Αφηρημένο

Ηλεκτρικές κλίσεις είναι παρούσα σε πολλές αναπτυσσόμενες και αναγέννησης ιστών και γύρω από τους όγκους. Μίμηση ενδογενή ηλεκτρικά πεδία

in vitro

έχει βαθιές επιπτώσεις στη συμπεριφορά πολλών τύπων κυττάρων. Περιέργως, συγκεκριμένους τύπους κυττάρων μεταναστεύουν cathodally, άλλοι anodally και κάποια πόλωση με το μεγάλο άξονά τους κάθετο προς το ηλεκτρικό φορέα. Αυτά τα εντυπωσιακά φαινόμενα είναι πιθανό να έχουν

in vivo

ενδιαφέρον δεδομένου ότι ένας από τους καθοριστικούς παράγοντες κατά τη διάρκεια της μετάστασης του καρκίνου είναι η δυνατότητα για εναλλαγή μεταξύ ελκυστική και αποκρουστικό μετανάστευση ως απάντηση σε εξωκυτταρικά ερεθίσματα καθοδήγηση. Παρουσιάζουμε αποδείξεις ότι το καρκίνο του τραχήλου κυτταρική σειρά HeLa μεταναστεύει cathodally σε ένα συνεχές ρεύμα ηλεκτρικό πεδίο της φυσιολογικής έντασης, ενώ η έντονα μεταστατική κυτταρική σειρά καρκίνου του προστάτη PC-3-M μεταναστεύει anodally. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η γενετική διαταραχή της πρωτεΐνης σερίνης /θρεονίνης φωσφατάσης-1 (ΡΡ1) και ρυθμιστής του NIPP1 μειωθεί κατευθυντική μετανάστευση σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές. Αντιστρόφως, η επαγώγιμη έκφραση του NIPP1 μεταγωγής την κατευθυντική απόκριση των κυττάρων HeLa από καθοδική να ελαφρώς ανοδική σε ένα ΡΡ1-εξαρτώμενο τρόπο. Αξίζει να σημειωθεί ότι, επαγωγή υπερκινητικά ΡΡ1 /NIPP1 ολοένζυμο, μετατοπίζεται περαιτέρω κατευθυνόμενη μετανάστευση προς την άνοδο. Δείχνουμε ότι η ένωση ΡΡ1 με NIPP1 απορυθμίζει σηματοδότηση από την ΘΤΡάσης Cdc42 και αποδεικνύουν ότι η φαρμακολογική αναστολή της Cdc42 σε κύτταρα που υπερεκφράζουν NIPP1 ανακτηθεί καθοδικό μετανάστευσης. Στο σύνολό τους, θα παρέχει τα πρώτα στοιχεία για τη ρύθμιση της κατεύθυνσης της μετανάστευσης των κυττάρων από NIPP1. Επιπλέον, έχουμε εντοπίσει ΡΡ1 /NIPP1 ως νέο μοριακό πυξίδα που ελέγχει την κατευθυνόμενη μετανάστευση των κυττάρων μέσω της προς τα πάνω ρύθμιση της Cdc42 σηματοδότησης και να προτείνει έναν τρόπο με τον οποίο ΡΡ1 /NIPP1 μπορεί να συμβάλει στις μεταναστευτικές ιδιότητες των καρκινικών κυττάρων

Αιτιολογική αναφορά.: Martin-Granados C, Prescott AR, Van Dessel Ν, Van Eynde Α, Arocena Μ, Klaska IP, et al. (2012) Ένας ρόλος για ΡΡ1 /NIPP1 στη διευθύνουσα μετανάστευση των ανθρώπινων κυττάρων του καρκίνου. PLoS ONE 7 (7): e40769. doi: 10.1371 /journal.pone.0040769

Επιμέλεια: Maddy Parsons, King College του Λονδίνου, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 24, Απρ 2012? Αποδεκτές: 13 Ιούν 2012? Δημοσιεύθηκε: 16 Ιούλη, 2012

Copyright: © 2012 Martin-Granados et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από την Wellcome Trust χορηγήσει 079.518 /z /06 /z για να CDM και με την ανάπτυξη εμπιστοσύνης του Πανεπιστημίου του Αμπερντίν προς JVF. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

μετανάστευση κυττάρων παίζει κεντρικό ρόλο σε πολλές διαδικασίες όπως η εμβρυϊκή ανάπτυξη και αποκατάσταση τραύματος και mis-ρυθμίζονται αποκρίσεις σηματοδότησης σε μεταναστευτικά συνθήματα μπορεί να προκαλέσει παθολογίες όπως μετάσταση όγκου, φλεγμονή και επιληψία [1] – [4]. Επιθηλιακά, ενδοθηλιακά, νευρωνικά και τα κύτταρα του ανοσοποιητικού, μεταξύ άλλων, εκτίθενται σε μια ποικιλία από ερεθίσματα που κατευθύνουν την κυτταρική μετανάστευση. έχουν Εκτός από τα πιο ευρέως αναγνωρισμένα χημικά σήματα, όπως αυξητικούς παράγοντες και κυτοκίνες, που παράγονται ενδογενώς ηλεκτρικά πεδία (EF) της ιοντικής φύσης έχουν μετρηθεί γύρω τραυματισμένους ιστούς, θέσεις φλεγμονής και όγκων [5] – [10]. Αυτά τα ηλεκτρικά σήματα μπορούν να δράσουν ως κατευθυντική συνθήματα καθοδήγησης κατά τη διάρκεια της επούλωσης τραύματος, εμβρυϊκή ανάπτυξη και ογκογένεση [11], επομένως αποκρυπτογράφηση των μοριακών μηχανισμών πίσω από τις κυτταρικές αποκρίσεις σε EF έχει μεγάλη σημασία. Εφαρμόζοντας μια σταθερή, συνεχές ρεύμα (DC) EF στα κύτταρα και τους ιστούς

in vitro

μιμείται τα αποτελέσματα ενός ενδογενούς EF [12] και αυτό έχει εντοπίσει μια σειρά από υποδοχείς στην επιφάνεια των κυττάρων, φωσφορυλίωσης σηματοδότησης πρωτεΐνες και δεύτερο αγγελιοφόροι που μετάγουν ηλεκτρικά σήματα. Για παράδειγμα, ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) και ιντεγκρίνες είναι μεταξύ των πρώτων αισθητήρων των ηλεκτρικών σημάτων σε διάφορους τύπους κυττάρων. EGFRs μετατοπίζονται εντός του επιπέδου της λιπιδικής διπλοστοιβάδας να συσσωρεύεται στην καθοδική, κορυφαία πλευρά των κυττάρων. Για κερατινοκύτταρα και επιθηλιακών κυττάρων κερατοειδούς αυτό συμβεί εντός 5-10 λεπτών από EF έκθεση [13], [14]. Κατά συνέπεια, EGF σηματοδότηση γίνεται πολωμένο, προκαλώντας μεγαλύτερη ενεργοποίηση καθοδική του ERK1 /2, καθοδικά καθοδική πολυμερισμό F-ακτίνης και κατευθυνόμενη μετανάστευση [13] – [15]. Παρόμοια ευρήματα έχουν αναφερθεί για τη στήριξη καθοδική ηλεκτροτάξη των εμβρυϊκών και των ενήλικων νευρικών προγονικών κυττάρων [16]. Επιπλέον, ιντεγκρίνες α5 και α5ß1 αναδιανέμουν και αδρανών cathodally σε ινοβλάστες μεταναστεύουν cathodally, όπως κάνει ιντεγκρίνης β1 σε επιθηλιακά κύτταρα [17], [18]. Επιπλέον, η εξάντληση του SS4 ιντεγκρίνης ή την προσθήκη ενός αντι-ιντεγκρίνης β1 υπομονάδα καταστέλλει EF-κατευθυνόμενη μετανάστευση [18], [19].

Ο ρόλος της πρωτεΐνης τυροσίνης (Tyr) κινάσες σε μετανάστευση έχει καλά μελετηθεί, ενώ η συμβολή των φωσφατασών πρωτεΐνης έχει αρχίσει να εκτιμηθεί μόλις πρόσφατα [20]. Στην πραγματικότητα, ο μόνος φωσφατάση που είναι γνωστό ότι εμπλέκονται σε ηλεκτροτάξη είναι το «ομόλογο tensin φωσφατάση διαγράφεται στο χρωμόσωμα δέκα« λιπίδιο φωσφατάση (ΡΤΕΝ) [7].

πρωτεΐνης σερίνης /θρεονίνης (Ser /Thr) φωσφατάσης-1 (ΡΡ1) είναι ένα από τα πιο ιδιαίτερα διατηρημένες ένζυμα γνωστά και παίζει έναν κεντρικό ρόλο σε ένα φάσμα κυτταρικών διεργασιών συμπεριλαμβανομένης της σύνθεσης πρωτεϊνών, RNA splicing, την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και ο μεταβολισμός του γλυκογόνου [21], [22]. Μια μεγάλη ποικιλία από ρυθμιστικές υπομονάδες συνεργάτες με την καταλυτική υπομονάδα ΡΡ1 να προσδιοριστεί κυτταρικό εντοπισμό του και εξειδίκευση υποστρώματος, μεσολαβώντας τον έλεγχο αυτών των πολλών φυσιολογικών διεργασιών μέσω ΡΡ1 holoenzymes [22] – [24]. NIPP1 (αναστολέας της πυρηνικής πρωτεΐνης φωσφατάσης 1) είναι ένα εντόνως διατηρημένο και πανταχού εκφραζόμενη πρωτεΐνη που αρχικά χαρακτηρίστηκε ως αναστολέας ΡΡ1 [25] – [27]. NIPP1 χρησιμεύει ως ένα είδος πρωτεΐνης ικριώματος γύρω από το οποίο μία ποικιλία πρωτεϊνών, όπως φωσφατάσες, κινάσες, παράγοντες ματίσματος και τροποποιητές χρωματίνης συγκεντρώσει λειτουργικά. NIPP1 περιέχει δύο μεγάλα sites ΡΡ1-αλληλεπίδρασης που βρίσκονται στις κεντρικές και C-τελικές περιοχές, μεταξύ των οποίων τα κατάλοιπα αμινοξέων 200-203, τα οποία αντιπροσωπεύουν ένα site ΡΡ1 σύνδεσης RVxF τύπου. Πιο πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι οι επιπτώσεις της NIPP1 στην ΡΡ1 είναι υπόστρωμα εξαρτάται από: το ισχυρά εμποδίζει την αποφωσφορυλίωση πολλά υποστρώματα ΡΡ1, αλλά προωθεί την αποφωσφορυλίωση υποστρώματα που έχουν προσληφθεί μέσω Forkhead Associated (ΝΑΣ) τομέα του [28]. Είναι ενδιαφέρον, ΡΡ1 δεσμεύεται να υπερεκφράζεται άγριου τύπου NIPP1 (WT-NIPP1) είναι εξαιρετικά φωσφορυλιώνεται σε Thr-320, ένα σήμα που αδρανοποιεί ΡΡ1, ενώ ΡΡ1 δεσμευμένο σε ένα C-τελικό άκρο κομμένης πρωτεΐνης NIPP1 (ΔΟ-NIPP1) είναι λιγότερο φωσφορυλιωμένη σε Thr -320, το οποίο είναι ενδεικτικό για υπερκινητικά ολοένζυμο ΡΡ1 /NIPP1 [28].

Ένας ρόλος για ΡΡ1 ως ρυθμιστής της κυτταρικής πολικότητας και της μετανάστευσης έχει αρχίσει να αναδύεται. ΡΡ1 αλληλεπιδρά με διάφορες πρωτεΐνες που ρυθμίζουν τον κυτταρικό σκελετό ακτίνης και συμβάλλει στο σχηματισμό των κυτταρικών προεξοχών και συμφύσεις [24]. Επιπλέον, μια πολύ πρόσφατη έκθεση εντόπισε ένα λειτουργικό ρόλο για την ΡΡ1 στον έλεγχο εντερική μετανάστευση νευρικών κυττάρων [29]. Εδώ, ερευνήσαμε αν τα επίπεδα ΡΡ1 και NIPP1 ρυθμίζουν κινητικότητα και κατευθυντική μετανάστευση του καρκίνου του τραχήλου κυτταρική γραμμή που λαμβάνεται HeLa. Περαιτέρω, ερευνήσαμε τη συμβολή των NIPP1 που σχετίζονται ΡΡ1 να κατευθυντική μετανάστευση χρησιμοποιώντας HeLa Tet-Off (ΟΤΕ) κύτταρα τα οποία είχαν κατασκευαστεί για να εκφράζουν διεγέρσιμα WT-NIPP1, C-άκρο κολοβωμένη NIPP1 (ΔΟ-NIPP1) ή ενός πρόσδεσης της ΡΡ1 μεταλλαγμένο της NIPP1 (mNIPP1) [28], [30]. Χρησιμοποιήσαμε ένα ηλεκτρικό πεδίο συνεχούς ρεύματος (ΕΡ) ως ένα άμεσα προσιτό σύνθημα καθοδήγηση είναι γνωστό ότι ελέγχουν την κατευθυνόμενη μετανάστευση των κυττάρων των φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων [31], [32]. Εδώ, έχουμε αποδείξει ότι τα επίπεδα ΡΡ1 και NIPP1 απαιτούνται για τη βέλτιστη τυχαία κινητικότητα μεμονωμένων κυττάρων HeLa και για κατευθυνόμενη μετανάστευση σε απόκριση σε μία EF DC. Επιβεβαιώνουμε ότι τα επίπεδα NIPP1 απαιτούνται για κατευθυντική μετανάστευση των κυττάρων με δοκιμή ηλεκτροτάξη του άκρως μεταστατικού καρκίνου του προστάτη που προέρχονται από κυτταρική σειρά PC-3-M. Περαιτέρω, έχουμε αποδείξει ότι η δέσμευση του ΡΡ1 σε λειτουργίες NIPP1 ως πυξίδα η οποία ελέγχει την κατεύθυνση προς την οποία κύτταρα μεταναστεύουν μέσω ρύθμισης της έκφρασης ιντεγκρίνης και αυξητικού παράγοντα των υποδοχέων και δραστικότητα ΟΤΡάσης Cdc42. Αυτά τα αποτελέσματα προσδιορίσει ένα λειτουργικό ρόλο για NIPP1 στη μετανάστευση των κυττάρων και να αποκαλύψει ΡΡ1 /NIPP1 ως πρώτης πρωτεΐνης σύμπλεγμα Ser /Thr φωσφατάση τον έλεγχο της κατεύθυνσης απόκριση των κυττάρων σε ηλεκτρική συνθήματα καθοδήγησης.

