Abstract

CK2 πρωτεΐνης κινάσης συχνά αυξημένα σε ποικιλία ανθρώπινων καρκίνων. Το μονοπάτι σηματοδότησης hedgehog (Hh) έχει ενοχοποιηθεί στη διατήρηση των βλαστικών κυττάρων, και ανώμαλη ενεργοποίηση του έχει υποδειχθεί σε διάφορους τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα. Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι CK2 θετικά εμπλέκονται στην Hh /Gli σηματοδότηση στον καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικές γραμμές Α549 και Η1299. Πρώτον, βρήκαμε μια συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων CK2α και Gli1 mRNA σε 100 πρωτοβάθμια πνεύμονα καρκινικούς ιστούς. Down-ρύθμιση της έκφρασης και μεταγραφικής δραστηριότητας Gli1 αποδείχθηκε μετά την αποσιώπηση του CK2α στον καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα. Επιπλέον, CK2α siRNA κάτω-ρυθμίζεται η έκφραση των γονιδίων στόχων Hh. Επιπλέον, δύο αναστολείς μικρού μορίου CK2α οδήγησε σε μια δοσο-εξαρτώμενη αναστολή της έκφρασης Gli1 και μεταγραφική δραστικότητα σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Αντίστροφα, η αναγκαστική υπερέκφραση CK2α ως αποτέλεσμα την αύξηση τόσο στην έκφραση Gli1 και μεταγραφική δραστικότητα σε κύτταρα Α549. Τέλος, η αναστολή της ΗΙι /Gli από CK2α siRNA οδήγησε σε μείωση ενός κυττάρου που ομοιάζει πλευρά πληθυσμός καρκινικά βλαστικά που δείχνει υψηλότερο επίπεδο έκφρασης ABCG2. Έτσι, αναφέρουν ότι η αναστολή της CK2α ρυθμίζει προς τα κάτω Hh /σηματοδότηση Gli και στη συνέχεια μειώνει το στέλεχος που μοιάζει με την πλευρά του πληθυσμού σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα

Παράθεση:. Zhang S, Wang Υ, ο Μάο JH, Hsieh D, Kim IJ, Χου LM, et al. (2012) Αναστολή της CK2α ρυθμίζει προς τα κάτω Hedgehog /Gli σηματοδότησης που οδηγεί σε μείωση της Stem-Όπως Side Πληθυσμός σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα. PLoS ONE 7 (6): e38996. doi: 10.1371 /journal.pone.0038996

Επιμέλεια: Alan P. πεδία, Mayo Clinic College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 16 Ιανουαρίου 2012? Αποδεκτές: 14, Μάη, 2012? Δημοσιεύθηκε: 29 του Ιούν 2012

Copyright: © 2012 Zhang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η παρούσα ερευνητικό έργο χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας επιχορήγησης R01 CA140654-01A1 (LY) και Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Γκουανγκντόνγκ, ΛΔΚ 2009 (9451008901003072). Είμαστε επίσης ευγνώμονες για την υποστήριξη από το Καζάν, McClain, Abrams, Fernandez, Λυών, Greenwood, Harley & amp? Oberman Ίδρυμα, Inc? η περιουσία του Robert Griffiths? το Ίδρυμα Jeffrey και Karen Peterson Οικογένεια? Paul και Michelle Zygielbaum? η περιουσία του Norman Mancini? και η Barbara Isackson καρκίνο του πνεύμονα Ταμείο Έρευνας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

CK2 πρωτεΐνης κινάσης (παλαιότερα γνωστό ως κινάση καζεΐνης II) είναι μια εξαιρετικά διατηρημένη κινάση σερίνης /θρεονίνης που φωσφορυλιώνει περισσότερες από 300 πρωτεΐνες [1]. CK2 έχει ετεροτετραμερείς δομή που αποτελείται από δύο καταλυτικές υπομονάδες (42-kDa α ή 38-kDa α ‘) και την ρυθμιστική υπομονάδα (28-kDa β), που αποτελούν το διαμορφώσεις α2β2, αα’β2 και α’2β2. CK2 είναι μια πολυλειτουργική πρωτεΐνη κινάση [2], που έχει αποδειχθεί ότι εμπλέκεται σε σχεδόν κάθε πτυχή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της επιβίωσης [3], [4], [5]. Το επίπεδο έκφρασης CK2α ρυθμίζεται στενά σε φυσιολογικά κύτταρα [6], και αυξημένο επίπεδο CK2α και δραστικότητα έχει παρατηρηθεί με συνέπεια σε μία ποικιλία ανθρώπινων καρκίνων [7], [8], [9]. Για παράδειγμα, το υψηλό επίπεδο και /ή πυρηνικό εντοπισμό του CK2α είναι ένας δείκτης της κακής πρόγνωσης για ασθενείς με οξεία μυελοειδή λευχαιμία, χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία, καρκίνο του προστάτη και γαστρικό καρκίνο [10], [11], [12], [13] . CK2 επηρεάζει επίσης αρκετές κυτταρικές σηματοδότησης οδούς, συμπεριλαμβανομένων των ΡΙ3Κ, NFkB και Wnt [6], [14], [15].

