Αφηρημένο

Ο καρκίνος του ενδομητρίου είναι η πιο συχνά διαγιγνώσκεται γυναικολογική κακοήθεια σε όλο τον κόσμο? Ωστόσο, το μικροπεριβάλλον του όγκου, ειδικά τα κύτταρα ινοβλαστών που περιβάλλουν τα καρκινικά κύτταρα, είναι ελάχιστα κατανοητή. Ιδρύσαμε τέσσερις πρωτογενείς καλλιέργειες ινοβλαστών από ανθρώπινες ενδομήτριες ιστούς καρκίνου (καρκίνος που σχετίζεται με ινοβλάστες, CAFS) χρησιμοποιώντας μαγνητικό διαχωρισμό σφαιριδίων αντίσωμα συζευγμένο. Αυτές οι σχετικά ομοιογενείς καλλιέργειες ινοβλαστών εκφράζεται δείκτες ινοβλαστών (CD90, βιμεντίνη και άλφα-λείου μυός ακτίνη) και ορμονικές (οιστρογόνα και προγεστερόνη) υποδοχείς. Ρυθμισμένα μέσα που συλλέγονται από CAFS προκάλεσε μια δοσο-εξαρτώμενο πολλαπλασιασμό των δύο πρωτογενείς καλλιέργειες και κυτταρικές σειρές καρκίνου του ενδομητρίου

in vitro

(175%) σε σύγκριση με μη-κατεργασμένα κύτταρα, σε αντίθεση με εκείνα από την κανονική του ενδομητρίου κύτταρο ινοβλάστη γραμμή (51%) (

P

. **

P

& lt? 0,0001. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Για να προσδιοριστεί και να συγκριθούν τα αποτελέσματα των CAFS εκκρίσεων επί του ενδομητρίου καρκινικά κύτταρα, συλλέξαμε ρυθμισμένα μέσα από 72 ώρες το καλλιεργημένες ινοβλάστες, και στη συνέχεια κατεργάζεται ECC-1 και HEC-1A ανθρώπινες ενδομήτριες καρκινικές κυτταρικές γραμμές για 72 ώρες. Είναι ενδιαφέρον, προσαρμοσμένα μέσα από καρκίνο που σχετίζεται με ινοβλάστες (EC6-ινωδογόνο, EC7-ινωδογόνο, ΕΚ11-ινωδογόνο και ΕΚ14-Fib) προκάλεσε αντικρουόμενες επιπτώσεις: οι αυξήσεις τόσο των πρωτογενών ενδομητρίου καρκινικά κύτταρα (EC6-EP και ΕΚ14-Ερ) και οι εμπορικές ενδομητρίου καρκινικά κύτταρα (ECC-1 και HEC-1Α) έχουν σημαντικά ενισχυμένη με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 4Α-D). Μεγαλύτερες επιδράσεις παρατηρήθηκαν με HEC-1A κυτταρικές σειρές ECC-1 και από ό, τι σε πρωτογενείς καλλιέργειες, EC6-EP και ΕΚ14-EP. Μεταξύ των CAFS, EC-11-Fib κατέδειξε τα πιο αυξητικά αποτελέσματα, που κυμαίνονται 135% έως 274% αύξηση σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. Όταν συνδυάστηκαν οι εν λόγω μεμονωμένες CAF επιδράσεις (χαρακτηρισμένα ως CAFS), υπήρξε μια σημαντική διαφορά της αύξησης τοις εκατό των κυττάρων που προκαλείται από CAFS και Τ-ανθρώπινα εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα σε 2 μg /μΙ θεραπείας (

P

& lt? 0,05) (Σχήμα 4Α D).

για να αποκλείσει το ενδεχόμενο ότι η CAFS-αυξητικών επιδράσεις οφείλονται στις διαδικασίες καλλιέργειας κυττάρων μας, απομονώσαμε ινοβλάστες από ένα άτυπο ιστό υπερπλασία, μια καλοήθης ενδομήτριο κατάσταση, χρησιμοποιώντας παρόμοια προσέγγιση. Τα απομονωμένα ινοβλάστες (EH-Fib) έδειξε παρόμοια ινοβλαστική μορφολογία

