤ εξετάζεται στενά ως θεραπευτικός στόχος [25]. Τα δεδομένα μας υποστηρίζουν τη χρήση των αναστολέων της Akt σε συνδυασμό με αντιανδρογόνα για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια και αντιανδρογόνα

ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκινώματος προστάτη (LNCaP, PC3, και VCAP) και ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα (293Τ) αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA) και διατηρήθηκαν κάτω από 20 περάσματα στο εργαστήριο. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες ATCC. Δεν παρατηρήθηκαν ανωμαλίες στην ανάπτυξη ή τη μορφολογία για κάθε κυτταρική γραμμή κάτω από τις αντίστοιχες συνθήκες ανάπτυξης τους. Βικαλουταμίδη αγοράστηκε από την AstraZeneca Pharmaceuticals LP (Wilmington, DE) και MDV3100 συντέθηκε στο Memorial Sloan-Kettering, από τη Διευκόλυνση Οργανική Σύνθεση πυρήνα [19].

Προετοιμασία της μικρής φουρκέτα RNA βιβλιοθήκη DNA και ο ιός

Μια βιβλιοθήκη πλασμίδιο (pLMP) που εκφράζουν ~6,000 βραχείας φουρκέτας RNAs (Τα siRNAs) κινάσες στόχευσης, γονίδια που εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, και άλλα γονίδια που είναι γνωστό ότι εμπλέκεται στον καρκίνο χρησιμοποιήθηκε στην τρέχουσα οθόνη [17]. Το ομαδοποιημένο πλασμίδιο βιβλιοθήκη ενισχύθηκε σε ΤΟΡ10 κύτταρα ηλεκτροϊκανά (Invitrogen, Carlsbad, CA) και το πλασμίδιο DNA απομονώθηκε από τουλάχιστον 1.000 προϊόντα μετασχηματισμού ανά φουρκέτα. Ο ιός που παράγεται σε 293FT κύτταρα με συν-επιμόλυνση του φορέα έκφρασης pUMVC3-Gag-Pol (Addgene, Cambridge, ΜΑ), VSVG παντροπική περίβλημα (Addgene), και το shRNA DNA βιβλιοθήκη που απομονώθηκε παραπάνω.

οθόνη shRNA παρεμβολή

Η οθόνη παρεμβολές shRNA απεικονίζεται στο Σχήμα 1Α. LNCaP και PC3 κύτταρα μολύνθηκαν με τον 6Κ shRNA ομαδοποιήθηκαν ιός βιβλιοθήκη (MOI≤0.5) εις τριπλούν για να δημιουργήσει ένα σύνολο από 6 εκατομμύρια μολυσμένα κύτταρα ανά επανάληψη, ανά κυτταρική γραμμή. Η μόλυνση των κυττάρων-στόχων σε MOI≤0.5 επιβεβαιώθηκε με μικροσκοπία φθορισμού και ενεργοποιημένη με φθορισμό διαλογή κυττάρων (FACS) 48 ώρες μετά τη μόλυνση. LNCaP και PC3 κύτταρα επελέγησαν με 3 μg /ml πουρομυκίνης και τα κύτταρα μετρήθηκαν και τοποθετήθηκαν σε μέσο ανάπτυξης που περιέχει 0,4 μΜ βικαλουταμίδη, 1,0 υΜ βικαλουταμίδη, ή φορέα (DMSO). Τα κύτταρα περάστηκαν και βικαλουταμίδη και το όχημα αναπληρώνονται, κάθε 4 ημέρες χωρίς να επιτρέπει τη συρροή. LNCaP και PC3 κύτταρα από κάθε επανάληψη συλλέχθηκαν και σβώλοι κυττάρων καταψύχθηκαν flash και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C σε πολλαπλά χρονικά σημεία κατά τη διάρκεια της οθόνης. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά τη μόλυνση (Τ = 0), και μετά από 8 ημέρες (Τ = 1) και 21 ημέρες (t = 2) της έκθεσης σε όχημα ή βικαλουταμίδη.

