Αφηρημένο

Οι δυνατότητες αυτο-ανανέωση των κυττάρων του καρκίνου μπορεί να εκτιμηθεί με τη χρήση συγκεκριμένων δοκιμασιών, οι οποίες περιλαμβάνουν ξενομεταμόσχευση σε ανοσοκατεσταλμένους ζώα ή καλλιέργεια σε μη προσκολλητικά μέσα χωρίς ορό βλαστικά κύτταρα (SCM). Ωστόσο, εάν τα κύτταρα με δυνατότητες αυτο-ανανέωση συμβάλλουν πραγματικά στην ασθένεια είναι άγνωστη. Εδώ ερευνήσαμε την ογκογόνο δυναμικό και την τύχη των καρκινικών κυττάρων σε ένα μοντέλο μελανώματος in-vivo. Εξετάσαμε κυτταρικές σειρές που προήλθαν από την ίδια γονική γραμμή: μια μη μεταστατική κυτταρική γραμμή (Κ1735 /16), μια μεταστατική κυτταρική γραμμή (Κ1735 /Μ4) και μία κυτταρική γραμμή η οποία επιλέχθηκε σε μη προσκολλημένα συνθήκες (Κ1735 /16S ). Όλες οι κυτταρικές σειρές παρουσίασαν παρόμοια κινητική πολλαπλασιασμού όταν αναπτύσσονται σε πλάκες καλλιέργειας. Κ1735 16 κύτταρα /αναπτύσσονται σε μαλακό άγαρ ή σε εναιώρημα μη-προσκολλημένα συνθήκες απέτυχε να σχηματίσει αποικίες ή σφαιροειδή, ενώ οι άλλες κυτταρικές σειρές παρουσίασαν εξέχουσα colonogenicity και σφαιροειδές ικανότητα σχηματισμού. Με τη χρήση σφαίρας ανάλυση περιοριστικής αραίωσης (SLDA) σε μέσα ελεύθερα ορού, Κ1735 /16S και Κ1735 /Μ4 κύτταρα που αναπτύσσονται σε εναιώρημα ήταν ικανό να σχηματίζει σφαιροειδή ακόμα και σε χαμηλές συχνότητες των συγκεντρώσεων, σε αντίθεση με Κ1735 /16 κύτταρα. Το ογκογόνο δυναμικό των κυτταρικών σειρών προσδιορίστηκε σε ποντίκια SCID με χρήση ενδο ενέσεις πατούσα. Ψηλαφητούς όγκους ήταν εμφανείς σε όλα τα ποντίκια. Σε συμφωνία με το

in-vitro

μελέτες, η κυτταρική γραμμή Κ1735 /M4 παρουσίασαν τα υψηλότερα κινητική ανάπτυξη, ακολουθούμενη από την κυτταρική σειρά Κ1735 /16S, ενώ η κυτταρική γραμμή Κ1735 /16 είχε τη χαμηλότερη ανάπτυξη του όγκου δυναμικό (

P

& lt? 0.001). Σε αντίθεση, όταν επαναλάβαμε τα πειράματα σε συγγενικά ποντίκια C3H /HeN, η κυτταρική γραμμή Κ1735 /16 παράγονται μακροσκοπικά όγκους 30-100 ημέρες μετά την ένεση, ενώ Κ1735 /Μ4 και Κ1735 /16S που προέρχεται όγκους υποχώρησαν αυθόρμητα στο 90-100% των ποντικών . ανάλυση TUNEL αποκάλυψε σημαντικά υψηλότερο αριθμό αποπτωτικών κυττάρων σε Κ1735 /16S και Κ1735 /Μ4 όγκους γραμμή που προέρχεται από κύτταρο σε σύγκριση με Κ1735 /16 όγκους (Ρ & lt? 0.001). Τα μοντέλα που εξετάσαμε εδώ εγείρει την πιθανότητα ότι κύτταρα με υψηλή-ογκογόνο δράση μπορεί να είναι πιο ανοσογόνα και ως εκ τούτου είναι πιο επιρρεπή σε ανοσολογική ρύθμιση

Παράθεση:. Krelin Υ, Berkovich L, Amit M, Gil Ζ (2013) σύνδεσης μεταξύ ογκογόνο δυναμικό και η τύχη των καρκινικά κύτταρα σε ένα Συγγενής μελάνωμα μοντέλο. PLoS ONE 8 (4): e62124. doi: 10.1371 /journal.pone.0062124

Επιμέλεια: Salvatore V. Pizzo, του Πανεπιστημίου Duke Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 16 του Απριλίου 2012? Αποδεκτές: 19 Μαρ 2013? Δημοσιεύθηκε: 23 Απρ 2013

Copyright: © 2013 Krelin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από το Ίδρυμα Ισραήλ Science (αριθμός 1680-1608 και 482/11), το Ισραήλ Καρκίνου (επιχορήγηση που δώρισε η Ellen και Emanuel Kronitz στη μνήμη του Δρ Leon Kronitz αριθμό 20090068), του ισραηλινού Υπουργείου Υγείας (αριθμός 3 – 7355 ), το Ινστιτούτο Weizmann – Sourasky Medical Center κοινή Grant, το Τελ Αβίβ Sourasky Τειχών Grant, η ICRF Barbara S. Goodman προικισμένο βραβείο έρευνα για την ανάπτυξη της σταδιοδρομίας (2011-601-BGPC) και επιχορήγηση από το Ίδρυμα των ΗΠΑ-Ισραήλ Binational Science (αριθμός 2007312) για να ZG Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος είναι μια πολύπλοκη ασθένεια, που περιλαμβάνει διαφορές μεταξύ των όγκων ή κυττάρων εντός ενός δεδομένου όγκου, καθώς και μεταβολή μεταξύ των ασθενών. Εντός του φάσματος των κυττάρων σε ένα δεδομένο όγκο, υποπληθυσμούς κυττάρων μπορεί να είναι φαινοτυπικά διαφορετικά και παρουσιάζουν διακριτά πολλαπλασιαστικού δυναμικού. Για παράδειγμα, το (CSC) μοντέλο καρκίνου των βλαστικών κυττάρων προτείνει ότι μόνο ένα μικρό υποπληθυσμό κυττάρων έχει δυνατότητα αυτο-ανανέωση και σχηματισμό όγκου, ενώ η πλειονότητα του όγκου αποτελείται από μη ογκογόνα κύτταρα [1]. Αποδεικτικά στοιχεία που υποστηρίζουν το μοντέλο CSC βρίσκεται στον καρκίνο των γεννητικών κυττάρων, λευχαιμία, καρκίνο μαστού, καρκίνο του παχέος εντέρου και σε ορισμένες μορφές καρκίνου του εγκεφάλου. [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]. Από την άλλη πλευρά, αν μελανώματα είναι συνεπείς με ένα τέτοιο μοντέλο είναι ένα θέμα συνεχούς συζήτησης [12], [13].

Προς το παρόν, η μόνη δοκιμασία που προσδιορίζει την ογκογόνο δυναμικό των ανθρώπινων όγκων περιλαμβάνει ξενομεταμόσχευση διαφορετικών υποπληθυσμών των καρκινικών κυττάρων μέσα λαγόνες των άκρως ανοσοκατασταλτική ζώα (π.χ. ποντίκια NOD /SCID). Επιπλέον, βλαστική ικανότητα (δηλαδή η ικανότητα να αυτο-ανανέωση και να διαφοροποιηθούν) συχνά αξιολογείται

in-vitro από

παρένθετη δοκιμασίες που εξετάζουν την ικανότητα σχηματισμού σφαίρας και κλωνογονικότητας στο Anchorage ανεξάρτητες συνθήκες, όπως ημιστερεές μαλακό άγαρ [ ,,,0],14]. Προηγούμενα πειράματα έδειξαν ότι πολυκύτταρων σφαιροειδών όγκου είναι μορφολογικά και χαρακτηριστικά παρόμοια με συμπαγείς όγκους

in-vivo

[15], [16]. Έχει επίσης αποδειχθεί ότι η σφαίρα που σχηματίζει δυναμικό σε εναιώρημα μη-προσκολλημένα συνθήκες συσχετίζεται με σταθερό νεοπλαστική δυναμικό ανάπτυξης σε ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς [17], [18], [19], [20].

Τόσο

in-vitro

και

in-vivo δοκιμασίες

βλαστική ικανότητα αντιμετωπίσει το ογκογόνο δυναμικό των διακριτών υποπληθυσμού κυττάρων, ενώ η πραγματική σχηματισμό όγκων σε ασθενείς μπορεί να εξαρτάται από άλλους παράγοντες. Το μικροπεριβάλλον του όγκου που μπορεί να είναι ειδική σε θέση και το ανοσοποιητικό σύστημα του ξενιστή που είναι εξασθενημένη σε NOD /SCID ποντίκια μπορούν να μεταβάλλουν την τύχη των καρκινικών κυττάρων και τη συμβολή τους στη νόσο. Ως εκ τούτου, το ερώτημα εάν τα κύτταρα με υψηλό ογκογόνο δυναμικό πραγματικά να συμβάλει στην ανάπτυξη του όγκου σε ασθενείς με ανέπαφο το ανοσοποιητικό σύστημα παραμένει άλυτο

Στην εργασία αυτή προσπάθησε να συγκρίνει δύο φαινόμενα που σχετίζονται με την ανάπτυξη του καρκίνου:. Ογκογόνο δυναμικό και η τύχη των καρκινικών κυττάρων. Για να αντιμετωπισθούν δύο από τους βασικούς περιορισμούς που είναι εγγενείς στην υποδόρια ξενομεταμόσχευση ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων σε ανοσοκατεσταλμένα ποντίκια, δηλαδή το φράγμα των ειδών και τη ρύθμιση της μεταμόσχευσης, χρησιμοποιήσαμε ένα συγγενικό μοντέλο μελανώματος και ορθοτοπική ενδο ενέσεις πελμάτων σε ανοσο-ικανά ζώα.

Υλικά και Μέθοδοι

τηλέφωνα γραμμές

κυτταρικές σειρές μελανώματος ποντίκι (Κ1735 /16 και Κ1735 /Μ4) ήταν ένα δώρο από το εργαστήριο του Δρ Lea Eisenbach (το Weizmann Institute, Rehovot ). Η κυτταρική σειρά Κ1735 /16S προήλθε από την κυτταρική σειρά Κ1735 /16, με καλλιέργεια κυττάρων σε μη προσκολλημένα συνθήκες (βλέπε παρακάτω) για 16 ημέρες. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με MSCM, 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, στους 37 ° C, 5% CO2, εντός υγραινόμενου επωαστήρα. Όλα μέσο συστατικά αγοράστηκαν από την Biological Industries, Israel. Για δοκιμασίες αυτοανανέωσης και ανάπτυξη σφαιροειδή χρησιμοποιήσαμε μελανώματος μέσα άνευ ορού βλαστοκυττάρων (MSCM) που αποτελείτο από τροποποιημένο μέσο /F12, νοκ-άουτ ™ SR Eagle του Dulbecco, 100 mM Ε-γλουταμίνη (Invitrogen), ΜΕΜ μη-απαραίτητα αμινοξέα Λύση 10 mM, 2 μg /ml FGF (Sigma), και αντιβιοτικά. Για τις δοκιμασίες αύξησης σφαίρα χρησιμοποιήσαμε MSCM ρυθμισμένο με εμβρυϊκές ινοβλάστες ποντικού (MEF) CF-1 για 24 ώρες. [21] Επίσης, χρησιμοποιήθηκαν αντιδραστήρια όπως: αζίδιο του νατρίου, παραφορμαλδεΰδη, ξυλόλιο και κιτρικό νάτριο αγοράστηκαν από την Sigma Aldrich, Ισραήλ

Ποντίκια και η

in vivo

Foot Pad Μοντέλο

.

Θηλυκά C3H ποντίκια /HeN και σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (SCID) αγοράστηκαν από την Harlan (Jerusalem, Israel). Όλα τα ποντίκια διατηρήθηκαν στα ζωικά εγκαταστάσεις του Τελ Αβίβ Ιατρικό Κέντρο (Τελ-Αβίβ, Ισραήλ), κάτω από άσηπτες συνθήκες.

Οι μελέτες σε ζώα πραγματοποιήθηκαν σε συμμόρφωση με όλες τις ισχύουσες πολιτικές, διαδικασίες και τις κανονιστικές απαιτήσεις της Θεσμικής Animal Care και Επιτροπή Χρήσης (IACUC), το Ερευνητικό Κέντρο ζώων πόρων (RARC) του Πανεπιστημίου του Τελ Αβίβ και τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (NIH) «Οδηγός για τη Φροντίδα και Χρήση των ζώων Εργαστηρίου». Όλες οι διαδικασίες ζώων πραγματοποιήθηκαν με εισπνοή 2% isoflurane. Μετά τις μελέτες, όλα τα ζώα θυσιάστηκαν με CO

2 εισπνοή.

Ένα μοντέλο συγγενικά μελανώματος πελμάτων διαπιστώθηκε, όπως περιγράφηκε προηγουμένως από Harrell et al. [22]. Εν συντομία, τριάντα, 6-εβδομάδων ποντικοί αναισθητοποιούνται με εισπνεόμενη ισοφλουράνη για όλες τις διαδικασίες. Το αριστερό οπίσθιο πέλμα άκρου αποστειρώθηκε με αλκοόλη και, στη συνέχεια, αργά ένεση με 50 μΙ κυτταρικού εναιωρήματος σε συγκέντρωση 2 × 10

5 κύτταρα /50 μι σε μία περίοδο 2 λεπτών. Οι ποντικοί στη συνέχεια ξύπνησε και στο πέλμα τους παρακολουθούνται για το μέγεθος του όγκου και τα σημάδια του πόνου ή εξέλκωση δύο φορές την εβδομάδα.

Το πείραμα με συγγενή ποντίκια C3H /HeN, επαναλήφθηκαν 3 φορές, και σε κάθε πείραμα ενέσαμε 10- 15 ποντίκια ανά ομάδα. Στα πειράματα με ποντίκια SCID χρησιμοποιήσαμε 6-7 ποντικών ανά ομάδα. Στο πείραμα διαλογής κυττάρων, όπου κάθε ομάδα (5-6 ποντίκια ανά ομάδα) εγχύθηκε με ταξινομημένα CD133 (+), έλεγχος Κ1735 /M4 ή ελέγχου Κ1735 /16 κύτταρα σε συγγενή ποντίκια C3H /HeN.

Ανοσοϊστοχημεία

τα δείγματα από το σημείο της ένεσης κυτταρικών γραμμών μελανώματος λήφθηκαν τις ημέρες 16 και 40, μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη, αφυδατώθηκαν σε αλκοόλη, καθαρίστηκαν σε ξυλόλιο και ενσωματώνονται σε παραφίνη. τομές τεσσάρων μικρομέτρων κηλιδώθηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε) χρησιμοποιώντας καθιερωμένα πρωτόκολλα. Για ανοσοϊστοχημεία, οι τομές ιστού αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο και επανυδατώθηκαν με μειούμενες συγκεντρώσεις αλκοόλης. Η ενδογενής υπεροξείδιο μπλοκαρίστηκε με υπεροξείδιο του υδρογόνου και ανάκτησης αντιγόνου επιτεύχθηκε με τη χρησιμοποίηση 0,01 mol κιτρικού /L νάτριο (ρΗ 6.0) για 1 λεπτό σε μια χύτρα ταχύτητας. Μετά τον αποκλεισμό με τον κατάλληλο φυσιολογικό ορό, τομές ιστών χρωματίστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα ή με το κιτ απόπτωσης Mebstain (δοκιμασία TUNEL) (κωδικός 8445 MBL Woburn, USA). Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ως ακολούθως: πολυκλωνικά κουνελιού αντι-ποντικού /ανθρώπου Κί67 (1:100? Κλώνος ab66155 Abcam Cambridge, UK), ποντικού αντι-ποντικού /ανθρώπου Μέλανα (1:20? Κλώνος ab731 Abcam Cambridge, UK). Το κιτ Vectastain Elite ABC υπεροξειδάσης (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση δευτερεύον αντίσωμα. Οπτικοποίηση έγινε με τη χρήση DAB ως ένα υπόστρωμα (κλώνος ab64238, Abcam Cambridge, UK). Ο παθολογοανατόμος εξέτασε τις διαφάνειες με τυφλό τρόπο

Ανοσοαποτύπωσης

Για την έκφραση της ABCB5 (1:1000? Κλώνος PAB9925, Abnova Taipei City, Ταϊβάν)., Νεστίνη (1:200? Κλώνος mab353 , Chemicon, Billerica, USA) και CD271 /NGFR (1:200? κλώνος sc-8317, Santa Cruz, USA), τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων. Στη συνέχεια, τα κύτταρα απελευθερώθηκαν χωρίς ενζυματική χώνευση στους 4 ° C. Τα κυτταρικά ιζήματα σε επεξεργασία με υπερήχους για 10 δευτερόλεπτα και διαυγάζεται με φυγοκέντρηση. Η συνολική πρωτεΐνη (50 μg) υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση 7.5% πηκτές Τπδ-ΗΟΙ (Bio-Rad, Hercules, CA) και μεταφέρθηκε σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου, μπλοκάρει και εκτίθεται σε πρωτογενές αντίσωμα, που ακολουθείται από ένα δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας. Συγκροτήματα αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ανίχνευσης ECL Plus (Amersham, Piscataway, NJ). Πυκνότητα ποσοτικά με τη χρήση ενός υπολογιστή-ελεγχόμενη κάμερα CCD (AlphaImager Imaging Systems, η Alpha Innotech, San Legndra, CA).

κυτταρομετρίας ροής και ταξινόμηση κυττάρων

Για την ανίχνευση επιφανειακών δεικτών στα κύτταρα του όγκου, του μελανώματος κυτταρικές σειρές θρυψινοποιήθηκαν ή μη ενζυματικά αποσπάστηκαν με EDTA και φυγοκεντρήθηκαν στις 1500 rpm /min για 5 λεπτά. [23] Εν συντομία, τα κύτταρα πλύθηκαν με Ca

2 + -δωρεάν Mg

2 + -δωρεάν αλατούχο φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS), και 4 ml 1 mM EDTA (Sigma Aldrich) προστέθηκε σε κάθε φιάλη . Οι φιάλες επωάστηκαν στους 37 ° C για 5 λεπτά και ανακινήθηκε αργά μέχρι αποκολλήθηκαν κύτταρα. Δέκα χιλιοστόλιτρα ρυθμιστικού PBS στη συνέχεια προστέθηκε σε κάθε φιάλη και τα κύτταρα επιβιβάζονται σε σωλήνες, φυγοκεντρήθηκε και πλύθηκε με Ca

2 + /Mg

2 + -δωρεάν PBS. Ο αριθμός των αποσπασμένων κυττάρων μετρήθηκε με ένα αιμοκυτταρόμετρο (Marienfeld, Γερμανία). Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με παγωμένο 0,5% FBS και 0.02% αζίδιο νατρίου σε PBS και αποκλείστηκαν με ένα διάλυμα 0.5% FBS και 5 μg /ml καθαρισμένου αντι-CD16 /CD32 (BioLegend, San Diego, USA) σε PBS για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολούθως, τα κύτταρα χρωματίστηκαν για APC συζευγμένο αντι-ποντικού-CD133 mAb (κλώνος 13A4, eBioscience, San Diego, USA), ΑΡΟ-επισημασμένο αντι-ποντικού CD117 (κλώνος 2Β8, eBioscience, San Diego, USA), FITC-επισημασμένο αντι- ποντίκι Sca-1α (κλώνος D7, eBioscience, San Diego, USA), CD271 (κλώνος ab8874, Abcam Cambridge, UK) και Goat πολυκλωνικό δευτερεύον αντίσωμα για IgG κουνελιού (κλώνος ab6108, Abcam Cambridge, UK) για 30 λεπτά επί πάγου. Δείγματα στη συνέχεια πλύθηκαν και αναλύθηκαν με BD FACSCanto ™ II (BD Bioscience, USA).

Για την διαλογή χρησιμοποιήσαμε σύστημα MACS® Separation (# 130-090-312, Miltenyl Biotec Inc., USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία: Κ1735 κύτταρα /M4 βάφτηκαν με APC συζευγμένο αντι-ποντικού-CD133 mAb και διαχωρισμός κυττάρου προχώρησε με αντι-APC μικροσφαιρίδια (# 130-090-855, Miltenyl Biotec Inc., USA). Το χώρισμα κύτταρο έγινε δύο φορές με ίδια κύτταρα για να εμπλουτίσει πληθυσμό CD133 θετικού κυττάρου. Μετά το διαχωρισμό των κυττάρων CD133 πληθυσμός θετικές κυτταρικές πλύθηκε με PBS και παρασκευάζονται για ένεση (7.5 × 10

4 κύτταρα /200 μί /ποντικό) ή για επαλήθευση με FACS.

Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού Προσδιορισμός

τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 1000 κύτταρα ανά φρεάτιο με DMEM-MSCM. Μετά από 24, 48 και 72 ώρες, η κυτταρική ανάπτυξη προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την δοκιμασία πολλαπλασιασμού κυττάρου ΧΤΤ Colorimetric (Beit Haemek, Ισραήλ). Τα δείγματα αναλύθηκαν με Spectra MR Dynex (Chantilly, USA).

Soft Agar Δοκιμασία

Κλάσματα των 10

4 κύτταρα μελανώματος επαναιωρήθηκαν σε 1 ml, 0,35% άγαρ σε MSCM. Κλάσματα χύθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων πάνω από ένα 1,5-ml στρώμα 0,5% άγαρ σε MSCM, αφέθηκε να στερεοποιηθεί και επωάστηκαν για 21 ημέρες στους 37 ° C υπό την παρουσία 5% CO2. Τα πιάτα φωτογραφήθηκαν με ένα στερεοσκοπικό σύστημα απεικόνισης (STEREO Lumar.V12. Zeiss, Γερμανία) και ο αριθμός αποικιών ανά 1 /cm

2 εκτιμήθηκε μετά την εξαγορά χρησιμοποιώντας ImagJ (ΝΙΗ, Bethesda, MD), το λογισμικό ανάλυσης εικόνας.

Αξιολόγηση των όγκων σφαιροειδούς Σχηματισμός και αυτο-ανανέωση Analysis

2 ml κατώτερο στρώμα άγαρ παρασκευάστηκε με επαναιώρηση 0.5% άγαρ με MSCM, το οποίο στη συνέχεια αφέθηκε να στερεοποιηθεί σε τρυβλία 6 φρεατίων. Κλάσματα των 3 × 10

4 κύτταρα μελανώματος σε MSCM απλώθηκαν σε συνθήκες εναιώρημα σε μαλακό στρώμα άγαρ και επωάζονται για 2-16 ημέρες στους 37 ° C, υπό την παρουσία 5% CO

2 πριν από την ανάλυση.

Σφαίρα ανάλυση περιοριστικής αραίωσης (SLDA) πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως. [24] Εν συντομία, σφαίρες συλλέχθηκαν μετά από 14 ημέρες διατηρούνται σε συνθήκες εναιώρημα σε 6 φρεάτια πλακών, που χωρίζονται με θρυψίνη και απλώθηκαν και πάλι σε μη προσκολλημένα συνθήκες MSCM χρησιμοποιώντας δείγματα αραίωση: 1000, 300, 100, 50, 10 κύτταρα /96 -wells πλάκα. Δεκατέσσερις ημέρες αργότερα, ο αριθμός των πηγαδιών χωρίς σχηματισμό σφαίρα ποσοτικοποιήθηκε και τα δεδομένα μετασχηματίστηκαν καταγραφής και συναρτήσει της πυκνότητας επιμετάλλωσης. Μια γραμμική παλινδρόμηση χρησιμοποιήθηκε για να υπολογιστεί η συχνότητα των κυττάρων που είναι ικανά να πολλαπλασιάζονται για να σχηματίσουν ένα σφαίρα μελανώματος.

Ποσοτική αντίστροφη μεταγραφή-ΡΟΚ

Ολικό RNA εκχυλίσθηκε από κυτταρικές σειρές μελανώματος ποντικού χρησιμοποιώντας ένα RNeasy Mini Kit (Qiagen, Κάτω Χώρες), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Καθαρισμένο RNA μετρήθηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας ένα NanoDrop® ND-1000 φασματοφωτόμετρο (NanoDrop Technologies Inc., USA). cDNA συντέθηκε από 200 ng ολικού RNA, με τη χρήση του cDNA VersoTM Kit (Thermo Scientific, Epsom, UK) και τυχαία εξαμερή. ενίσχυση cDNA με PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το Platinum® SYBR® Πράσινο qPCR SuperMix-UDG με ROX (Invitrogen Corporation, Grand Island, ΝΥ USA) σε ένα βήμα One Plus σύστημα Real Time PCR (Applied Biosystems) με ζεύγη ολιγονουκλεοτιδίων ειδικού γονιδίου (Sigma Aldrich, Ισραήλ). Κάθε γονίδιο ελέγχθηκε με τρία διάφορα ζεύγη εκκινητών, που αναφέρονται στον Πίνακα S1. Για να εξασφαλιστεί η εξειδίκευση των συνθηκών αντίδρασης, στο τέλος των επιμέρους διαδρομών, η θερμοκρασία τήξης (Tm) των ενισχυμένων προϊόντων μετρήθηκε για να επιβεβαιωθεί η ομοιογένεια της. Οι συνθήκες κύκλων είχαν ως εξής: 50 ° C για 2 λεπτά, 95 ° C για 2 λεπτά, 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα και 60 ° C για 30 δευτερόλεπτα για ένα σύνολο 40 κύκλων. Κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό, πρότυπες καμπύλες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας σειριακά αραιωμένο cDNA ενισχύθηκαν με την ίδια PCR πραγματικού χρόνου λειτουργίας. Τα αποτελέσματα ομαλοποιήθηκαν στα επίπεδα ACTB και mRNA 18S. Η μέθοδος 2-ΔΔCT εφαρμόστηκε για την ανάλυση των σχετικών μεταβολών στην έκφραση γονιδίου. Μετά τη διαδικασία ποσοτικοποίησης, τα προϊόντα αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 2,5% για να επιβεβαιωθεί ότι η αντίδραση είχε ενισχυμένα τμήματα DNA του αναμενόμενου μεγέθους.

Στατιστική Ανάλυση

Φοιτητής

t

δοκιμών ή αναλύσεων μεταξύ των ομάδων (ANOVA) χρησιμοποιήθηκαν για στατιστική ανάλυση όπως ενδείκνυται. Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές σε

P

& lt? 0,05. Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν εις τριπλούν. Τα δεδομένα από αντιπροσωπευτικά πειράματα φαίνονται.

In vivo πειράματα

αποτελούνταν από 10-15 ποντίκια σε κάθε πειραματική ομάδα.

Αποτελέσματα

Για να αξιολογεί τη συσχέτιση μεταξύ των καρκινικών κυττάρων δυναμικό αυτο-ανανέωση και την κυτταρική μοίρα, εμείς επιλεγμένα κύτταρα ποντικού μελανώματος, τα οποία προήλθαν από την ίδια γονική κυτταρική γραμμή, αλλά οι οποίες έχουν διαφορετικούς φαινοτύπους

in-vivo

και

in-vitro

. Η κυτταρική σειρά μελανώματος ποντικών γραμμή Κ1735 έχει χρησιμοποιηθεί εκτεταμένα για τη μελέτη του μελανώματος [25]. Αυτή η κυτταρική γραμμή, η οποία έχει μια χαμηλή τάση να σχηματίσουν μεταστάσεις, προκλήθηκε σε ποντικούς C3H /HeN από χρόνια έκθεση σε υπεριώδη ακτινοβολία Β. Για τη μελέτη μας, έχουμε επιλέξει τρεις κυτταρικές γραμμές, οι οποίες προέρχονται από αυτή την πατρική κυτταρική γραμμή, αλλά οι οποίες διέφεραν σημαντικά σε ογκογόνο δυναμικό, σχηματισμού σφαίρας ικανότητα και κλωνογονικότητας [26] τους, [27], [28]. Το Κ1735 /16 είναι ένα μη-μεταστατική κυτταρική γραμμή και η κυτταρική γραμμή Κ1735 /Μ4 προήλθε από ένα μετάσταση πνεύμονα και έχει υψηλό μεταστατικό δυναμικό. Μια τρίτη κυτταρική γραμμή, Κ1735 /16S, προήλθε από την κυτταρική σειρά Κ1735 /16 από τη διατήρηση των κυττάρων σε εναιώρημα μη-προσκολλημένα συνθήκες για 16 ημέρες. Και οι τρεις κυτταρικές γραμμές παρουσίασαν παρόμοια κινητική πολλαπλασιασμού όταν αναπτύσσονται σε πλάκες καλλιέργειας (Εικ. 1Α).

(Α) ρυθμό πολλαπλασιασμού σε πλάκες καλλιέργειας αγωγή προσδιορίστηκε μετά από 96 ώρες με τη χρήση της ανιχνεύσεως ΧΤΤ. Τα δεδομένα είναι ο μέσος όρος ± SD από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. (Β) Μέσος αριθμός αποικίες που αναπτύχθηκαν σε μαλακό άγαρ μετά από 21 ημέρες σε καλλιέργεια. Τα δεδομένα είναι ο μέσος όρος ± SD πέντε πεδία υψηλής ισχύος (P & lt? 0.001). (C) Εκπρόσωπος μικροσκοπικές εικόνες από σφαιροειδή όγκου 21 ημέρες μετά τον εμβολιασμό. (D) Αντιπροσωπευτική μικροσκοπικές εικόνες των σφαιροειδών όγκου, 6 ημέρες μετά την επίστρωση σε μη-προσκολλημένα συνθήκες.

Η

αποικίας μαλακού άγαρ και σφαιροειδή Σχηματισμός Πιθανές

Tumor κύτταρα αναπτύσσονται σε τρισδιάστατο πολυκύτταρους τα σφαιροειδή θεωρείται από πολλούς ένα αξιόπιστο

in-vitro

μοντέλο που αναπαράγει μερικά από τα πολύπλοκα χαρακτηριστικά των στερεών όγκων [29]. Επιδιώξαμε πρώτος που χαρακτηρίζουν την κλωνογενοποιήσεως και σχηματισμού σφαίρας ικανότητα των τριών κυτταρικών σειρών Κ1735 /16, Κ1735 /16S και Κ1735 /M4 στο μαλακό άγαρ. Η κυτταρική σειρά Κ1735 /16 καλλιεργούνται στο μαλακό άγαρ απέτυχε να σχηματίσει αποικίες μετά από 21 ημέρες στην καλλιέργεια (σχ. 1Β και C). Από την άλλη πλευρά, τόσο η μεταστατική Κ1735 /M4 κυτταρική γραμμή και η κυτταρική γραμμή Κ1735 /16S είχε εξέχουσα ικανότητα σχηματισμού αποικιών (Σχ. 1Β και 1Γ). Είμαστε δίπλα εξέτασε κατά πόσον η ίδια η φαινοτυπική ετερογένεια διατηρείται σε αιώρηση μη-προσκολλημένα συνθήκες, η οποία θεωρείται από πολλούς ως η πλησιέστερη προσέγγιση του

in-vivo

ογκογονικότητα μεταξύ των in-vitro δοκιμές [30], [31 ], [32], [33], [34]. Η σφαίρα ικανότητα σχηματισμού αξιολογήθηκε 6 ημέρες μετά τον εμβολιασμό με MSCM. Ένα φαίνεται στο σχήμα 1ϋ, το Κ1735 /Μ4 και Κ1735 /16S κυτταρικές γραμμές έδειξαν μία εξέχουσα ικανότητα σχηματισμού σφαίρας, ενώ η κυτταρική σειρά Κ1735 /16 απέτυχαν να αναπτυχθούν σε αυτές τις συνθήκες στρες. Ωστόσο, όταν Κ1735 /16 κύτταρα διατηρούνται σε αυτές τις συνθήκες για 16-20 ημέρες, μερικά σφαιροειδή μπορούσε να ανιχνευθεί σε ορισμένες από τις πλάκες.

βλαστική ικανότητα Δυνητικές

Για να αξιολογηθεί η αυτο-ανανέωση δυναμικό των τριών κυτταρικών γραμμών, πραγματοποιήσαμε μια σειρά δοκιμασιών αραίωσης με τη χρησιμοποίηση του SLDA σε μέσα χωρίς ορό, που κατευθύνεται για την εξέταση της ικανότητας μίας περιοριστική ανάλυση αραίωσης των κυττάρων μελανώματος για να σχηματίσουν σφαιροειδή σε μη προσκολλημένα συνθήκες και καθιέρωσε μια συχνότητα ανάλυση του σχηματισμού σφαίρας μελανώματος. [24], [35], [36] Και οι τρεις κυτταρικές γραμμές είχε ένα παρόμοιο δυναμικό πολλαπλασιασμού όταν απλώνονται επί πλακών καλλιέργειας 96-πηγαδιών σε κανονικές συνθήκες (Εικ. 2Α). Σε αντίθεση, το δυναμικό αυτο-ανανέωσης σε μέσα χωρίς ορό της μη μεταστατικό κυτταρική γραμμή, Κ1735 /16, διέφερε σημαντικά από τις άλλες δύο κυτταρικές σειρές. SLDA πραγματοποιείται μετά τη δεύτερη επανασπορά αποκάλυψε ότι η συχνότητα των κυττάρων που είναι ικανά αυτο ανανέωση ήταν 1/216 για την κυτταρική σειρά Κ1735 /Μ4, 1/296 για την /κυτταρική σειρά 16S Κ1735 και 1/36733 για την K1735-16 κυτταρικής γραμμής με MSCM (Εικ. 2). Επιπλέον, K1735-16 κύτταρα δεν ήταν ικανά να σχηματίσουν τομείς στους adeherent συνθήκες, ενώ Κ1735 /κυττάρων M4 σχηματίζεται αυτόματα sphares σε μέσα άνευ ορού.

SLDA πραγματοποιείται μετά τη δεύτερη επανασπορά με MSCM αποκάλυψε ότι η συχνότητα του κύτταρα ικανά αυτο ανανέωση ήταν Α 1/216 για την κυτταρική γραμμή Κ1735 /M4, Β 1/296 για την κυτταρική γραμμή Κ1735 /16S και Γ 1/74720 για την K1735-16 κυτταρική γραμμή. Το σημείο τομής του log (37% αρνητικά φρεάτια) χρησιμοποιήθηκε για να υπολογίσει τη συχνότητα σχηματισμού σφαίρας (βλέπε υλικά και μέθοδοι).

Η

Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν μια φαινοτυπική ετερογένεια των μεμονωμένων κυττάρων μελανώματος ποντικού, τα οποία προέρχονται από την ίδια γονική κυτταρική γραμμή. Το δυναμικό αυτο-ανανέωση στο αιώρημα μη προσκολλημένα δοκιμασία είναι συγκρίσιμη με την ικανότητα σχηματισμού σφαίρας και κλωνογονικότητας στην δοκιμασία μαλακού άγαρ.

ογκογόνο δυναμικό σε ποντίκια SCID

επόμενο επιδιώξαμε να αξιολογήσει ο ογκογόνο δυναμικό των τριών κυτταρικών γραμμών σε ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς χρησιμοποιώντας ορθοτοπική ενδο ενέσεις πατούσα. Αυτό αξιολογήθηκε με ένεση 2 χ 10

5 πρόσφατα διαχωρισθεί Κ1735 /16, Κ1735 /Μ4 και Κ1735 /16S καρκινικά κύτταρα μέσα στο πέλμα ποντικών SCID. Ψηλαφητούς όγκους ήταν εμφανείς σε όλα τα ποντίκια μέσα σε 20 ημέρες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, η μεταστατική κυτταρική γραμμή, Κ1735 /Μ4, παρουσίασαν τις υψηλότερες κινητική ανάπτυξη, που ακολουθείται από την Κ1735 /κυτταρική σειρά 16S, ενώ η μη μεταστατικό /μη-colonogenic 1735-1716 κυτταρική γραμμή είχε τη χαμηλότερη αυξανόμενες δυνατότητες των όγκων (n = 6-7 ποντικοί ανά ομάδα,

P

& lt? 0.001). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η δυνατότητα αυτο-ανανέωση

in-vitro

μπορεί να προβλέψει το

in-vivo

ογκογόνο δυναμικό σε SCID ποντίκια.

κυτταρικές σειρές μελανώματος (Α) (2 × 10

5) εγχύθηκε στο πέλμα των ποντικών SCID. Η κυτταρική σειρά Κ1735 /M4 έδειξε τα υψηλότερα κινητική της ανάπτυξης του όγκου, ακολουθούμενη από την κυτταρική γραμμή Κ1735 /16S. Η κυτταρική σειρά Κ1735 /16 είχε την πιο αργή ανάπτυξη του όγκου (n = 5-6 ανά ομάδα, Ρ & lt? 0.001). (Β) Η ίδια συγκέντρωση κυττάρων εγχέεται στο πατούσα συγγενών ποντικών C3H /HeN. Αυτή τη φορά, η Κ1735 /Μ4 και Κ1735 /16S έδειξε ελάχιστη ογκογόνο δυναμικό, ενώ η κυτταρική γραμμή Κ1735 /16S είχε το υψηλότερο όγκο kinetc ανάπτυξης (πειράματα που διεξήχθησαν 3 συνεχόμενες φορές με n = 10-15 ζώα ανά ομάδα? P & lt? 0.001 μεταξύ της Κ1735 /16 και η Κ1735 /Μ4 ή ο Κ1735 /16S κυτταρικές γραμμές). (C) Αντιπροσωπευτική ιστολογικά χαρακτηριστικά των όγκων που αναπτύσσονται σε ανοσο-ικανά ζώα, 16 ημέρες μετά την εμφύτευση. (D) Ανοσοϊστοχημική ανάλυση με αντι-Ki-67 Ab (δείκτης πολλαπλασιασμού) παρουσιάζει παρόμοια έκφραση στις τρεις κυτταρικές σειρές. (Ε) Η ανοσοϊστοχημική χρώση με αντι-Melan Α Ab (δείκτης μελάνωμα) έδειξαν θετική έκφραση σε όλους τους όγκους, αλλά όχι σε γειτονικό φυσιολογικό ιστό.

Η

ογκογόνο δυναμικό σε ανοσο-ικανά ποντίκια

στη συνέχεια, θέλαμε να αξιολογηθεί κατά πόσον η ογκογόνο δυναμικό των τριών κυτταρικών σειρών, όπως αποκαλύπτεται από τα δύο

in-vivo

και

in-vitro

δοκιμασίες που περιγράφονται παραπάνω, μπορεί να προβλέψει την πραγματική τύχη των καρκινικών κυττάρων σε ανοσο-ικανά ζώα. Αυτή η ερώτηση μπορεί να αντιμετωπιστεί μόνο σε συγγενικά μοντέλα ποντίκι που μπορεί να αντανακλά την αντικαρκινική ανοσολογική αντίδραση και την ανταπόκριση μικροπεριβάλλον. Ως εκ τούτου, επαναλάβαμε τις ενδοκοινοτικές ενέσεις πατούσα προηγουμένως πραγματοποιήθηκε σε ποντίκια SCID, αλλά αυτή τη φορά χρησιμοποιώντας συγγενικά C3H ποντίκια /HeN.

Προς έκπληξή μας, η μοίρα των καρκινικών κυττάρων στο συγγενές πρότυπο ήταν ακριβώς το αντίθετο από αυτό που περιγράφηκε προηγουμένως σε SCID ποντίκια. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β, Κ1735 /16 κύτταρα εγχέεται στο εσωτερικό πέλμα C3H /HeN ποντίκια έδειξαν την υψηλότερη κινητική ανάπτυξη του καρκίνου, ενώ μόνο μικρό αριθμό ζώων ανέπτυξαν όγκους μετά την ένεση του Κ1735 /Μ4 ή Κ1735 /16S κυτταρική γραμμή (πειράματα εκτελούνται 3 φορές με η = 10-15 ποντίκια ανά ομάδα,

P

& lt? 0.001). Η ιστολογική ανάλυση των όγκων με Η &? Ε, και ανοσοϊστοχημική χρώση με αντι-Κί67 Ab (δείκτης πολλαπλασιασμού) ή αντι-Melan-A Ab (δείκτης μελάνωμα) αποκάλυψε παρόμοια έκφραση αυτών των πρωτεϊνών από τους τρεις όγκους γραμμή που προέρχεται από καρκινικό κύτταρο ( Σχ. 3D-E). Περαιτέρω αναλύσεις της ενιαίας όγκων αποκάλυψε ότι όλοι οι ποντικοί εγχύθηκαν στο πέλμα του συγγενικό C3H /HeN με την κυτταρική σειρά Κ1735 /16 εμφάνισε μακροσκοπικές όγκους 30-100 ημέρες μετά την ένεση (Σχ. 4Α). Αντίθετα, μερικά ποντίκια που ενέθηκαν με το Κ1735 /16S κυτταρικές σειρές πράγματι αναπτύχθηκαν μικροί όγκοι 40 ημέρες μετά την ένεση Κ1735 /M4 ή, αλλά αυτοί οι όγκοι υποχώρησαν αυθόρμητα στο 90-100% των ποντικών εντός 80 ημερών από το πείραμα ξεκίνησε (Σχ. 4Β και C).

(Α-Γ) Οι γραφικές παραστάσεις δείχνουν τις καμπύλες ανάπτυξης όγκου και των τριών κυτταρικών γραμμών σε συγγενικά ποντίκια, 1-100 ημέρες μετά την ένεση των 2 × 10

5 κύτταρα. Κάθε γράφημα παρουσιάζει την ανάπτυξη του όγκου σε επιμέρους ζώων (η = 5 ανά ομάδα).

Η

Αυθόρμητη υποχώρηση του όγκου στην Κ1735 /16S κυτταρικές σειρές Κ1735 /Μ4 και μπορεί να οφείλεται σε κύτταρα που υφίστανται απόπτωση ημέρες μετά την εμφύτευση ή κύτταρα που παραμένουν αδρανείς για μεγάλο χρονικό διάστημα. Συνεπώς εξετάσαμε τον αριθμό των αποπτωτικών κυττάρων σε αυτούς τους όγκους 40 ημέρες μετά την ένεση σε πέλματα ποντικών C3H /HeN. TUNEL ανάλυση απόπτωσης αποκάλυψε σημαντικά υψηλότερους αριθμούς αποπτωτικών κυττάρων σε όγκους γραμμή που προέρχεται από Κ1735 /16S και Κ1735 /Μ4 κύτταρο, σε σύγκριση με εκείνη σε Κ1735 /16-προερχόμενο όγκους (Εικ. 5). Αυτό το εύρημα υποδεικνύει ότι η ογκογόνο δυναμικό του μελανώματος είναι ειδικό προσδιορισμό και ότι το

in-vivo

φαινοτυπική ετερογένεια των διαφόρων υποπληθυσμών των κυττάρων σε φυσιολογικά ζώα δεν μπορούν να προβλεφθούν μόνο από το δυναμικό βλαστική ικανότητα του.

Η απόπτωση εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία TUNEL. (Α-Γ) Αντιπροσωπευτική μικροσκοπική εικόνες (μεγέθυνση Χ20) του FITC-θετικών αποπτωτικά κύτταρα όγκου (πράσινο) και μετρητής χρώση με ιωδιούχο προπίδιο (ερυθρό). (D) Ποσοστό αποπτωτικών κυττάρων ποσοτικοποιήθηκε με τον μέσο αριθμό των ΡΙΤΟ-θετικών κυττάρων σε 6 μικροσκοπικά πεδία υψηλής ισχύος. Τα δεδομένα εκφράζονται ως η μέση + SD (η = 6 όγκους, Ρ & lt? 0.001). ανάλυση TUNEL αποκάλυψε ότι ο αριθμός των αποπτωτικών κυττάρων σε όγκους γραμμή που προέρχεται από Κ1735 /16 κυττάρων ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ό, τι σε Κ1735 /16S και Κ1735 /Μ4 κυτταρικές σειρές που προέρχονται από όγκους.

Η

Έκφραση Προφίλ Βλαστικών Κυττάρων Markers

Τα στοιχεία δείχνουν ότι ογκογόνα κύτταρα μπορούν να διακριθούν από τα μη ογκογόνα κύτταρα με βάση την έκφραση ειδικών δεικτών. Συνεπώς εξετάσαμε την ικανότητα των αναφερθέντων βλαστικών κυττάρων δεικτών για την πρόβλεψη της κλινικής φαινότυπο των τριών κυτταρικών γραμμών μελανώματος. Είχε προηγουμένως δειχθεί ότι το c-Kit, δοκιμασίες έκφρασης CD133 και CD271 μπορεί να διακρίνει ογκογόνα από μη ογκογόνα κύτταρα μελανώματος [13], [37], [38], [39]. Διερευνήσαμε επίσης την έκφραση του Sca-1α, που φάνηκε να σχετίζεται με ογκογόνο δυναμικό σε μαστού, του προστάτη και των πνευμόνων καρκίνων [13], [37], [38], [39]. Συνεπώς εξετάσαμε την έκφραση αυτών των δεικτών με κυτταρομετρία ροής σε όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές. Τα κύτταρα αποκολλήθηκαν χρησιμοποιώντας θρυψίνη διάσπασης ή σε ενζυματική χωρίς συνθήκες χρησιμοποιώντας EDTA. Το σχήμα 6-θρυψίνη κατεργασμένα κύτταρα και κύτταρα επεξεργασμένα Σχήμα S1-EDTA δείχνει ότι το c-Kit, CD133 και CD271 θετικά κύτταρα ανιχνεύθηκαν μόνο σε μειοψηφία των κυττάρων. Σε αντίθεση, Sca-1α έκφραση βρέθηκε σε & gt? 50% των 16 κυττάρων Κ1735 /, αλλά όχι στις άλλες κυτταρικές σειρές. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώθηκαν με ποσοτική RT-PCR αναλύσεις.

Η έκφραση των δεικτών των βλαστικών κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας αντι- Sca-1α, c-Kit, CD133 και CD271 Abs. Σε αντίθεση με τις άλλες δείκτες, SCA-1α εκφράστηκε σε & gt? 50% των κυττάρων στην κυτταρική σειρά Κ1735 /16, αλλά όχι στις άλλες κυτταρικές σειρές. Τα αποτελέσματα είναι από ένα από τα τρία αντιπροσωπευτικά πειράματα. Το ποσοστό των θετικών κυττάρων και των δεικτών φαίνονται στην επάνω δεξιά γωνία. Β16 κύτταρα μελανώματος ποντικιού, του μυελού των οστών (ΒΜ) ή κύτταρα του εγκεφάλου (BC) χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί έλεγχοι.

Η

Θα επιδιωχθεί περαιτέρω για τον εντοπισμό άλλων δεικτών CSC εκφράζονται από κύτταρα μελανώματος τα οποία μπορεί να προβλέψει ογκογόνο φαινότυπο τους. Έτσι, διαλογή άλλα 16 δείκτες δειχθεί προηγουμένως να εκφράζονται σε ΚΕΠ [12], [13], [21], [40], [41], [42], [43], [44], [45], [46], [47]. Χρησιμοποιώντας ποσοτική ανάλυση RT-PCR ήμασταν σε θέση να ανιχνεύσει υψηλότερη έκφραση της ABCG2, ABCB5, CD20, CD24, CD34, CD44, CD166, Oct4, Cripto-1, CD-90, Gli1 ή Sox2 σε οποιοδήποτε από τα Κ1735 /M4, Κ1735 /16S και /16 κυτταρικές γραμμές Κ1735 (Εικ. 7). Επιβεβαιώσαμε τα αποτελέσματα αυτά σε ορισμένες από τις δεικτών με κηλίδα Western (Εικ. 8). Είναι ενδιαφέρον, τους τρεις δείκτες Nanog, ALDH3A1 και νεστίνη, εκφράστηκαν στην κυτταρική σειρά Κ1735 /16, αλλά όχι στην κυτταρική σειρά κόρη του Κ1735 /16S ή στο μεταστατικό Κ1735 /κυτταρική σειρά Μ4. Συνολικά, έχουμε διαλογή 19 διαφορετικών δεικτών που είχαν προηγουμένως προταθεί ότι σχετίζεται με την ογκογόνο δυναμικό των καρκινικών κυττάρων, και σε όλα αυτά, οι εξαιρετικά ογκογόνων κυτταρικών γραμμών Κ1735 /Μ4 και Κ1735 /16S είχαν παρόμοια ή χαμηλότερη έκφραση σε σύγκριση με την χαμηλής ογκογόνο κυτταρική γραμμή.

Σχετική έκφραση της 15ης δεικτών προηγουμένως προταθεί για χρήση για την πρόβλεψη του δυναμικού αυτοανανέωσης των καρκινικών κυττάρων. ALDH3A1, Nanog και νεστίνη εκφράζονται ως επί το πλείστον στην κυτταρική γραμμή Κ1735 /16, αλλά όχι στις κυτταρικές γραμμές Κ1735 /Κ1735 M4 /16S και. Άλλοι δείκτες αρχέγονων κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων SOX2 δεν δείχνουν οποιαδήποτε διαφορική έκφραση μεταξύ των τριών κυτταρικών γραμμών. Τα δεδομένα είναι ο μέσος όρος ± SD από τρία διαφορετικά πειράματα. κύτταρα Φρέσκο ​​διαχωρίστηκαν μυελού των οστών και του εγκεφάλου χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί έλεγχοι (δεξιά στήλη).

Η

Αυτοί οι δείκτες είχαν προηγουμένως προταθεί για χρήση για την πρόβλεψη του δυναμικού μελανώματος αυτο-ανανέωση. ΗΤΒ-72 ανθρώπινη κυτταρική γραμμή μελανώματος ποντικού και αστροκύτταρα (AST) χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί έλεγχοι. Σημειώστε ότι ο μόνος δείκτης που εκφράστηκε από τις κυτταρικές σειρές ποντικού μελανώματος ήταν Nestine, η οποία εκφράστηκε στην κυτταρική σειρά μη μεταστατικό (Κ1735 /16).

Η

Τέλος, επιδιώξαμε να επιβεβαιώσει τα αποτελέσματά μας από κλωνική διαλογή κυττάρων στο επίπεδο του ενός κυττάρου. Αυτή η δοκιμασία που κατευθύνεται για να καθοριστεί κατά πόσον τα επιμέρους πληθυσμούς Κ1735 /Μ4 μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένη κλωνογονικότητας και αυτο-ανανέωση.