Αφηρημένο

Απελευθερωμένης Rho ΘΤΡάσες Rac1 και Cdc42 έχουν ανακαλυφθεί σε διάφορους όγκους, συμπεριλαμβανομένων του προστάτη και την έκφραση της πρωτεΐνης Rac αυξάνει σημαντικά στον καρκίνο του προστάτη. Οι οδοί Rac και Cdc42 προωθούν την ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό, την εισβολή και μεταστατικές ιδιότητες των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων. Συνθέσαμε τη νέα ένωση AZA1 βασίζονται σε δομικές πληροφορίες του γνωστού NSC23766 αναστολέα Rac1. Στην παρούσα μελέτη ερευνήσαμε την επίδραση της αναστολής αυτών των οδών με AZA1 επί ογκογονικότητα προστάτη εκτελώντας προκλινικές μελέτες χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο ποντικού ξενομοσχεύματος καρκίνου του προστάτη. Σε ανεξάρτητος από ανδρογόνο καρκινικών κυττάρων του προστάτη, AZA1 ανέστειλε τόσο Rac1 και Cdc42 αλλά όχι δραστηριότητα RhoA ΟΤΡάσης με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο και μπλοκάρει την κυτταρική μετανάστευση και πολλαπλασιασμό. έκφραση Κυκλίνη D1 μειώθηκαν σημαντικά μετά την αναστολή Rac1 /Cdc42 σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. θεραπεία AZA1 επίσης ρυθμίζεται προς τα κάτω PAK και δραστικότητα ΑΚΤ σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη, που σχετίζεται με την επαγωγή του προ-αποπτωτική λειτουργία του BAD από την καταστολή της φωσφορυλίωσης της σερίνης-112. Ημερήσια συστημική χορήγηση AZA1 για 2 εβδομάδες μειωμένη ανάπτυξη των ξενομοσχευμάτων ανθρώπινου όγκου του προστάτη 22Rv1 σε ποντίκια και βελτίωσε σημαντικά την επιβίωση των ζώων που φέρουν όγκους. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν έναν ρόλο των AZA1 στον αποκλεισμό Rac1 /Cdc42-εξαρτώμενη εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, η μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και την αύξηση του καρκίνου του κυτταρικής απόπτωσης που περιλαμβάνει κάτω ρύθμιση της ΑΚΤ και PAK οδό σηματοδότησης σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Προτείνουμε, λοιπόν, ότι μια θεραπεία με αναστολείς μικρού μορίου στόχευσης οδών σηματοδότησης Rac1 /Cdc42 Rho ΟΤΡάσης μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως μια νέα θεραπεία για ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο του προστάτη

Παράθεση:. Zins K, Λούκας Τ, Reichl P, ο Αβραάμ D, Aharinejad S (2013) A Rac1 /Cdc42 ΘΤΡάσης-Ειδικό μικρό μόριο αναστολέα καταστέλλει την ανάπτυξη του καρκίνου του Δημοτικού Ανθρώπινου προστάτη Ξενομοσχεύματα και παρατείνει την επιβίωση σε ποντίκια. PLoS ONE 8 (9): e74924. doi: 10.1371 /journal.pone.0074924

Συντάκτης: Μινγκ Tat Λινγκ, Queensland University of Technology, Αυστραλία

Ελήφθη: 15, Απριλίου, 2013? Δεκτές: 7, Αυγούστου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 11 του Σεπτεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Zins et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Έργου ΒΡΑΒΕΙΟ αριθμός: Z080347? Austria Wirtschaftsservice Ges.m.b.H (AWS). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη είναι η κύρια αιτία του καρκίνου και η δεύτερη συχνότερη αιτία θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με τους άνδρες [1]. Αν και διαλογής για καρκίνο του προστάτη έχει βελτιωθεί, 10-20% των ασθενών θα διαγνωστεί με τοπικά προχωρημένο ή μεταστατικό νόσο, ενώ άλλοι θα προχωρήσουν παρά θεραπεία χειρουργική επέμβαση, ακτινοβολία και τη στέρηση ανδρογόνου [2], [3]. Κατά συνέπεια, προχωρημένο καρκίνο του προστάτη παραμένει ένα σημαντικό πρόβλημα της υγειονομικής περίθαλψης και η ταυτοποίηση νέων στοχευμένων θεραπειών με επίκεντρο τις οδούς της μοριακής σηματοδότησης είναι απαραίτητο να βελτιωθεί η θεραπευτική παρέμβαση.

