Αφηρημένο

Ιστορικό

Η ενεργοποίηση του μονοπατιού σηματοδότησης Wnt έχει εμπλακεί σε ανώμαλος κυτταρικός πολλαπλασιασμός σε διάφορους καρκίνους. Στο 40% των καρκίνων των ωοθηκών ενδομητριοειδές, συστατική ενεργοποίηση της οδού οφείλεται σε ογκογόνους μεταλλάξεις σε β-κατενίνη ή άλλες μεταλλάξεις απενεργοποιήσεως σε βασικούς αρνητικών ρυθμιστών. Εκκρίνεται κατσαρωμένα που σχετίζονται με πρωτεΐνη 4 (SFRP4) έχει προταθεί να έχει ανασταλτική δράση μέσω της δέσμευσης και απομόνωσης συνδέτες Wnt.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Πραγματοποιήσαμε RT-qPCR και Δυτική ειδικής διαγνωστικής ικανότητας στην πρωτοβάθμια πολιτισμών και κυτταρικές σειρές των ωοθηκών για SFRP4 και το κλειδί προς τα κάτω ρυθμιστές της ενεργοποιημένης β-κατενίνης, β-κατενίνης και της GSΚ3β. SFRP4 εξετάστηκε στη συνέχεια με ανοσοϊστοχημεία σε μία ομάδα από 721 ασθενείς και λόγω προτεινόμενη εκκριτική λειτουργία του, στο πλάσμα, παρουσιάζοντας την πρώτη ELISA για SFRP4. SFRP4 ήταν περισσότερο εντόνως εκφρασμένο σε σαλπίγγων επιθήλιο και μειώθηκε με κακοήθη μετασχηματισμό, τόσο σε RNA και σε επίπεδο πρωτεΐνης, όπου ήταν ακόμη πιο βαθιά στο κλάσμα μεμβράνης (ρ PBZHP3-133289 να F.J.)? Ευρωπαϊκό Ίδρυμα Επιστημών (με V.H.S.)? Cancer Institute της Νέας Νότιας Ουαλίας (09 /CRF /2-02 έως V.H.S.)? Royal Αυστραλίας και της Νέας Ζηλανδίας Κολέγιο Μαιευτήρων και Γυναικολόγων (σε V.H.S.)? William Maxwell Εμπιστοσύνη (σε V.H.S.) και το Βασιλικό Νοσοκομείο Γυναικών του Ιδρύματος (με V.H.S.). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή καρκίνο των ωοθηκών

τα επιθηλιακά (ΕΓΚ) είναι η πέμπτη πιο κοινή αιτία θανάτου από όλες τις μορφές καρκίνου που εμφανίζονται στις γυναίκες και η κύρια αιτία θανάτου από γυναικολογικό κακοήθειες. Πάνω από το 75% των γυναικών παρόντες με τοπικά προχωρημένο ή γενικευμένη νόσος, συνήθως χαρακτηρίζεται από βαθμιαία εισβολή των γύρω οργάνων και, σε περιπτώσεις υψηλής στάδιο, της περιτοναϊκής κοιλότητας. Επιβίωση έχει αλλάξει ελάχιστα από τις αρχές της δεκαετίας του 1980, παρά νέα χημειοθεραπευτικά φάρμακα. Το ποσοστό επιβίωσης των τριών τετάρτων των ασθενών που εμφανίζουν εκτεταμένη μεταστατική νόσο είναι μόνο γύρω στο 20% [1].

Αυτή η κακή γενική πρόγνωση αποτελέσματα από την έλλειψη των πρώιμων συμπτωμάτων και την έγκαιρη διάγνωση, αναποτελεσματική θεραπεία για προχωρημένη νόσο, αντίσταση σε χημειοθεραπείες με βάση την πλατίνα και από περιορισμένη κατανόηση των αρχών της δεκαετίας-εναρκτήρια συμβάντα και τα πρώτα στάδια της ανάπτυξης του καρκίνου των ωοθηκών. Μια σημαντική πρόκληση παραμένει η ταυτοποίηση των ογκογόνων οδών καρκίνου των ωοθηκών για να βοηθήσει στη διάγνωση, ως προγνωστικούς δείκτες και ως στόχοι για νέες θεραπευτικές στρατηγικές [2]. Πολλές ομάδες, συμπεριλαμβανομένης και της δικής μας, έχουν χρησιμοποιήσει σειρά με βάση το γονιδίωμα-ευρεία πλατφόρμες ανακάλυψη για τον προσδιορισμό της έκφρασης παρεκκλίνουσα mRNA και σωματικά απέκτησε αλληλουχία DNA παραλλαγές ή μεταλλάξεις για τον προσδιορισμό των μοριακών αλλαγών που διέπουν την ανάπτυξη του καρκίνου των ωοθηκών, ως ένα πρώτο βήμα για τον εντοπισμό μοριακών δεικτών με πιθανή κλινική χρησιμότητα [3], [4].

Χρησιμοποιώντας αυτή την τεχνολογία, τα μέλη του μονοπατιού σηματοδότησης Wnt έχουν ενοχοποιηθεί σε ωοθηκών καρκινογένεση, ότι έχουν τη δυνατότητα για διαγνωστικούς, προγνωστικούς και θεραπευτικούς στόχους [5], [6]. Το μονοπάτι σηματοδότησης Wnt είναι εξαιρετικά διατηρημένη όλη ζώα και μεσολαβεί μία ποικιλία κυτταρικών λειτουργιών, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων πολικότητα, σχηματοποίησης ιστό, τον έλεγχο του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της ανάπτυξης της νεοπλασίας [7], [8]. Οι Wnt πρωτεΐνες που εκκρίνονται, πλούσιες σε κυστεΐνη μόρια σηματοδότησης με συντηρημένες δομές. Οι Δεκαεννέα Wnt πρωτεΐνες έχουν ταυτοποιηθεί και να συνδέεται με τα διάφορα στάδια της ανάπτυξης του ανθρώπου και την καρκινογένεση, συμπεριλαμβανομένων των καρκίνων του μαστού, του πνεύμονα, του παχέος εντέρου, των ωοθηκών και του δέρματος [9], [10], [11], [12], [13], [14]. Οι πρωτεΐνες Wnt σηματοδοτούν