Το Hedgehog (Hh) οικογένεια εκκρινόμενων πρωτεϊνών, η οποία αποτελείται από Sonic, ινδική και Desert Hedgehog, παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των θηλαστικών και σε συντήρηση βλαστικών κυττάρων [16], [17]. Η ενεργοποίηση της οδού Hh εκκινεί στην κυτταρική επιφάνεια από το πρόσδεμα Hh πρόσδεσης στον υποδοχέα του Patched (PTC), με αποτέλεσμα αποκαταστολή της πρωτεΐνης τελεστή, ένα G-πρωτεΐνη υποδοχέα που συζευγνύεται, smoothened (SMO), [18]. Τελικά, ΠΕΑ ενεργοποιεί την οικογένεια Gli παραγόντων μεταγραφής και γονιδίων-στόχων. Υπάρχουν τρεις πρωτεΐνες Gli σε ανθρώπους: Gli1 χρησιμεύει για την ενεργοποίηση των γονιδίων στόχων Hh, Gli2 δρα τόσο ως ενεργοποιητή και καταστολέα των γονιδίων στόχων Hh, ενώ Gli3 δρα ως καταστολέας των γονιδίων στόχων Hh [19], [20]. Απορρύθμιση της Hh /Gli σηματοδότηση εμπλέκεται ως έναρξη ή διατήρηση του παράγοντα στην εξέλιξη των διαφόρων μορφών καρκίνου, περιλαμβανομένων των βασικών κυττάρων καρκινωμάτων, μυελοβλαστώματα, λευχαιμία, του πνεύμονα, του γαστρεντερικού, του πνεύμονα, των ωοθηκών, του μαστού και του καρκίνου του προστάτη [19], [21]. Για παράδειγμα, το γονίδιο Gli1 ενισχύεται σε ανθρώπινο γλοίωμα και ενεργοποιείται σε βασικοκυτταρικό καρκίνωμα [22], [23], [24]. Τα διαγονιδιακά υπερέκφραση Gli1 σε ποντικούς οδηγεί στην ανάπτυξη του καρκινώματος βασικών κυττάρων [25]. ενεργοποίηση Gli1 έχει αποδειχθεί σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) κύτταρα και τους ιστούς [26].

Άμεση απόδειξη ότι Hh /Gli σηματοδότηση διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στον καρκίνο βλαστοκύτταρα (ΚΕΠ) προέρχεται από μία σειρά μελετών σε διαφορετικούς τύπους όγκων [21]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι το ΑΤΡ-δέσμευσης μέλος μεταφορέα κασέτα 2 από την οικογένεια πρωτεϊνών G (ABCG2) είναι ένας άμεσος στόχος μεταγραφική του ΗΙι /Gli σηματοδότηση [27]. Ένας υποπληθυσμός, που ονομάζεται πλευρά πληθυσμό (SP) με υψηλότερο επίπεδο έκφρασης ABCG2 σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων Α549 καρκίνου του πνεύμονα, έδειξε σειρά χαρακτηριστικών ΚΕΠ »[28], [29], [30]. Αρκετές γραμμές του πρόσφατα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η σηματοδότηση σκαντζόχοιρος ρυθμίζει στέλεχος που μοιάζει με την πλευρά του πληθυσμού σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Για παράδειγμα, η πλευρά πληθυσμός του καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικής γραμμής Η460 εκφράζει προτίμηση ABCG2 και SMO, ένα κρίσιμο διαμεσολαβητή της σηματοδότησης hedgehog. Η κυκλοπαμίνη, ένα φυσικό αναστολέα hedgehog οδού, αναστέλλει σημαντικά την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και του κυτταρικού πολλαπλασιασμού κυτταρικής σειράς Η460 [30]. Η κυκλοπαμίνη μείωσε επίσης πλευρά πληθυσμός σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα [31]. Επιπλέον, αναστολέα οδού Hedgehog GDC-0449, ένα FDA εγκεκριμένο φάρμακο για τη θεραπεία του μεταστατικού καρκινώματος βασικών κυττάρων, μειώνεται αποτελεσματικά την ανάπτυξη των κυττάρων σε καρκινικές κυτταρικές σειρές ανθρώπινου πνεύμονα. Το αποτέλεσμα προκαλείται από την αναστολή της stem-σαν πλευρά πληθυσμός [32].

Μέχρι σήμερα, δεν υπάρχουν στοιχεία για τη σχέση μεταξύ CK2 και σηματοδότηση Hh /Gli σε κύτταρα θηλαστικών. Για να διερευνηθεί κατά πόσο CK2 εμπλέκεται στην οδό Hh σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα, ελέγξαμε τη δράση των Gli1 μετά την αναστολή CK2.

Είναι

Αποτελέσματα

CK2α και Gli1 Γονίδια Ενεργοποιημένο και διαβάζονται τα Ανθρώπινα NSCLC οι

Τόσο CK2α και Gli1 γονίδια έχουν δειχθεί ότι υπερ-εκφράζεται σε μια ποικιλία καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα [26], [33]. Μέσω της χρήσης του ημι-ποσοτική RT-PCR (Σχήμα 1Α) και ανάλυση στυπώματος Western (Εικόνα 1Β), εξετάσαμε το γονίδιο CK2α και πρωτεΐνης σε οκτώ κυτταρικών γραμμών NSCLC. Τα δεδομένα έδειξαν ότι η CK2α εκφράζεται σε όλα αυτά τα καρκινικά κύτταρα. Μεταξύ αυτών, τουλάχιστον πέντε κυτταρικές γραμμές (Α549, Α427, Η1299, Η358 και H838) έδειξε σχετικά υψηλότερη έκφραση του CK2α τόσο στο mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης. έκφραση CK2α είχε προηγουμένως δειχθεί να είναι ελάχιστη σε φυσιολογικά κύτταρα του πνεύμονα [34]. γονίδιο Gli1 και πρωτεΐνη εκφράσεις έγιναν ευρέως ανιχνεύεται σε όλες τις κυτταρικές σειρές, εκτός Η358. Είναι ενδιαφέρον, φάνηκε να υπάρχει συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης CK2α και Gli1 σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές εκεί. Πραγματοποιήσαμε πραγματικού χρόνου RT-PCR του CK2α και Gli1 σε 100 στοιχειώδη δείγματα NSCLC. Ένα ήπιο συσχέτιση μεταξύ CK2α και επιπέδων Gli1 mRNA βρέθηκε σε αυτούς τους ιστούς (r = 0,37,

P

& lt? 0,05) (Σχήμα 1 C). Για τις επόμενες πειραματικές μελέτες, Α549 επιλέχθηκε επειδή το καθεστώς των σχετιζόμενων με τον καρκίνο οδών σε κύτταρα Α549 έχει χαρακτηριστεί. Η1299 επελέγη επίσης λόγω του σχετικά υψηλότερη έκφραση της CK2α και Gli1 γονίδια.