Αποτελέσματα

ΡΡ1 και NIPP1 απαιτούνται για Τυχαία και κατεύθυνσης μετανάστευση των HeLa και PC-3-Μ κύτταρα ως απάντηση στην ηλεκτρική Στέκες Προσανατολισμού

Μια πολύ πρόσφατη μελέτη έχει δείξει ότι η θεραπεία των εντερικών κυττάρων νευρικής ακρολοφίας με οκαδαϊκό οξύ, ένας αναστολέας της πρωτεΐνες φωσφατάσες 1 και 2Α, προκαλεί μη κατευθυνόμενες προεξοχές των κυττάρων και τυχαίες κινήσεις των κυττάρων [29]. Ως εκ τούτου, ερευνήσαμε ένα δυναμικό ρόλο για την ΡΡ1 στη ρύθμιση της κατεύθυνσης της μετανάστευσης των κυττάρων του τραχηλικού επιθηλίου καρκινώματος που προέρχονται από HeLa Tet-Off (ΟΤΕ) ως απάντηση στην ηλεκτρική συνθήματα καθοδήγησης. Για το σκοπό αυτό, εξετάσαμε την επίδραση της προηγουμένως επικυρωθεί siRNAs που στοχεύουν και τα τρία ΡΡ1 ισομορφών σε τυχαία κινητικότητα των ξεχωριστών κυττάρων και στο κατευθυνόμενη μεταναστευτική απόκριση των κυττάρων σε μια εφαρμοσμένη EF (ηλεκτροτάξη) [33]. επίπεδα πρωτεΐνης ΡΡ1 μειώθηκαν κατά 85% μετά από 48 ώρες από την επιμόλυνση (Εικ. 1Α). Σε περίπτωση απουσίας ενός EF, τόσο ελέγχου και knockdown κυττάρων ΡΡ1 (KD) μετανάστευσε τυχαία (Εικ. 1Β). Όταν εφαρμόζεται ένα DC EF, 82% ± 5 των κυττάρων siRNA ελέγχου μετανάστευσαν cathodally (κόκκινο, προς τα δεξιά) (Σχήμα 1Β? Βλ. Βίντεο S1). επεξεργασία EF αύξησε την απόσταση μετανάστευσαν, την ταχύτητα της μετανάστευσης και της directedness των κυττάρων siRNA ελέγχου (Εικ. 1Γ). Ωστόσο, η εξάντληση ΡΡ1 πλήρως απομειωθεί ηλεκτροτάξη, το 57% ± 2 κυττάρων ΡΡ1 siRNA μετανάστευσαν cathodally (κόκκινο, δεξιά) και 43% ± 2 anodally (μαύρο, αριστερά) (εικ 1Β, C? Βλ. Βίντεο S2). Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι τα κύτταρα εξαντλούνται σε ΡΡ1 εμφανίζεται λιγότερο κυτταρική προεξοχές και περισσότερες ίνες στρες σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου siRNA (Σχ. 1D). Ειδικότερα, η απώλεια της ΡΡ1 μειωμένο σχηματισμό τΊΙοροάίβ σε μη επεξεργασμένα και EF-κατεργασμένα κύτταρα (Εικ. 1 Ε).

Α. Θεραπεία των γονικών κυττάρων HeLa Tet-Off (ΟΤΕ) με siRNA μειώνει σε μεγάλο βαθμό τα επίπεδα ΡΡ1 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Ενδογενή επίπεδα ΡΡ1 έγιναν ορατά με ΡΡ1 αντισώματα που αναγνωρίζουν όλες τις ισομορφές. Β διαγράμματα Οικόπεδο δείχνουν ότι η απώλεια της ΡΡ1 μειώνει την ικανότητα των κυττάρων να μεταναστεύουν προς την κάθοδο. Κάθε γραμμή αντιπροσωπεύει την μετανάστευση τροχιά ενός μόνο κυττάρου. Το σημείο εκκίνησης για κάθε κομμάτι κυτταρική μετανάστευση είναι η αιτία. κομμάτια κυττάρων με τελικές θέσεις προς τα δεξιά εμφανίζονται με κόκκινο χρώμα ( «C», κάθοδος) και εκείνων προς τα αριστερά εμφανίζονται σε μαύρο χρώμα ( «Α», άνοδος). EF-μη επεξεργασμένα κύτταρα δοκιμάστηκαν ως έλεγχοι. κύτταρα ελέγχου siRNA μεταναστεύουν έντονα προς την κάθοδο? κύτταρα κατεργασμένα ΡΡ1 siRNA δεν είναι σε θέση να μεταναστεύσει σε απάντηση σε μια EF DC. Κλίμακες δείχνουν απόσταση μετανάστευσαν σε μm. εξάντληση Γ ΡΡ1 μειώνει έντονα απόσταση μετανάστευσαν, την ταχύτητα, και directedness σε απάντηση φυσιολογικών EF DC. Οι ράβδοι σφαλμάτων είναι S.E.M.

Οι σ

τιμές για τις σημαντικές διαφορές στην απόσταση, την ταχύτητα και directedness εμφανίζονται. Δ εντοπισμός των ενδογενών ΡΡ1 και διανομή των νηματοειδών-ακτίνης στον έλεγχο και την ΡΡ1 εξαντληθεί τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με DC EF. Ενδογενή επίπεδα ΡΡ1 έγιναν ορατά με ΡΡ1 αντισώματα που αναγνωρίζουν όλες τις ισομορφές (πράσινο) και πολυμερίστηκαν ακτίνης ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας phalloidin ροδαμίνης (κόκκινο). Οι πυρήνες έχουν χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ (μπλε). Βέλη σήμα κύτταρα με μια ισχυρή μείωση των επιπέδων ΡΡ1 που συσχετίζονται με ελαττώματα στο σχηματισμό ακτίνης πλούσια προεξοχών. Αντιπροσωπευτικά εικόνες. μπαρ κλίμακα είναι 50 μm. Ε αριθμοί κυττάρων με filopodia ποσοτικοποιήθηκαν μετρώντας 100 κύτταρα. Οι ράβδοι σφαλμάτων είναι S.E.M.

Οι σ

τιμές για τις σημαντικές διαφορές που φαίνεται. Εικόνες δείχνουν μια λεπτομέρεια του κυττάρου προεξοχές στα κύτταρα ελέγχου siRNA και ΡΡ1 siRNA. Βέλη σηματοδοτήσει πολλές τΊΙοροάίβ στα κύτταρα ζώνες ελέγχου και περίγραμμα με μια σημαντική έλλειψη filopodia στις άκρες των κυττάρων σε κύτταρα ΡΡ1 siRNA.

Η

Επιπλέον, μελετήσαμε ένα πιθανό ρυθμιστικό ρόλο για το αλληλεπίδρασης NIPP1 ΡΡ1 στο σχηματισμό των προεξοχών ακτίνης και σε τυχαία και κατευθυνόμενη μετανάστευση των κυττάρων ΟΤΕ. Πρώτον, εξετάστηκε αν NIPP1 απαιτείται για μετανάστευση με δοκιμή της επίδρασης των προηγουμένως επικυρωθεί siRNAs που στοχεύουν NIPP1 [34]. επίπεδα πρωτεΐνης NIPP1 μειώθηκαν κατά 80% μετά από 48 ώρες από την επιμόλυνση (Εικ. 2Α). Σε περίπτωση απουσίας ενός EF, τόσο ελέγχου και κυττάρων NIPP1 knockdown (KD) μετανάστευσε τυχαία (Εικ. 2Β). Με την παρουσία ενός EF, κύτταρα ελέγχου έδειξε ισχυρή μετανάστευση καθοδικό? 87% ± 4 κυττάρων siRNA ελέγχου μετανάστευσαν cathodally (κόκκινο, δεξιά) και 13% ± 4 anodally (μαύρο, αριστερά) (Σχήμα 2Β? Βλ. Βίντεο S3). Ωστόσο, τα κύτταρα NIPP1 KD εμφάνισε πολύ αμβλύνθηκε μετανάστευση καθοδική, 57% ± 3 των κυττάρων που NIPP1 siRNA μετανάστευσαν cathodally (κόκκινο, δεξιά) και 43% ± 3 anodally (μαύρο, αριστερά) (Σχ. 2Β, C και δείτε βίντεο S4). Επιπλέον, στην απουσία ενός EF μια διπλάσια μείωση στην ταχύτητα και ως εκ τούτου η απόσταση της κυτταρικής μετανάστευσης παρατηρήθηκε σε κύτταρα NIPP1 siRNA σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου αγωγή siRNA (Σχ. 2C). Η μειωμένη ταχύτητα και την απόσταση της μετανάστευσης που προκαλείται από έλλειψη NIPP1 ήταν ακόμα μεγαλύτερη σε κύτταρα εκτίθενται σε ένα EF τα οποία έδειξαν μία μείωση τετραπλάσια σε κυτταρική μετανάστευση και πάνω από διπλάσια μείωση στην ταχύτητα της μετανάστευσης σε σχέση με EF-αγωγή κύτταρα ελέγχου siRNA (Σχ. 2C). Συνεπής με προηγούμενες εκθέσεις, η DC EF προώθησε τον πολυμερισμό της ακτίνης και το σχηματισμό της ακτίνης πλούσια κυττάρων προεξοχές στα κύτταρα ΟΤΕ ελέγχου (Σχ. 2D). Ωστόσο, τα κύτταρα NIPP1 KD είχαν λιγότερα κύτταρο προεξοχές (Σχ. 2D). Ειδικότερα, η ικανότητα να σχηματίζουν filopodia σε κύτταρα NIPP1 KD έχει παραβιαστεί σοβαρά σε μη επεξεργασμένα και EF-επεξεργασμένα κύτταρα (Σχ. 2Ε).

A. Θεραπεία των γονικών κυττάρων HeLa Tet-Off (ΟΤΕ) με siRNA μειώνει σε μεγάλο βαθμό τα επίπεδα NIPP1 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Τα κυτταρολύματα αναλύθηκαν με SDS /PAGE και ανοσοκηλίδωση. Συγκροτήματα που αντιστοιχούν σε όλες τις ισομορφές ΡΡ1 ανιχνεύθηκαν και GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Β διαγράμματα Οικόπεδο δείχνουν ότι η απώλεια της NIPP1 μειώνει την ικανότητα των κυττάρων να μεταναστεύουν προς την κάθοδο. κύτταρα ελέγχου siRNA μεταναστεύουν έντονα προς την κάθοδο? κύτταρα αντιμετωπίζονται NIPP1 siRNA δείχνουν μια πολύ μειωμένο καθοδικό απάντηση. Κλίμακες δείχνουν απόσταση μετανάστευσαν σε μm. Κλίμακες διαφέρουν μεταξύ διαγράμματα προκειμένου να συμπεριλάβει τα κομμάτια του κάθε κυττάρου προσδιορίστηκαν. εξάντληση Γ NIPP1 μειώνει έντονα απόσταση μετανάστευσαν, την ταχύτητα, και directedness σε απάντηση φυσιολογικών EF DC. Τα δεδομένα είναι από τουλάχιστον τρία πειράματα. Οι ράβδοι σφαλμάτων είναι S.E.M.

Οι σ

τιμές για τις σημαντικές διαφορές στην απόσταση, την ταχύτητα και directedness εμφανίζονται. Δ εντοπισμός των ενδογενών NIPP1 και διανομή των νηματοειδών-ακτίνης σε έλεγχο και NIPP1 εξαντληθεί τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με DC EF. Ενδογενή επίπεδα NIPP1 αναγνωρίστηκαν με ένα αντίσωμα αντι-NIPP1 (πράσινο) κουνέλι και πολυμερισμένων ακτίνης ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας phalloidin ροδαμίνης (κόκκινο). Πυρήνες χρωματίζονται με DAPI (μπλε). NIPP1 εντοπίζεται στον πυρήνα σε EF-επεξεργασμένα και μη επεξεργασμένα κύτταρα και τα επίπεδα της εξαντλημένο από siRNA. μπαρ κλίμακα είναι 50 μm. Ε αριθμοί κυττάρων με filopodia ποσοτικοποιήθηκαν μετρώντας 100 κύτταρα. Οι ράβδοι σφαλμάτων είναι S.E.M.