Microarray

Γενωμικό DNA εκχυλίστηκε από τα κύτταρα χρησιμοποιώντας πρότυπες συνθήκες. Οι γραμμωτοί κώδικες και ημι-φουρκέτες από το πλασμίδιο βιβλιοθήκη DNA (που χρησιμοποιήθηκε αρχικά για να κάνει τον ιό) και LNCaP και PC3 κυττάρων γονιδιωματικού DNA που απομονώθηκε παραπάνω ενισχύθηκαν με PCR χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές: 5′-TAGTGAAGCCACAGATGTA-3 ‘και 5′-AAAGCGCATGCTCCAGACTGCC-3’ . Τα προϊόντα της PCR υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση πηκτώματος και τα προκύπτοντα 350 ζώνες bp καθαρίστηκαν σε πήκτωμα χρησιμοποιώντας το κιτ εκχύλισης πηκτής QIAEX II (Qiagen, Valencia, CA) θραύσματα .Purified DNA (1.5 ug) από LNCaP ή κύτταρα PC3 σημάνθηκαν και υβριδισμό μικροσυστοιχιών ήταν πραγματοποιείται χρησιμοποιώντας προσαρμοσμένες Agilent μάρκες όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17].

μικροσυστοιχιών ανάλυση των δεδομένων

Affymetrix δεδομένα array εξόνιο από 147 δείγματα όγκων [18] χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων στόχων shRNA εκπροσωπούνται στην οθόνη της βιβλιοθήκης. Ανιχνευτές με φόντο προσαρμοστεί κανονικοποιημένη ένταση είναι μεγαλύτερη από 50 θεωρήθηκαν ως εντοπιστεί.

Agilent λογισμικού Χαρακτηριστικό Extractor χρησιμοποιήθηκε για να σαρώσετε εικόνες μικροσυστοιχιών. Χαρακτηριστικό Extractor ένταση κανονικοποιημένη Cy3 για κάθε συστοιχία συντάχθηκε και όλα τα περαιτέρω επεξεργασία έγινε με το στατιστικό λογισμικό πακέτο R 2.8.1. Ποιότητα εκτιμήθηκε σε όλη χρησιμοποιώντας ανάλυση σε κύριες συνιστώσες και πιο επίσημα με τη σύγκριση της διατεταρτημοριακό εύρος σε όλη συστοιχίες. Δείγματα με log2 μετατραπεί διατεταρτημοριακά κυμαίνεται λιγότερο από 6 θεωρήθηκαν ακραίες τιμές και δεν λαμβάνονται υπόψη στην περαιτέρω ανάλυση. Όταν παραμένουν δείγματα εις διπλούν (τεχνική επαναλήψεις), χρησιμοποιήθηκε η πιο πρόσφατη αντίγραφο κάθε. Τα υπόλοιπα δείγματα υποβλήθηκαν σε quantile εξομάλυνση. Ανιχνευτές που αντιστοιχούν σε φουρκέτες που δεν υπάρχουν στη βιβλιοθήκη χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί έλεγχοι. Η ένταση του σήματος 95ο εκατοστημόριο του αρνητικού ελέγχου χρησιμοποιήθηκε ως μέτρο υπόβαθρο και εκτιμήθηκε από την προ-επιλογής (Τ = 0) δείγματα. Ανιχνευτές αφαιρέθηκαν από την περαιτέρω ανάλυση, όταν δεν υπερβαίνει τη συγκεκριμένη εκτίμηση φόντο δείγμα για την πλειοψηφία των δειγμάτων προ-επιλογής. Στατιστική δοκιμή διεξήχθη για να προσδιορίσει φουρκέτες των οποίων αφθονία μεταβάλλεται συναρτήσει του χρόνου σε μη επεξεργασμένα δείγματα. Η ανάλυση χρονικής πορείας εφαρμοστεί στην εκχύλιση της διαφορικής έκφρασης γονιδίου (EDGE) λογισμικό χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση αυτή [37]. Για τον προσδιορισμό φουρκέτες όπου αφθονία συσχετίστηκε με την παρουσία της βικαλουταμίδης χρησιμοποιήθηκαν τα γραμμικά μοντέλα για τη βιβλιοθήκη μικροσυστοιχίας στην Ε 2.8.1 [38]. Συγκεκριμένα, ένα γραμμικό μοντέλο κατασκευάστηκε με όρους για θεραπεία, χρονικό σημείο, και να αναπαραχθούν. Αυτό το μοντέλο ταιριάζει σε κάθε ανιχνευτή, και πολλαπλές μεταβολές και ρ-τιμές που αντιστοιχούν στο αποτέλεσμα της θεραπείας, χρησιμοποιήθηκαν για την ταυτοποίηση ανιχνευτών ενδιαφέροντος. Οι δύο βικαλουταμίδη δόσεις (0,4 υΜ και 1.0 υΜ) και οι δύο χρονικά σημεία συλλέχθηκαν μετα-επιλογής (Τ = 1 και t = 2) συνδυάστηκαν για την ανάλυση για την αύξηση στατιστική ισχύς. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των δόσεων βικαλουταμίδη και χρονικά σημεία. Οι υποψήφιοι που είχε μια αλλαγή αφθονία που σχετίζεται με επελέγησαν η παρουσία βικαλουταμίδης που κατέληξαν σε log2 βικαλουταμίδη /οχήματος ≤-0,58 και ρ-value≤0.01. Οπτικοποίηση των υποψηφίων έγινε με ιεραρχική ομαδοποίηση και θερμικούς χάρτες. Όλα τα δεδομένα μικροσυστοιχιών είναι MIAME συμβατό. Όλα τα ανεπεξέργαστα δεδομένα που έχει κατατεθεί στο GEO (σειρά ID GSE32261).

