Αφηρημένο

Micro (mi) RNAs είναι σημαντικοί ρυθμιστές εμπλέκονται σε διάφορες φυσικές και παθολογικές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου. Η οικογένεια miRNA-302 έχει τεκμηριωθεί ότι παίζουν κρίσιμο ρόλο στην καρκινογένεση. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε ο ρόλος των miRNA-302A στον καρκίνο του προστάτη (PCA). έκφραση miRNA-302A ανιχνεύθηκε σε 44 ιστούς του προστάτη και 10 φυσιολογικούς ιστούς του προστάτη, και κλινικοπαθολογοανατομικές σημασία τους αναλύθηκε. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων και η ανάλυση του κυτταρικού κύκλου πραγματοποιήθηκαν σε κύτταρα του προστάτη που εκφράζουν σταθερά miRNA-302A. Το γονίδιο στόχος των miRNA-302A και κατάντη της οδού ερευνήθηκαν περαιτέρω. Σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς του προστάτη, η έκφραση miRNA-302A ήταν προς τα κάτω σε ιστούς του προστάτη, και ήταν ακόμα χαμηλότερο σε προστάτη ιστούς με σκορ Gleason ≥8. Η υπερέκφραση του miRNA-302A που επάγεται G1 /S διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα PCa, και κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του προστάτη τόσο in vitro όσο και in vivo. Επίσης, αναστέλλει miRNA-302A

ΑΚΤ

έκφραση με απευθείας σύνδεση με 3 αμετάφραστη περιοχή του, με αποτέλεσμα μεταγενέστερες τροποποιήσεις του

ΑΚΤ-ΟδΚ3β-κυκλίνης D1

και

ΑΚΤ-p27

Kip1

οδού. Τα αποτελέσματα αυτά αποκαλύπτουν miRNA-302A ως καταστολέας των όγκων σε προστάτη, γεγονός που υποδηλώνει ότι miRNA-302A μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως πιθανός στόχος για θεραπευτική παρέμβαση σε προστάτη

Παράθεση:. Zhang GM, Bao CY, Wan FN, Cao DL , Qin XJ, Zhang HL, et al. (2015) microRNA-302a Καταστέλλει Tumor τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό ανασταλτικός

ΑΚΤ

στον καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 10 (4): e0124410. doi: 10.1371 /journal.pone.0124410

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Jun Li, η Sun Yat-sen University Medical School, ΚΙΝΑ

Ελήφθη: 21 του Οκτωβρίου του 2014? Αποδεκτές: 13 Μαρτίου, 2015? Δημοσιεύθηκε: 29, Απρ, 2015

Copyright: © 2015 Zhang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Grant Νο NSFC 81202003) (https://www.nsfc.gov.cn . /) και Επιστημών Ίδρυμα της Σαγκάης Δημοτική Επιτροπή Υγείας και Οικογενειακού Προγραμματισμού (Grant Νο 2010145) (https://www.wsjsw.gov.cn/wsj/) με το GHS

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

Καθώς η πιο διαδεδομένη κακοήθεια στους άνδρες στις ανεπτυγμένες χώρες [1], ο καρκίνος του προστάτη (PCA) δείχνει επίσης μια σταθερή αύξηση στη συχνότητα εμφάνισης στην Κίνα τις τελευταίες δεκαετίες. Σύμφωνα με την Ετήσια Έκθεση κινεζική Αρχείο Καρκίνου (2012), του προστάτη έχει γίνει η έκτη πιο κοινή μορφή καρκίνου και η ένατη κύρια αιτία θνησιμότητας σχετίζονται με τον καρκίνο στους άνδρες, ειδικά σε [2] αστικές περιοχές. Επιπλέον, έως και 70% των ασθενών με προστάτη έχουν μεταστάσεις κατά τη στιγμή της διάγνωσης, με αποτέλεσμα δραματικά μειωμένη μακροπρόθεσμη επιβίωση [3]. Ως εκ τούτου, είναι επιτακτική ανάγκη να διερευνήσει τους μηχανισμούς με τους οποίους ξεκινούν την παραγωγή και την εξέλιξη του προστάτη.

Growing στοιχεία δείχνουν ότι η microRNAs (miRNAs), ένα είδος ενδογενών, μικρά RNAs μη κωδικοποιητική, συμμετέχουν σε διάφορες κυτταρικές διαδικασίες. Μέσω δεσμεύονται ειδικά και διάσπαση mRNAs ή αναστέλλοντας την μετάφρασή τους [4,5], η λειτουργία miRNAs είτε ως ογκογονίδια ή καταστολείς όγκων [6]. Η οικογένεια miRNA-302 εντοπίστηκε για πρώτη φορά σε ανθρώπινα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα (βλαστοκύτταρα) και τα κύτταρα ανθρώπινα εμβρυϊκά καρκινώματος το 2004. Από τότε, διάφορες μελέτες για την οικογένεια miRNA-302 έχουν επικεντρωθεί σε πιθανό ρόλο της στην reprograming σωματικά κύτταρα σε βλαστικά κύτταρα που προκαλείται από πολυδύναμα , καθώς και τα εμβρυϊκά αυτο-ανανέωση [7]. Διάφοροι παράγοντες μεταγραφής που εκφράζονται νωρίς στην ανάπτυξη του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων και τη συντήρηση, όπως

Oct4

,

Sox2

, και

Nanog

, βρέθηκαν απαραίτητα για την μεταγραφική ρύθμιση του η οικογένεια miRNA-302 [8]. Είναι ενδιαφέρον, Fareh et al. έδειξαν ότι σταθερή έκφραση των miRNA-302 ήταν σε θέση να προκαλέσουν απώλεια