μέσω

Frizzled υποδοχέων μέσω ενός αριθμού διαφορετικών αλλά διασυνδεδεμένων οδών σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένου του Wnt /Ca

2+, β-κατενίνης και επίπεδες-κυττάρων οδούς πολικότητα [15], [16] , [17]. Σε γενικές γραμμές, η οικογένεια Wnt ταξινομείται με βάση συνδέτη και την εμπλοκή του υποδοχέα σε κανονικό /β-κατενίνης μονοπάτι και το β-κατενίνης ανεξάρτητη /μη κανονικά οδό. Είναι ενδιαφέρον ότι, η μη κανονική σηματοδότηση Wnt μπορεί να ανταγωνιστεί κανονική σηματοδότηση Wnt, και μπορεί να αντιπροσωπεύει μία νέα οδό για τη στόχευση καρκίνων οδηγείται από κανονική Wnt σηματοδότηση [18]. Οι μεταγενέστεροι γονιδίων στόχων του /της β-κατενίνης σηματοδοτικό μονοπάτι Wnt /TCF αναγνωρίστηκαν ως ζωτικής σημασίας για το μετασχηματισμό των ωοθηκών επιθηλιακών κυττάρων, και ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω σε όλες τις ενδομητριοειδές καρκίνους των ωοθηκών με Wnt ελαττώματα οδό [19], [20]. Αρκετές άλλες μελέτες υποστήριξαν αυτήν την παρατήρηση, η υπερέκφραση της κυκλίνης D1 σε καρκίνους των ωοθηκών που φέρουν μεταλλάξεις β-κατενίνης αναφορά [21], [22], [23], [24].

εκκρινόμενη κατσαρωμένα σχετίζονται πρωτεΐνες (SFRPs) είναι εξωκυτταρικό αναστολείς της σηματοδότησης Wnt που δρουν με δέσμευση απευθείας σε Wnt συνδέτες [25] ή να Frizzled υποδοχείς [26]. Οι Frizzled υποδοχείς βρίσκονται αποκλειστικά στην πλασματική μεμβράνη, η οποία βρίσκεται στην επιφάνεια του Wnt-αποκριτικά κύτταρα. Τα τελευταία χρόνια, πολυάριθμες αναφορές έχουν περιγράψει επιγενετική αποσιώπηση αυτών των κανονικών ανταγωνιστών σηματοδότηση Wnt σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους, γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να λειτουργούν ως καταστολείς όγκων [27]. Στον καρκίνο των ωοθηκών,

SFRP1

ήταν το πρώτο μέλος της οικογένειας αναφερθεί ότι υπερμεθυλιωμένο και σιγήσει σε καρκινικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών και τα δείγματα των ασθενών, αλλά όχι σε φυσιολογικούς ελέγχους, γεγονός που υποδηλώνει μια πιθανή ρόλο ως καταστολέας όγκου [28]. Υποστηρικτής υπερμεθυλίωση

SFRP2

και

SFRP5

στη συνέχεια βρέθηκε επίσης στον καρκίνο των ωοθηκών [29]. Μια πρόσφατη μελέτη ανέφερε απώλεια

SFRP5

έκφρασης να συνδέεται τόσο με την εξέλιξη των ωοθηκών καρκινογένεση και την αντίσταση χημειοθεραπεία [29].

Όπως είχε επισημάνει στο παρελθόν

SFRP4

να είναι παρεκκλίνοντα εκφραζόμενη σε επίπεδο RNA σε ένα μεγάλο μεταγραφικό πείραμα των χαρακτηριστικών των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών (μη δημοσιευμένα δεδομένα), εδώ ερευνούμε για πρώτη φορά SFRP4 RNA και έκφρασης πρωτεΐνης σε 725 ασθενείς που χρησιμοποιούν ανάστροφη μεταγραφή αλυσιδωτής αντίδρασης ποσοτικής πολυμεράσης (RT-qPCR), Western -blot, ανοσοϊστοχημεία (IHC) και σύλληψη συνδεδεμένη με ένζυμο ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA) σε πρωτογενείς καλλιέργειες, κυτταρικές σειρές ωοθήκης, ασκίτη, ιστούς και πλάσμα.

Μέθοδοι

κλινικοπαθολογοανατομικές ασθενής κοόρτη

η δεοντολογική έγκριση και την έγγραφη συγκατάθεση χορηγήθηκε σε τρεις διαφορετικές τοποθεσίες στην Ελβετία, τη Γερμανία και την Αυστραλία: 1. Τμήμα Γυναικολογίας, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο της Ζυρίχης και του Τμήματος Γυναικολογίας και Μαιευτικής, Spital Limmattal, Ζυρίχη (SPUK, StV06 /2006, για να VHS)? 2. Τμήμα Γυναικολογίας και Μαιευτικής, Πανεπιστήμιο του Schleswig-Holstein (Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου του Schleswig-Holstein, Campus Λούμπεκ? Να Ο.Η.)? και 3. Γυναικολογική Cancer Centre, Βασιλικό Νοσοκομείο Γυναικών, Σίδνεϊ (HREC 09.08 /17 /3.02, για να V.H.S.). Αρχειακή ιστού από 721 ασθενείς εντός της Ελβετικής κοόρτης με κανονικό, καλοήθεις και των ωοθηκών /σαλπίγγων /περιτοναϊκή ή ενδομητρίου καρκίνων περιλήφθηκαν στην μικροσυστοιχίες ιστού (281 καλοήθεις διαγνώσεις, 440 καρκίνοι), με την πλειονότητα των καρκίνων είναι ωοθηκικής προέλευσης (69,8%? Πίνακας 1). Αιματοξυλίνη & amp? Ηωσίνη (Η & amp? Ε) τομές από κάθε δείγμα τόσο από την ελβετική και Αυστραλίας Κοόρτεις εξετάστηκαν από έναν παθολόγο που ειδικεύεται στην γυναικολογική παθολογία (Κ.Ο. για την ελβετική Cohort? J.S. για την αυστραλιανή Cohort) και οι περιοχές που αντιστοιχούν σε όγκο /καλοήθη ιστό σημειώνονται. πυρήνας Tissue βιοψίες 1,0 ή 2,0 πιπί ενσωματωθεί ιστικές μικροσυστοιχίες μεσαίας πυκνότητας (Beecher Instruments, Silver Spring, MD, USA). Κάθε ασθενής που αντιπροσωπεύεται από δύο πυρήνες του δείγματος από διαφορετικές περιοχές του όγκου. Τμήματα από κάθε σειρά ήταν Η & amp? Ε βάφονται για να επιβεβαιώσετε την εγγραφή του επιλεγμένου ιστού σε κάθε πυρήνα, και οι ασθενείς με ασαφείς ή μικτές ιστολογίες αποκλείονται. Όλα κλινικοπαθολογοανατομικές στοιχεία των ασθενών, όπως το στάδιο της νόσου, την ποιότητα, υπολειμματικής νόσου, παρουσία ασκίτη, το παρελθόν και το παρόν ιατρική ασθένεια, υπερηχογραφική ευρήματα και τα στοιχεία έκβασης ήταν αποθηκευμένα σε ένα ειδικά σχεδιασμένο in-house βάση δεδομένων (Perov) βασίζεται σε Microsoft Access (αδημοσίευτη? Microsoft , Seattle, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Οι ασθενείς με προηγούμενο ιστορικό καρκίνου ή φλεγμονωδών /αυτοάνοσων ασθενειών εξαιρέθηκαν από αυτή τη μελέτη.

Η

ομάδα πλάσμα μας επεκτάθηκε κατά 52 ασθενείς (γερμανικά κοόρτης) με σκοπό τη διευκόλυνση μια μεγαλύτερη ομάδα ασθενών η ενδομητρίωση. Τα δείγματα αίματος συλλέχθηκαν σε σωλήνες EDTA αίμα (BD Vacutainer®, BD Diagnostics, Franklin Lakes, NJ, USA) πριν από το χειρουργείο και αποθηκεύεται επί πάγου μέχρι την περαιτέρω επεξεργασία. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία εντός 3 h με φυγοκέντρηση των 3’000 g για 10 λεπτά στους 4 ° C και το πλάσμα αποθηκεύτηκε στους -80 ° C.

Κυτταρική καλλιέργεια

Η γραμμή κυττάρων SKOV3 (ορώδες καρκίνο των ωοθηκών ) καλλιεργήθηκε σε RPMI 1640 που περιέχει πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Pen /Strep), 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS) και L-γλουταμίνη (L-Glut). TOV112D (ενδομητριοειδές καρκίνο των ωοθηκών) και TOV21G (σαφής καρκίνο των ωοθηκών κυττάρων) καλλιεργήθηκαν σε DMEM + Pen /Strep + 10% FCS + L-Glut. Φυσιολογικά ανθρώπινα επιφάνεια επιθηλιακών κυττάρων των ωοθηκών (HOSE6-3) καλλιεργήθηκαν σε Μέσο 199 /MCDB 105 (1:02) που περιείχε Pen /Strep + 10% FCS + L-Glut. Όλες οι καρκινικές κυτταρικές γραμμές προήλθαν από την ATCC (www.atcc.org), HOSE6-3 ήταν ένα δώρο από το Garvan Institute of Medical Research, Σίδνεϊ, Αυστραλία.

πρωτογενείς καλλιέργειες

Οι πρωτογενείς καλλιέργειες συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια χειρουργικής επέμβασης ή κατ ‘επανάληψη κατά τη διάρκεια της παρακέντησης που απαιτούνται για την χημειοθεραπεία προοδευτική ασθένεια (Αυστραλιανή Ομάδα). Ωοθηκών καλλιέργειες καρκίνος προέρχεται κατά τη διάρκεια της παρακέντησης ελήφθησαν από το κυτταρικό ίζημα που παράγεται μετά τη φυγοκέντρηση των ασκιτών στους 4 ° C με 3’000 γρ. Σαλπίγγων κύτταρα για καλλιέργεια συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας μια κυτταρική ψήκτρα στο κροσσωτό άκρο του σωλήνα αμέσως μετά την προφυλακτική αμφοτερόπλευρη σαλπιγγοωοθηκεκτομή. Οι δύο σαλπίγγων κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται στην παρούσα έκδοση προέρχονται από δύο ασθενείς που υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση μείωσης του κινδύνου για το

BRCA1

κατάσταση μετάλλαξης (Tube 1) και ισχυρό οικογενειακό ιστορικό /καρκίνου του μαστού των ωοθηκών (Tube 2), όπου ενυπόγραφη ενημερωμένη ηθική συγκατάθεση χορηγήθηκε (HREC 09.08 /17 /3.02, σε VHS). Μετά τη συλλογή, οι καλλιέργειες αμέσως αποθηκεύεται σε ϋΜΕΜ και μεταφέρονται στο εργαστήριο για καλλιέργεια. Πρωτογενείς καλλιέργειες είτε αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ + Pen /Strep + 10% FCS + L-Glut (κυτταρικές σειρές του καρκίνου των ωοθηκών) ή Medium 199 /MCDB 105 (1:02) που περιείχε Pen /Strep + 10% FCS + L-Glut (κανονική σαλπίγγων κυτταρικές σειρές) μέχρι συρροής. Το δεύτερο πέρασμα του κάθε καλλιέργεια χρησιμοποιήθηκε για τα πειράματα.