in vitro

, και εξέφρασαν υψηλά επίπεδα CD90 (65%) (Σχήμα 5Α-C). Χρησιμοποιώντας το εμπλουτισμένο μέσο από αυτά τα κύτταρα, εξετάσαμε τα αποτελέσματά τους επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και των δύο καρκινικών κυτταρικών γραμμών (ECC-1 και HEC-1Α) και πρωτογενή επιθηλιακά κύτταρα (EC6-Ερ και ΕΚ 14-Ερ). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5D, EH-Fib ρυθμισμένα μέσα δεν επηρέασε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των ECC-1 και HEC-1A κύτταρα. Ωστόσο, όταν δοκιμάστηκε σε πρωτογενή επιθηλιακά κύτταρα EC6-Ερ και ΕΚ 14-Ερ, EH-Fib ανέστειλε την ανάπτυξη με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, με μέσο όρο 69% σε 2 μg /μΙ συγκέντρωση (Εικόνα 5D). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι οι επιδράσεις προαγωγής ανάπτυξης με CAFS είναι ειδική, και δεν οφείλεται σε επιλογή με πειραματική διαδικασία μας.

χρώση αιματοξυλίνης και ηωσίνης (Α) και εικόνας αντίθεσης φάσης (Β) των κυττάρων ινοβλαστών που απομονώνονται από την ανθρώπινη άτυπη ιστού υπερπλασία (EH-Fib)? Μεγέθυνση, 100χ. (Γ) Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του EH-Fib βάφονται με CD326-Alexa Fluor επιθηλιακών δείκτη 647 και δείκτη ινοβλαστών CD90-ΡΕ. (Δ) προσδιορισμός της βιωσιμότητας των κυττάρων προσδιορισμό των επιπτώσεων EH-Fib προσαρμοσμένα μέσα σε καρκίνο του ενδομητρίου κυτταρικές σειρές (ECC-1 και HEC-1Α) και τα πρωτογενή επιθηλιακά κύτταρα (EC6-EP και ΕΚ14-Ερ) μετά από θεραπεία 72 ώρες. Δεδομένων, κατά μέσο όρο? μπάρες σφάλματος, S.E.M. *,

P

& lt? 0,01. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Ενεργοποίηση της ΡΙ3Κ /Akt και ΜΑΡΚ /ΕΚΚ μονοπάτια σε ενδομήτριο πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων ινοβλαστών με τη μεσολάβηση του καρκίνου που σχετίζεται με

Για να διαλευκανθεί ο μηχανισμός υποκείμενων η αύξηση αποτελέσματα προαγωγής της εκκρίσεως CAFS επί ΕΚ, προσδιορίσαμε την ενεργοποίηση της ΡΙ3Κ /Akt και ΜΑΡΚ /ΕΚΚ, δύο σημαντικές οδούς επιβίωσης ενοχοποιηθεί σε καρκίνο του ενδομητρίου. Συνεπής με προηγούμενη μελέτη [27], θεραπεία των φυσιολογικών ινοβλαστών Τ-ανθρώπινα εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα-ρυθμισμένα μέσα μείωσε σημαντικά φωσφο-Ακί και φωσφο-ΕΚΚ έκφραση της πρωτεΐνης σε κύτταρα ECC-1, όπως δείχνεται με κηλίδα Western και δοκιμασίες ELISA (Σχήμα 6Α, Β). Αντίθετα, το επίπεδο της πρωτεΐνης φωσφο-Ακί ήταν μετρίως αυξημένα όταν τα κύτταρα ECC-1 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με EC6-ινωδογόνο, EC7-ινωδογόνο, ΕΚ11-ινωδογόνο και ΕΚ14-ινωδογόνο (Σχήμα 6Α, Β). Επιπλέον, CAFS επεξεργασμένο ECC-1 κύτταρα έδειξαν επίσης αύξησε το επίπεδο φωσφο-ΕΚΚ, σε σύγκριση με εκείνους που έλαβαν με μέσα ελέγχου (Σχήμα 6Α, Β).

(Α) ανάλυση κηλίδας Western των phosphorylated- Akt (Ser473) και έκφραση -Erk πρωτεΐνης στα κύτταρα ECC-1 μετά από αγωγή είτε με κανονική ενδομήτρια κύτταρα ινοβλαστών Τ-ανθρώπινα εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα ή σχετίζονται με τον καρκίνο κύτταρα ινοβλαστών (EC6-ινωδογόνο, EC7-ινωδογόνο, ΕΚ11-ινωδογόνο και ΕΚ14-Fib). πυκνομετρική ανάλυση σύγκριση του σχετικού επιπέδου έκφρασης της ρ-Ακί και ρ-Erk με το συνολικό επίπεδο πρωτεΐνης τους. (Β) Ποσοτική ανάλυση του φωσφορυλιωμένου Akt-(Ser473 και Thr308) και φωσφορυλιωμένου-Erk επίπεδα σε κύτταρα ECC-1 μετά από αγωγή είτε με T-ανθρώπινα εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα ή CAFS, σε σύγκριση προς κύτταρα που κατεργάζονται με έλεγχο (μέσο που περιέχει 2% FBS). ECC-1 (C) και EC6-Ερ (D) κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με ΡΙ3Κ οδός εκλεκτικός αναστολέας (LY294002) ή Erk οδού εκλεκτικός αναστολέας (U0126) παρουσία καρκίνου που σχετίζεται με ινοβλάστες ρυθμισμένα μέσα (1 μg /μl) για 72 ώρες. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι η βιωσιμότητα των κυττάρων μετά κανονικοποιημένη με τον έλεγχο (μέσο που περιέχει 2% FBS). Δεδομένων, κατά μέσο όρο? μπάρες σφάλματος, S.E.M. *,