Oct4

,

Sox1

, και

Nanog

[9]. Ο ρόλος των miRNA-302 στην ογκογένεση έχει συζητηθεί πρόσφατα, όπως έχουν αντικρουόμενα συμπεράσματα έχουν συνταχθεί από διαφορετικές ερευνητικές ομάδες. Για παράδειγμα, ενδογενείς miRNA-302 δεν ανιχνεύθηκε σε τραχήλου καρκινικά κύτταρα, και η εκτοπική έκφραση του miRNA-302 ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και το σχηματισμό όγκων [10]. Σε αντίθεση, η διαμόλυνση του miRNA-302b σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου ως αποτέλεσμα μια αυξημένη ικανότητα για αποικίας σχηματισμό, εισβολή, και τη μετανάστευση in vitro [11]. Ωστόσο, μέχρι σήμερα, λίγες μελέτες έχουν διεξαχθεί για να διερευνηθεί ο πιθανός ρόλος των miRNA-302 στη ΣΕΣΣ.

Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι, σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς του προστάτη, του προστάτη ιστούς εκφράζεται κάτω miRNA-302A επίπεδα, και η έκφραση των miRNAs-302A συσχετίστηκε αντίστροφα με σκορ Gleason (GS). Δείχνουμε επίσης ότι η υπερέκφραση του miRNA-302A σε κύτταρα προστάτη μπορούν να επάγουν αναστολή του κυτταρικού κύκλου και αναστέλλουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό in vitro και όγκων σχηματισμό in vivo. Επιπλέον, εντοπίσαμε

ΑΚΤ

ως ένα γονίδιο-στόχο μέσω του οποίου miRNA-302A ασκεί ανασταλτικό ρόλο της στην ΣΕΣΣ.

Υλικά και Μέθοδοι

Τα δείγματα ασθενών

προστάτη ιστού και καλοήθη ιστό του προστάτη ελήφθησαν από την τράπεζα ιστών στο Πανεπιστήμιο Fudan της Σαγκάης Κέντρο Καρκίνου. Κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά αυτών των ασθενών είχαν ανακτηθεί από τη βάση δεδομένων του Τμήματος Ουρολογίας. Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Θεσμικών Έρευνας κριτική στο Πανεπιστήμιο Fudan της Σαγκάης Κέντρο Καρκίνου και υπέγραψε συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους συμμετέχοντες στη μελέτη.

Κυτταρική καλλιέργεια

κυτταρικές σειρές ανθρώπινου προστάτη, ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα 293Τ (ΗΕΚ293Τ) και φυσιολογικό προστάτη επιθηλιακά κύτταρα (RWPE-1) αγοράστηκαν από το Ινστιτούτο Κυτταρικής Ερευνών της κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών (Σαγκάη, Λαϊκή Δημοκρατία της Κίνας). LNCaP και 22Rv1, PC-3, DU145, και τα κύτταρα ΗΕΚ293Τ αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640, μέσο F-12K, μέσο ΜΕΜ, και μέσο DMEM, αντίστοιχα, όλα συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου. κύτταρα RWPE-1 αναπτύχθηκαν σε μέσο Κ-SFM συμπληρωμένο με εκχύλισμα βόειας υπόφυσης και ανθρώπινο ανασυνδυασμένο επιδερμικό αυξητικό παράγοντα. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2.

RNA, εκχύλιση miRNA, και ποσοτική πραγματικού χρόνου

αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

Ολικό RNA απομονώθηκε από καλλιεργημένα κύτταρα και καρκινικά ιστούς χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤπζοΙ. Πρώτος κλώνος cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ RevertAid First Strand cDNA σύνθεσης (τεχνολογία Life, Carlsbad, CA), το οποίο στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για πραγματικό χρόνο αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR), μαζί με προς τα εμπρός και αντίστροφοι εκκινητές και το Power SYBR Green PCR κύριο Μείγμα.

β-ακτίνη

χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος για

ΑΚΤ επίπεδα

απομαγνητοφώνηση. Οι αλληλουχίες εκκινητών ήταν ως εξής:

ΑΚΤ

-forward: GGGTTTCTCCCAGGAGGTTT, αντίστροφη: GTCCATGGTGTTCCTACCCA? β-ακτίνης προς τα εμπρός: ACCGAGCGCGGCTACAG, αντίστροφη:. CTTAATGTCACGCACGATTTCC

Σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, miRNA από τους ιστούς και τα κύτταρα που εξήχθη χρησιμοποιώντας το κιτ mirVana miRNA απομόνωσης (τεχνολογία Ζωής, Carlsbad, CA), και τα επίπεδα έκφρασης των miRNA-302A είχαν εντοπιστεί από τους προσδιορισμούς TaqMan miRNA (τεχνολογία ζωής, Carlsbad, CA), χρησιμοποιώντας U6 μικρά πυρηνικά RNA ως εσωτερικός έλεγχος.

Vector κατασκευή, φακοϊού παραγωγής, και την επιμόλυνση των κυττάρων

Η ώριμη αλληλουχία HSA-miRNA-302A συντέθηκε και εισήχθη εντός του φορέα για να παραχθεί PLKO.3G PLKO.3G-miR-302A. Ένας φορέας αποκατάσταση ΑΚΤ δομήθηκε με εισαγωγή του

ΑΚΤ

CDS που ενισχύθηκε από το PC-3 cDNA εντός του φορέα pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP. Ο φορέας αναφοράς λουσιφεράσης-3 αμετάφραστη περιοχή (UTR) προήλθε από την κατασκευή του

ΑΚΤ

3UTR, το οποίο φέρει μία υποθετική θέση δέσμευσης miRNA-302A σε φορέα MT01. Όλες οι κατασκευασμένοι φορείς επαληθεύτηκαν με ανάλυση αλληλουχίας.