Η βιωσιμότητα των κυττάρων και την απόπτωση δοκιμασίες

ON-TARGETplus μη στόχευσης (ΝΤ) siRNA και siRNA SMARTpools στόχευση

ABL2

,

ΑΚΤ1

,

AR

,

CIT

,

IGF1R

,

ΜΑΡΚΑΡΚ5

,

MAST3

,

PLK2

,

PRKACG

,

PSMC1

,

RABGAP1

,

STRADα (STRADA)

,

STRN3

,

TSSK2

,

TTK

, και

VEGFβ

αγοράστηκαν από την Thermo Fisher Scientific (Lafayette, CO). siRNAs που στοχεύουν

PLK1

χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος για απόπτωση και ελήφθησαν από το Screening διευκόλυνση MSKCC High-Throughput Drug. Λογαριθμική φάση LNCaP, PC3, και τα κύτταρα vCap επιμολύνθηκαν με 100 ηΜ siRNA χρησιμοποιώντας DharmaFECT (Thermo Fisher Scientific). Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε 3 και 6 ημέρες μετά την επώαση με βικαλουταμίδη (1 μΜ), MDV3100 (1 υΜ), ή όχημα χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας κυττάρων Titer-Glo Luminescent (Promega). Η απόπτωση προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό κασπάση-Glo 3/7 (Promega) και οι τιμές ομαλοποιήθηκαν με την Ημέρα 3 κυτταρική δοκιμασία Titer-Glo. Οι ανιχνεύσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και οι πρότυπα σφάλματα του μέσου αναφερθεί. δοκιμασίες πολλαπλασιασμού των κυττάρων διεξήχθησαν επίσης με επώαση κυττάρων με όχημα (DMSO), βικαλουταμίδη (1 μΜ), αναστολέα ΑΚΤ (1 μΜ) (Merck, Σταθμός Whitehouse, NJ), ή ένα συνδυασμό βικαλουταμίδης και αναστολέα ΑΚΤ και καταμέτρηση των κυττάρων. Τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν και οι τυπικές αποκλίσεις που αναφέρθηκαν.