(Α) RT-PCR. (Β) κηλίδα Western. Το γονίδιο CK2α ενεργοποιήθηκε στις οκτώ κυτταρικές σειρές NSCLC εξετάστηκαν (Α549, Α427, Η460, Η1299, H1650, Η358, H838 και H322), και το γονίδιο Gli1 εκφράστηκε σε όλες τις κυτταρικές γραμμές εκτός Η358. καμπύλη συσχέτισης (C) Γραμμική των επιπέδων CK2α και Gli1 mRNA. Μια ήπια συσχέτιση (r = 0,37,

P

& lt? 0,05) φαίνεται στην γραμμική ανάλυση συσχέτισης με SPSS. Πρωτογενής NCSCL ιστούς από ασθενείς που υποβάλλονται σε εκτομή συλλέχθηκαν κατά το χρόνο της χειρουργικής επέμβασης και αμέσως snap-καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο. Αυτά τα δείγματα ιστού διατηρήθηκαν στους -170 ° C σε καταψύκτη υγρού αζώτου πριν από τη χρήση.

Η

CK2α Νοκ ντάουν Αναστέλλει ΗΗ /Gli σηματοδότηση μέσω ρύθμισης προς τα κάτω Gli1

Για να διερευνηθεί κατά πόσο η καταστολή CK2 έχουν επίδραση επί της οδού Hh, θα σιγήσει έκφραση CK2 χρησιμοποιώντας CK2 υπομονάδα ειδικά siRNAs. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, η αποτελεσματικότητα της RNA παρεμβολής παρακολουθήθηκε με ημι-ποσοτική RT-PCR (Σχήμα S1). Τα αντίστοιχα επίπεδα mRNA των υπομονάδων τρία μειώθηκε, και η knockdown του α και α ‘επιβεβαιώθηκε με συν-επιμόλυνση των siRNAs τους. Η έκφραση των υποδεικνυόμενων συστατικών μονοπατιού Hh επίσης προσδιορίστηκε (Εικόνα S2). Συνολικά, τα αποτελέσματα RT-PCR έδειξε ότι τα επίπεδα PTC1 και Gli1 mRNA σε Α549 και κύτταρα Η1299 ήταν σταθερά κάτω ρυθμισμένα μετά CK2α ή CK2β knockdown, ενώ παρατηρήθηκαν ελάχιστες μεταβολές σε άλλα συστατικά μονοπάτι Hh. Με πραγματικού χρόνου RT-PCR, επιβεβαιώσαμε ότι η φίμωση του CK2α ανέστειλε σημαντικά την έκφραση Gli1 τόσο στο Α549 και κυτταρικές γραμμές Η1299 (Σχήμα 2Α). Αποσιώπηση του CK2β επίσης είχε σαν αποτέλεσμα σημαντική μείωση του Gli1 στις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 2Α). Επιπλέον, η έκφραση Gli1 ήταν ελάχιστη στο φυσιολογικό έλεγχο των πνευμόνων. Στο επίπεδο πρωτεΐνης, αποσιώπηση CK2α οδήγησε σε 71% (Α549) και 73% (Η1299) μείωση του Gli1, ενώ αποσιώπηση του CK2β οδήγησε σε 67% (Α549) και 35% (Η1299) μείωση του Gli1. Η θεραπεία με CK2α’ στόχευση siRNA δεν παρήγαγε προφανής διαφορά, όχι μείωση του Gli1 σε Α549, και παρήγαγε μία αύξηση κατά 60% σε Η1299, τόσο στο mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης (Σχήμα 2Β). Επιπλέον, εκτελέσαμε χρώση ανοσοφθορισμού με μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-Gli1 αντίσωμα, αφού πυρηνικό εντοπισμό του Gli1 αντιστοιχεί στη δραστηριότητα της οδού της Hh [35]. Πυρηνική Gli1 πρωτεΐνες δραματικά μειώθηκαν παρουσία CK2α siRNA (Σχήμα 2C). Επιπλέον, αποσιώπηση CK2α οδήγησε σε σημαντική μείωση (45% στα 25 μΜ και το 60% στα 50 μΜ, Ρ & lt? 0,01) στην Gli1 ενισχυμένο δραστηριότητα ανταποκριτή Gli, σε σύγκριση με το μη-στόχευσης siRNA (έλεγχος) (Εικόνα 2D) .

(α) επίπεδα Ποσοτική Gli1 mRNA μετά από αγωγή με CK2 ειδική ως προς υπομονάδα siRNA που εντοπίστηκε με πραγματικού χρόνου RT-PCR. Αποσιώπηση του CK2α μείωσε σημαντικά τα επίπεδα του mRNA Gli1 τόσο στο Α549 και κυτταρικές γραμμές Η1299 (κατά 50% και 45%, αντίστοιχα). Αποσιώπηση του CK2β επίσης είχε σαν αποτέλεσμα σημαντική μείωση του Gli1 στις δύο κυτταρικές σειρές. Ελάχιστο επίπεδο Gli1 mRNA παρατηρήθηκε στο φυσιολογικό πνεύμονα (NL). *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01, t-test του Student. επίπεδα (Β) Protein ανιχνεύεται με στύπωση Western. Αποσιώπηση του CK2α οδήγησε σε 71% (Α549) και μείωση 73% (Η1299) του Gli1, ενώ αποσιώπηση του CK2β οδήγησε σε 67% (Α549) και 35% (Η1299) μείωση του Gli1. Θεραπεία με CK2α’ στόχευση siRNA δεν παρήγαγε προφανής διαφορά, όχι μείωση του Gli1 σε Α549, και παρήγαγε μία αύξηση κατά 60% σε Η1299, τόσο σε mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης. (Γ) Ο εντοπισμός των Gli1 ανιχνεύεται από πράσινο φθορισμό. Η πρωτεΐνη εντοπίζεται κυρίως Gli1 στον πυρηνικό διαμέρισμα των κυττάρων, και δείχνει μεγάλη μείωση μετά CK2α knockdown. μπαρ κλίμακας = 30 μm. (Δ) Η μεταγραφική δραστικότητα του Hh πορείας στα Α549 ανιχνεύεται με δοκιμασία ρεπόρτερ Gli. Αποσιώπηση του CK2α οδήγησε σε σημαντική μείωση (περισσότερο από 40% στα 25 μΜ και το 60% στα 50 μΜ) της μεταγραφικής δραστικότητας, σε σύγκριση με τον έλεγχο siRNA. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01, t-test του Student. επίπεδα (Ε) Ποσοτικές Gli1 mRNA μετά από αγωγή με ΤΒΒ και CX-4945 με πραγματικού χρόνου RT-PCR. έκφραση Gli1 σε Α549 μειώθηκαν αισθητά στα επίπεδα δοσολογίας της 1 μΜ CX-4945 και 10 μΜ TBB, σημαντικά στα 10 μΜ CX-4945 και 50 μΜ ΤΒΒ (50% και 60%). *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01, t-test του Student. επίπεδα (F) Protein ανιχνεύεται με στύπωση Western. Στο επίπεδο πρωτεΐνης, αυτές οι μειώσεις ανήλθε στο 76% (10 μΜ CX-4945) και 89% (50 μΜ ΤΒΒ) στο Α549, και το 81% (10 μΜ CX-4945) και 93% (50 μΜ ΤΒΒ) σε Η1299, αντίστοιχα . (Ζ) Η έκφραση της πρωτεΐνης του Gli1 ανιχνεύεται από πράσινο φθορισμό. Κύτταρα θεραπεία με 30 μΜ ΤΒΒ ή όχημα DMSO, χρώση ανοσοφθορισμού με αντι-Gli1 mAb επί καλλιεργημένων κυττάρων έδειξαν σαφώς χαμηλότερη πράσινο φθορισμό υπό την παρουσία 30 μΜ ΤΒΒ. (Κλίμακα bar = 30 μm). (Η) Η μεταγραφική δραστηριότητα της ομάδας HH μονοπατιού στο Α549 ανιχνεύεται με τη δοκιμασία ρεπόρτερ Gli. Μια μείωση κατά 50% ανιχνεύθηκε με την παρουσία 10 μΜ CX-4945 ή 10 μΜ ΤΒΒ. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt?. 0.01, έλεγχος τ

Η

μικρών μορίων αναστολείς CK2α Down-ρυθμίζουν την έκφραση Gli1 και μεταγραφική δραστηριότητα

Για την περαιτέρω επικύρωση του ρόλου που διαδραματίζει η CK2α στην οδό Hh, χρησιμοποιήσαμε δύο μικρών μορίων CK2α αναστολείς: ΤΒΒ (4,5,6,7-tetrabromobenzotriazole), ένα γνωστό αναστολέα της CK2α [36], και CX-4945 (5- (3-χλωροφαινυλαμινο) βενζο [c] [2], [6] ναφθυριδινο-8-καρβοξυλικό οξύ), ένα πρώτο στην κατηγορία, εκλεκτικός, από του στόματος αναστολέα της CK2α υπό έρευνα σε κλινικές δοκιμές φάσης 1 [37].

τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις του ΤΒΒ (10, 30, 50 μΜ) ή CX-4945 (1, 3, 10 μΜ), ή με το όχημα DMSO για 48 ώρες. Θεραπείες με ΤΒΒ ή CX-4945 οδήγησε σε μια δοσο-εξαρτώμενη μείωση Gli1 mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης, τόσο σε Α549 και κυτταρικές γραμμές Η1299 (Σχήμα 2Ε, 2F και S3). Τα ποσοτικά επίπεδα του mRNA ανιχνεύθηκαν με πραγματικού χρόνου RT-PCR. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Ε, έκφραση Gli1 σε Α549 μειώθηκαν αισθητά στα επίπεδα δοσολογίας της 1 μΜ CX-4945 και 10 μΜ TBB, και μειώθηκε σημαντικά στα 10 μΜ CX-4945 και 50 μΜ ΤΒΒ (50% και 60%,

P

& lt? 0,05). Στο επίπεδο πρωτεΐνης, αυτές οι μειώσεις ανήλθε στο 76% (10 μΜ CX-4945) και 89% (50 μΜ ΤΒΒ) σε Α549, και 81% (10 μΜ CX-4945) και 93% (50 μΜ ΤΒΒ) σε Η1299, αντιστοίχως (Σχήμα 2F). χρώση ανοσοφθορισμού με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-Gli1 σε καλλιεργημένα κύτταρα έδειξαν δραματικά χαμηλότερο πράσινο φθορισμό υπό την παρουσία 30 μΜ ΤΒΒ (Σχήμα 2G). Στη συνέχεια έδειξε ότι τα μικρά μόρια ανέστειλαν δραστικότητα ανταποκριτή Gli σε Α549 κυτταρική γραμμή, όπου μια σημαντική μείωση (55%, Ρ & lt? 0.01) ανιχνεύθηκε με την παρουσία 10 μΜ CX-4945 ή 10 μΜ ΤΒΒ (Σχήμα 2Η). Αυτά τα αποτελέσματα είναι σύμφωνα με αυτά που βρέθηκαν σε μελέτες siRNA.

Αναγκαστική υπερέκφραση του CK2α Gene οδηγεί σε Gli1 Up-κανονισμός και μεταγραφική ενεργοποίηση

Για να επιβεβαιώσετε αν το γονίδιο CK2 επηρεάζει θετικά την μεταγραφική δραστικότητα Gli1, επιμολύναμε κύτταρα Α549 είτε με pcDNA3.1-CK2α ή ελέγχου pcDNA3.1-LacZ πλασμίδιο. Όπως αναμένεται, η υπερ-έκφραση του CK2α αποδόθηκε στην ενεργοποίηση του Gli1 στο Α549 κυτταρική γραμμή. Η υπερ-έκφραση της CK2α ανιχνεύθηκε με RT-PCR (Σχήμα 3Α) και στύπωμα Western (Σχήμα 3Β). Το αυξημένο επίπεδο Gli1 mRNA επίσης ανιχνεύθηκε με RT-PCR (Σχήμα 3Α). Με ανάλυση κηλίδος Western, δείξαμε το αυξημένο επίπεδο πρωτεΐνης Gli1 (2,35 πτυχώσεις) σε κύτταρα με έκτοπη υπερέκφραση του CK2α (Σχήμα 3Β). Επιπλέον, η δοκιμασία ρεπόρτερ έδειξε επίσης μια σημαντική (& gt? 2 πτυχώσεις, Ρ & lt? 0,01) αύξηση του Gli1 μεταγραφικής δραστικότητας (Σχήμα 3C). Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι η υπερ-έκφραση του γονιδίου CK2α οδηγεί σε μία ανοδική ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου Gli1 και μεταγραφική δραστικότητα.

(Α) κύτταρα Α549 διαμολύνθηκαν είτε με pcDNA3.1-CK2α ή pcDNA3 ελέγχου. 1-LacZ πλασμιδικούς φορείς, οι υπερ-εκφράζεται CK2α και πάνω ρυθμισμένα Gli1was που εντοπίστηκε με πραγματικού χρόνου RT-PCR. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01, t-test του Student. (Β) κηλίδα Western. Το επίπεδο πρωτεΐνης του Gli1 ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω σε αυτό το σύστημα με μια διπλάσια αύξηση. (C) Επιπλέον, η δοκιμασία ρεπόρτερ έδειξε επίσης μια σημαντική (περισσότερο από 2 φορές) αύξηση της μεταγραφικής δραστηριότητας Gli1. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01, t-test του Student. (Δ) Σε μια ανάλυση της υποβάθμισης της πρωτεΐνης, κύτταρα Α549 έδειξε μειωμένη Gli1 πρωτεϊνών στο χρονικό σημείο των 2 ωρών μετά την αγωγή με CK2α siRNA.

Η

Η κατασιγάσει του CK2α Προωθεί Gli1 Υποβάθμιση

εμείς περαιτέρω πραγματοποίησε πείραμα χρονική πορεία για να εξετάσει Gli1 ημίχρονο. Α549 κύτταρα επιμολυσμένα με CK2α ή ελέγχου siRNA, και τα επίπεδα πρωτεΐνης Gli1 ανιχνεύθηκαν στα χρονικά σημεία των 0, 1 και 2 ώρες μετά την θεραπεία με τον αναστολέα πρωτεΐνης, κυκλοεξιμίδη. Στην ομάδα knockdown CK2α, το επίπεδο της πρωτεΐνης Gli1 μειωθεί σε mimimum στις 2 ώρες μετά τη θεραπεία με κυκλοεξιμίδιο (σε σύγκριση με το ότι στο 0 ώρα), η οποία πρότεινε ότι η ημιζωή του Gli1 μετά CK2α siRNA knockdown είναι & lt? 2 ώρες. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι CK2α knockdown αποτελέσματα στην αποικοδόμηση του Gli1 (Σχήμα 3D). Αυτό, με τη σειρά του, υποδηλώνει ότι CK2α ρυθμίζει δραστηριότητα Gli1 με την πρόληψη της υποβάθμισης του.

CK2α Νοκ ντάουν ρυθμίζει προς τα κάτω Hh μεταγενέστεροι Γονίδια και μειώνει SP Προφίλ μέσω ABCG2 στο Α549

Hh φέρεται να ελέγχει τον πολλαπλασιασμό των διάφορους τύπους κυττάρων μέσω διαφόρων μοριακών μηχανισμών και στόχων κατάντη γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων των Ptc, τα μέλη της οικογένειας κυκλίνης, και αυτο-επαγωγή Gli1 [20], [38]. Αναλύσαμε τα επίπεδα mRNA του τέσσερα (Gli1, PTC1, PTC2 και Κυκλίνη Ε1) αυτών των γονιδίων με τη χρήση πραγματικού χρόνου RT-PCR (Σχήμα 4Α). Η έκφραση των τεσσάρων γονιδίων στόχων Hh μειώθηκε σημαντικά (

P

& lt? 0,05). Μετά CK2α knockdown, το οποίο προτείνει μια καταθλιπτική μεταγραφική δραστηριότητα της πορείας Hh

(Α) Hh έκφραση καθοδικών γονιδίων εντοπίστηκε με πραγματικού χρόνου RT-PCR. Το επίπεδο του mRNA των τεσσάρων γονιδίων στόχων Hh (Gli1, PTC1, PTC2 και Κυκλίνη Ε1) μειώθηκε σημαντικά μετά CK2α knockdown. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01, t-test του Student. (Β) Η έκφραση της ABCG2 μειώθηκε σε CK2α-σιγήσει κύτταρα Α549. (Γ) Το ποσοστό των κυττάρων SP μειώθηκε από 26,8% σε 15,4%, και από 9,4% σε 3,4% σε παρουσία 50 μΜ βεραπαμίλη, αντιστοίχως. Τα κύτταρα σημάνθηκαν με τη Hoechst 33342 και στη συνέχεια αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. (Δεξιά) προκύπτει όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 50 μΜ βεραπαμίλη κατά τη διαδικασία επισήμανσης. Το SP περιγράφεται και παρουσιάζεται ως ποσοστό του συνολικού πληθυσμού των κυττάρων. Αυτά τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα. (Δ) γράφημα Bar για (C). (Ε) Μοντέλο ΗΗ /Gli1 σηματοδότηση ρυθμίζονται από CK2. Λεπτομέρειες περιγράφονται στο κείμενο.