PLKO.3G-miR-302A αναμιγνύεται με psPAX2 και PMD2-G διαμολύνθηκε σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ χρησιμοποιώντας λιποφεκταμίνη αντιδραστήριο 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή . Σαράντα οκτώ ώρες αργότερα, φακοϊό συλλέχθηκε και χρησιμοποιήθηκε για να μολύνει κύτταρα PC-3 και DU145. Στη συνέχεια, τα κύτταρα διαχωρίστηκαν με κυτταρομετρία ροής (Beckman Coulter, Brea, CA) για τη δημιουργία σταθερών κυτταρικών γραμμών που εκφράζουν ιδιοσυστατικά miRNA-302A (PC-3-302a και κυττάρων DU145-302a).

δοκιμασίες λουσιφεράσης

Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα λύθηκαν χρησιμοποιώντας 50 μι ρυθμιστικού διαλύματος λύσης παθητική. Στη συνέχεια, ένας προσδιορισμός διπλής λουσιφεράσης εκτελέστηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Promega, Madison, WI). Η αναλογία πυγολαμπίδας να Renilla δραστικότητα λουσιφεράσης χρησιμοποιήθηκε για να εκφράσει λουσιφεράση δραστηριότητες. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

συγκομιδή Protein και δυτικές

κηλίδα

Σύνολο πρωτεΐνες συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ εκχύλισης CelLytic (Roche, Basel, Switzerland) που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης και στη συνέχεια ποσοτικοποιούνται χρησιμοποιώντας την πρωτεΐνη BCA κιτ Αντιδραστηρίου δοκιμασίας (Thermo Fisher Scientific, Waltham, ΜΑ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά το διαχωρισμό πρωτεϊνών χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση γέλης δωδεκυλο θειικού νατρίου πολυακρυλαμιδίου, η πρωτεΐνη μεταφέρθηκε σε μεμβράνες πολυβινυλιδενο φθορίδιο και στη συνέχεια δεσμεύθηκαν σε 5% αποβουτυρωμένο γάλα. Χρησιμοποιώντας τα πρωτογενή αντισώματα και αντι-κουνελιού συνδεδεμένη με υπεροξειδάση (1: 5000) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, ΤΧ) ως το δεύτερο αντίσωμα, οι πρωτεΐνες-στόχους ανιχνεύθηκαν και, στη συνέχεια, οπτικοποιούνται χρησιμοποιώντας το ECL PlusWestern Blotting συστήματος (Thermo Fisher Scientific, Waltham, ΜΑ).

β-ακτίνης

ήταν να χρησιμοποιηθεί ως έλεγχος φόρτωσης. Τα πρωτογενή αντισώματα περιλαμβάνονται τα εξής:

ΑΚΤ

(1: 1000), φωσφορυλιώνεται

ΑΚΤ

(

ρΑΚΤ

)

(Ser473)

(1: 500 ),

ΟδΚ3β

(1: 500),

pGSK3β (Ser9)

(1: 500),

κυκλίνης D1

(1: 1000),

p27

Kip1

(1: 1000),

PI3K

(1: 1000), (Cell Signaling Technology, Boston, MA) και

β-ακτίνης

(1: 2000). (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, ΤΧ)

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων και του κυτταρικού κύκλου δοκιμασίες

CCK-8 και δοκιμασίες Edu διεξήχθησαν για την ανίχνευση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Εν συντομία, CCK-8 δοκιμασίες διεξήχθησαν ως ακολούθως: κύτταρα σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων πλάκα σε μια συγκέντρωση 1 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο. Μετά προσκόλληση, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε φρέσκο ​​μέσο αναμιγνύεται με CCK-8 (10: 1) (Dojindo, Σαγκάη, Κίνα) για 2 ώρες, πριν από την απορρόφηση μετρήθηκε με μια συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών στα 450 nm. Για τις δοκιμασίες edu, τα κύτταρα επωάστηκαν σε διάλυμα edu (1: 5000) επί 2 ώρες, στη συνέχεια συλλέχθηκαν και χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας το κινητό-Light edu Apollo 643 In vitro Κυτταρομετρία Ροής Kit (Ribobio, Guangzhou, Κίνα), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή . Τα κύτταρα στη συνέχεια αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής

Μια δοκιμασία κυτταρικού κύκλου εκτελέστηκε επίσης χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής:. Συντομία, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 75% ψυχρά αιθανόλη όλη τη νύκτα, και στη συνέχεια πλένονται με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό. Στη συνέχεια, ιωδιούχο προπίδιο (50 μg /mL) που περιέχει RNase προστέθηκε στα κύτταρα για χρώση ΟΝΑ πριν την ανάλυση κυτταρομετρίας ροής.

Colony δοκιμασία σχηματισμού

Απομονωμένα κύτταρα εμβολιάστηκαν σε πλάκες 60 mm σε ένα συγκέντρωση 500 κύτταρα /φρεάτιο και στη συνέχεια επωάστηκαν σε 5% CO

2 στους 37 ° C. Είκοσι ημέρες αργότερα, τα κύτταρα βάφτηκαν με 0.5% κρυσταλλικό ιώδες επί 30 λεπτά. Οι αριθμοί των αποικιών σε κάθε πλάκα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο.