ανοσοαποτύπωσης

Τα κυτταρολύματα για τις αναλύσεις κηλίδος Western παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας πρότυπο ρυθμιστικό διάλυμα RIPA. Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση western blot και ανοσοϊστοχημεία ήταν pAkt Ser473 (Cell Signaling Technology, 1:1000 αραίωση), Akt (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ, 1:1000 αραίωση), PS6 Ser235 /236 (Cell Signaling Technology, 1: 1000 αραίωση), PARP (Cell Signaling Technology, 1:1000 αραίωση), και ακτίνη (Cell Signaling Technology, 1:1000 αραίωση).

Ποσοτική αντίστροφη μεταγραφή-PCR

LNCaP, PC3, και τα κύτταρα υπόκεινται σε Vcap siRNA την επιμόλυνση συλλέχθηκαν 4 ημέρες ή και 7 ημέρες μετά την επιμόλυνση για την παρακολούθηση knockdown του γονιδίου (ων) στόχου με ποσοτική αντίστροφη μεταγραφή-ΡΟΚ (qRT-PCR) (βλέπε πίνακα S4). Οι αντιδράσεις έγιναν εις τριπλούν και κανονικοποιήθηκαν ως προς RPL27 για κάθε cDNA και στη συνέχεια κανονικοποιούνται να υποστεί αγωγή με έκδοχο NT. Τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής υπολογίστηκε.

Βιοχημική υποτροπή

Η γονιδιακή έκφραση και την αντιγραφή κατάσταση αριθμό

STRADA

,

TTK

,

AR

,

ΑΚΤ1

,

SKT22B

,

PSMC1

, και

PRKACG

στην πρωτοβάθμια και μεταστατικό καρκίνο του προστάτη του ανθρώπου (n = 218) προσδιορίστηκε με τη χρήση του MSKCC Καρκίνου Genomics Διαδρομή Πύλη [18]. Είκοσι από τους 131 όγκους είχαν

TTK

υπερ-έκφραση ορίζεται ως z-score≥2. Περιπτώσεις ταξινομήθηκαν ως

TTK

υψηλό και

TTK

κανονική /χαμηλή. Η πιθανότητα της ελευθερίας από βιοχημική υποτροπή μετά από ριζική προστατεκτομή (BCR ορίζεται ως & gt? 0,2 ng /ml και η άνοδος ειδικό προστατικό αντιγόνο) αναφέρθηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση Kaplan-Meier. P-αξία υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία log-rank.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Βικαλουταμίδη ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των LNCaP κυττάρων. Μετά τη μόλυνση με τη βιβλιοθήκη shRNA και επιλογή πουρομυκίνης (Α) LNCaP και (Β) PC3 κύτταρα μετρήθηκαν και τοποθετήθηκαν σε μέσο ανάπτυξης που περιέχει 0,4 μΜ βικαλουταμίδη, 1,0 υΜ βικαλουταμίδη, ή όχημα (0 μΜ). Τα κύτταρα μετρήθηκαν και ανακαλλιεργήθηκαν κάθε 4 ημέρες για την παρακολούθηση της ανάπτυξης σε απάντηση του οχήματος και βικαλουταμίδη. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως ο μέσος αριθμός των βιώσιμων κυττάρων (άνω πάνελ) ή ως το ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων υπό θεραπεία με βικαλουταμίδη σύγκριση με τα κύτταρα υπό αγωγή με όχημα (κάτω πάνελ) σε κάθε χρονικό σημείο κατά τη διάρκεια του χρόνου 21 ημερών για κάθε φαρμακευτική αγωγή ± τυπική σφάλμα 3 πειραμάτων επαναληπτικές

doi:. 10.1371 /journal.pone.0034414.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

shRNA ανιχνευτές εξαντληθεί στα κύτταρα LNCaP. Boxplots της σχετικής αφθονίας των ανιχνευτών στο όχημα και bicalutamide- (φάρμακο) επεξεργασμένα κύτταρα LNCaP. Δεδομένα από t = 2 και t = 3 συνενώθηκαν για το όχημα ή Boxplots βικαλουταμίδη επεξεργασία. Και οι δύο βικαλουταμίδη δόσεις (0,4 μΜ και 1,0 μΜ) επίσης συνδυάζονται για τους Boxplots ναρκωτικών.