Η

Έχει αποδειχθεί ότι ABCG2 είναι ο πρωταρχικός συνεισφέρων στο φαινότυπο SP σε αρκετές καρκινικές κυτταρικές σειρές συμπεριλαμβανομένων Α549 [28]. Ο φαινότυπος SP έχει χαρακτηριστεί σε μια σειρά μελετών από καρκινικά βλαστικά κύτταρα προερχόμενα από προστάτη, μαστού, παχέος εντέρου, γλοίωμα, της ουροδόχου κύστης, των ωοθηκών, του τραχήλου, και το μελάνωμα [29], [39], [40], [41], [ ,,,0],42]. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι ABCG2 είναι άμεσος στόχος του μονοπατιού Hh το οποίο εμπλέκεται στην διατήρηση των βλαστικών κυττάρων [27]. Εξετάσαμε πρώτη έκφραση ABCG2 μετά CK2α νοκ ντάουν και διαπίστωσε ότι το επίπεδο ABCG2 μειώθηκε δραματικά σε CK2α-σιγήσει κύτταρα Α549 (Εικόνα 4Β). Συνεπής με άλλα ευρήματα, σχετικά υψηλότερο ποσοστό (26,8%) των κυττάρων Α549 είχαν ταξινομηθεί ως κύτταρα SP στη μελέτη μας. Με την παρουσία βεραπαμίλης, ενός αναστολέα μεταφορέα ABC, η αναλογία των κυττάρων SP μειώθηκε σε 9,4%. Μετά τη θεραπεία με CK2α siRNA, το ποσοστό μειώθηκε στο 15,4% (χωρίς βεραπαμίλη) ή 3,4% (με βεραπαμίλη) (Σχήμα 4C και 4D). Στη συνέχεια ταξινομούνται SP και μη SP κύτταρα σε αυτό το σύστημα. Σε περαιτέρω ανάλυση με ημι-ποσοτική RT-PCR, τα ταξινομημένα κύτταρα SP έδειξαν υψηλότερη έκφραση του ABCG2 από ό, τι τα κύτταρα μη-SP, αλλά καμία διαφορά της έκφρασης ABCG2 στο SP ή μη SP κύτταρα δείχθηκε μεταξύ της CK2α siRNA και ελέγχου (Εικόνα S4). Εν συντομία, έχουμε παρουσίασαν μείωση 42,5% του ποσοστού SP μετά CK2α νοκ ντάουν.

Συζήτηση

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι CK2 είναι ένας θετικός ρυθμιστής σε ΗΗ /Gli1 σηματοδότησης στον ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα. Αυτό υποστηρίζεται από πολλές γραμμές των αποδεικτικών στοιχείων. Πρώτα απ ‘όλα, ο συσχετισμός των CK2 και Gli1 εκφράσεις παρατηρήθηκαν σε αρκετές κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα. Δείξαμε περαιτέρω μια γραμμική συσχέτιση σε 100 πρωτογενείς ιστούς NSCLC. Δεύτερον, η αναστολή της CK2α με siRNA ή μικρού μοριακού αναστολείς οδήγησε σε μειορύθμιση της έκφρασης Gli1 και μεταγραφική δραστικότητα. Τρίτον, η αναγκαστική υπερέκφραση CK2α οδήγησε σε αυξημένη έκφραση Gli1 και μεταγραφική δραστικότητα. Τέλος, CK2α νοκ ντάουν οδήγησε σε μείωση της πλευράς πληθυσμού μέσω ρύθμισης προς τα κάτω ABCG2, έναν άμεσο στόχο του Hh /Gli σηματοδότηση [27].

Μέχρι σήμερα, δεν υπάρχουν στοιχεία για τη συσχέτιση μεταξύ CK2 και ΗΗ /Gli σηματοδότηση σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα, αν και CK2 προτάθηκε ως θετικός ρυθμιστής της μεταγωγής σήματος Hh οδού και δύο υπολείμματα σερίνης σε Smo φωσφορυλιώθηκαν με CK2 σε

Drosophila

[43]. Ωστόσο, ο μηχανισμός για φωσφορυλίωση Smo με CK2 δεν φαίνεται να ισχύει για τους ανθρώπους, καθώς αυτά τα δύο υπολείμματα Smo δεν είναι διατηρημένα σε ανθρώπινο Smo όταν ευθυγραμμίζονται με Clustal W [44] (Εικόνα S5). Επιπλέον, διάφορες μελέτες έχουν δείξει ότι Smo θηλαστικών και

Drosophila

Smo ρυθμίζονται από ριζικά διαφορετικών μηχανισμών [45], [46]. Πρόσφατα, Chen et al. έδειξαν ότι ΠΕΑ θηλαστικών ενεργοποιείται μέσω φωσφορυλίωσης multi-site από CK1α και ΟΚΚ2 και προτεινόμενος μηχανισμός δύο σταδίων για την φωσφορυλίωση ΠΕΑ σε κύτταρα θηλαστικών [47].

Για να ερευνηθεί η δυνατότητα μηχανισμό μέσω του οποίου CK2 ρυθμίζει θετικά την έκφραση της ανθρώπινης Gli1 και μεταγραφική δραστηριότητα, πραγματοποιήσαμε ανάλυση πρωτεϊνικής αποδόμησης της Gli1 μετά τη θεραπεία με CK2α siRNA. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι CK2 σίγηση μειώνει την ημιζωή της ανθρώπινης πρωτεΐνης Gil1 σε κύτταρα Α549. Επιπλέον, τόσο CK2 siRNA και αναστολέων μικρών μορίων κάτω-ρυθμίζονται Gli1 ενισχυμένο μεταγραφική δραστηριότητα. Επιπλέον, η αναγκαστική υπερέκφραση CK2α οδήγησε σε μεταγραφική δραστικότητα Gli1. Επιπλέον, βρήκαμε δύο προβλεπόμενες θέσεις φωσφορυλίωσης CK2 στο ανθρώπινο Gli1 χρησιμοποιώντας Scansite με μέσο αυστηρότητα [48] (Εικόνα S6). Τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι μπορεί να ρυθμίζει CK2 Gli1 σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα με παρόμοιο τρόπο με αυτόν στο