In vivo ογκογονικότητα

Οι PLKO.3G-SCR-επιμολυσμένα PC-3 κύτταρα (κύτταρα PC-3-SCR) και PC- 3-302a κύτταρα εγχύθηκαν υποδορίως σε πλευρό είτε οπίσθιο του ίδιου 4-6 εβδομάδων αρσενικούς BALB /c γυμνό ποντίκι, τα οποία αγοράστηκαν από τη Σαγκάη SLAC Laboratory Animals Co., Ltd. (Σαγκάη, Κίνα). Τα μεγέθη των όγκων μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας καλίμπρες τουλάχιστον τρεις φορές την εβδομάδα. Οι ποντικοί υποβλήθηκαν σε ευθανασία με CO

2 την ημέρα 44. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε και το βάρος όγκου μετρήθηκε μετά τη θυσία. Οι όγκοι στη συνέχεια χωρίζεται σε δύο μέρη, κάθε μέρος σταθεροποιήθηκαν με 10% φορμαλίνη ή διατηρημένα σε -80 ° C. Τα πειράματα σε ζώα έγιναν με την έγκριση της Επιτροπής Δεοντολογίας Ζώων Σπουδών του Πανεπιστήμιο Fudan της Σαγκάης Κέντρο Καρκίνου.

Η ανοσοϊστοχημεία

Η ανοσοϊστοχημεία (IHC) χρώση των δειγμάτων σε παραφίνη ενσωματωμένο διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [ ,,,0],12]. Εν συντομία, κουνέλι αντι-

ΑΚΤ

και αντισώματος αντι-ποντικού /κουνελιού υπεροξειδάσης αρμορακίας-επισημασμένου αντισώματος (Παν-bio, Σαγκάη, Κίνα) χρησιμοποιήθηκαν ως το πρωτεύον και το δεύτερο αντίσωμα, αντιστοίχως.

Στατιστικές αναλύσεις

η διαφορά μεταξύ συνεχείς μεταβλητές αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το Μαθητή

t-test

ή ανάλυση διακύμανσης. Δύο όψεων

P

-τιμές & lt? 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του SPSS έκδοση 20.0 (IBM Corporation, Νέα Υόρκη).

Αποτελέσματα

έκφραση miRNA-302A καταστέλλεται στους ιστούς του προστάτη και είναι χαμηλότερα με την υψηλότερη GS

προστάτη ιστοί που αποκτήθηκαν από συνολικά 44 άνδρες ασθενείς με μέσο όρο ηλικίας 67 έτη (εύρος, 49-77 ετών) με νεοδιαγνωσμένο, επιβεβαίωσε παθολογικά ΣΕΣΣ. Μεταξύ αυτών, 32 ασθενείς είχαν λάβει ριζική προστατεκτομή και 12 ασθενείς είχαν λάβει διουρηθρική εκτομή του προστάτη. Παθολογικά επιβεβαίωσε φυσιολογικούς ιστούς του προστάτη αποκτήθηκαν από 10 άνδρες ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης που είχαν λάβει ριζική κυστεκτομή. Τα κλινικά και παθολογικά χαρακτηριστικά όλων των ασθενών αναλύονται στον πίνακα S1.

Διαπιστώσαμε επίπεδα έκφρασης miRNA-302A σε 44 ιστούς του προστάτη και 10 φυσιολογικούς ιστούς του προστάτη και διαπίστωσε ότι, σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς του προστάτη, του προστάτη ιστούς εξέφρασε χαμηλότερο επίπεδα των miRNA-302A (Σχήμα 1Α). Επίσης, αναλύσαμε τη σχέση μεταξύ των επιπέδων miRNA-302A και κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά σε ασθενείς ΣΕΣΣ. Δεν υπήρχε σημαντική συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ επιπέδων miRNA-302α και την ηλικία, τα επίπεδα αντιγόνου ειδικού προστατικού, ή κλινικό στάδιο (S1 πίνακα). Ωστόσο, η σύγκριση των επιπέδων έκφρασης miRNA-302A σε διαφορετικούς ιστούς προστάτη αποκάλυψε ότι η έκφραση του miRNA-302A μειώθηκε σημαντικά όταν GS & gt? 7 (Σχήμα 1Β). Συλλογικά, έχουμε υποθέτουν ότι προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης των miRNAs-302A μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του προστάτη.

έκφραση (Α) miRNA-302A ήταν προς τα κάτω σε προστάτη ιστό σε σύγκριση με το φυσιολογικό ιστό του προστάτη. (Β) έκφραση miRNA-302A ήταν χαμηλότερη σε προστάτη ιστούς με GS & gt? 7 σε σύγκριση με εκείνους με GS = 7. (C) Χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης miRNA-302A ανιχνεύθηκαν σε τέσσερεις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές προστάτη σε σύγκριση με φυσιολογικό προστάτη επιθηλιακά κύτταρα. (D) Υψηλά επίπεδα έκφρασης των miRNAs-302A ανιχνεύθηκαν σε κύτταρα του προστάτη που εκφράζουν σταθερά miRNA-302A (*

P

& lt? 0,05).

Η

Η υπερέκφραση του miRNA-302A αναστέλλει προστάτη κυτταρικής ανάπτυξης in vitro και in vivo

Για να διερευνηθεί η λειτουργία του miRNA-302α σε PCa, μετρήσαμε την έκφραση του miRNA-302A σε τέσσερις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές προστάτη (LNCaP, 22Rv1, PC-3, DU145 και) και φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα προστάτη (RWPE-1) με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR. Όπως φαίνεται στο Σχ 1C, υπήρξε χαμηλότερη έκφραση του miRNA-302A σε όλες τις τέσσερις κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με κύτταρα RWPE-1. Επειδή Πιθανολογείται ότι η υπερέκφραση του miRNA-302A μπορεί να αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων PCa, έχουμε σταθερά υπερεκφράζεται miRNA-302A σε PC-3 και DU145 κύτταρα, γεγονός που επιβεβαιώθηκε με ποσοτική αντίστροφης μεταγραφάσης (qRT) -PCR (Εικ 1D).

Ο CCK-8, edu, και προσδιορισμούς σχηματισμού αποικιών διεξήχθησαν για να εξεταστεί αν miRNA-302A υπερέκφραση επηρεάζονται πολλαπλασιασμού των κυττάρων του προστάτη in vitro. Όπως φαίνεται στο σχήμα 2, υπήρξε μια σημαντικά χαμηλότερη (

P

& lt? 0,05) ρυθμό ανάπτυξης σε PC-3-302a και κυττάρων DU145-302a σύγκριση με τους ελέγχους. Οι αναλύσεις κυτταρομετρίας ροής έδειξε ότι τα ποσοστά edu-θετικών κυττάρων στις δύο PC-3-302a και τα κύτταρα DU145-302a ήταν χαμηλότερες σε σχέση με τους μάρτυρες. Επιπλέον, σε σύγκριση με τους ελέγχους, τόσο PC-3-302a και τα κύτταρα DU145-302a αναπτύξει λιγότερες αποικίες στις 20 και 15 ημέρες, αντίστοιχα. Ως εκ τούτου, οι in vitro πειράματα δείχνουν ότι η miRNA-302A άσκησαν κατασταλτική ρόλο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του προστάτη.

Μια δοκιμασία CCK-8 εκτελέστηκε για να μετρηθεί πολλαπλασιασμός σε PC-3 και (Β) DU145 κύτταρα (Α). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν την μέση ± τυπική απόκλιση της τιμής οπτικής πυκνότητας (OD) ανιχνεύονται στα 450 nm από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων ανιχνεύθηκε σε (C) PC-3 και (D) DU145 κύτταρα χρησιμοποιώντας edu δοκιμασίας αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. (Ε, F) δοκιμασίες σχηματισμού αποικίας υποδεικνύεται λιγότερες αποικίες σε miRNA-302A κύτταρα που υπερεκφράζουν PCa. (*

P

& lt? 0,05).

Η

Για να επικυρώσετε περαιτέρω παρατηρήσεις μας in vivo, τα κύτταρα PC-3-SCR και PC-3-302a κύτταρα εγχέεται στο αριστερό και πλευρό δεξιά οπίσθια πέντε γυμνών ποντικών, αντίστοιχα. Οι όγκοι των όγκων μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας καλίμπρες σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά τον εμβολιασμό, και τα βάρη των όγκων μετρήθηκαν μετά τη θυσία. Τόσο ο όγκος και η μάζα ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε όγκους PC-3-302a ό, τι σε PC-3-Scr όγκους (

P

& lt? 0,05? Σχήμα 3). Στο σύνολό τους, προφανής η αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού παρατηρήθηκε μετά από υπερέκφραση του miRNA-302A σε κύτταρα PCa.

κύτταρα PC-3-GFP και PC-3-302a κύτταρα εγχύθηκαν στο πλευρό αριστερό και το δεξί οπίσθιο μέρος BALB /c γυμνά ποντίκια, αντίστοιχα (Α, Β). Ο όγκος του όγκου (Γ) και της μάζας (D) στην PC-3-302a ομάδα ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ό, τι στην ομάδα του PC-3-GFP. (*

P

& lt? 0,05).

Η

Η υπερέκφραση του miRNA-302A προκαλεί διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα προστάτη

Τώρα, παρατηρήθηκε ότι η αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων του προστάτη , πραγματοποιήσαμε ανάλυση κυτταρικού κύκλου για να διερευνήσει κατά πόσον η υπερέκφραση των miRNA-302A οδήγησε σε μεταβολές του κυτταρικού κύκλου. Όπως φαίνεται στο σχήμα 4, το ποσοστό των κυττάρων σε G1-φάση αυξήθηκε αξιοσημείωτα σε PC-3-302a κύτταρα, ενώ η αναλογία των κυττάρων στη φάση S ήταν σημαντικά λιγότερο σε σχέση με το μάρτυρα. Ανάλογα αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε κύτταρα DU145-302a, υποδηλώνοντας ότι miRNA-302A επάγουν αποτελεσματικά G1 /S διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα PCa.

Η αναλογία των κυττάρων σε G1-φάση αυξήθηκε σημαντικά σε PC-3-302a κύτταρα (A, C) και DU145-302a κύτταρα (Β, D) σε σχέση με τους ελέγχους, ενώ η αναλογία των κυττάρων στη φάση S ήταν σημαντικά λιγότερο από τους ελέγχους. (* P & lt? 0,05).

Η καταστέλλει

miRNA-302A

ΑΚΤ

έκφραση με την άμεση στόχευση 3UTR της

Για την ανίχνευση των μοριακών μηχανισμών με τους οποίους miRNA- 302α ασκεί μεταγραφικούς ρυθμιστικές λειτουργίες της, θα χρησιμοποιηθούν για τη βιοπληροφορική αλγορίθμους (https://www.targetscan.org) προκειμένου να αναζητηθούν πιθανές γονίδια-στόχους, και διαπίστωσε ότι η 3UTR του

ΑΚΤ

mRNA φιλοξενεί μια συντηρημένη θέση δέσμευσης για miRNA-302A. Στη συνέχεια, εξετάσαμε την έκφραση του

ΑΚΤ

στο επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης σε PC-3-302a και κυττάρων DU145-302a και τους ελέγχους. Όπως φαίνεται στα Σχήματα 5Α και 6, σε σύγκριση με τους ελέγχους,

ΑΚΤ

εκφράσεις μειώθηκε σημαντικά σε PC-3-302a και τα κύτταρα DU145-302a, τόσο σε επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης. Επιπλέον,

ΑΚΤ

έκφραση σε όγκους PC-3-302a ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ό, τι σε PC-3-Scr όγκων, όπως προσδιορίζεται με PCR πραγματικού χρόνου και χρώση IHC (Σχήμα 5Β και 5Γ). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι

ΑΚΤ

έκφραση ρυθμίζεται προς τα κάτω από το miRNA-302A στην ΣΕΣΣ.

ΑΚΤ

έκφραση του mRNA ήταν αξιοσημείωτα κατέστειλε το (Α) PC-3-302a και DU145 κύτταρα -302a, και (Β) PC-3-302a όγκων (πέντε ανεξάρτητες όγκοι ανιχνεύθηκαν). χρώση (Γ) Η ανοσοϊστοχημεία έδειξε χαμηλότερη έκφραση του

ΑΚΤ

σε όγκους PC-3-302a. (D) Σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης κυρίως καταστέλλεται σε άγριου τύπου

ΑΚΤ

-3 μη μεταφραζόμενη περιοχή (UTR) επιμολυσμένα κύτταρα. (Ε) Σχηματική αναπαράσταση της αναφοράς της λουσιφεράσης, η οποία έφερε το άγριου τύπου ή μεταλλαγμένο

ΑΚΤ

-3 ‘UTR. (* P & lt? 0,05).

Η

κηλίδας Western αναλύσεις έδειξαν μειωτικά ΑΚΤ, φωσφορυλιωμένη ΑΚΤ (ρΑΚΤ) και κυκλίνης D1 επίπεδα, και υπερεκφράζεται ΟδΚ3β, pGSK3β και ρ27

επίπεδα Kip1 σε miRNA-302A που υπερεκφράζουν κύτταρα του προστάτη. επίπεδα ΡΙ3Κ δεν επηρεάστηκαν.

Η

Για να ελέγξετε αν ρυθμίζει miRNA-302A

ΑΚΤ

με απευθείας σύνδεση με 3UTR του, ένα διάνυσμα αναφοράς της λουσιφεράσης που περιέχει το ανθρώπινο

ΑΚΤ

3UTR που πραγματοποιήθηκε την άγριου τύπου αλληλουχία δέσμευσης miRNA-302A υποκλωνώθηκε. Ένα λουσιφεράσης φορέα που φέρει το μεταλλαγμένο 7-bp περιοχή συμπληρωματική προς την περιοχή 5 σπόρων miRNA-302A παρήχθη ως ρεπόρτερ ελέγχου (Εικ 5Ε). Σε σύγκριση με τον έλεγχο, η σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης καταστάλθηκε κατά 36% (

P

& lt? 0,05) σε άγριου-τύπου

ΑΚΤ

3UTR επιμολυσμένα κύτταρα (Σχ 5D). Ως εκ τούτου, miRNA-302A αναστέλλει τα κύτταρα του προστάτη μέσω απευθείας στόχευση

ΑΚΤ

.

προκαλείται από miRNA-302A μεταβολές του κυτταρικού κύκλου στα κύτταρα του προστάτη, αναστέλλοντας τη

ΑΚΤ-ΟδΚ3β-κυκλίνης D1

και

ΑΚΤ-p27

Kip1

μονοπάτια

για την περαιτέρω αξιολόγηση της επίδρασης των miRNA-302A για το

ΑΚΤ

μονοπατιού σηματοδότησης, ανιχνεύσαμε η έκφραση του ανάντη (

PI3K

) και κατάντη (

ΟδΚ3β

,

κυκλίνης D1

και

p27

Kip1

)

ΑΚΤ

δράστες με κηλίδα western. Επιπλέον, εξετάστηκαν επίσης τα επίπεδα της φωσφορυλιωμένης ΑΚΤ (ρΑΚΤ) και pGSK3β. Σε σύγκριση με τα αντίστοιχα κύτταρα ελέγχου, τόσο ΟδΚ3β και pGSK3

β

επίπεδα, καθώς και p27

επίπεδα Kip1, ήταν κυρίως αυξημένα, ενώ ρΑΚΤ και κυκλίνης D1 ήταν ιδιαίτερα μειωμένη σε miRNA-302A επιμολυσμένα PC-3 και τα κύτταρα DU145. Ωστόσο, η έκφραση του

ΡΙ3Κ

ήταν που δεν επηρεάζονται από miRNA-302A διαμόλυνση (Σχήμα 6). Για την περαιτέρω επιβεβαίωση αυτών των ευρημάτων, θα αποκατασταθεί

ΑΚΤ

έκφρασης με παροδική επιμόλυνση ένα

ΑΚΤ

φορέα έκφρασης που μεταφέρουν

ΑΚΤ

CDS σε PC-3-302a και τα κύτταρα DU145-302a (που ονομάζεται PC-3-ΑΚΤ-CDS και DU145-ΑΚΤ-CDS αντίστοιχα). Όπως υποδεικνύεται στο Σχήμα 7, μετά την αποκατάσταση της έκφρασης ΑΚΤ, τόσο ΟδΚ3β και ρ27

επίπεδα Kip1 μειώθηκαν, ενώ η έκφραση της κυκλίνης D1 δεν διασώθηκε και στις δύο PC-3-ΑΚΤ-CDS και DU145-ΑΚΤ-CDS κύτταρα. Λόγω των κρίσιμους ρόλους του

ΑΚΤ-ΟδΚ3β-κυκλίνης D1 και AKT-p27

Kip1

μονοπάτια σε μεταβατικό στάδιο του κυτταρικού κύκλου σηματοδότησης, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι miRNA-302A μπορεί να προκαλέσουν G1 /S διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα του προστάτη με την ταυτόχρονη αναστολή του

ΑΚΤ-ΟδΚ3β-κυκλίνης D1

και το

ΑΚΤ-p27

Kip1

μονοπάτι, έτσι καταστολή των κυττάρων του προστάτη αναλύσεις πολλαπλασιασμού.

κηλίδας Western έδειξε διασωθεί η έκφραση της ΑΚΤ, και ανέστειλε την έκφραση της ΟδΚ3β και p27

επίπεδα Kip1 από την αποκατάσταση ΑΚΤ. Ωστόσο, η κυκλίνη D1 επίπεδα δεν διασώθηκαν.

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, παρατηρήσαμε ότι miRNA-302A ήταν προς τα κάτω σε ιστούς του προστάτη. Περαιτέρω αναλύσεις αποκάλυψαν χαμηλότερη έκφραση σε προστάτη ιστούς με GS ≥8 από αυτούς με GS & lt? 8. Η υπερέκφραση του miRNA-302A που επάγεται σύλληψη G1 /S σε κύτταρα PCa, και αξιοσημείωτα κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων PCA σε vitro και in vivo. Επιπλέον,

ΑΚΤ

αποκαλύφθηκε ως άμεσο και λειτουργικό γονίδιο στόχος των miRNA-302A.

Κατά την τελευταία δεκαετία, οι περισσότερες έρευνες που αφορούν miRNA-302 έχει εστιάσει στον ρόλο της στην hESCs, τα οποία είναι χαρακτηρίζεται από την αυτο-ανανέωση και pluripotency. Μελέτες ανάλυσης miRNA-302 Λειτουργία στην καρκινογένεση είναι περιορισμένη και ασυνεπής. Lin et al. Βρέθηκε ότι miRNA-302 θα μπορούσε να αναστείλει την ογκογονικότητα και διεγείρουν απόπτωση σε ανθρώπινα κύτταρα MCF7 καρκίνου του μαστού, την εμβρυονική τερατοκαρκινώματος κύτταρα Tera-2, και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα κυττάρων HepG2 [13]. Ομοίως, ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός κατεστάλη σε καρκίνο του τραχήλου HeLa και SiHa κύτταρα, καθώς επίσης και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα SMMC-7721 κύτταρα, μέσω της ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου [10,14]. Ωστόσο, Zhu et al. παρατηρείται μια αντίστροφη φαινόμενο σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου: η υπερέκφραση του miRNA-302b οδήγησε σε αυξημένη ικανότητα σχηματισμού αποικιών in vitro [11]. Η επαυξημένη ικανότητα σχηματισμού αποικίας παρομοίως επικυρωθεί σε καρκινικά βλαστικά κύτταρα από καρκίνωμα κεφαλής και λαιμού πλακωδών κυττάρων [15]. Για πρώτη φορά, αποκάλυψε κατασταλεί έκφραση miRNA-302A σε PCa ιστούς σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς του προστάτη, και χαμηλότερη έκφραση σε προστάτη ιστούς με υψηλότερη GS. Ως εκ τούτου, εμείς εικάζουν ότι miRNA-302A μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και εξέλιξη του προστάτη.

Στη μελέτη μας, η ανασταλτική δράση των miRNA-302A για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων παρατηρήθηκε σε προστάτη PC-3 και DU145 κύτταρα, μέσω εμποδίζουν την G1 στην S φάση μετάβασης, η οποία θεωρείται ως ένα βασικό γεγονός κατά τη διάρκεια του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες [8,10,14], βρήκαμε επίσης αξιοσημείωτη αρνητική ρύθμιση του

κυκλίνης D1

σε miRNA-302A κύτταρα που υπερεκφράζουν ΣΕΣΣ. Είναι ενδιαφέρον, miRNA-302 αναμένεται να στοχεύσει πολλούς ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου. Για παράδειγμα, Lin et al. έδειξαν ότι το miRNA-302 ταυτόχρονα καταστέλλεται τόσο

κυκλίνη E-CDK2

και

κυκλίνης D-CDK4 /6

οδών σηματοδότησης [13], και αυτό το μπλοκάρισμα στόχος ρυθμίζεται από διάφορους μεταγραφικούς παράγοντες, όπως η

Oct4

και

Sox2

[8]. Ωστόσο, κάρτα et al. ανέφεραν ότι miRNA-302A προώθησε μια αύξηση στην φάση S και μια μείωση στην φάση G1 σε hESCs, αν και

κυκλίνη D1

επίσης καταστέλλεται [8]. Σαφώς, η περαιτέρω έρευνα διαλεύκανση τους ακριβείς μηχανισμούς του miRNA-302 λειτουργία είναι απαραίτητη.

Οι παρατηρήσεις μας ότι υπερέκφραση του miRNA-302A σε κύτταρα προστάτη που επάγεται αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης in vitro και in vivo υποδηλώνουν ότι miRNA-302A μπορούσε απόηχο μεταγραφικά ρυθμίζουν έναν κεντρικό γονίδιο που εμπλέκεται στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Ως ένα σημαντικό ογκογονίδιο,

ΑΚΤ

επηρεάζει ένα ευρύ φάσμα φυσιολογικών λειτουργιών, συμπεριλαμβανομένων του μεταβολισμού, τον πολλαπλασιασμό, την επιβίωση, αγγειογένεση, μετανάστευση, και εισβολή [16]. Ομοίως,

ΑΚΤ

έχει αποδειχθεί ότι οδηγεί σχηματισμό του προστάτη in vivo [17]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι miRNA-302A κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό και την ογκογονικότητα των κυττάρων του προστάτη μέσω του

ΑΚΤ-ΟδΚ3β-κυκλίνης D1

και το

ΑΚΤ-p27

Kip1

μονοπάτι, και με την άμεση δέσμευση του 3UTR του

ΑΚΤ

. Επιπλέον, η έκφραση του

PI3K

, η οποία αποτελεί την κύρια ανάντη τελεστή

ΑΚΤ

και έχει επίσης αποδειχθεί σημαντική στην ανάπτυξη του προστάτη, δεν είχαν επηρεαστεί από miRNA-302. Ο ρυθμιστικός ρόλος των miRNA-302 στο

ΑΚΤ

καταδείχθηκε επίσης από Cai et al: μετά miRNA-302s επιμόλυνση σε τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα, που παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση των αναστολέων της κινάσης που εξαρτάται από κυκλίνη

p27

Kip1

και

p21

Cip1

, μαζί με μειωτικά

επίπεδα ΑΚΤ

. Επιπλέον, έδειξαν επίσης ότι

κυκλίνη D1

είναι ένα άλλο γονίδιο στόχο των miRNA-302s, το οποίο αντιπροσώπευε για την παρατήρηση μας ότι η έκφραση της κυκλίνης D1 δεν διασώθηκε μετά την αποκατάσταση της ΑΚΤ [10]. Ως εκ τούτου, ως στόχο της miRNA-302,

ΑΚΤ

ήταν κυρίως καταστέλλεται και προκάλεσε αλλαγές σε πολλούς μεταγενέστερους μονοπάτια σηματοδότησης.

Τα ευρήματα μας δίνουν επίσης ορισμένες ενδείξεις όσον αφορά τη θεραπεία του καρκίνου miRNAs στοχευμένες. Προηγούμενες μελέτες αποκάλυψαν ότι ορισμένες ειδικές miRNAs συχνά υπερεκφράζεται σε όγκους, ενώ τα περισσότερα miRNAs ήταν μειωτικά [18,19]. Παγκόσμια καταστολή miRNA βρέθηκε να ενισχύσει την καρκινογένεση τόσο σε in vitro και in vivo μοντέλα [20], τονίζοντας τα protumorigenic επιδράσεων μετά miRNA απώλειας λειτουργίας. Liang et al. παρατήρησαν μια ευαισθητοποίηση ρόλος της θεραπείας αντικατάστασης miRNA-302 σε κύτταρα καρκίνου του μαστού σε ιοντίζουσα ακτινοβολία [21]. Μια άλλη πρόσφατη μελέτη ανέφερε ότι η ιική παράδοση ας-7 miRNA θα μπορούσε να αναστείλει την ανάπτυξη του όγκου σε ένα μοντέλο αδενοκαρκινώματος πνεύμονα ποντικού [22]. Παρομοίως, τα αποτελέσματα μας επικύρωσε την ανασταλτική επίδραση της αντικατάστασης miRNA-302A σε κύτταρα PCa. Στο σύνολό τους, αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι η υπερέκφραση του έστω και ενός miRNA σε καρκινικά κύτταρα θα μπορούσε να προσδώσει σημαντική θεραπευτικό όφελος.

Εν κατακλείδι, η μελέτη μας δείχνει ότι miRNA-302A είναι ζωτικής σημασίας για την ανάπτυξη των κυττάρων του προστάτη με τη ρύθμιση G1-S φάσης μετάβαση. έκφραση miRNA-302A καταστέλλεται στους ιστούς του προστάτη, και είναι ακόμη χαμηλότερο σε προστάτη ιστούς με υψηλότερες GS. Επιπλέον, μέσω της άμεσης σύνδεσης με 3UTR, miRNA-302A αναστέλλει του

ΑΚΤ

έκφρασης, με αποτέλεσμα μεταγενέστερες τροποποιήσεις στο

ΑΚΤ-ΟδΚ3β-κυκλίνης D1

και

ΑΚΤ-p27

Kip1

μονοπάτια. Αν και είναι σαφές ότι miRNA-302A συμμετέχει στη ΣΕΣ, απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να εξηγήσει τους ακριβείς μηχανισμούς που διέπουν το ρόλο του στην εξέλιξη της ΣΕΣ, και έτσι τον προσδιορισμό των πιθανών αξία του ως βιοδείκτη ή /και τον στόχο της θεραπευτικής παρέμβασης.

Υποστήριξη Πληροφορίες

πίνακα S1. Δημογραφικά και κλινικοπαθολογικών χαρακτηριστικά των 44 ασθενών με καρκίνο του προστάτη (PCA)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0124410.s001

(DOCX)

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς ευχαριστήσω θεσμικό μέλη μας, ιδιαίτερα ο Δρ Sheng-Λιν Χουάνγκ για την τεχνική βοήθεια.