Rho ΘΤΡάσες όπως Rac, Cdc42 και RhoA οι πρωτεΐνες που ρυθμίζουν σηματοδότησης κυτταροσκελετού οργάνωση, την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, την κυτταρική επιβίωση και μετανάστευση συμβάλλει άμεσα στην ανάπτυξη και την εξέλιξη του όγκου [4]. Cdc42 παίζει επιπλέον ένα σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της κυτταρικής μετανάστευσης [5]. Rho ΘΤΡάσες υπάρχουν είτε ως ανενεργές, μορφές ΑΕΠ-δεσμεύεται ή ενεργό, GTP-δεσμεύεται μορφές που καθορίζουν τις κυτταρικές λειτουργίες της Rho GTPases [6]. δραστηριότητα ΘΤΡάσης Rho ενδέχεται να επηρεαστούν από διαφορετική ενεργοποίηση των Rho ΟΤΡάσης ρύθμιση οδούς σηματοδότησης ή ποικίλες ποσότητες των ρυθμιστικών μορίων Rho ΟΤΡάσης όπως Rho ΟΤΡάσης-ενεργοποίηση παραγόντων ανταλλαγής νουκλεοτιδίων γουανίνης (GEFs) [4]. Απελευθερωμένης Rho ΘΤΡάσες έχουν ανακαλυφθεί σε διάφορες πολλαπλασιαστική κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένου όγκων του προστάτη [4] και η έκφραση πρωτεΐνης Rac είναι σημαντικά αυξημένη σε καρκίνο του προστάτη [7].

Rho ΘΤΡάσες ρυθμίζουν τον κυτταρικό κύκλο με ενεργοποίηση του c-Jun Ν τερματική κινάση (JNK) και ρ38 ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ), οδηγώντας σε προς τα πάνω ρύθμιση της κυκλίνης D1 [8], [9], [10]. Το μονοπάτι σηματοδότησης Rac1 παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στην επιβίωση των κυττάρων που περιλαμβάνουν ν-Ακί ποντικού θυμώματος ιικού ογκογονιδίου ομόλογο 1 (ΑΚΤ) κινάση [11]. ΑΚΤ με τη σειρά της φωσφορυλιώνει BCL2 που σχετίζεται με αγωνιστή κυτταρικού θανάτου (BAD) [12], ένα προ-αποπτωτικών μέλος της οικογένειας Bcl-2, εξουδετερώνοντας τις προ-απόπτωσης της BAD [13]. πρωτεΐνη p21 (Cdc42 /Rac) -ενεργοποιημένου κινάση 1 (ΡΑΚ1) είναι μια περαιτέρω σημαντική καθοδικός τελεστής της Cdc42 και Rac1 [14], [15] για τον έλεγχο του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου [16].

Από την πρόσφατη μελέτες έχουν ενοχοποιηθεί ανώμαλη δραστικότητα Rac1 και Cdc42 στον καρκίνο του ανθρώπου, αυτές οι Rho ΘΤΡάσες έχουν προταθεί ως αντικαρκινικά στόχων [17], [18]. Rac1 ήταν ένας από τους πρώτους στόχους της ορθολογικής προσεγγίσεις σχεδιασμού φαρμάκων και ένας αναστολέας μικρό μόριο (NSC23766) που παρεμβαίνει στην αλληλεπίδραση της Rac1 με αρκετές GEFs ταυτοποιήθηκε ότι επηρεάζεται μόνο ελάχιστα δραστηριότητα Cdc42 [19].