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,0001. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά των δύο ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Για να διερευνήσουν περαιτέρω το λειτουργικό ρόλο των οδών PI3K /Akt και ΜΑΡΚ /ΕΚΚ στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων CAFS μεσολάβηση, είμαστε δίπλα αντιμετωπίζονται ECC-1 και EC6-Ερ κυττάρων με ΡΙ3Κ εκλεκτικός αναστολέας (LY294002) και Erk εκλεκτικός αναστολέας (U0126) παρουσία του EC6-Fib και ΕΚ11-Fib προσαρμοσμένα μέσα για 72 ώρες. Τόσο LY294002 και U0126 μείωσε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων CAFS μεσολάβηση σε αυτά τα κύτταρα (

P

& lt? 0.0001) (Σχήμα 6C, D). Αξίζει να σημειωθεί ότι, U0126 προκάλεσε μεγαλύτερη επίδραση ανασταλτική ανάπτυξης σε κύτταρα ΕΚ αγωγή με ΕΚ11-Fib ρυθμισμένα μέσα. Τα αποτελέσματα της LY294002 και U0126 στην αναστολή ενδομήτριο πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων ήταν εμφανής μόνο με την παρουσία του CAFS μέσων έκκρισης, όπως αυτοί οι αναστολείς επηρεάζεται ελάχιστα τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε μέσα ελέγχου (Σχήμα S1). Αυτοί οι αναστολείς άσκησαν επίσης παρόμοιες επιπτώσεις σε άλλα κύτταρα του ΕΚ, HEC-1A και ΕΚ14-Ep (Σχήμα S1). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η κατάσταση ενεργοποίησης του PI3K /Akt ή /και τα μονοπάτια ΜΑΡΚ /ΕΚΚ μπορεί να είναι το βασικό σημείο κατά το οποίο ινοβλαστών από τόσο φυσιολογικά και καρκινικά συνθήκες ρυθμίζουν ενδομητρίου τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων.

αξιολογηθεί περαιτέρω κατά πόσον η ραπαμυκίνη, ένα γνωστό ΡΙ3Κ κατάντη αναστολέα, μπορεί να είναι κλινικά χρήσιμη στην αναστροφή CAFS μεσολάβηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων ΕΚ. Με την παρουσία του ΕΚ11-Fib ρυθμισμένα μέσα, η θεραπεία της ραπαμυκίνης για 72 ώρες ανέστειλε αποτελεσματικά ECC-1 και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων EC6-Ep (

P

& lt? 0,0001) (Εικ. 7Α, Β). Στην υψηλότερη δόση που δοκιμάστηκε (2 μΜ), ραπαμυκίνη μειωμένη ECC-1 κύτταρα από 180% (ρυθμισμένο θεραπεία media μόνο) σε 40% (εμπλουτισμένο μέσο και ραπαμυκίνη θεραπεία) (

P

& lt? 0,0001), ενώ ελάχιστη αναστολή παρατηρήθηκε όταν τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσα ελέγχου (Σχήμα 7Α, Β). Παρόμοιο αποτέλεσμα παρατηρήθηκε και με τα αποτελέσματα της ραπαμυκίνης σε άλλα κύτταρα ΕΚ, HEC-1A και ΕΚ14-Ep (Εικόνα S2). Χρησιμοποιώντας την επισήμανση αννεξίνη V, διαπιστώσαμε επίσης ότι η ραπαμυκίνη παρεμπόδισε CAFS με τη μεσολάβηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων ΕΚ

μέσω

επαγωγή της απόπτωσης (Εικόνα 7C-Ε). Θεραπεία της ECC-1 με 1 μg /μl ΕΚ11-Fib προσαρμοσμένα μέσα για 72 ώρες δεν επηρέασε σημαντικά το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων?