Αφηρημένο

Η τελομεράση είναι ένα αντίστροφης μεταγραφάσης που σχετίζονται με την κυτταρική αθανασία μέσα από τη συντήρηση των τελομερών. Αυτό το ένζυμο ενεργοποιείται στο 90% των ανθρώπινων καρκίνων, και οι αναστολείς της τελομεράσης είναι επί του παρόντος σε κλινικές δοκιμές για την αντιμετώπιση της ανάπτυξης του όγκου. Πολλές πτυχές της βιολογίας τελομεράσης έχουν διερευνηθεί για θεραπεία, ιδιαίτερα αναστολή του ενζύμου, αλλά λίγα έγιναν σχετικά με υποκυτταρική παλινδρόμηση του. Δείξαμε πρόσφατα ότι μεταλλάξεις στο πυρηνικό σήμα εξαγωγής του hTERT, το καταλυτικό συστατικό τελομεράσης, οδήγησε σε μια μεταλλαγμένη (

NES-hTERT) που απέτυχαν να αποθανατίζω κύτταρα παρά πυρηνικό εντοπισμό και καταλυτική δράση. Έκφραση των

NES-hTERT σε πρωτογενείς ινοβλάστες οδήγησε σε τελομερών που βασίζονται σε πρόωρη γήρανση και μιτοχονδριακή δυσλειτουργία. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι η έκφραση του

NES-hTERT σε LNCaP, SQ20B και HeLa κύτταρα μειώνεται γρήγορα και σημαντικά ρυθμό πολλαπλασιασμού τους και την ικανότητα να σχηματίζουν αποικίες σε μαλακό άγαρ, ενώ δεν αλληλεπιδρούν με ενδογενή δραστικότητα τελομεράσης. Τα καρκινικά κύτταρα έδειξαν αυξημένη βλάβη του DNA στα τελομερικού και έξτρα-τελομερικού sites, και έγινε ευαίσθητα στην ιονίζουσα ακτινοβολία και υπεροξείδιο του υδρογόνου ανοίγματα. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η έκφραση του

NES-hTERT εξουδετερώνει αποτελεσματικά την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων

in vitro

σε τουλάχιστον δύο διαφορετικούς τρόπους, και προτείνουν χειρισμό με το NES του hTERT ή υποκυτταρικών παλινδρόμηση της ως μια νέα στρατηγική για τον καρκίνο επεξεργασία

Παράθεση:. Κοβαλένκο ΟΑ, Kaplunov J, Herbig U, deToledo S, Azzam ΕΙ, Santos JH (2010) Έκφραση

NES-hTERT στα καρκινικά κύτταρα Καθυστερήσεις κυτταρικού κύκλου εξέλιξη και αυξάνει την ευαισθησία στην Γονοτοξική Στρες. PLoS ONE 5 (5): e10812. doi: 10.1371 /journal.pone.0010812

Επιμέλεια: Marcelo Γ Bonini, Πανεπιστήμιο του Ιλινόις στο Σικάγο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 13 Απρ., 2010? Αποδεκτές: τρίτης Μαΐου του 2010? Δημοσιεύθηκε: May 25, 2010

Copyright: © 2010 Κοβαλένκο et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το New Jersey της Επιτροπής για την Έρευνα του Καρκίνου (NJCCR), αριθμός επιχορήγηση 808.033 (JHS), 09-1124-CCR-ΕΟ (UH) και 10 – 2412-CCR-E0 (JF), το Γραφείο Ερευνών του Στρατού, χορηγεί τον αριθμό 56027LS (JHS), το Ιατρικό Ίδρυμα Ellison χορηγήσει AG-NS-0387-07 (UH). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Μια βασική ιδιότητα των κακοήθων όγκων είναι η ικανότητά τους να πολλαπλασιάζονται επ ‘αόριστον. Αυτό γίνεται με τη μεσολάβηση, στο 90% των περιπτώσεων, με την επανενεργοποίηση του τελομεράσης, μια αντίστροφη μεταγραφάση υπεύθυνος για τη διατήρηση τελομερή [1], [2]. Η τελομεράση αποτελείται ελάχιστα από δύο διαφορετικές υπομονάδες, ένα καταλυτικό πυρήνα (hTERT) και ένα συστατικό RNA (hTR), που εργάζονται σε συναυλία για την ανασυγκρότηση των τελομερών με κάθε κυτταρική διαίρεση. hTERT έχει δειχθεί πρόσφατα να αποκτήσει ιδιότητες ενός ΚΝΑ-εξαρτώμενη RNA πολυμεράση, όταν σε ένα συγκρότημα με το συστατικό RNA της μιτοχονδριακής ενδοριβονουκλεάσης MRP [3]? τέτοια δραστηριότητα δεν εμπλέκεται στην διατήρηση των τελομερών. Ενώ hTR είναι παρούσα σε αμφότερες τις σωματικά και γεννητικά κύτταρα ιδιοσυστατικά, η έκφραση της hTERT ρυθμίζεται στενά. δραστηριότητα της τελομεράσης είναι υψηλή κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης και στη συντριπτική πλειονότητα των όγκων, αλλά είναι χαμηλή ή ανύπαρκτη στα περισσότερα σωματικά κύτταρα ενηλίκων [1]. Για το λόγο αυτό, αναστέλλοντας τελομεράσης έχει γίνει μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική για τη θεραπεία του καρκίνου.

Αρκετές διαφορετικές προσεγγίσεις έχουν αναπτυχθεί για να μπλοκάρουν την δραστικότητα του ολοενζύμου τελομεράσης, που κυμαίνονται από αναστολείς της hTERT σε G-παραβλεφθούν παράγοντες σταθεροποίησης σε στοχευμένες αποικοδόμηση της η σχετική hTR [4] – [17]. Σε όλες τις περιπτώσεις, άμεση ή έμμεση αποτελέσματα αναστολής τελομεράσης στο ανικανότητα των κυττάρων να διατηρήσουν τελομερή και τελικά τα κύτταρα σταματήσει την ανάπτυξη ή να πεθάνουν. Ένα πρόβλημα αυτών των προσεγγίσεων είναι ότι αρκετές εβδομάδες έως μήνες απαιτούνται για τις επιδράσεις που ως επί το πλείστον βασίζονται σε εκτεταμένη βράχυνσης των τελομερών [5]. Παρ ‘όλα αυτά, οι αναστολείς της τελομεράσης είναι επί του παρόντος σε κλινικές δοκιμές [18].

Έχουμε δείξει πρόσφατα ότι μια μετάλλαξη hTERT ελαττωματικό το σήμα πυρηνικής εξαγωγής (

NES-hTERT) απέτυχε να διατηρήσει τα τελομερή και το «υγιές» μιτοχόνδρια τόσο στην πρωτογενή και SV40-μετασχηματισμένα ανθρώπινους ινοβλάστες [19]. Παρά πυρηνικό εντοπισμό και την καταλυτική δραστηριότητα in vitro, η μεταλλαγμένη πρωτεΐνη ήταν βιολογικά αδρανής σε βιολογικό περιβάλλον οδηγούν σε πρόωρη γήρανση με την ενεργοποίηση της κλασικής τελομερούς σχετίζεται απόκριση βλάβης του DNA (DDR), όταν εκφράζεται σε πρωτογενή κύτταρα. Η έκφραση της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης συσχετίστηκε επίσης με μιτοχονδριακή δυσλειτουργία και βλάβη του DNA τόσο τελομερή και έξτρα-τελομερούς θέσεις [19]. Λαμβάνοντας υπόψη τις ραγδαίες και δραματικές επιπτώσεις που παρατηρούνται, υποθέσαμε ότι η έκτοπη έκφραση

NES-hTERT μπορεί επίσης να είναι ένα αποτελεσματικό μέσο για την αντιμετώπιση της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων. Στην παρούσα μελέτη εκφράσαμε

NES-hTERT σε διάφορες γραμμές καρκινικών κυττάρων και δείχνουν μια ταχεία και αποτελεσματική καθυστέρηση στην πρόοδο του κυτταρικού κύκλου, χωρίς καμία ανιχνεύσιμη μεταβολή στα επίπεδα των ενδογενών τελομεράσης ενζυματική δραστικότητα. Η έκφραση της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης μειώνει σημαντικά την ικανότητα των κυττάρων για αγκύρωση ανάπτυξη ανεξάρτητη in vitro. Βρήκαμε ότι η έκτοπη έκφραση του

NES-hTERT οδήγησε στην πυρηνική τελομερή, εξω-τελομερή και μιτοχονδριακού DNA (mtDNA) βλάβη στα καρκινικά κύτταρα και ευαισθητοποιημένα τουλάχιστον έναν τύπο των καρκινικών κυττάρων τόσο οξειδωτικό στρες και γ-ακτινοβολία. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας δείχνουν με στόχο την NES της hTERT ή ενδοκυτταρική κίνηση της ως νέα στρατηγική για την αντιμετώπιση αποτελεσματικά την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων.

Αποτελέσματα

Η υπερέκφραση του

NES-hTERT στο δέρμα και κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη ταχέως μπλοκ κύκλου κυττάρου εξέλιξη

πρόσφατα δείξαμε ότι η έκτοπη έκφραση ενός μεταλλαγμένου hTERT στην οποία η NES έχει διακοπεί (

NES-hTERT) προκαλεί πρόωρη γήρανση σε τελομεράση αρνητικά ανθρώπινους ινοβλάστες [19]. Πρωτογενή κύτταρα που εκφράζουν

NES-hTERT σταματήσει να αυξάνεται εντός 5-20 διπλασιασμούς πληθυσμού μετά την εισαγωγή της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης, η οποία συνδέεται με την κλασική σημάδια κυτταρικής γήρανσης, όπως αποκλεισμός στην G1 προς S μετάβαση, προς τα πάνω ρύθμιση της ρ21

WAF1 , ρ16 και θετικότητα για γήρανση που σχετίζεται με β-γαλακτοσιδάση (β-gal) δραστηριότητα [19]. Λαμβάνοντας υπόψη αυτά τα αποτελέσματα, ρωτήσαμε αν έκφραση

NES-hTERT θα επηρεάσει επίσης την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου της τελομεράσης-θετικά καρκινικά κύτταρα. Για να απαντηθεί αυτό το ερώτημα, θα εκφράζονται σταθερά

NES-hTERT σε SQ20B (ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα – του καρκίνου του δέρματος) και LNCaP (καρκίνος του προστάτη) κύτταρα και ακολούθησε αύξηση της μάζας των πολιτισμών για αρκετές εβδομάδες? κύτταρα ελέγχου είτε αριστερά μη μολυσμένα ή μολύνθηκαν με κενό φορέα. Δεν παρατηρήθηκαν διαφορές μεταξύ των κυττάρων μη μολυσμένα και τα κενά-φορέα σε μεταγωγή (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τα κύτταρα που επιλέγονται με αντιβιοτικά για 2 εβδομάδες πριν από την έναρξη των πειραμάτων. Viral μεταγωγές επαναλήφθηκαν τουλάχιστον δύο ανεξάρτητες φορές με κάθε κυτταρική γραμμή που δείχνει αναπαραγώγιμα αποτελέσματα. Όλα τα πειράματα που παρουσιάζονται εδώ βασίζονται σε δεδομένα που ελήφθησαν με κύτταρα που προέρχονται από τουλάχιστον δύο ανεξάρτητες ιογενείς λοιμώξεις

πιαστεί σύντομα την προσοχή μας ότι κατά την ιική μεταγωγή αλλαγές στον φαινότυπο των κυττάρων συνέβη.? οι αλλαγές αυτές παρατηρήθηκαν, ενώ τα κύτταρα εξακολουθούν να επιλεγεί. Ένα κλάσμα (~30-50%) των κυττάρων SQ20B εκφράζουν

NES-hTERT είχε ισοπεδωθεί και διευρυμένη μορφολογία με μερικά από αυτά τα κύτταρα παρουσιάζουν πολλαπλές πυρήνες (Εικ. 1Α, άνω πάνελ), που θυμίζει τις επιδράσεις που παρατηρούνται στα πρωτογενή κύτταρα [19]. Σε αντίθεση με τις πρωτογενείς ινοβλάστες, καμία θετική χρώση β-gal παρατηρήθηκε σε κύτταρα που εκφράζουν SQ20B

NES-hTERT (τα δεδομένα δεν φαίνονται), γεγονός που υποδηλώνει ότι η διευρυμένη κύτταρα δεν ήταν σε γήρανση. Αυτά τα κύτταρα ήταν επίσης δεν αποπτωτικά όπως ήταν ούτε διόγκωση ούτε αποκόλληση από τα πιάτα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Διευρυμένη μορφολογία δεν παρατηρήθηκε σε κύτταρα LNCaP που εκφράζουν το μεταλλαγμένο hTERT? Ωστόσο, ενώ τα κύτταρα αυτά έχουν την τάση να μεγαλώνουν σε ομάδες /εστίες, ανεξαρτήτως της συμβολής τους (βλέπε επίσης ATCC), έκφραση

NES-hTERT κατέστειλε αυτή φαινότυπο (Εικ. 1Α, μεσαίο πάνελ).

(Α ) SQ20B (άνω πάνελ) LNCaP (μεσαίο πάνελ) και τα παράγωγά τους που εκφράζουν σταθερά

NES-hTERT απλώθηκαν σε πιάτα σε ίσους αριθμούς και αναλύθηκαν 72 ώρες αργότερα. εικόνες αντίθεσης φάσης ελήφθησαν σε ένα μικροσκόπιο Olympus IX70. Σημείωση διευρυμένη μορφολογία του SQ20B

NES-hTERT και κύτταρα που φιλοξενούν πολλαπλά πυρήνες (βέλη). Ομαδοποίηση παρατηρείται σε LNCaP (βλέπε πλαίσιο), αλλά δεν έχουμε δει σε LNCaP

NES-hTERT. Κάτω πάνελ δείχνουν κύτταρα HeLa που επιμολύνθηκαν παροδικά με το

NES-hTERT μεταλλαγμένο. Εικόνες ελήφθησαν 48 ώρες μετά τις επιμολύνσεις. Τα βέλη δείχνουν διευρυμένη και πολυπύρηνα κύτταρα (μέση) παρατηρήθηκαν μόνο μετά από επιμόλυνση με το μεταλλαγμένο hTERT. (Β) SQ20B, LNCaP και

τους παράγωγα NES-hTERT απλώθηκαν και αφέθηκαν να αναπτυχθούν για έως και 144 ώρες. Σε διάφορους χρόνους τα κύτταρα συλλέχθηκαν και μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας αιμοκυτταρόμετρο. Στην περίπτωση των LNCaP, τα κύτταρα ανακαλλιεργήθηκαν και μετρήθηκαν πάλι 72 ώρες αργότερα. Μέση τριών αναλύσεων φαίνεται, μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν S.E.M. (* P ≤ 0,05) (C) Ποσοστό των κυττάρων σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου υπολογίστηκε με κυτταρομετρία ροής με βάση χρώση ΡΙ. (D) Τα κύτταρα στερήθηκαν ορό όλη την νύκτα, στη συνέχεια απελευθερώνεται με την προσθήκη ορού. Τα κύτταρα σημάνθηκαν με [

3Η] -θυμιδίνης και αναλύθηκαν σε προγραμματισμένα χρονικά διαστήματα για την ενσωμάτωση θυμιδίνης. Μέσος όρος δύο ανεξάρτητων πειραμάτων παρουσιάζεται, ράβδοι σφάλματος είναι s.d.

Η

Είναι δυνατόν ότι αυτές οι μορφολογικές αλλαγές απλώς να προκύψει από την μη-ειδική ολοκλήρωση του

διάνυσμα NES-hTERT pBabe. Για να αποκλειστεί αυτό το ενδεχόμενο, έχουμε παροδικά επιμολυσμένα την μεταλλαγμένη πρωτεΐνη στα κύτταρα HeLa (αδενοκαρκίνωμα). κύτταρα HeLa επιλέχθηκαν λόγω της υψηλής απόδοσης του παροδικές επιμολύνσεις (-60%) σε σύγκριση με τα δύο κύτταρα SQ20B και LNCaP (~ 10-20%? δεδομένα δεν φαίνονται) και επειδή πολύ εκφράζουν ενδογενή τελομεράσης. Για να διασφαλιστεί ότι τα κύτταρα που αναλύθηκαν εκφράζουν την μεταλλαγμένη πρωτεΐνη,

NES-hTERT υποκλωνοποιήθηκε εντός του φορέα pCMV και είτε επιμολυσμένα μόνο του ή συν-επιμολύνθηκαν με GFP? αποτελέσματα ήταν συγκρίσιμα με τις δύο προσεγγίσεις. Κύτταρα επιμολυσμένα με άδειο φορέα pCMV (+ ή – GFP) χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί έλεγχοι. Όπως μπορεί να φανεί στο Σχ. 1Α (δεξιά κάτω πάνελ), εντός 48 ωρών από την έκφραση της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης, ένα κλάσμα των κυττάρων HeLa έδειξε επίσης διευρυμένη και επίπεδη μορφολογία, η οποία δεν παρατηρήθηκε σε κύτταρα επιμολυσμένα με τον φορέα ελέγχου (Εικ. 1Α, κάτω αριστερά πλαίσιο). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι οι μορφολογικές αλλαγές που παρατηρούνται συσχετίστηκαν ειδικά με την έκφραση του

NES-hTERT. Είναι ενδιαφέρον, καμία αλλαγή στον αριθμό κυττάρων ανιχνεύθηκε για πρώτη 96 ώρες μετά τις επιμολύνσεις με κατασκεύασμα της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται), ενώ τα κύτταρα HeLa μεταχθέντα με φορέα ελέγχου ήταν ο διπλασιασμός 48 ώρες μετά την επιμόλυνση (Εικ. 1Α, αριστερά κάτω πάνελ) .

Στη συνέχεια, ορίσαμε αν

NES-hTERT αλλαγμένη εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων SQ20B και LNCaP χρησιμοποιώντας τρεις διαφορετικές προσεγγίσεις. Πρώτον, σπάρθηκαν παρόμοιο αριθμό των κυττάρων που εκφράζουν σταθερά ή όχι την μεταλλαγμένη πρωτεΐνη και ακολούθησε ανάπτυξη τους για μια περίοδο 6 ημερών. Σε κάθε χρονικό σημείο (24, 72 και 144 ώρες) τα κύτταρα υπέστησαν κατεργασία τρυψίνης και απαριθμήθηκαν χρησιμοποιώντας αιμοκυτόμετρο. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Β, η έκφραση του

NES-hTERT μετέβαλε το ρυθμό πολλαπλασιασμού των δύο κυτταρικών τύπων. Υπό αυτές τις συνθήκες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε SQ20B 1 πληθυσμός διπλασιάζεται κάθε 28 ώρες, ενώ SQ20B εκφράζουν το μεταλλαγμένο hTERT διπλασιάζεται ανά -36 ώρες. Times για διπλασιασμό στην περίπτωση των κυττάρων LNCaP και του

NES-hTERT παράγωγο υπολογίστηκε σε 36 και 57 ώρες, αντιστοίχως (34 ωρών ο χρόνος διπλασιασμού των κυττάρων LNCaP σύμφωνα με τον πωλητή (ATCC)). Στη συνέχεια παρακολουθείται εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου με κυτταρομετρία ροής. Τα κύτταρα συγχρονίστηκαν με απόσυρση ορού για 16-18 ώρες. Σε 8 ώρες μετά την προσθήκη ορού, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και επωάστηκαν με RNase Α και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ). Τα δεδομένα στην Εικ. 1C είναι αντιπροσωπευτικά τεσσάρων ανεξάρτητων αναλύσεων? και στις δύο κυτταρικές γραμμές έκφρασης του

NES-hTERT αύξησε το ποσοστό των κυττάρων σε G1 ενώ μειώθηκε το κλάσμα των κυττάρων σε S (Σχ. 1 C). Αυτά τα δεδομένα μας οδήγησε να ποσοτικοποιηθεί ειδικά το κλάσμα των κυττάρων στη φάση S με βάση ενσωμάτωση τριτιωμένης θυμιδίνης. πληθυσμοί κυττάρων Συρρέουσες υποκαλλιεργήθηκαν σε χαμηλότερη πυκνότητα και επωάστηκαν παρουσία [

3Η] -θυμιδίνης. Κίνηση σε S-φάση παρακολουθήθηκε με αυτοραδιογραφία σε πολλαπλές χρονικές στιγμές μέχρι 72 ώρες μετά την υποκαλλιέργεια. Αυτά τα πειράματα επαναλαμβάνονται δύο ανεξάρτητες φορές και έδειξε σαφώς μια σημαντική μείωση στο ποσοστό των κυττάρων στη φάση S κατά την έκφραση της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης (Σχ. 1D), σύμφωνα με τα αποτελέσματα που λαμβάνονται με κυτταρομετρία ροής. Κατά μέσο όρο, με ~20-70 ώρες αφού τα κύτταρα υποκαλλιέργεια, SQ20B και LNCaP εκφράζουν

NES-hTERT είχε 40% και 60-80% λιγότερο κυττάρων στην S φάση, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τις αντίστοιχες τους ελέγχους τους.

Κάποιος μπορεί να υποστηρίξει ότι τα υψηλά επίπεδα της hTERT θα μπορούσε να οδηγείτε τα αποτελέσματα του κυτταρικού κύκλου, όπως υποστήριξε στο παρελθόν [20]. Ωστόσο, δεν ευνοούν την υπόθεση αυτή ως έκτοπη έκφραση του άγριου τύπου (WT) ή R3e /R6e hTERT, ένα μεταλλαγμένο hTERT που δεν είναι σε θέση να εισέλθουν μιτοχόνδρια [21], δεν είχε καμία επίδραση στο ρυθμό πολλαπλασιασμού των κυττάρων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται ). Άλλες ομάδες έχουν επίσης εκτοπικά εκφραζόμενη WT hTERT σταθερά σε διάφορους διαφορετικούς τύπους καρκινικών κυττάρων και όχι ελαττώματα πρόοδο του κυτταρικού κύκλου έχουν αναφερθεί [22], [23]. Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα στο Σχ. 1 δείχνουν ότι η έκφραση του

NES-hTERT αποτελεσματικά και γρήγορα καθυστερεί την εξέλιξη των κυττάρων SQ20B και LNCaP διαμέσου του κυτταρικού κύκλου.

Η υπερέκφραση του

NES-hTERT στο δέρμα και κύτταρα καρκίνου του προστάτη μειώνεται το δυναμικό σχηματισμού αποικίας

in vitro

Η

Ένας αριθμός μετασχηματισμών απαιτούνται για τα κύτταρα να γίνουν ογκογόνα, συμπεριλαμβανομένων αυξημένο ρυθμό ανάπτυξης και την ικανότητα να αναπτύσσονται σε αγκυροβόλιο-ανεξάρτητο τρόπο [22] – [24]. Η ικανότητα των μετασχηματισμένων κυττάρων να σχηματίζουν αποικίες σε μαλακό άγαρ είναι ένα χρήσιμο προγνωστικό in vitro σχηματισμού όγκων in vivo [24]. Επιδιώξαμε να διερευνήσει κατά πόσον οι παρατηρούμενες επιδράσεις στο ρυθμό πολλαπλασιασμού μετά την εισαγωγή του

NES-hTERT στο δέρμα και προστάτη καρκινικά κύτταρα θα μπορούσαν να επηρεάσουν την ικανότητά τους να σχηματίζουν αποικίες σε μαλακό άγαρ. Για το σκοπό αυτό, μπορούμε επιμεταλλωμένα ίσο αριθμό SQ20B, LNCaP και των αντίστοιχων

τους παράγωγα NES-hTERT εις τριπλούν σε μαλακό άγαρ και αφέθηκαν να αναπτυχθούν για έως και 3 εβδομάδες? αποικίες μετρήθηκαν κάθε εβδομάδα χρησιμοποιώντας κρυσταλλικό ιώδες λεκέ. Δεδομένου του υψηλού ποσού των αποικιών που σχηματίστηκαν σε εβδομάδες 2 και 3, ιδιαίτερα στους μάρτυρες, εμείς σημείωσε αύξηση μετά από 1 εβδομάδα ανάπτυξης στο οποίο μεμονωμένες αποικίες ήταν ακόμη εύκολα διακριτά. Τα αποτελέσματα αναπαράγονται δύο ανεξάρτητες φορές. Άνω πάνελ σε σχήμα. 2 δείχνουν τον αριθμό των αποικιών που σχηματίστηκαν, κατώτερο πάνελ παρουσιάζουν αντιπροσωπευτικά εικόνες των πλακών. Σε αμφότερες τύπους καρκινικών κυττάρων, εισαγωγή

NES-hTERT μείωσε σημαντικά τον αριθμό των αποικιών που σχηματίστηκαν, γεγονός που υποδηλώνει μειωμένη ογκογόνο δυναμικό αυτών των κυττάρων που σε σύγκριση με τα αντίστοιχα δείγματα αναφοράς άδειου φορέα που εκφράζει.

5 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο SQ20B, LNCaP και

παράγωγα NES-hTERT αναπτύχθηκαν σε μαλακό άγαρ για έως 3 εβδομάδες. ανάπτυξη αποικίας εκτιμήθηκε κάθε εβδομάδα και αποικίες με βάση την χρώση κρυσταλλικού ιώδους. Γραφήματα δείχνουν τα αποτελέσματα από τις αποικίες υπολογίζονται σε 1 εβδομάδα, όταν μεμονωμένες αποικίες, ειδικά στα κύτταρα ελέγχου, ήταν ακόμη εύκολα διακριτές. Αποικίες βαθμολογήθηκαν από δύο ανεξάρτητους παρατηρητές. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι ο μέσος όρος δύο ανεξάρτητων πειραμάτων που έγιναν εις τριπλούν. Ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. Αντιπροσωπευτικά εικόνες των πλακών εμφανίζονται κάτω από κάθε γράφημα.

Η

Έκφραση

NES-hTERT δεν μεταβάλλει τα ενδογενή επίπεδα της ενζυμικής δραστηριότητας της τελομεράσης, αλλά αυξάνει τα επίπεδα της τελομερικού και έξτρα-τελομερικού βλάβες στο DNA

έκτοπη έκφραση ενός καταλυτικά ανενεργό μεταλλαγμένη hTERT που συμπεριφέρθηκε ως ένας κυρίαρχος αρνητικός αποδείχθηκε ότι αναστέλλει αποτελεσματικά την ενζυματική δράση της τελομεράσης, που οδηγεί σε διάβρωση των τελομερών και μειωμένο πολλαπλασιασμό διαφόρων τύπων καρκινικών κυττάρων. Αυξημένη αυθόρμητη απόπτωση, μειωμένη ανάπτυξη αποικίας σε μαλακό άγαρ και μειωμένη σχηματισμό όγκου σε γυμνούς ποντικούς παρατηρήθηκαν επίσης [9], [17]. Αν και

NES-hTERT είναι ενζυμικά ενεργή in vitro, δεν είναι σε θέση να επιμηκύνει τα τελομερή in vivo [19]. Έτσι, είναι πιθανό ότι στο τελομεράση θετικά SQ20B και τα κύτταρα LNCaP,

NES-hTERT συμπεριφέρεται κατά κυρίαρχο αρνητικό τρόπο, οδηγώντας τελικά στην μειωμένο ρυθμό πολλαπλασιασμού σημειώθηκε παραπάνω (Εικ. 1). Για να ελεγχθεί αυτή η πιθανότητα, αναλύσαμε τα επίπεδα της hTERT mRNA και της δραστηριότητας της τελομεράσης σε ολόκληρο κυτταρικά εκχυλίσματα των κυττάρων που εκφράζουν ή όχι

NES-hTERT χρησιμοποιώντας, αντίστοιχα, RT-PCR και το πρωτόκολλο τελομερή επαναλαμβανόμενη ενίσχυση (TRAP). Όπως αναμενόταν, τα επίπεδα του RNA του hTERT αυξήθηκαν στα κύτταρα εκτοπικά εκφράζουν την μεταλλαγμένη (Εικ. 3Α). Ωστόσο, καμία αλλαγή στην τελομεράσης ενζυματική δραστικότητα παρατηρήθηκαν με έκφραση της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης όπως κρίνεται με TRAP (Σχ. 3Β), δεικνύοντας ότι

NES-hTERT δεν ασκεί μια κυρίαρχη αρνητική επίδραση επί της ενδογενούς πρωτεΐνης τουλάχιστον από την άποψη της ενζυματική δραστικότητα.

(Α) Επίπεδα hTERT ΚΝΑ εκτιμηθεί με RT-PCR. GAPDH ενισχύθηκε και χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) 100 ng συνολικού κυτταρικά εκχυλίσματα χρησιμοποιήθηκαν για να εκτελέσει την παγίδα. Το βέλος δεικνύει τον εσωτερικό έλεγχο της δοκιμασίας. Θετικοί και αρνητικοί έλεγχοι δεν εμφανίζονται.

Η

Σε τελομεράση αρνητικά ινοβλάστες, έκφραση

NES-hTERT οδηγεί σε τελομερές και ζημιές εκτός τελομερικού DNA [19]. Έτσι, μια άλλη πιθανή εξήγηση για την μείωση στο ρυθμό πολλαπλασιασμού είναι ότι

NES-hTERT προκαλεί βλάβη στο DNA των καρκινικών κυττάρων, η οποία με τη σειρά της επιβραδύνει την ικανότητά τους να προχωρήσει μέσα από τον κυτταρικό κύκλο. Ελέγξαμε αυτή την υπόθεση με την αξιολόγηση της παρουσίας του φωσφορυλιωμένη μορφή της παραλλαγής ιστόνης Η2Α, γH2AX, και 53-πρωτεΐνης δέσμευσης 1 (53BP1). Διαπιστώσαμε επίσης βλάβες του DNA απευθείας στο τελομερή με ανοσο-φθορισμό in situ υβριδισμού (FISH ανοσο-) σε μεμονωμένα κύτταρα, mtDNA βλάβη αξιολογήθηκε με ειδική γονιδιακή ποσοτική PCR (QPCR) [25] – [27].

Μια μορφή της ιστόνης Η2Α φωσφορυλιωμένη στην σερίνη 139 (S139 της γH2AX) είναι απαραίτητη για την αποτελεσματική αναγνώριση διάλειμμα DNA διπλό σκέλος sites (ΟΕΔ). Εκατοντάδες ή χιλιάδες μόρια γH2AX παράγουν πυρηνική εστίες που μπορούν να βρεθούν στην ιστοσελίδα του κάθε αρχόμενη ΟΕΔ με ανοσοχρώση με αντισώματα για να γH2AX [28] – [30]. 53BP1 ενεργοποιείται ως μέρος της απάντησης βλάβη του DNA (DDR) και επίσης να σχηματίσουν εστίες [28], [29], [31]. Πραγματοποιήσαμε ανάλυση απλού κυττάρου σε SQ20B, τα κύτταρα LNCaP και των αντίστοιχων

τους παράγωγα NES-hTERT όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19], [29]. Τα κύτταρα βαθμολογήθηκαν ως έχοντα βλάβη του DNA, αν ήταν θετικά τόσο για γH2AX και 53BP1 εστιών. Αριθμός και μέγεθος των εστιών ανιχνεύεται σε κάθε απλού κυττάρου προσδιορίστηκαν ποσοτικά και απεικονίζονται στο Σχ. 4Α. Σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές, το ποσό των εστιών αυξήθηκε σημαντικά από την έκφραση του

NES-hTERT (

σ

= 0,006 για SQ20B και 0.034 για τα κύτταρα LNCaP). Είναι αξιοσημείωτο ότι η έκφραση της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης οδήγησε σε σημαντική αύξηση των κυττάρων που παρουσιάζουν μεγαλύτερες εστίες. Για παράδειγμα, ο αριθμός των SQ20B

κύτταρα NES-hTERT που δείχνει 6 εστιών ή περισσότερο ήταν 3 φορές υψηλότερη από ό, τι στα κύτταρα ελέγχου SQ20B (

σ

= 0,004) (Σχ. 4Α).

(Α) τα κύτταρα ανοσοχρώση με αντισώματα έναντι γH2AX και κατά 53BP1. Το DNA αντίθετα με DAPI. Γράφημα δείχνει το ποσοστό των κυττάρων που είναι θετικά τόσο για γH2AX και 53BP1 εστίες και τον αριθμό και το μέγεθος των εστιών ανά κύτταρο (που αντιπροσωπεύεται από τα διαφορετικά χρώματα ανάλογα με την επισήμανση γράφημα). Οι στήλες είναι μέσες ± s.d. (Β) χρώση ImmunoFISH να απεικονίσει ταυτόχρονα DNA εστίες ζημιά και τελομερή. DAPI χρησιμοποιήθηκε αιματοξυλίνης DNA. Γράφημα δείχνει το ποσοστό των εστιών βλάβης του DNA εντοπίζεται σε τελομερή (ΔΕΘ) ανά μεμονωμένο κύτταρο. (Γ) ακεραιότητα mtDNA αναλύθηκε με QPCR σε τρία ανεξάρτητα πειράματα. Γράφημα δείχνουν συχνότητα υπολογίζεται βλάβη ± s.e.m.

Η

Στη συνέχεια, θα αξιολογηθούν τα επίπεδα των τελομερών που προκαλείται από εστίες (ΔΕΘ), που έχουν περιγραφεί ως εστίες βλάβης του DNA παρουσιάζεται σε θέσεις τελομερική. ΔΕΘ μπορούν να προκύψουν από τη σταδιακή διάβρωση των τελομερών, λόγω της συνεχούς πολλαπλασιασμού των κυττάρων ή με στοχαστικές βλάβη τελομερικού DNA [31] – [34]. Υιοθετήσαμε ένα πρωτόκολλο που περιγράφηκε προηγουμένως [29], και ο αριθμός των θετικών κυττάρων TIF υπολογίστηκε με βάση το συνολικό αριθμό των κυττάρων που αναλύθηκαν. Ένα κύτταρο θεωρήθηκε ΔΕΘ-θετική όταν το 50% της μεγαλύτερης βλάβης του DNA συν-εντοπίζεται με τελομερή. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Β, τα επίπεδα του TIF-θετικών κυττάρων ήταν σημαντικά αυξημένα με έκφραση του μεταλλαγμένου hTERT. Πράγματι, TIF-θετικών κυττάρων αυξήθηκε περίπου 2-φορές στο παρασκήνιο LNCaP ενώ σε SQ20B Αυτή η βελτίωση ήταν λιγότερο έντονη (Εικ. 4Β). Σε κύτταρα SQ20B, το βασικό επίπεδο της ΔΕΘ ήταν υψηλό: περίπου το 45% των κυττάρων ήταν ΔΕΘ-θετικά. Τέτοιες υψηλές βασικό επίπεδο της βλάβης των τελομερών ήταν απροσδόκητο δεδομένου ότι αυτά τα κύτταρα εκφράζουν ενδογενή τελομεράσης που διατηρεί προφανώς τελομερών τους. Ωστόσο, η εισαγωγή

NES-hTERT οδήγησε σε περαιτέρω αύξηση της ΔΕΘ που εντοπίστηκε σε περίπου 70% του συνόλου των κυττάρων που αναλύθηκαν (Σχ. 4Β, μπαρ στα αριστερά).

Τέλος, αναλύσαμε mtDNA ακεραιότητα από QPCR, όπως στο παρελθόν έδειξαν ότι η έκφραση

NES-hTERT συνδέθηκε με μιτοχονδριακή δυσλειτουργία, συμπεριλαμβανομένης της απώλειας της ακεραιότητας mtDNA σε πρωτογενείς ινοβλάστες. Τέτοια αποτελέσματα ήταν στενά συνδεδεμένη με την ανιχνευθεί βλάβη πυρηνικό DNA σε τελομερικού και εξω-τελομερικού περιοχές [19].

Αν υποθέσουμε ότι η ζημιά είναι τυχαία κατανεμημένα, QPCR επιτρέπει μια συνολική εικόνα της ακεραιότητας του γονιδιώματος του υπό μελέτη [25 ] – [27]. Η δοκιμασία μετρά την ακεραιότητα του DNA με χρήση PCR μακρών στόχων, σε αυτή την περίπτωση 8.9 kb σε μήκος, το οποίο είναι περίπου 2/3 του συνόλου του mtDNA. Δεδομένου ταυτόσημες συνθήκες, το DNA από τον έλεγχο και την αγωγή δείγματα ενισχύουν διαφορετικά ανάλογα με τον αριθμό των βλαβών που υπάρχουν στην μήτρα με τον χρόνο της αντίδρασης. Για παράδειγμα, το DNA από κύτταρα που εκτέθηκαν σε υπεριώδη ενισχύει λιγότερο από το DNA από την αντίστοιχη μη-επεξεργασμένα ελέγχου [35]. Το ποσό της ζημίας μπορεί να εκφραστεί ως ο αριθμός των βλαβών ανά 10 kb υποθέτοντας μια κατανομή Poisson των βλαβών στο πρότυπο. Παρουσία των αλλοιώσεων αντικατοπτρίζει το γεγονός ότι το δείγμα που μας ενδιαφέρει ενισχύει λιγότερο από τον έλεγχό του, ενώ αρνητικός αριθμός των βλαβών μπορεί να παρατηρηθεί όταν το DNA ενός δεδομένου δείγματος ενισχύει καλύτερα από τα αντίστοιχα του ελέγχου της. Για την παρακολούθηση πιθανές αλλαγές στον αριθμό αντιγράφων mtDNA, μια σύντομη θραύσμα του μιτοχονδριακό γονιδίωμα ενισχύεται επίσης με σκοπό την κανονικοποίηση των δεδομένων. όριο ευαισθησίας της τεχνικής είναι 1 βλάβη /10

5 βάσεις (για περισσότερες λεπτομέρειες σχετικά με τον προσδιορισμό, ανατρέξτε στις αναφορές [25] -.. [27] και [35]

Τα δεδομένα στο σχήμα 4C απεικονίζουν ο μέσος όρος ± SEM από 3 ανεξάρτητες αναλύσεις. τα βασικά επίπεδα των βλαβών στους ελέγχους υπολογίστηκαν με βάση το μέσο ενίσχυσης των δειγμάτων ελέγχου κάθε κυτταρική σειρά, το οποίο στη συνέχεια χρησιμοποιείται ως σημείο αναφοράς για σύγκριση κάθε άτομο ελέγχου (για περισσότερες λεπτομέρειες βλέπε την τμήμα Μέθοδοι). Όπως αναμένεται, τόσο κυτταρική υπόβαθρα έκφραση του

NES-hTERT αύξησε σημαντικά τα βασικά επίπεδα του mtDNA βλάβη (Σχ. 4C), προτείνοντας ότι μιτοχονδριακή δυσλειτουργία ενισχύεται επίσης στα καρκινικά κύτταρα με έκφραση μεταλλαγμένης πρωτεΐνης.

Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα που παρουσιάζονται στο Σχ. 4 δείχνουν ότι η έκφραση του

NES-hTERT στην τελομεράση θετικά SQ20B και LNCaP κυττάρων οδηγεί σε βλάβη του DNA στα τελομερή και εξω-τελομερή τοποθεσίες, οι οποίες δεν είναι που προκαλείται από μια μείωση των επιπέδων του ενεργού ενζύμου στον πυρήνα αλλά μπορεί να σχετίζεται με δυσλειτουργικές μιτοχόνδρια.

NES-hTERT αυξάνει την ευαισθησία να γενοτοξικό στρες στο δέρμα καρκινικά κύτταρα

Έκφραση τελομεράσης έχει συσχετιστεί με διαμόρφωση του κυτταρικού θανάτου που επάγεται από γονοτοξικούς παράγοντες. Ευαισθητοποίηση, προώθηση και καμία επίδραση επί της απόπτωσης και /ή νέκρωση έχουν αναφερθεί, οι οποίες φαίνεται να βασίζονται στον τύπο των κυττάρων υπό μελέτη, η γονοτοξική παράγοντα που χρησιμοποιείται και, ειδικότερα, με το μήκος των τελομερών [17], [36] – [45]. Δεδομένης της σημαντικής αύξησης στα επίπεδα της βασικής των πυρηνικών και mtDNA βλάβη που παρατηρείται κατά την έκφραση του μεταλλαγμένου hTERT, ερευνήσαμε αν τα κύτταρα θα ευαισθητοποιούνται περαιτέρω να γενοτοξικό στρες. Για αυτά τα πειράματα, μπορούμε επιλεγμένα κύτταρα SQ20B, τα οποία είναι γνωστό ότι είναι πολύ ραδιοανθεκτικά τόσο από την άποψη της βλάβης του DNA και απώλεια της πολλαπλασιαστικής ικανότητας [46], [47].

Σε μία πρώτη σειρά πειραμάτων, εκθέσαμε τα κύτταρα σε

137Cs γ-ακτίνες. κύτταρα SQ20B και του

NES-hTERT παράγωγο απλώθηκαν σε ίσους αριθμούς και εμπλουτίσθηκαν σε G1 για 48 ώρες πριν από την ακτινοβόληση με διατήρηση σε κατάσταση συρροής. Αυτό είναι σημαντικό διότι τα κύτταρα σε διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου διαφέρουν ως προς την ευαισθησία τους ακτινοβολία [48]. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 1 Gray (Gy) του γ- ακτινοβολία (0.65 Gy /min), και αναλύσαμε πυρηνικό DNA (nDNA) ζημία από QPCR αμέσως μετά την έκθεση με παρακολούθηση της ακεραιότητας ενός θραύσματος 13.5 kb του β-σφαιρίνης γονίδιο [ ,,,0],25] – [27]. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται στο Σχ. 5Α δείχνουν σαφώς μια σημαντική αύξηση στην ποσότητα της βλάβης του DNA γ-ray που προκαλείται στο SQ20B

κύτταρα NES-hTERT. Ενώ σε κύτταρα SQ20B ελέγχου, 1 βλάβη παρατηρείται σε κάθε 50 kb του γονιδιώματος, το επίπεδο των ζημιών ανιχνεύθηκε σε SQ20B

κύτταρα NES-hTERT είναι 5-φορές μεγαλύτερη, που μεταφράζεται σε 1 αλλοίωση κάθε 10 kb δίκλωνου DNA ( Εικ. 5Α).

(ζημιές Α) πυρηνικό DNA εκτιμήθηκε σε SQ20B και της

NES-hTERT παράγωγο αμέσως μετά από έκθεση σε 1 Gy ακτινοβολίας γάμμα χρησιμοποιώντας QPCR. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων ± s.e.m. (Β) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 200 μΜ H

2O

2 για 60 λεπτά και αφέθηκαν να αναρρώσουν για 24 ώρες σε ρυθμισμένο μέσο. Σε αυτό το σημείο, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και ο αριθμός των αποπτωτικών, τα νεκρά και τα βιώσιμα κύτταρα αξιολογήθηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας ΡΙ και YOPRO-1. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Γ) Το ίδιο ποσό των βιώσιμων κυττάρων (500.000) απλώνονται εκ νέου μετά την H

2O

2 ανοίγματα και ο ρυθμός ανάπτυξής τους ακολούθησαν για 2 εβδομάδες. Ο αριθμός των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας αιμοκυτόμετρο στις 24 ώρες και κάθε φορά τα κύτταρα κατέστησαν συρρέοντα στη συνέχεια. Καθώς ο αριθμός των επεξεργασμένων SQ20B

NES-hTERT δεν άλλαξε στις ακόλουθες 2 εβδομάδες μόνο στοιχεία για 24 ώρες μετά τη θεραπεία παρουσιάζονται. Τα αποτελέσματα είναι μέση τιμή τριών ανεξάρτητων πειραμάτων ± s.e.m. (* P ≤ 0,05).

Η

Στη συνέχεια θα εξεταστεί αν τα κύτταρα θα πρέπει να ευαισθητοποιηθεί σε άλλους τύπους στρες. Για το σκοπό αυτό, θα τους εκτέθηκαν σε υπεροξείδιο του υδρογόνου (H

2O

2) και αναλύθηκαν κυτταρικό θάνατο δια κυτταρομετρίας ροής. Εμείς επιλέξαμε H

2O

2 λόγω της εμπειρίας μας με αυτό το οξειδωτικό παράγοντα άγχους? πειράματα πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφεται από εμάς προηγουμένως [21], [49], [50]. Εν συντομία, ίσο αριθμό κυττάρων SQ20B σπάρθηκε 16 ώρες πριν από την H

2O

2 ανοίγματα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 200 μΜ H

2O

2 για 60 λεπτά σε βασικό μέσο απουσία FBS και συλλέχθηκαν είτε αμέσως μετά την έκθεση σε H

2O

2 ή αφήνονται να αναρρώσουν για 24 ώρες σε ρυθμισμένο μέσο ανάπτυξης. Και στα δύο σημεία, η ποσότητα των νεκρών και αποπτωτικών κυττάρων βαθμολογήθηκε με βάση την πρόσληψη ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) και χρώση YOPRO-1. YOPRO-1 είναι ένα πράσινο-φθορίζουσα χρωστική που ανιχνεύει ειδικά αποπτωτικά κύτταρα [51] – [55]. Τα κύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής για την ποσοτικοποίηση με μεγαλύτερη εμπιστοσύνη του ποσοστού των βιώσιμων, νεκρών και αποπτωτικών κυττάρων. Καθώς δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές αλλαγές στις παραμέτρους αυτές αμέσως μετά την

2O

2 θεραπεία Η, τα δεδομένα που παρουσιάζονται κατωτέρω αφορούν το σημείο ανάκαμψης 24 ώρες.

Το σχήμα 5Β απεικονίζει πειράματα που είναι αντιπροσωπευτικές των 3 ανεξάρτητες αναλύσεις. Μια μεγάλη αύξηση στην ποσότητα των YOPRO-1 και ΡΙ-θετικά κύτταρα παρατηρήθηκε στο επεξεργασμένο SQ20B φόντο εκφράζουν το μεταλλαγμένο hTERT (Εικ. 5Β). Ποσοτικοποίηση του αριθμού των βιώσιμων, νεκρών και αποπτωτικών κυττάρων αποκάλυψε ότι ενώ παρατηρήθηκε μια 2-πλάσια αύξηση στον αριθμό των νεκρών κυττάρων (είτε ΡΙ-θετικά μόνο ή ΡΙ και YOPRO θετικά) σε SQ20B 24 ώρες μετά τις θεραπείες, η αύξηση αυτή ήταν περίπου 5-φορές σε SQ20B εκφράζουν

NES-hTERT (Εικ. 5Β). Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στο βασικό ρυθμό των νεκρών /αποπτωτικά κύτταρα ανιχνεύθηκαν κατά τη σύγκριση των μη επεξεργασμένων SQ20B με το παράγωγο μεταλλαγμένα που εκφράζουν (Εικ. 5Β, άνω πάνελ).

Για να αναζητήσετε τις μακροπρόθεσμες επιπτώσεις της θεραπείες, μπορούμε στη συνέχεια ακολούθησε τους ρυθμούς πολλαπλασιασμού του ελέγχου και αντιμετωπίζεται SQ20B και SQ20B

NES-hTERT για 2 εβδομάδες μετά από το H

2O

2 της έκθεσης. Ίσοι αριθμοί των βιώσιμων ελέγχου και επεξεργασμένα κύτταρα (0.5 × 10

6) απλώθηκε και ο αριθμός τους μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα αιμοκυτόμετρο στις πρώτες 24 ώρες και κάθε φορά τα κύτταρα έφθασαν το 100% συρροή στη συνέχεια. Ενώ οι έλεγχοι και κατεργάστηκε SQ20B διπλασιάστηκε σε αριθμό τουλάχιστον μία φορά κατά τις πρώτες 24 ώρες, καμία αλλαγή στον αριθμό κυττάρων παρατηρήθηκε σε επεξεργασία SQ20B

NES-hTERT (Εικ. 5C). Αξιοσημείωτα, αυτά τα κύτταρα παρέμειναν σε ηρεμία για 2 επιπλέον εβδομάδες όταν τελικά άρχισαν διπλασιασμού (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα αποτελέσματα είναι ιδιαίτερα ενδιαφέρουσα δεδομένου ότι φιλοξενούν SQ20B ένα μεταλλαγμένο p53 που δεν είναι σε θέση να διεγείρει το σημείο ελέγχου G1-S μετά βλάβη του DNA [46], [47].

Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα φαίνεται στο Σχ. 5 καταδεικνύουν ότι η έκφραση

NES-hTERT είναι σε θέση να ευαισθητοποιήσει SQ20B σε γ-ακτινοβολία και στο οξειδωτικό στρες που προκαλείται από H

2O

2.

Συζήτηση

η παρούσα μελέτη δείξαμε ότι η εισαγωγή του

NES-hTERT, ένα μεταλλαγμένο, που είναι ελαττωματικό στην πυρηνική-κυτταροπλασματική παλινδρόμηση, σε πλακώδες καρκίνωμα (SQ20B) και του καρκίνου του προστάτη (LNCaP) κυττάρων οδηγεί σε σημαντικές καθυστερήσεις στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, μείωση του πολλαπλασιασμού ρυθμό και ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη (Σχήματα 1, 2). Αυτές οι επιδράσεις δεν συσχετίστηκαν με μειωμένη ενδογενή ενζυμική δραστικότητα τελομεράσης αφού η έκφραση του μεταλλαγμένου hTERT δεν μετέβαλλε τη δραστικότητα της TRAP (Εικ. 3). Παρατηρήσαμε επίσης σημαντικές βλάβες του DNA τελομερικού και έξτρα-τελομερικού περιοχές, και αύξηση του αριθμού των mtDNA βλαβών υπό κανονικές συνθήκες κατά την έκφραση του

NES-hTERT (Εικ. 4). Είναι αξιοσημείωτο ότι το μεταλλαγμένο hTERT ευαισθητοποιημένα κύτταρα SQ20B που διαφορετικά ιδιαίτερα ανθεκτικά στην ιονίζουσα ακτινοβολία που προκαλείται από βλάβη του DNA και σε κυτταρικό θάνατο που επάγεται από την H

2O

2 (Εικ. 5). Στο σύνολό τους, τα στοιχεία μας δείχνουν το χειρισμό των NES της hTERT ή υποκυτταρικών παλινδρόμηση της τελομεράσης ως νέα και αποτελεσματικά μέσα για να αντισταθμίσει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων.

NES-hTERT επηρεάζει τον κυτταρικό κύκλο και ογκογονικότητα των καρκινικών κυττάρων

στο