RT-qPCR

RT-qPCR διεξήχθη σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές MIQE Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων (NUNC, Thermo Fisher Scientific , Roskilde, Δανία) σε μία συρροή 60%, πλένεται με 1 χ DPBS (Gibco, Invitrogen Australia Pty Ltd, Mulgrave) και ολικό RNA εκχυλίστηκε (κιτ NucleoSpin RNAII, Macherey & amp? Nagel, Duren, Germany). Η συγκέντρωση του RNA μετρήθηκε με τη χρήση της NanoDrop ND-1000 φασματοφωτόμετρο (Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Denmark), η ακεραιότητα επιβεβαιώθηκε με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης (1,7% πήκτωμα αγαρόζης) και λόγο της οπτικής πυκνότητας του 260/230 nm≈2.1 (2,0 έως 2.2) και 260 /280≈2.0 (01.08 – 02.02) επιλέγεται ως κριτήρια ένταξης. QPCR πραγματοποιήθηκε σε τρία γονίδια αναφοράς καθώς και το γονίδιο στόχο,

SFRP4

χρησιμοποιώντας 500 ng αντίστροφη μεταγραφεί RNA σε συνολικό όγκο 20 μΐ (iScript Αντίστροφη Μεταγραφή Supermix, Bio-Rad Laboratories Pty Ltd, Gladesville, Αυστραλία ). Εκκινητές για τα γονίδια αναφοράς επελέγησαν λόγω της σταθερής έκφραση τους: πρωτεΐνη σύνδεσης ΤΑΤΑ κουτί [30] προς τα εμπρός 5′-TGCACAGGAGCCAAGAGTGAA-3 ‘και αντίστροφος 5′-CACATCACAGCTCCCCACCA-3′? βήτα-γλυκουρονιδάση [31] προς τα εμπρός 5’-AGCCAGTTCCTCATCAATGG-3 ‘και αντίστροφος 5′-GGTAGTGGCTGGTACGGAAA-3′? ηλεκτρικό αφυδρογονάσης συγκρότημα, υπομονάδας Α [32] προς τα εμπρός 5’-TGGGAACAAGAGGGCATCTG-3 ‘και αντίστροφος 5′-CCACCACTGCATCAAATTCATG-3’? και

SFRP4

μπροστά 5′-ACACCCTCTTAAGCAGCACCAG-3 ‘και αντίστροφη 5′-AGGGTGGATGTCCTGGGAAGTAAG-3’ [33] (Sigma-Aldrich Pty Ltd, Castle Hill, Αυστραλία). QPCR εκτελείται στο Stratagene Mx3005® (Integrated Sciences Pty Ltd, Chatswood, Αυστραλία) χρησιμοποιώντας πλάκες μικροτιτλοδότησης 96 φρεατίων (Bio-Rad Laboratories (Pacific) Pty Ltd, Gladesville, Αυστραλία) και ο SensiFAST ™ SYBR lo-ROX Kit (Bioline ( Aust) Pty Ltd, Αλεξάνδρεια, Αυστραλία) με χαμηλό ROX ως χρωστική αναφοράς φθορισμού. Οι βέλτιστες συνθήκες αντίδρασης ελήφθησαν με 2 × μίγμα SensiFAST ™ SYBR, 400 ηΜ συγκεκριμένη έννοια εκκινητή, 400 ηΜ συγκεκριμένες αντιπληροφοριακό εκκινητή, RNase /άνευ ϋΝάσης ύδωρ και 25 ng cDNA εκμαγείο μέχρι ένα τελικό όγκο 20 μΙ. Εκτελέστηκαν ενισχύσεις ξεκινώντας με την ενεργοποίηση του ενζύμου 30 sec στους 95 ° C ακολουθούμενη από 40 κύκλους αποδιάταξης στους 95 ° C για 5 sec και ανασύνδεσης /επέκτασης στους 60 ° C για 30 sec. Μια καμπύλη τήξης ακολούθως παράγεται σε 65-95 ° C. Όλα τα δείγματα και τους αρνητικούς μάρτυρες ενισχύθηκαν εις τριπλούν και η μέση τιμή των σημάτων κανονικοποιημένης φθορισμού βασικής γραμμής-διορθωμένη (DRN) που ελήφθη για περαιτέρω υπολογισμούς. κύκλος Ποσοτικοποίηση (Cq) τιμές των γονιδίων αναφοράς μας συνενώθηκαν σε μία γεωμετρική μέση τιμή για κάθε δείγμα [32] και αφαιρείται από

SFRP4

έκφραση: ΔCq = Cq

SFRP4

-Cq

Ref. Για να ποσοτικοποιηθεί σχετικώς

SFRP4

έκφρασης (R) σε όλα τα μελετήθηκαν κυτταρικές σειρές, επελέγη ως HOSE6-3 ελέγχου μας και εκφράσεις άλλες γραμμές υπολογίστηκαν ως μια αναλογία σε σύγκριση με HOSE6-3 ως εξής: R = 2

-. [ΔCqSFRP4- ΔCqHOSE6-3]

Western κηλίδας ανάλυση

ασκίτης συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια της παρακέντησης από δύο ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών σε δύο διαδοχικά χρονικά σημεία, τρεις μήνες χώρια. Τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης για κυτταρικές γραμμές και αντι-βήτα-2-μικροσφαιρίνη για τον ασθενή εκχυλισμάτων πρωτεΐνης ασκίτη. Κλάσματα των 30 μg συνδυάστηκαν με δείγμα NuPAGE® LDS και μειώνοντας ρυθμιστικά (Invitrogen Australia Pty Ltd, Mulgrave) και βράζεται πριν από τη φόρτωση επί δωδεκυλοθειικό νάτριο (SDS) πολυακρυλαμιδίου πηκτές. Όλες οι πηκτές ηλεκτρικά μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF πριν αποκλείστηκαν για 1 ώρα σε ΘΔ σε 0,01% TBS /Tween που περιέχει 3% άπαχο γάλα σε σκόνη (TBS /Tween με άπαχο γάλα). Οι μεμβράνες επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 ° C σε TBS /Tween με άπαχο γάλα και στη συνέχεια πλένεται τρεις φορές επί 5 λεπτά σε TBS /Tween. Η οπτικοποίηση των πρωτεϊνών πραγματοποιήθηκε

μέσω

την προσθήκη ενός δευτερεύοντος αντισώματος συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας (HRP), το οποίο επωάστηκε για 1 ώρα σε ΘΔ σε TBS /Tween με άπαχο γάλα. Οι μεμβράνες πλύθηκαν τρεις φορές για 10 λεπτά σε TBS-Tween, επωάστηκαν σε ECL και αναπτύχθηκε με Hyperfilm. Σάρωση και ποσοτικοποίηση των εντάσεων των σημάτων πραγματοποιείται με τη χρησιμοποίηση ενός πυκνόμετρου Bio-Rad GS-800 με Ποσότητα Ένα λογισμικό (Hercules, CA, USA). Αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν στις ακόλουθες αραιώσεις: SFRP4 (Abnova, # 6424-A01): 1:1’000, ενεργοποιημένα β-κατενίνης (Millipore, # 05-665) 1:1’000, β-κατενίνης (Santa Cruz Biotechnology, # SC-7963), ΟδΚ3β (Sigma, # G7914) 1:1’000, αντι-βήτα-2-μικροσφαιρίνη (Sigma, # WH0000567M1, 1:1’000). Όλα τα δευτερογενή αντισώματα ήταν από την Dako (Dako Australia Pty Ltd, Botany, Αυστραλία) και χρησιμοποιήθηκαν στις ακόλουθες αραιώσεις: κατσίκας αντι-κουνελιού, 1:5’000 και αντι-ποντικού κατσίκας, 1:5’000

Ανοσοϊστοχημεία

Για την ανίχνευση της έκφρασης SFRP4 σε διάφορους ιστούς, slides μικροσυστοιχιών ιστού αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το αυτοματοποιημένο σύστημα χρώσης Ventana Benchmark (Ventana Medical Systems, Tucson, Αριζόνα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Για ανάκτηση αντιγόνου, τα πλακίδια θερμαίνονται με διάλυμα κλιματισμού κύτταρο για 1 ώρα (CC1? Τρις-βάση ρυθμιστικό με ελαφρά αλκαλικό ρΗ) χρησιμοποιώντας ένα πρότυπο πρωτόκολλο. Τα πλακίδια επωάστηκαν για 1 ώρα με αντι-ανθρώπινο αντίσωμα SFRP4 πολύκλωνο πρωτεύον ποντικού (1:30? Abnova, Taipeh, Ταϊβάν). Η ανίχνευση διεξήχθη με τη χρήση του συστήματος UView HRP (Ventana Medical Systems, Tucson, Arizona, USA). Αρνητικοί έλεγχοι παραλειφθεί το πρωτογενές αντίσωμα, και ένα θετικό και αρνητικό ιστό ελέγχου για κάθε αντίσωμα ταυτοποιήθηκε από ηλεκτρονικά δεδομένα κηλίδας Northern ή τη δημοσιευμένη βιβλιογραφία. Αντιχρωματισμός πραγματοποιήθηκε με αιματοξυλίνη και 1% αλκοόλη οξύ. Η ανοσοχρώση βαθμολογήθηκε ως ποσοστό και η ένταση της έκφρασης SFRP4 σε διάφορα κυτταρικά διαμερίσματα (μεμβράνη, κυτταρόπλασμα, τον πυρήνα). Βαθμολόγησης ανεξάρτητα αξιολογείται από δύο ερευνητές και οι διαφορές επιλύονται με συναίνεση. έκφραση SFRP4 από όλα τα δοκίμια από έναν ασθενή ήταν κατά μέσο όρο.

ELISA

Οι συγκεντρώσεις στον ορό SFRP4 προσδιορίστηκαν από αναπτυχθεί in-house Sandwich ELISA. Immunoplates (96-φρεατίων NUNC MaxiSorp? Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Denmark) επικαλύφθηκαν με ένα πολυκλωνικό αντίσωμα σύλληψης ποντικού που εγείρεται έναντι μερικής ανασυνδυασμένη ανθρώπινη πρωτεΐνη SFRP4 (# H00006424-A01, Abnova, Taipei City, Ταϊβάν) και αραιώνεται 1:250 σε ρυθμιστικό 0.1 Μ φωσφορικού ρΗ 7.2. Επίστρωση και επώασης διεξήχθησαν όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη, πρωτογενή και δευτερογενή αντισώματα αραιώθηκαν σε PBS και οι πλάκες πλύθηκαν τρεις φορές με 0.05% (ν /ν) Tween 20 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Ελβετία). Οι πλάκες μπλοκαρίστηκαν με PBS που περιείχε 5% (w /v) πρότυπο εμπορικό διαθέσιμο γάλακτος σε σκόνη για 40 λεπτά στους 37 ° C και πλύθηκαν τρεις φορές. Μετά το μπλοκάρισμα της μη ειδικής θέσεων σύνδεσης μια πρότυπη καμπύλη αναπτύχθηκε με τη χρήση ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης SFRP4 (# H00006424-Q01, Abnova, Taipei City, Taiwan) που κυμαίνονται από 3’200 ng /ml έως 12,5 ng /ml. Μη αραιωμένα δείγματα πλάσματος επωάστηκαν εις διπλούν για 1 h σε RT. Η δεσμευμένη SFRP4 ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας κουνελιού πολυκλωνικό πρωτογενές αντίσωμα ανθρώπινης SFRP4 σε RT για 60 λεπτά (Dr. R. Friis, Πανεπιστήμιο Βέρνης, Ελβετία). Οι πλάκες πλύθηκαν τρεις φορές ακολουθούμενο από επώαση με δευτερογενές πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-ποντικού συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας κουνελιού (1:1’000, Abcam, Cambridge, UK) για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από πέντε στάδια πλύσης, χρωμογόνο ΤΜΒ (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Switzerland) εφαρμόστηκε ως υπόστρωμα και η αντίδραση υπεροξειδάσης σταμάτησε σε 30 λεπτά με ένα ίσο όγκο 2 Μ θειικού οξέος. Η οπτική πυκνότητα μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα 450 nm με συσκευή ανάγνωσης ELISA (Tecan SpectraFluor Plus, Tecan, Μάνερντορφ, Ελβετία).

Στατιστική ανάλυση

Ενώ η έκφραση της πρωτεΐνης σε ιστούς SFRP4 αρχικά ποσοτικά ως κυτταροπλασματική, μεμβράνη και πυρηνική χρώση, οι αριθμοί ήταν συχνά πολύ χαμηλή για περαιτέρω στατιστικές αναλύσεις των επιμέρους ιστολογικές υποομάδες. Ως εκ τούτου, η έκφραση SFRP4 συνδυάστηκε, ανεξάρτητα από την τοποθεσία της χρώσης, και ονομαζόταν γενική «έκφραση SFRP4» (αυθαίρετη μονάδες). έκφραση SFRP4 τόσο ιστό και το πλάσμα που περιγράφονται χρησιμοποιώντας αρχικά Boxplots για διάφορες ομάδες διάγνωση. Μια κανονική ποσοστημόριο οικόπεδο για έκφραση SFRP4 στο πλάσμα ήταν ενδεικτική της θετικής ασυμμετρίας κάνει τυχόν μεταγενέστερες αναλύσεις που απαιτούν μια κανονική υπόθεση κατανομής αμφισβητήσιμη. Ωστόσο, η διακύμανση σταθεροποίηση λογαριθμική μετατροπή βελτιώνεται το θέμα. Οι διαφορές στην έκφραση μεταξύ των ομάδων SFRP4 διάγνωση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας μια σειρά γενικών γραμμικών μοντέλων, μαζί με μια ρύθμιση Bonferroni για συγκρίσεις κατά ζεύγη. Πιθανές συσχετίσεις μεταξύ της έκφρασης SFRP4 και κλινικές παράμετροι εκτιμήθηκαν με τη χρήση συντελεστή συσχέτισης του Pearson. Συγκεκριμένες ασθένειες επιβίωσης και υποτροπής επιβίωση χωρίς για την έκφραση της SFRP4 περιγράφονται χρησιμοποιώντας καμπύλες Kaplan-Meier και η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας Cox παλινδρόμησης υπολογίζοντας αδιόρθωτη και προσαρμοσμένο αναλογίες κινδύνου. Προσαρμοσμένη μοντέλα Cox περιλαμβάνονται ηλικιακές κατηγορίες (≤60, & gt? 60), ο βαθμός όγκου (1-2, 3), το στάδιο του καρκίνου ΦΥΓΩ (Ι-ΙΙ, ΙΙΙ-IV) και υπολειπόμενη νόσο (& lt? 10 mm, ≥10 mm) . Ρ-τιμές μικρότερες από 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. αναλύσεις δεδομένων δημιουργήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού SAS (v9.2, Cary, NC, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής).

Αποτελέσματα

Η απώλεια της έκφρασης SFRP4 συσχετίζεται με την επιθετική φαινότυπο

SFRP4

ήταν εντόνως εκφρασμένο σε πρωτογενείς καλλιέργειες σαλπιγγική σε σύγκριση με την κανονική κυτταρική γραμμή ωοθηκών επιφάνεια επιθηλιακών HOSE6-3 και ήταν ιδιαίτερα υψηλή σε ασθενή με τη μετάλλαξη BRCA (Tube 1) σε σύγκριση με τον ασθενή με θετικό οικογενειακό ιστορικό καρκίνου του μαστού /καρκίνο των ωοθηκών (Tube 2? Εικόνα 1 Α). Ενώ μια σαφή κυττάρων και ενδομητριοειδές καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών γραμμή (TOV21D, TOV 112D, αντίστοιχα) εξέφρασε

SFRP4

σε παρόμοια επίπεδα με μία από τις σαλπίγγων ελέγχων, το αδιαφοροποίητο ορώδες καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών γραμμή (SKOV3) εμφανίζεται πολύ χαμηλά επίπεδα του

SFRP4

(Σχήμα 1 Α). έκφραση SFRP4 μετρήθηκε κατόπιν σε πρωτεϊνικό επίπεδο σε διάφορους υγιείς και ωοθηκών καρκινικές κυτταρικές σειρές με Western κηλίδας. έκφραση SFRP4 συγκρίθηκε με το κλειδί του κατάντη ενεργοποιούνται οι ρυθμιστικές αρχές και η συνολική β-κατενίνης. HOSE6-3 συγκρίθηκε με διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές διαφορετικής histotypes και την κυτταρική διαφοροποίηση των ωοθηκών. έκφραση SFRP4 χάθηκε σε όλες τις καρκινικές κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με HOSE6-3 (Σχήμα 1 Β). Είναι ενδιαφέρον, TOV112D, ο ενδομητριοειδές κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών, που εκφράζεται υψηλότερα επίπεδα τόσο ενεργοποιημένα και η συνολική β-κατενίνης, συνεπή τη γνωστή Wnt αναστάτωση σηματοδότησης σε ενδομητριοειδές καρκίνους (Σχήμα 1 Β) [19]. Υγρό ασκίτη συλλέγεται κατά προοδευτική αντίσταση χημειοθεραπείας στη συνέχεια αναλύθηκε για την έκφραση του SFRP4 και κατάντη στόχοι ως μέτρο της προόδου σε βάθος χρόνου. Χρησιμοποιώντας ασκίτη σε δύο διαδοχικές χρονικές στιγμές από δύο ασθενείς με καρκίνο με δήθεν διαφορετικές επιθετικότητα (Pt 1 μικτός G1 καρκίνο των ωοθηκών, Pt 2 ορώδες περιτοναϊκή G3 καρκίνο), αυτά τα πειράματα έδειξαν μια μείωση της έκφρασης πρωτεΐνης SFRP4 διάρκεια προοδευτική ασθένεια στη χημειοθεραπεία (Εικόνα 1 C, D ). Παράλληλα με μείωση SFRP4, τα επίπεδα του κατάντη Wnt ρυθμιστή σηματοδότηση ΟδΚ3β ήταν επίσης μειωμένη, ενώ ενεργοποιείται β-κατενίνης αυξήθηκε, γεγονός που υποδηλώνει ότι σηματοδότηση Wnt πράγματι ενεργοποιηθεί σε αυτούς τους ασθενείς.

Απώλεια

SFRP4

έκφραση από πρωτογενείς σαλπίγγων επιθηλιακών κυτταρικών σειρών προς κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών δείχνεται σε διάφορα πειραματικά ρυθμίσεις. (Α) Έχουμε εφαρμοστεί φθορισμό RT-qPCR να ερευνήσει

SFRP4

γονιδιακή έκφραση σε πρωτογενείς σαλπιγγική (υγιείς ασθενείς) και αθανατοποιημένες κυτταρικές σειρές. επιλέχθηκε HOSE6-3 όπως τον έλεγχο και τις εκφράσεις των άλλων κυτταρικών σειρών υπολογίστηκαν ως αναλογία σε σύγκριση με HOSE6-3: R = 2

– [ΔCq

SFRP4

– ΔCqHOSE6-3]. (Β) SFRP4 και κατάντη στόχοι ενεργοποιημένα β-κατενίνης του (ABC), β-κατενίνης και GSK3 β μετρήθηκαν με Western κηλίδας σε διάφορες κυτταρικές σειρές (HOSE6-3, TOV21G (σαφής κύτταρο, Τύπου Ι καρκίνος των ωοθηκών), TOV112D ( ενδομητριοειδές) και SKOV3 (ορώδες) τύπου II καρκίνους των ωοθηκών), καθώς και στο (C) δείγματα ασκίτη από υψηλής ποιότητας ασθενείς ορώδες ωοθηκικό καρκίνο με χημειοαντίσταση, συλλέγονται σε δύο διαδοχικά χρονικά σημεία κατά τη διάρκεια της εξέλιξης της νόσου (TP, χρονικό σημείο εμφανίζεται ως Western κηλίδας ? Β2Μ, βήτα-2-μικροσφαιρίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης). (D) Αποτελέσματα για SFRP4, ενεργοποιημένα β-κατενίνης (ABC), β-κατενίνης, GSK3 β παρουσιάζονται ποσοτικά χρησιμοποιώντας πυκνομετρική ανάλυση από ένα πείραμα σε δείγματα ασκίτη ασθενή.

Η

Συσχετισμός της έκφρασης ιστού SFRP4 με διάφορες παραμέτρους κλινικοπαθολογοανατομικές

SFRP4 εντοπισμός κατόπιν μετρήθηκε στο επίπεδο πρωτεΐνης λόγω προτεινόμενη λειτουργία του στη μεμβράνη, κυτταρόπλασμα και περιστασιακά επίσης στον πυρήνα των κυττάρων (Σχήμα 2) με τη χρήση IHC σε μια μεγάλη ομάδα από 721 ασθενείς σε μικροσυστοιχίες ιστού που συνδέονται με την εκτεταμένη δεδομένων παρακολούθησης (Πίνακας 1). Μεμβρανώδης χρώση μπορεί να προσδιοριστεί στο κυττάρου-κυττάρου όριο και για την κορυφαία μεμβράνη, η οποία είναι συνεπής με προτεινόμενη λειτουργία εκκριτική του. ομάδα μας ενσωματώθηκε 281 ασθενείς της ομάδας ελέγχου που ήταν υγιείς ή είχαν καλοήθεις παθήσεις όπως η ενδομητρίωση ή cystadenomas /-fibromas. Η ομάδα καρκίνος επίσης αποτελείτο από 440 ασθενείς με οριακή όγκους ή διηθητικού καρκίνου του κυρίως των ωοθηκών (69,8%), αλλά και του ενδομητρίου (11,3%) και άλλες προελεύσεις (18,9%). Η μέση ηλικία κατά τη διάγνωση ήταν 57,1 χρόνια (19-88 ετών) για όλη την ομάδα, με τη μέση τιμή για την ομάδα ελέγχου είναι πέντε χρόνια νεότερος από τον ομάδα του καρκίνου (53,7

vs.

58,9 χρόνια). περιεκτική βάση δεδομένων μας ενσωμάτωσε τα στοιχεία παρακολούθησης από μια μέγιστη περίοδο 29 ετών (μέσος όρος για τις δύο ομάδες ασθενών 48,4 μήνες (1-348 μήνες)).

IHC αποδεικνύοντας εκπρόσωπος έκφραση της πρωτεΐνης SFRP4 σε δύο μεγεθύνσεις (× 10 αριστερή στήλη , × 40 δεξιά στήλη) σε φυσιολογικούς ιστούς (επιφανειακό επιθήλιο των ωοθηκών (Α) και των σαλπίγγων επιθήλιο (Β)) και διαφόρων τύπων καρκίνων των ωοθηκών (ενδομητριοειδές (C), ορώδες (D) και σαφή κυττάρων (Ε)).

SFRP4 θετικά εκφράζεται σε ιστό σε 296 721 ιστούς των ασθενών (41,1%) και σε 128 από 142 δείγματα πλάσματος (90,1%). Εντός της κλάσης του καρκίνου, 279 ασθενείς (86,4%) είχαν υψηλή όγκους βαθμού (βαθμός 3) και 221 ασθενείς (55,3%) παρουσιάζονται με προχωρημένο (ΦΥΓΩ III /IV) στάδιο της νόσου. Το ποσοστό θνησιμότητας πέντε χρόνια σε όλη την ομάδα του καρκίνου /Type I /Type II ήταν 29,5 /20,6 /41,3%, αντίστοιχα. Το ποσοστό υποτροπής πέντε χρόνια στις ίδιες υποομάδες ομάδα ήταν 20,5 /15,3 /27,5%, αντίστοιχα, αντικατοπτρίζοντας έτσι μια αντιπροσωπευτική ομάδα του καρκίνου.

Οι πιθανές συσχετίσεις μεταξύ της έκφρασης SFRP4 προσδιορίζεται τόσο στον ιστό και το πλάσμα, με κλινικοπαθολογικών παραμέτρων που προέρχονται από μας in-house κλινικοπαθολογοανατομικές βάση δεδομένων (βάση δεδομένων Perov? Access (Microsoft, Seattle USA)) εκτιμήθηκε με τη χρήση συντελεστή συσχέτισης του Pearson, r. Κλινικοπαθολογοανατομικές παράμετροι οι οποίες ήταν προσβάσιμες μέσα σε ομάδα μας περιλαμβάνονται αμβλώσεις, την ηλικία κατά τη διάγνωση, ΔΜΣ, τα επίπεδα CA125, τα επίπεδα CA72-4, τα επίπεδα HE4, τον βαθμό και το στάδιο των καρκίνων, υπολειμματική νόσο, ασκίτη κατά τη διάγνωση, το μέγεθος και την αμφοτερόπλευρη των όγκων των ωοθηκών, των επιδόσεων κατάστασης κατά τη διάγνωση, τη διάρκεια της παρακολούθησης, συγκεκριμένες ασθένειες και ελεύθερη υποτροπής επιβίωση, χημειοθεραπεία πλατίνα, από του στόματος αντισυλληπτικά ή ορμονικής υποκατάστασης θεραπείες, εγκυμοσύνη /παραδόσεις, την ηλικία εμμηναρχής και εμμηνόπαυσης, η παρουσία της ακμής, πολυκυστικές ωοθήκες, υπερβολική τριχοφυΐα, στειρότητα , λοιμώξεις, διαβήτη, υπέρταση, η κατανάλωση αλκοόλ /φαρμάκου, το κάπνισμα, η πρόσληψη του μη-στεροειδή φάρμακα, το ιστορικό των νοσηλειών, παθήσεις του μαστού, ενδομητρίωση, ινομυώματα, κύστες ωοθηκών, και το ιστορικό του καρκίνου ή οικογενούς καρκίνων.

το μόνο μετρίως ισχυρή συσχέτιση αποτελέσματα για έκφραση SFRP4 τόσο σε ιστό και το πλάσμα ανιχνεύθηκε στην περίπτωση της ασκίτη είναι παρόν σε πρώτη διάγνωση (SFRP4 IHC: r = 0.55, p = 0.01? SFRP4 ELISA: r = -0.60, ρ = 0.03 ). Ένα άλλο μετρίως ισχυρή συσχέτιση ήταν παρούσα για τον θηλασμό, όταν συσχετίζεται με την έκφραση του πλάσματος SFRP4 (r = -0,79, p = 0.06). Ωστόσο, αυτό είναι οριακής σημασίας καθώς το μέγεθος του δείγματος για τον θηλασμό ήταν μάλλον μικρό. Ασθενής συσχετίσεις βρέθηκαν για το ΔΜΣ (SFRP4 IHC: r = 0,19, p = 0,003) και η νέα HE4 δείκτης όγκου (SFRP4 ELISA: r = -0.25, p = 0.02) [34]. Μια οριακά σημαντική σχέση θα μπορούσε να ανιχνευθεί για το ιστορικό της γυναικολογικές επεμβάσεις (IHC: p = 0,038, ELISA: p = 0,099), τη θεραπεία ορμονικής υποκατάστασης (ELISA: p = 0,097) και την πρόσληψη αλκοόλ. (IHC: p = 0,098)

SFRP4 όλο και περισσότερο χάνεται κατά τη διάρκεια της κακοήθους εξαλλαγής

όπως θα έχουν προβλεφθεί από την υποτιθέμενη λειτουργία του, η έκφραση SFRP4 παρουσιάζονται κυρίως ως μεμβράνη και κυτταροπλασματική χρώση. Από όλους τους ιστούς που εξετάστηκαν, μόνο το κροσσωτά άκρο της σάλπιγγας που εκφράζεται χρώση πυρηνική SFRP4, το οποίο ήταν ένα μάλλον αναπάντεχο εύρημα (Σχήμα 2 Β). Ωοθηκών επιθήλιο της επιφάνειας, η οποία μέχρι πρόσφατα πρότεινε να είναι ο ενιαίος τόπος προέλευσης των καρκίνων των ωοθηκών οι περισσότεροι, εμφανίζεται μόνο ελάχιστη κυτταροπλασματική και δεν μεμβράνη χρώση, όπως ήταν η περίπτωση για κύστεις ένταξη, την τοποθεσία του μεταπλαστικού αλλαγές μέσα στην ωοθήκη. Η υψηλότερη έκφραση SFRP4 μέσα σε όλα ιστοί που μελετήθηκαν βρέθηκε στο σαλπιγγικό επιθήλιο, το οποίο είναι σύμφωνο με τα ευρήματά μας σε επίπεδο RNA σε πρωτογενείς καλλιέργειες των σαλπίγγων (Σχήμα 1 Α). Τα πρόσφατα προτεινόμενες καρκίνοι Τύπου II είναι όλο και πιστεύεται ότι έχουν την προέλευσή τους στο κροσσωτό άκρο της σάλπιγγας, η οποία θα πρέπει στη συνέχεια μάλλον να είναι η κανονική ελέγχου για τους περισσότερους καρκίνους (38). Πράγματι, βρήκαμε μια μείωση στην αθροιστική έκφραση SFRP4 από σαλπίγγων επιθήλιο, καλοήθεις ιστούς (συμπεριλαμβανομένων επιφάνεια των ωοθηκών επιθήλιο και κύστεις ένταξης), ενδομητρίωσης σε οριακά όγκους και καρκίνους (Σχήμα 3.1 Α, Β), και πάλι σε συνέπεια με την τάση που βρήκαμε με RT -qPCR σε κυτταρικές σειρές (Σχήμα 1 Α). Η απώλεια της έκφρασης SFRP4 από καλοήθεις με τον καρκίνο ήταν στατιστικά σημαντική τόσο όταν μετριέται ως έκφραση μεμβράνης μόνο του (ρ & lt? 0,0001 συνολικά, Σχήμα 3.2? Καλοήθης

vs

Καρκίνο, p = 0,07?. Borderline

vs.

Καρκίνος, σ & lt? 0.0001) και όταν μεμβράνη, κυτταρόπλασμα και η πυρηνική έκφραση μετρήθηκαν σε συνδυασμό (p = 0,0004 συνολικά, Σχήμα 3.1 A? Καλοήθης

vs

Καρκίνο, p = 0.039?. Borderline

vs.

Cancer, p = 0,002). Ενώ μια υποδιαίρεση της χρώσης μεμβράνης ήταν δύσκολο να μετρηθεί λόγω του μικρού μεγέθους του δείγματος στους ιστούς της μεμβράνης που εκφράζουν, η υψηλότερη έκφραση στην καλοήθη ομάδας για τη συνολική έκφραση SFRP4 ήταν στην σαλπίγγων επιθήλιο, που ακολουθείται από την ενδομητρίωση και το χαμηλότερο στην επιφάνεια του επιθηλίου και την ένταξη των ωοθηκών κύστεις (Εικόνα 3.1 Β? Tube εναντίον του ΟΣΕ, σ & lt? 0,0001? Tube εναντίον ενδομητρίωση, p = 0,014).

Boxplots αντιπροσωπεύουν αθροιστική έκφραση SFRP4 (αυθαίρετες μονάδες) στο κυτταρόπλασμα, μεμβράνη και τον πυρήνα (SFRP4 έκφραση σε