Δεν ήταν ενδιαφέρονται για την ανάπτυξη περισσότερο ισχυρές, νέες, χημικά τροποποιημένα μικρά μόρια να αναστέλλουν δραστικότητα ΟΤΡάσης Rho για πιθανή κλινική εφαρμογή στη θεραπεία του καρκίνου με τη χρήση του αναστολέα Rac1 NSC23766 ως επικεφαλής δομή για την ένωση του σχεδιασμού [19]. Εμείς τώρα αναφέρουν την ταυτοποίηση και βιολογική δράση της AZA1, μία νέα διπλή ανασταλτική ένωση Rac1 και Cdc42 που επιβραδύνει αποτελεσματικά την ανάπτυξη καρκίνου του προστάτη σε ένα μοντέλο ανθρώπινου προστάτη ξενομοσχεύματος καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρικές γραμμές

Ανθρώπινο ανεξάρτητο από ανδρογόνο καρκινικών κυττάρων του προστάτη 22Rv1 (CRL-2505), PC-3 (CRL-1435) και DU 145 (ΗΤΒ-81) ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC? Manassas, VA) και καλλιεργήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (ϋΜΕΜ, ΡΑΑ, Pasching, Αυστρία) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS? ΡΑΑ), 0,1 Μ μη απαραίτητα αμινοξέα, 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη. Οι κυτταρικές σειρές ελέγχθηκαν για τη γνησιότητά τους από τη χρήση STR-PCR (PowerPlex 16 Σύστημα HS, Promega, Madison, WI).

γενιάς Ένωση

Με βάση τις διαθέσιμες δομικές και λειτουργικές πληροφορίες για Rac1-GEF αλληλεπίδραση της ένωσης αναστολέα Rac1 NSC23766 [19] και χρησιμοποιώντας μια στρατηγική εικονικής διαλογής χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων ZINC [20], δημιουργήσαμε 21 χημικά ποικίλες δυνητικές τύπων ένωση Ρακ-αναστολής, οι οποίες στη συνέχεια συντίθενται με προδιαγραφές (Delft, Ολλανδία). Στη συνέχεια, όλοι οι συντεθούν οι ενώσεις ελέγχθηκαν

in vitro από

εξέταση διαλυτότητα, δοκιμασίες ενεργοποίησης και προσδιορισμούς μιτοχονδριακής τοξικότητας (WST-1) όπως περιγράφεται παρακάτω

Rac1, Cdc42 και RhoA δοκιμασίες ενεργοποίησης.

προστάτη καρκινικά κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και πεινασμένο για 24 ώρες. Τα κύτταρα επωάστηκαν με μικρό μόριο αναστολέα AZA1 20 μΜ για 60 λεπτά και στη συνέχεια διεγέρθηκαν με 50 ng /ml επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF? Ε . Β, Εκπρόσωπος κυτταρομετρία ροής ιστογράμματα δείχνουν κυτταρικών πληθυσμών σε υπο-G

0 /G

1, G

0 /G

1, S και G

2 /

M φάσεις. 22Rv1 κύτταρα επωάστηκαν με 10 μΜ AZA1 για 24 ώρες. Τα κύτταρα ελέγχου δεν έλαβαν καμία αγωγή. Cellular περιεχόμενο DNA αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής μετά από χρώση με ιωδιούχο προπίδιο. C, έκφραση Κυκλίνη D1. Αντιπροσωπευτικά ανάλυση κυτταρομετρίας ροής και ποσοτικοποίηση της έντασης φθορισμού στα κύτταρα 22Rv1 σε επεξεργασία με 10 μΜ AZA1 για 60 λεπτά (κόκκινο ιστόγραμμα) σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (έντονη γραμμή) και τους ελέγχους ισοτύπου (λεπτή γραμμή). Ένωση θεραπεία μείωσε τα επίπεδα της κυκλίνης D1. *, Σημαντικά διαφορετικό έναντι του ελέγχου.

Η

Στη συνέχεια αναλύσαμε κατανομή του κυτταρικού κύκλου μετά από αγωγή AZA1. 22Rv1 κύτταρα χωρίζονται σε υπο G

0 /G

1, G

0 /G

1, S και G

2 /M φάσεις. Η υπο G

0 /G

1 πληθυσμού χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση της απόπτωσης. Σχήμα 3Β δείχνει ένα αντιπροσωπευτικό σύνολο των δεδομένων από μη επεξεργασμένο και AZA1 επεξεργασμένα κύτταρα 22Rv1. 22Rv1 κύτταρα κατεργασμένα με 10 μΜ AZA1 για 24 ώρες έδειξαν αύξηση στην υπο G

0 /G

1 φάση από 1,47% έως 26,9% (± 2,78? Ρ & lt? 0,05) και μία μείωση της G

2 /M φάσεις από 32,25% έως 20,30% (± 3,56? Ρ & lt? 0,05) σε κύτταρα επεξεργασμένα με 10 μΜ AZA1, υποδηλώνοντας αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και την αύξηση του αριθμού των αποπτωτικών γεγονότων. Στη συνέχεια εξετάσαμε το αποτέλεσμα της AZA1 στην πρωτεΐνη ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου Κυκλίνη D1. Σε κυτταρικά λύματα υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 10 μΜ AZA1 για 60 λεπτά, Κυκλίνη D1 ένταση φθορισμού μειώθηκε σημαντικά κατά 22% ± 4,2% (ρ & lt? 0.001) σε σύγκριση με μη κατεργασμένους μάρτυρες αντιπροσωπευτικά φαίνεται στο Σχήμα 3C. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ένα ρόλο για AZA1 στον αποκλεισμό Rac1 και Cdc42-εξαρτώμενη γεγονότα του κυτταρικού κύκλου σε 22Rv1 κυττάρων καρκίνου του προστάτη και η επαγωγή της απόπτωσης.

AZA1 αναστέλλει τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων

Ενεργή μετανάστευση των κυττάρων του όγκου είναι προαπαιτούμενο για την εξέλιξη του όγκου και τη μετάσταση και εκθέσεις δείχνουν ότι EGF-επαγόμενη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων μπορεί να ανασταλεί με καταστολή Cdc42 /Rac1 μονοπάτια σηματοδότησης [25]. Έτσι, εξετάσαμε την επίδραση της AZA1 για τη μετανάστευση των EGF-διεγείρεται 22Rv1, DU 145 και PC-3 κύτταρα σε δοκιμασίες Transwell. EGF-διέγερση αύξησε σημαντικά τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων σε 22Rv1 (Σχήμα 4Α), DU 145 και τα κύτταρα PC-3 (Σχήμα S4A) (ρ & lt? 0.001). Η επεξεργασία των κυττάρων με 2 μΜ AZA1 για 24 ώρες μείωσε σημαντικά τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων από 59,6 ± 12% (22Rv1 κύτταρα? Ρ & lt? 0,001? Σχήμα 4Α), 56,8 ± 18,8% (DU 145 κύτταρα? Ρ & lt? 0,001? Σχήμα S4A) και 57.3 ± 16,1% (PC-3 κύτταρα? ρ & lt? 0,001? Σχήμα S4A). έναντι EGF-διεγερμένα κύτταρα καρκίνου

Α, Αντιπροσωπευτικές εικόνες του μετανάστευσαν κυττάρων καρκίνου του προστάτη από μια

in vitro

μετανάστευση δοκιμασία δείχνονται. 22Rv1 προστάτη καρκινικά κύτταρα διεγέρθηκαν με 50 ng /ml EGF και υφίσταται κατεργασία με 2, 5 ή 10 μΜ AZA1 για 24 ώρες και μετανάστευσαν καρκινικά κύτταρα ποσοτικοποιούνται στη συνέχεια στο

in vitro δοκιμασίες

μετανάστευση. Τα δεδομένα συλλέχθηκαν από πέντε επιμέρους διαδοχικών πεδίων ορατότητας (40x) από τρεις επαναληπτικές θαλάμους Boyden. *, Σημαντικά διαφορετικό από τον έλεγχο? +, Σημαντικά διαφορετικό από τον έλεγχο και τα κύτταρα EGF-διεγερμένα. Β, Επίδραση της θεραπείας AZA1 στο σχηματισμό ελασματοπόδια και filopodia. 22Rv1 καρκίνου του προστάτη κύτταρα απλώθηκαν σε θαλάμους καλλιέργειας κυττάρων, διεγέρθηκαν με 50 ng /ml EGF και επωάστηκαν με 5 και 10 μm AZA1 για 24 ώρες. Η παραφορμαλδεΰδη στερεωμένα κύτταρα βάφτηκαν με Atto-488 φαλλοειδίνη (F-ακτίνη, πράσινο) για την ανίχνευση πολυμερισμένο κυτταροσκελετού της ακτίνης, filopodia και ελασματοπόδια και αντίθετα με ϋΑΡΙ (μπλε) και φωτογραφήθηκαν (μεγέθυνση, x1000). κεφαλής βέλος δείχνει τΊΙοροάίβ, βέλος δείχνει ελασματοπόδια. Οι αριθμοί των filopodia και ελασματοπόδια ανά κύτταρο υπολογίστηκαν από 25 κύτταρα σε κάθε ομάδα. AZA1 οδηγεί σε αλλαγές στην κυτταρική μορφολογία και καταστέλλει το σχηματισμό filopodia και ελασματοπόδια. *, Σημαντικά διαφορετικές από τους ελέγχους? +, Σημαντικά διαφορετικές από τους ελέγχους και τα κύτταρα EGF-διεγερμένα? ‡, σημαντικά διαφορετικό από κύτταρα EGF-διεγερμένα. Co, έλεγχο. C, Επίδραση της AZA1 στη δυναμική της ακτίνης. Εκφράσεις του F-ακτίνης και G-ακτίνης σε 22Rv1, DU 145 και PC-3 κύτταρα που αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση (αναλογία F-ακτίνης /G-ακτίνης). Μπάρες αντιπροσωπεύουν το ακτίνης F /G μέση τιμή ± SD. *, Σημαντικά διαφορετικές από τους ελέγχους της αντίστοιχης κυτταρικής γραμμής? +, Σημαντικά διαφορετικές από τους ελέγχους και EGF-διεγερμένα κύτταρα της αντίστοιχης κυτταρικής γραμμής.

Η

Η θεραπεία με 2 μΜ AZA1 επίσης μειωμένη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και στις τρεις κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου χωρίς EGF-διέγερση από 40,2 ± 12,1% (22Rv1 κύτταρα? ρ & lt? 0,01? Σχήμα 4Α), 20,2 ± 8,9% (DU 145 κύτταρα? ρ & lt? 0,04? Σχήμα S4A), και 24,9 ± 16,1% (PC-3 κύτταρα? ρ & lt? 0,05? Εικόνα S4A), αντίστοιχα, σε σύγκριση με EGF-διεγερμένα κύτταρα καρκίνου

η επεξεργασία των κυττάρων με 5 μΜ και 10 μΜ AZA1 μειωθεί περαιτέρω μετανάστευση με 72,1% και 79,1% (p & lt?. 0.001) σε 22Rv1 κύτταρα, κατά 72,4% και 91.4% (ρ & lt? 0.001) σε DU 145 κύτταρα, και κατά 60,9% και 74,7% (ρ & lt? 0.001) σε κύτταρα PC-3, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τα κύτταρα EGF-διεγερμένα (Σχήματα 4Α και το Σχήμα S4A). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ένα ρόλο για AZA1 στον αποκλεισμό Rac1 και Cdc42-εξαρτώμενη μετανάστευση των 22Rv1, DU 145 και PC-3 καρκίνου του προστάτη κύτταρα.

AZA1 μειώνει ελασματοπόδια και σχηματισμού filopodia και μειώνει την αναλογία F /G-ακτίνης

Cdc42 και Rac1 είναι επίσης ζωτικής σημασίας για το σχηματισμό των filopodia και ελασματοπόδια, τα οποία είναι σημαντικά για την εισβολή των καρκινικών κυττάρων [26]. Ως εκ τούτου, διερευνήθηκε η επίδραση της AZA1 στη μορφολογία των κυττάρων χρησιμοποιώντας χρώση φαλλοϊδίνη του 22Rv1, DU 145 και PC-3 κύτταρα που βάφει ειδικά πολυμερισμένο κυτταροσκελετού ακτίνης. Μορφολογικά, οι αριθμοί των 22Rv1 ελασματοπόδια και filopodia αυξήθηκε σημαντικά στην EGF-διέγερση (ρ & lt? 0,04? Σχήμα 4Β). Η θεραπεία με AZA1 στα 5 και 10 μΜ κατέληξε σε σημαντικά μειωμένη ελασματοπόδια (ρ & lt? 0,01) και filopodia (ρ & lt? 0,01) σχηματισμός σε 22Rv1 κύτταρα καρκίνου του προστάτη μετά από 24 ώρες σε σύγκριση με τα κύτταρα EGF-διεγερμένα (Σχήμα 4Β)

Σε DU 145 κύτταρα, ενώ πολλές τΊΙοροάίβ παρατηρούνται αυτή την αύξηση μετά από EGF-διέγερση, σχεδόν καμία ελασματοπόδια είναι ορατά. Παρόμοια με την επίδραση επί 22Rv1 κύτταρα, η θεραπεία με AZA1 στα 5 και 10 μΜ είχε ως αποτέλεσμα δραματικά μειωμένη σχηματισμό filopodia σε καρκινικά κύτταρα DU 145 προστάτη μετά από 24 ώρες σε σύγκριση με EGF-διεγερμένα κύτταρα (Σχήμα S4B, επάνω τρία πάνελ). Σε κύτταρα PC-3, τόσο ελασματοπόδια και σχηματισμός filopodia εμφανίστηκαν σε έλεγχο και τα κύτταρα EGF-διεγερμένα. Μετά τη θεραπεία με AZA1 (5 και 10 μΜ), ελασματοπόδια ήταν σχεδόν μη ανιχνεύσιμα και τα κύτταρα ανέπτυξαν μια πιο στρογγυλεμένη μορφολογία. ΤΊΙοροάίβ να παρατηρηθούν ακόμα και μετά τη θεραπεία AZA1 5 μΜ, αν και μειώθηκαν στα 10 μΜ AZA1 (Σχήμα S4B, κάτω τρεις πίνακες).

Ως εκ τούτου, AZA1 ανέστειλε ελασματοπόδια και το σχηματισμό τΊΙοροάίβ στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη, εμφανίζοντας διαφορετικό βαθμό της καταστολής ανάλογα με τον τύπο των καρκινικών κυττάρων. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν μια άμεση ρυθμιστική επίδραση της δραστηριότητας Rac1 /Cdc42 για ελασματοπόδια και επέκταση filopodia σε όλες τις δοκιμασμένες κυτταρικές γραμμές που μπορεί να επηρεαστεί από τη θεραπεία AZA1. Μαζί, αυτά τα δεδομένα δεικνύουν έναν ειδικό ρόλο για AZA1 στην αναστολή Rac1 /Cdc42 μεσολάβηση κυττάρων μορφολογία.

Στη συνέχεια εξετάσαμε το περιεχόμενο F- και G-ακτίνης σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη για να προσδιοριστεί αν μπορεί να επηρεάσει AZA1 δυναμική αναδιάταξη ακτίνης . AZA1 μειωμένη ελασματοπόδια και σχηματισμού filopodia και μειωμένη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων. Από Cdc42 και Rac είναι γνωστό ότι παίζουν μείζονα ρόλο στην αναδιάταξη ακτίνη, η οποία αποτελεί προϋπόθεση σε αυτές τις διαδικασίες [28], αξιολογήσαμε την επίδραση της αναστολής Rac1 /Cdc42 για τη σχέση μεταξύ της δραστηριότητας Rac1 και Cdc42 και δυναμική αναδιοργάνωση του σκελετού ακτίνης. Ανοσοκηλίδωση αναλύσεις των F- και G-ακτίνης κλασμάτων έδειξε ότι το σχετικό επίπεδο έκφρασης του F-ακτίνης /G-ακτίνη ήταν σημαντικά υψηλότερη στην EGF-διεγερμένα 22Rv1, DU 145 και του καρκίνου PC-3 κύτταρα προστάτη σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (ρ & lt? 0,05? Σχήμα 4C). Η θεραπεία με AZA1 σε 2, 5 και 10 μΜ, μείωσε σημαντικά τη σχετική αναλογία έκφραση του F- σε G-ακτίνης σε όλους τους τρεις κυτταρικές γραμμές μετά από 24 ώρες σε σύγκριση με EGF-διεγερμένα κύτταρα καρκίνου (ρ & lt? 0,01? Εικόνα 4C) και τα κύτταρα ελέγχου ( p & lt? 0,05?.. Σχήμα 4C)

Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι ελασματοπόδια και το σχηματισμό τΊΙοροάίβ στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη συνδέεται με την αναδιοργάνωση των νημάτων ακτίνης και ότι αυτή η διαδικασία επηρεάζεται από επεξεργασία AZA1

AZA1 ρυθμίζει προς τα κάτω την PAK μονοπάτι σηματοδότησης

Ομάδα Ι ρ21 κινάσες που ενεργοποιούνται (PAK) είναι σημαντικά τελεστές των μικρών ΟΤΡασών Rac και Cdc42, οι οποίες ρυθμίζουν την κυτταρική μετανάστευση, την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό [27], [29]. PAK ρυθμίζει επίσης την επέκταση ελασματοπόδια Rac μεσολάβηση, τη μετανάστευση και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων [27]. Για την ανάλυση οδούς σηματοδότησης που θα μπορούσε να μεσολαβήσει τις επιδράσεις της AZA1 παρεμπόδιση που προκαλείται Rac1 /Cdc42, εξετάσαμε την δράση του καθοδικός τελεστής PAK αξιολογώντας PAK φωσφορυλίωση σε EGF-διεγερμένα κύτταρα καρκίνου εξής AZA1 θεραπεία. Τα δεδομένα δείχνουν ότι /2 φωσφορυλίωση ΡΑΚ1 στην σερίνη 144/141, η οποία διατηρεί την καταλυτική δραστικότητα του ΡΑΚδ [30], ήταν εξαρτώμενο από τη δόση μειώνεται σημαντικά από 46,9 ± 19,1% (2 μΜ), 55,5 ± 18,4% (5 μΜ) και 85 ± 14,3% (10 μΜ) (ρ & lt? 0,04) για την επεξεργασία των AZA1 σε 22Rv1 κύτταρα σε σύγκριση με EGF διεγερμένα κύτταρα (Σχήμα 5). Παρομοίως, /2 φωσφορυλίωση ΡΑΚ1 στην σερίνη 144/141 επίσης δοσοεξαρτώμενο και σημαντικά μειωμένη έως και 52,4 ± 15,1% (ρ & lt? 0,05) και 48,1 ± 11,5% (ρ & lt? 0,04), αντίστοιχα, για την επεξεργασία AZA1 του EGF-διεγείρεται DU 145 και PC-3 κύτταρα (Σχήμα S5), υποδεικνύοντας ότι Rac1 /Cdc42 μπλοκ αναστολής ο ΡΑΚ1 μονοπάτι σηματοδότησης σε αυτά τα κύτταρα καρκίνου του προστάτη. ΡΑΚ1 επίπεδα πρωτεΐνης δεν επηρεάστηκαν από αγωγή AZA1 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι AZA1 επηρεάζει την κυτταρική κινητικότητα και αναδιάταξη της ακτίνης σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη με την καταστολή δραστηριότητα Rac1 και Cdc42 μέσω /2 φωσφορυλίωση ΡΑΚ1.

Ανάλυση του ΠΑΚ, ΑΚΤ και BAD-φωσφορυλίωση σε EGF-διεγείρονται 22Rv1 καρκινικά κύτταρα του προστάτη μετά από AZA1 θεραπεία. Αντιπροσωπευτικές εικόνες Western blot και ποσοτικοποίηση των ανοσοκηλίδων βάφονται με φωσφο-ΡΑΚ1 /2 (ΡΡΑΚ), φωσφο-ΑΚΤ (ρΑΚΤ) και φωσφο-BAD (ρΒΑϋ) αντισωμάτων πριν και μετά τη θεραπεία με 2, 5 και 10 μΜ AZA1 για 24 ώρες. Rac1 /Cdc42 αποκλεισμό μειώνει την φωσφορυλίωση της ΡΑΚ1, ΑΚΤ και BAD στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη 22Rv1 σύγκριση με τους μάρτυρες (μέσα από 3 ανεξάρτητα πειράματα). *, Σημαντικά διαφορετικό από μη διεγερμένα και ελέγχους χωρίς αγωγή? +, Διαφέρει σημαντικά από τον έλεγχο EGF-διεγείρεται? ‡, διαφέρει σημαντικά από τα μη διεγερμένα, μη επεξεργασμένο έλεγχο και τον έλεγχο EGF-διεγείρεται. SP, ειδική πρωτεΐνη? LC, φόρτωση έλεγχο.

Η

AZA1 ρυθμίζει προς τα κάτω την οδό σηματοδότησης ΑΚΤ και μειώνει την κακή φωσφορυλίωση

Για να προσδιορίσει περαιτέρω κατάντη Rac1 /Cdc42 υποψήφιοι επηρεαστεί από τη θεραπεία AZA1, αναλύσαμε ΑΚΤ και δραστηριότητα MAPKs χρησιμοποιώντας φωσφο-εξειδικευμένα αντισώματα. έχουν ΑΚΤ και ERK δραστηριότητες έχουν μειωθεί με αναγωγή της έκφρασης ΡΑΚ1 που οδηγεί σε μειωμένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων, η μετανάστευση /την εισβολή και την επιβίωση στον καρκίνο του παχέος εντέρου [28]. Επιπλέον, το μονοπάτι σηματοδότησης ΑΚΤ έχει δειχθεί ότι εμπλέκεται στην εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη και η μετάβαση σε ανδρογόνο ανεξάρτητη ασθένεια [31].

Βρήκαμε ότι η αναστολή Rac1 /Cdc42 από AZA1 για 24 ώρες οδήγησε σε σημαντική δοσοεξαρτώμενη αναστολή της φωσφο-ΑΚΤ επίπεδα κατά 20,8% (2 μΜ), 39,3% (5 μΜ) και 62,5% (10 μΜ) (ρ & lt? 0,05) μετά AZA1 θεραπεία της 22Rv1 κυττάρων με EGF διεγείρονται (Σχήμα 5). Αντίθετα, η θεραπεία AZA1 δεν προκάλεσε αλλαγές στη φωσφορυλίωση του δυναμικού Rac1 τελεστές ERK, JNK ή ρ38 (τα δεδομένα δεν φαίνονται), υποδεικνύοντας ότι η ενεργοποίηση αυτών των οδών ΜΑΡΚ δεν επηρεάζεται από Rac1 και Cdc42 αναστολή σε 22Rv1 κύτταρα καρκίνου του προστάτη.