Οι σ

τιμές για τις σημαντικές διαφορές που φαίνεται. Εικόνες δείχνουν μια λεπτομέρεια του κυττάρου προεξοχές στα κύτταρα ελέγχου siRNA και NIPP1si RNA. Βέλη σηματοδοτήσει πολλές τΊΙοροάίβ στα κύτταρα ζώνες ελέγχου και περίγραμμα με μια σημαντική έλλειψη filopodia στις άκρες των κυττάρων σε κύτταρα NIPP1 siRNA.

Η

Για την περαιτέρω επικύρωση των δεδομένων μας και να αποκλειστούν πιθανές επιπτώσεις εκτός-του siRNA NIPP1 στόχευσης εξετάσαμε επίσης την electrotactic ανταπόκριση του ιδιαίτερα μεταστατικές ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου του προστάτη, PC-3-M, φτωχό σε επίπεδα NIPP1 μέσω έκφρασης ενός shRNA στόχευσης NIPP1 μετά τη θεραπεία IPTG. επίπεδα NIPP1 μειώθηκαν κατά περίπου 70% μετά από 5 ημέρες θεραπείας IPTG (Σχ. 3Α). Δείχνουμε για πρώτη φορά ότι τα κύτταρα PC-3-M εμφανίζει μια πολύ ισχυρή απάντηση electrotactic προς την άνοδο όπως υποδεικνύεται από ένα έντονα αρνητικό directedness του -0.9 (Σχ. 3Β, C και δείτε βίντεο S5) και ότι η απώλεια του NIPP1 μειώνει έντονα το κατευθυντικό απόκριση αυτών των κυττάρων σε ένα EF DC (Σχ. 3Β, C και δείτε βίντεο S6).

A. Θεραπεία της PC-3-M κυττάρων με IPTG επάγει εξάντληση NIPP1. Τα κυτταρολύματα αναλύθηκαν με SDS /PAGE και ανοσοκηλίδωση. Συγκροτήματα που αντιστοιχούν στις ισομορφές ΡΡ1 ανιχνεύθηκαν και GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Β διαγράμματα Οικόπεδο δείχνουν ότι η απώλεια της NIPP1 μειώνει την ικανότητα των κυττάρων PC-3-M για να μεταναστεύσουν anodally. τροχιές μετανάστευσης παρακολουθήθηκαν για τρεις ώρες. Το σημείο εκκίνησης για κάθε κομμάτι κυτταρική μετανάστευση είναι η αιτία. κομμάτια κυττάρων με τελικές θέσεις προς τα δεξιά εμφανίζονται με κόκκινο χρώμα και εκείνων προς τα αριστερά εμφανίζονται σε μαύρο χρώμα. Καθόδου σημειώνεται ως «C» και ανόδου ως «Α» όταν ένας EF DC εφαρμόζεται σε κύτταρα. Ελέγχου ομελέτα κύτταρα PC-3-M μεταναστεύουν έντονα anodally (αρνητική τιμή directedness)? κύτταρα που εκφράζουν shRNA NIPP1 στόχευση δείχνουν μια πολύ μειωμένη ανταπόκριση ανοδική. Κλίμακες δείχνουν απόσταση μετανάστευσαν σε μm. Κλίμακες διαφέρουν μεταξύ διαγράμματα προκειμένου να συμπεριλάβει τα κομμάτια του κάθε κυττάρου προσδιορίστηκαν. εξάντληση Γ NIPP1 μειώνεται έντονα απόσταση μετανάστευσαν και directedness σε απάντηση φυσιολογικών EF DC. Τα δεδομένα είναι από τουλάχιστον τρία πειράματα. Οι ράβδοι σφαλμάτων είναι S.E.M.

Οι τιμές ρ

για σημαντικές διαφορές στην απόσταση, την ταχύτητα και directedness δείξει.

Η

Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι τόσο ΡΡ1 και NIPP1 απαιτούνται για την κατευθυντική μεταναστευτική απόκριση των HeLa και PC -3-M κυττάρων σε ένα EF DC.

ΡΡ1 /NIPP1 Ελέγχει κατεύθυνσης κυττάρων μετανάστευση

Στη συνέχεια, πήραμε μια αντίστροφη προσέγγιση και να διερευνηθεί η επίδραση της υπερέκφρασης της NIPP1 και δεσμευτική της να ΡΡ1 σε EF-επαγόμενη κατεύθυνσης της μετανάστευσης. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήσαμε προηγουμένως χαρακτηριζόμενη κυτταρικές σειρές HeLa Tet-Off (ΟΤΕ) που εκφράζουν τρεις διαφορετικές παραλλαγές NIPP1 απουσία δοξυκυκλίνης (Σχ. 4Α) [28], [30]. Τρεις ημέρες μετά την απομάκρυνση δοξυκυκλίνης από το μέσο, ​​η έκφραση των παραλλαγών NIPP1 εκτιμήθηκε με κηλίδωση Western (Εικ. 4Β). Αυτές οι παραλλαγές περιλαμβάνονται FLAG-tagged WT-NIPP1, η οποία συνδέεται με (εν μέρει) ανενεργό ΡΡ1, C-τελικά κομμένη FLAG-NIPP1 (ΔΟ-NIPP1) το οποίο συμπλέκεται με ουσιαστικά δραστική ΡΡ1 και ένα σημείο μετάλλαγμα (mNIPP1) που στερείται ενός λειτουργικού μοτίβο RVxF τύπου ΡΡ1 δεσμευτική και μπορεί, ως εκ τούτου μόνο οριακά συνδέονται με ΡΡ1 (Σχ. 4Α).

Α. Γελοιογραφία της ενδογενούς NIPP1 και η διαφορετική FLAG-tagged NIPP1 παραλλαγών που εξέφρασε μετά την αφαίρεση δοξυκυκλίνη σε κυτταρικές σειρές HeLa Tet-Off (ΟΤΕ). Και οι τρεις παραλλαγές NIPP1 έχουν forkhead σχετίζεται τομέα (FHA). Η συναινετική αλληλουχία πρόσδεσης της ΡΡ1, RVTF σε W.T-NIPP1 έχει μεταλλαχθεί σε αναλογία προς την παραλλαγή FLAG-mNIPP1. Το Ο-τερματικό αυτόματης ανασταλτική (ID) τομέα δεν περιλαμβάνεται στην FLAG ετικέτα ΔΟ-NIPP1 πρωτεΐνη, με αποτέλεσμα την έκφραση μιας συστατικώς δραστικής ολοένζυμο ΡΡ1 /NIPP1. Β Έκφραση NIPP1 παραλλαγών που επιβεβαιώθηκε με κηλίδωση Western μετά την αφαίρεση των δοξυκυκλίνη. Τα κυτταρολύματα αναλύθηκαν με SDS /PAGE και ανοσοκηλίδωση. Συγκροτήματα που αντιστοιχούν στις ισομορφές ΡΡ1 ανιχνεύθηκαν και GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. έκφραση Γ NIPP1 και τον εντοπισμό στα κύτταρα ΟΤΕ επιβεβαιώθηκε από το ΔΠΔ σε EF-επεξεργασμένα και μη επεξεργασμένα κύτταρα ΟΤΕ. αντίσωμα αντι-FLAG και ροδαμίνης phalloidin έχουν χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση των FLAG-tagged παραλλαγές NIPP1 (πράσινο) και F-ακτίνη (κόκκινο). Οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI. Υπερεκφράζεται NIPP1 εντοπίζεται στον πυρήνα σε EF-επεξεργασμένα και μη επεξεργασμένα κύτταρα. μπαρ κλίμακα είναι 50 μm. διαγράμματα οικόπεδο δείχνουν ότι η EF της φυσιολογικής αντοχής (200 mV /mm) που προκαλείται από διακριτές μεταναστευτικών απαντήσεις στα κύτταρα ΟΤΕ εκφράζουν διαφορετικές παραλλαγές NIPP1. Τα EF-μη επεξεργασμένα κύτταρα ΟΤΕ εμφανίζονται ως μάρτυρες. τροχιές Μετανάστευση παρακολουθήθηκαν για τρεις ώρες απουσία και παρουσία του EF. θέση κάθε κυττάρου σε 0 h είναι τοποθετημένη στην αρχή των αξόνων (0, 0). Κύτταρα των οποίων ακραία θέση είναι στα δεξιά είναι χρωματισμένα κόκκινα και εκείνων προς τα αριστερά εμφανίζονται σε μαύρο χρώμα. Καθόδου χαρακτηρίζεται ως «C» και άνοδος χαρακτηρίζεται ως «Α», όταν DC EF εφαρμόζεται στα κύτταρα. Κλίμακες δείχνουν απόσταση μετανάστευσαν σε μm. Σημειώστε ότι κλίμακες διαφέρουν μεταξύ διαγράμματα προκειμένου να συμπεριλάβει τα κομμάτια του κάθε κυττάρου προσδιορίστηκαν.

Η

Ο εντοπισμός των τριών διαφορετικών παραλλαγών NIPP1 εξετάστηκε με ανοσοκυτταροχημεία. Παρόμοια με ενδογενή NIPP1, FLAG-tagged W.T- και ΔΟ-NIPP1 εντοπίστηκαν έντονα στον πυρήνα σε EF-επεξεργασμένα και μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχ. 4C, εικόνες κύτταρο). Περιπυρηνική χρώση των FLAG-tagged πρόσδεσης της ΡΡ1 μετάλλαξη του NIPP1 (mNIPP1) θα μπορούσε επίσης να παρατηρηθεί (Εικ. 4C, εικόνες κυττάρων).

Στη συνέχεια, ελέγξαμε εάν η σύνδεση της ΡΡ1 με NIPP1 επηρεάζει ηλεκτροτάξη των κυττάρων ΟΤΕ . Χωρίς την EF, η μετανάστευση των κυττάρων προσανατολίζονται τυχαία για όλους τους τύπους κυττάρων (Εικ. 4C, «όχι EF» οικόπεδα). Ωστόσο, τα κύτταρα που εκφράζουν ΟΤΕ παραλλαγές NIPP1 FLAG-tagged έδειξε μια σειρά από διαφορετικές συμπεριφορές σε ένα EF. 72% ± 3 των γονικών κυττάρων ΟΤΕ μετανάστευσαν cathodally (δεξιά) και 28% ± 3 anodally (αριστερά) και εμφανίζεται ένα directedness 0,27 ± 0,05 (Εικόνα 4C? Βλ. Βίντεο S7). Η υπερέκφραση του W.T-NIPP1 μετατόπισε την καθοδική απάντηση σε ελαφρώς ανοδική, με μόνο το 35% ± 12 των κυττάρων που μεταναστεύουν cathodally και 65% ± 12 anodally, και directedness των -0.12 ± 0.05 (Σχήμα 4C? Βλ. Βίντεο S8). Επιπλέον, η υπερέκφραση του ΔΟ-NIPP1 προκάλεσε μια ισχυρή μετατόπιση στην κατευθυντική απόκριση. Μόνο το 16% ± 5 των κυττάρων που μετανάστευσαν cathodally με ένα αξιοσημείωτο 84% ± 5 των κυττάρων που μεταναστεύουν anodally δίνοντας μια αντιστραφεί έντονα directedness του -0,55 ± 0,04 (Εικόνα 4C? Βλ. Βίντεο S9). Είναι ενδιαφέρον ότι, η υπερέκφραση του mNIPP1 δεν επηρέασε καθοδική μετανάστευση και τα κύτταρα συμπεριφέρθηκαν παρομοίως να γονικά κύτταρα ΟΤΕ? 80% ± 13 μετανάστευσαν cathodally και 20% ± 13 anodally, και εμφανίζεται μια ισχυρή καθοδική directedness 0,52 ± 0,1 (Σχήμα 4C? Βλ. Βίντεο S10).

Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ο έλεγχος της κατεύθυνσης της μετανάστευσης από NIPP1 εξαρτάται σχετικά με τη σύνδεση της με την ΡΡ1. Όταν NIPP1 ήταν υπερεκφράζεται και είναι σε θέση να δεσμεύσει ΡΡ1, η καθοδική μετανάστευση μετατοπίζεται σε ελαφρώς ανοδική. Επιπλέον, η επαγωγή μιας συστατικώς δραστικής ΡΡ1 /NIPP1 ολοενζύμου προκάλεσε ακόμη ισχυρότερη απόκριση ανοδικό. Ωστόσο, η ΡΡ1 δεσμευτική μετάλλαξη της NIPP1 προκάλεσε καθοδικό μετανάστευση, παρόμοια με μητρικά κύτταρα.

ΡΡ1 /NIPP1 Ελέγχει κεντροσώματος θέσης κατά τη διάρκεια της μετανάστευσης

Μια συσχέτιση μεταξύ της θέσης του κεντρόσωμα και την κατεύθυνση της μετανάστευση κυττάρων έχει παρατηρηθεί σε διάφορους τύπους κυττάρων [35]. Σε πολλές περιπτώσεις η κεντροσωμάτων βρίσκεται πίσω από την αιχμή και μπροστά από τον πυρήνα. Ως εκ τούτου, είμαστε δίπλα στόχο να επιβεβαιώσει τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τη μέτρηση της κατεύθυνσης απόκριση των κυττάρων ΟΤΕ υπερεκφράζουν παραλλαγές NIPP1 FLAG-tagged διερευνώντας αν υπήρχε ένας συσχετισμός μεταξύ της θέσης του κεντρόσωμα και την κατεύθυνση της κίνησης των κυττάρων στα κύτταρα ΟΤΕ. Σε κύτταρα ΟΤΕ (χωρίς EF) κεντροσωμάτια τοποθετήθηκαν τυχαία (Εικ. 5). Κεντροσώματα των γονικών κυττάρων σε ένα πολωμένο cathodally EF (δείκτης πόλωση (ΡΙ) = 0,46 (βλέπε Πειραματικές Διαδικασίες)? Εικ. 5). Ωστόσο, τα κύτταρα που υπερεκφράζουν W.T-NIPP1 εμφανίζεται σχεδόν την ίδια κατανομή των κεντροσωμάτων προς την κάθοδο και άνοδο (PI = -0,09? Εικ. 5). Η διακοπή του EF-επαγόμενης καθοδική centrosomal πόλωση σε κύτταρα που υπερεκφράζουν WT-NIPP1 εξαρτιόταν πρόσδεσης στην ΡΡ1 να NIPP1 επειδή κύτταρα που υπερεκφράζουν mNIPP1 πολωμένο κεντροσωμάτια τους προς την κάθοδο (ΡΙ = 0,77), όπως και τα γονικά κύτταρα (ΡΙ = 0,46? Εικ. 5) . Περιέργως, η επαγωγή μιας συστατικώς δραστικής ολοένζυμο ΡΡ1 /NIPP1 επάγεται τόσο ισχυρή ανοδική πόλωση του κεντροσωμάτων (PI = -0,23) και ισχυρή μετανάστευση ανοδικό των κυττάρων (Σχ. 4C, 5). Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι η τοποθέτηση του κεντροσώματος κατά τη μετανάστευση αντικατοπτρίζει την κατευθυντική μετανάστευση σε κύτταρα HeLa. Πιο σημαντικά, αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η σύνδεση των ΡΡ1 με NIPP1 ελέγχει το διακόπτη για να ανοδική κεντρόσωμα πόλωση και καλωδιακής ανοδικής μετανάστευση, αντικατοπτρίζοντας πιθανώς εμπλοκή παρόμοιων μηχανημάτων κυτταροσκελετού και στις δύο διαδικασίες.

Α. Ένα EF DC πολώνει κεντροσωμάτια στην κάθοδο σε γονικά κύτταρα ΟΤΕ όπως φαίνεται με απαρίθμηση των κυττάρων σε 5 περιφέρειες, κορυφή (t), δεξιά (κάθοδος σε κύτταρα EF-θεραπεία), κάτω (b), αριστερά (άνοδος σε EF-επεξεργασμένα κύτταρα ) και το κέντρο του πυρήνα (σημειώνεται ως λευκό τελεία). Β γονικά κύτταρα και κύτταρα mNIPP1 θέση κεντροσωμάτια τους cathodally σε ένα EF, ενώ η υπερέκφραση του W.T-NIPP1 διαταράσσει καθοδική centrosomal πόλωση και η υπερέκφραση της ΔΟ-NIPP1 μετατοπίζει καθοδική πόλωση κεντροσωμάτια σε ανοδική. 100 κύτταρα μετρήθηκαν σε κάθε περίπτωση και τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ποσοστά.

Η

Η αναστολή της Cdc42 αντιστρέφει την NIPP1 που προκαλείται Ανοδική Μετανάστευση και Centrosomal Πόλωση

Τα αποτελέσματα της NIPP1 για το σχηματισμό της filopodia (Σχ. 2), κατευθυνόμενη μετανάστευση των κυττάρων (Εικ. 4C) και κεντροσωμάτων τοποθέτηση σε ένα φυσιολογικό EF (Εικ. 5) εξαρτώνται από ΡΡ1. Είναι ενδιαφέρον, ένα γονιδίωμα σε επίπεδο προφίλ των κυττάρων ΟΤΕ αποκαλύφθηκαν ότι NIPP1 επηρεάζει επίσης την έκφραση πολυάριθμων γονιδίων σε ένα ΡΡ1-εξαρτώμενο τρόπο [30]. Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι η ΟΤΡάσης Cdc42 ελέγχει filopodial επέκταση και κεντροσωμάτων τοποθέτησης μεταναστευτικά κύτταρα [36] – [38], και ότι η κατευθυντική μετανάστευση των επιθηλιακών κυττάρων κερατοειδούς σε απόκριση σε ένα EF DC ελέγχεται από ένα διακόπτη Cdc42 /Rho [39 ]. Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα οδηγούν στο δελεαστικός υπόθεση ότι η NIPP1 που προκαλείται ανοδική πόλωση που προκαλείται από σηματοδότηση μέσω Cdc42. Για να δοκιμαστεί αυτή η ιδέα, αναλύσαμε πρώτα τον κατάλογο των γονιδίων που υπερεκφράζονται σημαντικά από την υπερέκφραση του WT-NIPP1 ή ΔΟ-NIPP1, αλλά όχι από mNIPP1, όλα σε σύγκριση με την γονική κυτταρική γραμμή ΟΤΕ [30] και μη δημοσιευμένα δεδομένα (βλέπε υλικά και μέθοδοι). Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε 24 γονίδια που εμπλέκονται στην κυτταροσκελετική δυναμική, οι αλληλεπιδράσεις κυττάρου-μήτρας και της οδού Cdc42, και ενεργοποιούνται από υπερέκφραση του WT-NIPP1 ή ΔΟ-NIPP1, αλλά όχι από mNIPP1 (Πίνακας 1).

στη συνέχεια, μετρήθηκε η δραστικότητα ΟΤΡάσης Cdc42 σε κύτταρα ΟΤΕ σε ένα φυσιολογικό EF και επαληθεύεται εάν η μετρούμενη δραστικότητα ανεστάλη από την ειδική και κυτταρο-διαπερατό Cdc42 ΟΤΡάσης αναστολέας ML141 (CID2950007) [40]. Βρήκαμε ότι μία EF DC επάγει μια μικρή αλλά σημαντική αύξηση στη δραστικότητα ΟΤΡάσης Cdc42 σε όλα τα κύτταρα ΟΤΕ (Σχήμα 6Α? Ρ. & Lt? 0.001) και ότι η αγωγή αυτών των κυττάρων με 10 μΜ ML141 καταργήθηκε πλήρως Cdc42 δραστικότητα ΟΤΡάσης (τιμές ρ σύγκριση δειγμάτων σε απουσία και παρουσία της ML141 ήταν σε όλες τις περιπτώσεις & lt? 0,01). Είναι ενδιαφέρον ότι, η αναστολή της Cdc42 δεν επηρέασε καθοδική μετανάστευση των γονικών κυττάρων (directedness = 0,42 ± 0,06? Σχ. 6Β? Δείτε βίντεο S11). Ωστόσο, η αντιστροφή της EF-κατευθυνόμενη μετανάστευση από την υπερέκφραση του W.T-NIPP1 ανακτήθηκε από την αναστολή της Cdc42 (directedness = 0,29 ± 0,05? Σχ. 6Β? Δείτε βίντεο S12). Ομοίως, EF εκτεθειμένα κύτταρα ΔΟ-NIPP1, τα οποία μεταναστεύουν anodally, έχασε αυτή την απάντηση όταν Cdc42 ανεστάλη με ML141 και μάλιστα εμφανίζεται μια μέτρια ανταπόκριση καθοδική (directedness = 0.2 ± 0.1? Σχ. 6Β? Δείτε βίντεο S13). EF-διέγερση αυτών των κυττάρων (+ ML141) προωθείται σχηματισμό ινών στρες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται) και που προκαλείται από τη διάδοση και ruffling μαζί με διόγκωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης των κυττάρων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε πολλές περιπτώσεις όπου παρατηρήθηκε ισχυρή ruffling, τα κύτταρα αποκολλήθηκαν. Η αύξηση του πληθυσμού υπο-G1 (νεκρά κύτταρα) στις ML141-προεπεξεργασμένων κυττάρων ΔΟ-NIPP1 (που προσδιορίζεται με κυτταρομετρία ροής) μπορεί ενδεχομένως να ευθύνονται για τη χαμηλή μετανάστευση και την απόσπαση παρατηρείται σε αυτά τα κύτταρα. Σε αντίθεση, ML141 δεν προκάλεσε βλάβη στη βιωσιμότητα των γονικών, mNIPP1 και W.T-NIPP1 κύτταρα (Εικ. S1).

Α. Επίδραση της ML141 στη δραστηριότητα ΟΤΡάσης Cdc42 σε μη διεγερμένα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλήρες μέσο και σε EF-διεγερμένα κύτταρα που υπερεκφράζουν ΟΤΕ των παραλλαγών πρωτεΐνης FLAG-NIPP1. Επίπεδα Cdc42-GTP προσδιορίζεται με G-LISA σε γονικά, W.T-NIPP1, ΔΟ-NIPP1 και mRATA κυττάρων απουσία ή παρουσία DC EF και σε κύτταρα προ-επεξεργασμένα με 10 μΜ του ML141 πριν ηλεκτρική διέγερση.

σ

τιμές γονική να W.T-NIPP1 και τη γονική να ΔΟ-NIPP1 σε πλήρες θρεπτικό μέσο ήταν 0,1 και 0,01, αντίστοιχα?

σ

τιμές σύγκριση δειγμάτων απουσία και παρουσία ML141 ήταν σε όλες τις περιπτώσεις & lt? 0,01. αναστολή Β Cdc42 διασώζει καθοδική πόλωση και αυτό συσχετίζεται με κεντροσωμάτων τοποθέτηση. Directedness τιμές για την μετανάστευση των EF-κατεργασμένων κυττάρων επωάστηκαν με ML141. αναστολή Cdc42 διασώζει τη θετική directedness κυττάρων μειώθηκε κατά W.T-NIPP1 υπερέκφραση. Η έντονα αρνητική τιμή directedness εμφανίζονται από κύτταρα ΔΟ-NIPP1 γίνεται πιο κοντά στο 0 όταν τα κύτταρα προεπεξεργασία με αναστολέα Cdc42. Για τις τιμές directedness απλούστευση απουσία EF της γονικής, W.T-NIPP1, ΔΟ-NIPP1, και mNIPP1 με και χωρίς ML141 δεν έχουν περιληφθεί στο διάγραμμα. Αυτά ήταν, χωρίς ML141, -0,07 ± 0,04? 0,05 ± 0,09? -0,08 ± 0,05 και -0,01 ± 0,04, αντίστοιχα? με ML141 ήταν -0,07 ± 0,04? 0,09 ± 0,05? -0,07 ± 0,05 και -0,01 ± 0,04, αντίστοιχα. Σε περίπτωση απουσίας των αξιών EF ήταν σε όλες τις περιπτώσεις πολύ κοντά στο μηδέν και οι διαφορές μεταξύ των τεσσάρων γραμμών δεν ήταν στατιστικά σημαντικές σε οποιαδήποτε από τις περιπτώσεις. Δεδομένα ποσοτικοποιήθηκε από τουλάχιστον τρία πειράματα. Οι ράβδοι σφαλμάτων είναι S.E.M.

Οι σ

τιμές για τις σημαντικές διαφορές στην directedness δείξει. δείκτης Πόλωση των κεντροσωμάτων υπολογίζεται όπως εξηγείται στο υλικά και μέθοδοι. δείκτης Πόλωση των κυττάρων WT-NIPP1 και ΔΟ-NIPP1 γίνεται παρόμοιο με το δείκτη πόλωσης των γονικών κυττάρων όταν τα κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με το Cdc42 αναστολέα ML141.

Η

Η αναστολή της Cdc42 ΟΤΡάσης σε κύτταρα που υπερεκφράζουν NIPP1 αλλά αδυνατεί να δεσμεύουν ΡΡ1 (mNIPP1) δεν επηρέασε την ισχυρή μετανάστευση τους καθοδική (directedness = 0,57 ± 0,03? Σχ. 6Β? δείτε βίντεο S14). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν σαφώς ότι ο διακόπτης στην κατεύθυνση της EF που προκαλείται από τη μετανάστευση που προκαλείται από υπερέκφραση του NIPP1 εξαρτάται από τη σύνδεση των NIPP1 με ΡΡ1 και ότι διαμεσολαβείται από τη δραστηριότητα ΘΤΡάσης Cdc42.

Θα διερευνηθεί επίσης κατά πόσον η αναστολή της Cdc42 στον ΟΤΕ κύτταρα θα μπορούσε να ανακτήσει την πόλωση του κεντροσωμάτια προς την κάθοδο στα κύτταρα WT-NIPP1 και ΔΟ-NIPP1. Έχουμε αποδείξει ότι η αναστολή Cdc42 αύξησε την centrosomal ΡΙ των γονικών κυττάρων σε επίπεδα συγκρίσιμα με αυτά που παρατηρήθηκαν σε mNIPP1 κύτταρα (PI = 0,76 και στις δύο περιπτώσεις), ανακτάται η καθοδική centrosomal πόλωση στην WT-NIPP1 κύτταρα (PI = 0,59) και πιο εντυπωσιακά, που προκαλείται ισχυρή πόλωση κεντροσωμάτια προς την κάθοδο στα κύτταρα ΔΟ-NIPP1 (PI = 0,62) (Εικ. 6Β). Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι EF-επαγόμενη centrosomal πόλωση προς την κάθοδο είναι Cdc42 ΘΤΡάσης-ανεξάρτητη. Ωστόσο, η ανοδική πόλωση κεντροσωμάτια παρατηρηθεί σε κύτταρα WT-NIPP1 και ΔΟ-NIPP1 απαιτεί τόσο τη σχέση της με ΡΡ1 και τη δραστηριότητα ΘΤΡάσης Cdc42.

Συζήτηση

Συγκεκριμένα, βρήκαμε ότι τόσο ΡΡ1 και NIPP1 θετικά