Drosophila

. Για παράδειγμα, Jia et al. ανέφερε ότι CK2 φωσφορυλιώνει άμεσα Ci στο

Drosophila

, και στη συνέχεια να αποτρέπει ουμπικουιτίνωση και την υποβάθμιση [43] της. Από την άλλη πλευρά, έχει προταθεί ότι κινάση συνθάση γλυκογόνου-3 βήτα ρυθμίζει αρνητικά παράγοντες μεταγραφής Gli1 συνεργάζονται με άλλες κινάσες όπως ΡΚΑ και CK1s σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα Α549 [49]. Έτσι, δύο βήματα είναι πιθανόν εμπλέκονται στην θετική ρύθμιση των Gli1 από CK2. Στο πρώτο στάδιο, η αναστολή της CK2 προάγει αποικοδόμηση Gli1, ακολουθούμενη από μειωμένη συσσώρευση Gli1 στο πυρηνικό διαμέρισμα. Στο δεύτερο στάδιο, ως ο βασικός παράγοντας μεταγραφής του μονοπατιού Hh, η μειωμένη πρωτεΐνη Gli1 καταστέλλει ακολούθως τη μεταγραφή των γονιδίων στόχων Hh. Αυτό με τη σειρά, σχηματίζει ένα βρόχο ανάδρασης για να μειώσει περαιτέρω το επίπεδο έκφρασης του Gli1, η οποία ενεργεί ως γονίδιο στόχος της οδού (Εικόνα 4Ε). Αν και ο μηχανισμός της ρύθμισης CK2 σε ανθρώπινους καρκίνους παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστη, υπάρχουν ενδείξεις ότι CK2 είναι απαραίτητη για Wnt /β-κατενίνης σηματοδότηση [50], [51]. Για παράδειγμα, είχε ενοχοποιηθεί ότι CK2 μπορεί να δεσμεύσει και να φωσφορυλιώνει β-κατενίνης και προωθεί την υποβάθμιση του [52]. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι μπορεί να σταθεροποιήσει CK2α της ανθρώπινης πρωτεΐνης Gli1 μέσω απευθείας φωσφορυλίωσης. Απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να φωτιστούν οι ακριβείς μηχανισμοί.

Ο μεταγραφικός παράγοντας οδού Hh Gli1 ρυθμίζει την έκφραση του ABC πρωτεΐνη μεταφορέα ABCG2 με απευθείας σύνδεση με τον υποκινητή ABCG2 [27], ABCG2 είναι ένα μοριακό καθοριστικός παράγοντας της SP φαινότυπο και εκφράζονται σε υψηλότερα επίπεδα σε κύτταρα SP, σε σύγκριση με κύτταρα μη-SP [28], [31]. Τα κύτταρα SP φέρεται να εμπλουτιστεί με καρκινικά βλαστικά κύτταρα, καθώς παρουσιάζει ιδιότητες των βλαστικών κυττάρων (ιδιαίτερα tumurigenic και χημειο-ανθεκτικό). Προηγούμενες μελέτες έχουν ανιχνεύσει φαινότυπο SP με υψηλότερο επίπεδο έκφρασης ABCG2 και εμπλέκεται ABCG2 ως δείκτη CSC σε κύτταρα Α549 καρκίνου του πνεύμονα [28]. Για παράδειγμα, τα κύτταρα SP στον Α549 έδειξε πιο tumurigenic δυναμικό [29]. Στη μελέτη μας, το γονίδιο στόχος της ομάδας HH /Gli ABCG2 σηματοδότηση ήταν κάτω-ρυθμίζονται μετά την αναστολή CK2α, όπου ABCG2 με γνώμονα την πλευρά πληθυσμός μειώθηκε στη συνέχεια. Έτσι, αναφέρουμε ότι CK2 συμμετέχει στη συντήρηση ΚΕΠ με τη ρύθμιση Hh /Gli σηματοδότηση.

Hh οδό μπορεί να παίζουν σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της ΚΕΠ, ωστόσο οι druggable στόχους σε ΗΗ μονοπάτι είναι πολύ περιορισμένη. CK2 παρέχουν ένα πρόσθετο στόχο για την αναστολή του Hh /Gli σηματοδότηση. αναστολείς CK2 δεν έχουν εκτεταμένα αναπτυχθεί ως θεραπευτικοί παράγοντες, οφείλεται εν μέρει σε ότι η ΑΤΡ-δέσμευσης τσέπη του CK2 δεν είναι τόσο druggable και ορισμένες άλλες πρωτεϊνικές κινάσες [50], [53], [54]. Μέχρι σήμερα, μόνο ένα αναστολέα CK2 μικρού μορίου έχει εισαχθεί με τις κλινικές δοκιμές ως δυνητικό αντικαρκινικό φάρμακο. CX-4945, ένας πολύ εκλεκτικός αναστολέας μικρό μόριο CK2, είναι μια πολλά υποσχόμενη πρώτη στην κατηγορία του στόματος θεραπευτικός παράγοντας στόχευσης πολλαπλών ανθρώπινων καρκίνων. CX-4945 δείχνει ένα ευνοϊκό προφίλ ασφάλειας στη Φάση Ι των κλινικών δοκιμών [55]. Επιπλέον, CIGB-300 (με στόχο τον τομέα CK2 phosphoaceptor ένα συνθετικό πεπτίδιο που βασίζεται ναρκωτικών) έχει αποδειχθεί ότι είναι ασφαλή και κλινικό όφελος σε Φάση Ι του τραχήλου της μήτρας δοκιμές του καρκίνου [56].

Συνοπτικά, αναφέρουμε ότι CK2 είναι ένας θετικός ρυθμιστής της οδού σηματοδότησης Hh /Gli, και η αναστολή της CK2α ρυθμίζει προς τα κάτω Hh /Gli σηματοδότηση σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Με δεδομένη η αναδυόμενη σημασία της hh /Gli σηματοδότησης στην έναρξη και την εξέλιξη του όγκου, τα ευρήματά μας παρέχουν σημαντικές ενδείξεις για τα πιθανά οφέλη των αναστολέων CK2.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture και μικρό μόριο Θεραπεία

κυτταρικές σειρές ανθρώπινου NSCLC (Α549, Α427, Η460, Η1299, H1650, H358, H838 και H322) λήφθηκαν από την American Type Culture Συλλογές (Manassas, VA). Τα κύτταρα συνήθως διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο εμβρυϊκό βόειο ορό, πενικιλλίνη (100 μg /ml) και στρεπτομυκίνη (100 μg /ml). Όλα τα κύτταρα καλλιεργούνται σαν ρουτίνα σε 37 ° C σε ένα υγρό επωαστήρα με 5% CO2. Η θεραπεία με CX-4945 (Synkinase, San Diego, CA) και TBB (Sigma, St. Louis, ΜΟ) διαλυμένη σε DMSO χορηγήθηκε σε διάφορες δόσεις (1, 3 και 10 μΜ CX4945? 10, 30, 50 μΜ ΤΒΒ ). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο για 48 ώρες μετά τη θεραπεία.

siRNA και πλασμίδιο DNA Επιμόλυνση

CK2α, CK2α »και CK2β ειδικά siRNAs (ON-TARGET

συν

SMARTpool) και RNA ελέγχου αγοράστηκαν από Thermo Scientific (Waltham, ΜΑ). Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 6-φρεατίων και 10

5 κύτταρα /φρεάτιο μία ημέρα πριν την επιμόλυνση, με στόχο 30-50% συρροή κατά τη στιγμή της διαμόλυνσης. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 50 nmol /L του siRNA χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Επαρκή αναστολή του siRNA με τη μεσολάβηση knockdown επιβεβαιώθηκε με RT-PCR. Οι pcDNA3.1-CK2α ή ελέγχου pcDNA3.1-LacZ φορείς πλασμιδίου στη συνέχεια επιμολύνονται σε κύτταρα Α549 (0,5 μg /ml σε πλάκα 24 φρεατίων) χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine 2000 διαμόλυνσης (Invitrogen), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν για RT-PCR και στυπώματος Western ή να χρησιμοποιηθούν σε προσδιορισμούς ρεπόρτερ σε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση.

Απομόνωση RNA, cDNA Σύνθεση και Ημι-ποσοτική RT-PCR

Απομόνωση ΚΝΑ πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA). Ανθρώπινα Lung Ολικό RNA αγοράστηκε από την Applied Biosystems (Foster City, CA). Πεντακόσια ng ολικού RNA μετατράπηκε σε cDNA 20 μΐ χρησιμοποιώντας iScript cDNA Synthesis Kits (Bio-Rad, Hercules, CA,) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. ζώνες PCR έγιναν ορατά υπό υπεριώδες φως και φωτογραφήθηκε.

Real-Time ΚΤ-ΡΟΚ

Ένα σύνολο 2 μΐ της αντίδρασης αντίστροφης μεταγραφής χρησιμοποιήθηκαν ως εκμαγείο για την ανίχνευση σε πραγματικό χρόνο της έκφρασης Gli1 χρησιμοποιώντας τεχνολογία TaqMan σε ένα σύστημα ανίχνευσης 7000 ακολουθία Applied Biosystems (Applied Biosystems, Foster City, CA). Η γονιδιακή έκφραση προσδιορίστηκε ποσοτικά για τις δοκιμασμένες γονίδια (Gli1, PTC1, PTC2 και Κυκλίνη Ε1) και ενδογενούς γονιδιακού ελέγχου β-γλυκουρονιδάση (GUSB) χρησιμοποιώντας τις αλληλουχίες εκκινητή και ανιχνευτή από το εμπόριο (Applied Biosystems).

Ανάλυση Western Blot και Ανοσοφθορισμός Χρώση

Σύνολο πρωτεΐνη εκχυλίζεται από το αντιδραστήριο εκχύλισης M-PER θηλαστικών πρωτεΐνη (Thermo) από κυτταρικές γραμμές που προστίθεται με φωσφατάση Inhibitor Cocktail Set II (Calbiochem, San Diego, CA) και Πλήρες κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche, Lewes , UK) σύμφωνα με τις κατασκευάζει »πρωτόκολλα. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε 4-15% κλίση γέλες SDS-πολυακρυλαμιδίου και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες Immobilon-P (Millipore, Bellerica, ΜΑ). Τα ακόλουθα πρωτεύοντα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν: αντι-CK2α (Millipore), αντι-Gli1 (Cell Signaling, Beverly, ΜΑ), αντι-ABCG2 (Millipore), και αντι-GAPDH (Trevigen, Gaithersburg, MD). Αφού επωάστηκε με κατάλληλα δευτερεύοντα αντισώματα, τα σύμπλοκα αντιγόνου-αντισώματος ανιχνεύθηκαν με τη χρησιμοποίηση ενός ECL στυπώματος σύστημα ανάλυσης (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). χρώση ανοσοφθορισμού διεξήχθη. Η εξέταση έγινε με τη χρήση σάρωσης με λέιζερ συνεστιακή μικροσκοπία (LSM 510, Carl Zeiss, Oakland, CA). Ψηφιακές εικόνες του ενιαίου συνεστιακού φέτες παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας το Adobe Photoshop 6.0.

Protein Assay Αποδόμηση

Ο CK2α- και τον έλεγχο siRNA-transtected Α549 κύτταρα εκτέθηκαν σε 50 μg /ml κυκλοεξιμιδίου και συλλέχθηκαν κατά τη χρονικά σημεία 0 και 6 ωρών. Το ολικό κυτταρικό πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν και αναλύθηκαν με ανάλυση κηλίδος Western.

Luciferase Reporter Δοκιμασίες

Για να μετρηθεί το Gli-προκαλούμενη δραστικότητα μεταγραφικής Hh, ο ανταποκριτής λουσιφεράσης κατασκευάσματα, 8 × άγριου τύπου θέση σύνδεσης Gli (8 × Gli

κ.β. Luc) ή 8 × μεταλλαγμένο Gli θέση σύνδεσης (8 × Gli

mut Luc) πλασμίδια [57] και ένα φορέα έκφρασης ανθρώπινης Gli1 (pcDNA3.1-Gli1) συν-επιμολύνθηκαν σε Α549 κύτταρα σε πλάκα 24 φρεατίων. Η

Renilla

λουσιφεράσης ρΡΙ_-ΤΚ πλασμίδιο (Promega, Madison, WI), του οποίου η έκφραση κατευθύνεται από τον υποκινητή του γονιδίου της κινάσης της θυμιδίνης οικοκυρική, συν-επιμολύνθηκε για την κανονικοποίηση για αποδοτικότητα διαμόλυνσης. Όλα τα πειράματα επιμόλυνσης πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το Lipofectamine2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από 24 ώρες τα κύτταρα λύθηκαν και προσδιορισμοί λουσιφεράσης πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [58]. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως πολλαπλότητα επαγωγής, η οποία είναι ο λόγος της δραστηριότητας της λουσιφεράσης που επάγεται σε Gli-επιμολυσμένα κύτταρα σε σχέση με την βασική δράση λουσιφεράσης σε έλεγχο επιμολυσμένα κύτταρα Α549. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν?