Αφηρημένο

Η ανώμαλη micro RNA (miRNA) έκφραση έχει ενοχοποιηθεί για την παθογένεση του καρκίνου. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι το σύμπλεγμα miR-17-92 υπερεκφράζεται σε πολλούς τύπους καρκίνου. Το ογκογόνο λειτουργία των ώριμων miRNAs που κωδικοποιείται από το σύμπλεγμα miR-17-92 έχει αναγνωριστεί από το 5 ‘βραχίονα έξι πρόδρομων ουσιών. Ωστόσο, η λειτουργία των miRNAs παράγονται από το 3 ‘βραχίονα αυτών των προδρόμων παραμένει άγνωστη. Η παρούσα μελέτη αποδεικνύει ότι miR-17 * είναι σε θέση να καταστείλει κρίσιμη πρωτογενούς μιτοχονδριακής αντιοξειδωτικά ένζυμα, όπως υπεροξείδιο μαγγανίου δισμουτάσης (MnSOD), γλουταθειόνη υπεροξειδάση-2 (GPX2) και θειορεδοξίνης αναγωγάση-2 (TrxR2). Η επιμόλυνση του miR-17 * σε καρκίνο του προστάτη PC-3 κύτταρα μειώνει σημαντικά τα επίπεδα των τριών αντιοξειδωτική πρωτεΐνες και η δραστηριότητα της λουσιφεράσης υπό τον έλεγχο του miR-17 * αλληλουχίες που βρίσκονται στην 3’-αμετάφραστες περιοχές των τριών γονιδίων στόχων δέσμευσης . Disulfiram (DSF), ένα φάρμακο dithiolcarbomate αποδειχθεί ότι έχει αντικαρκινική δράση, προκαλεί το επίπεδο των ώριμων miR-17 * και κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα ΣΕΣΣ, η οποία μπορεί να ελαττωθεί με την επιμόλυνση του αντιπληροφοριακού miR-17 *. Αύξηση miR-17 * επίπεδο σε PC-3 κύτταρα με ένα σύστημα έκφρασης εξαρτάται Tet-on βάση καταστέλλει σημαντικά tumorigencity της. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το miR-17 * μπορεί να καταστείλει την γένεσιν όγκων του καρκίνου του προστάτη μέσω της αναστολής της μιτοχονδριακής αντιοξειδωτικών ενζύμων

Παράθεση:. Xu Y, Fang ΣΤ, Zhang J, Josson S, St. Clair WH, St. Clair DK (2010) miR-17 * Καταστέλλει ογκογονικότητα του καρκίνου του προστάτη από ανασταλτικός μιτοχονδριακού αντιοξειδωτικά ένζυμα. PLoS ONE 5 (12): e14356. doi: 10.1371 /journal.pone.0014356

Επιμέλεια: Αντρέι Λ Gartel, Πανεπιστήμιο του Ιλινόις στο Σικάγο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 24 Ιουλίου, 2010? Αποδεκτές: 20 Οκτ, 2010? Δημοσιεύθηκε: 22η Δεκεμβρίου 2010

Copyright: © 2010 Xu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας CA115801 επιχορήγησης με τον William H. St. Clair και να χορηγήσει CA 049.797 σε Daret Κ St. Clair. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Micro RNA (miRNA), ~ 22 νουκλεοτιδίων του RNA μόρια που συνήθως καταστέλλουν τη μετάφραση των αγγελιοφόρων RNA στόχου, συμμετέχει σε διάφορες πτυχές της physiogenesis και παθογένεση [1] – [2]. Το σύμπλεγμα miR-17-92 κωδικοποιεί έξι miRNAs, συμπεριλαμβανομένων των miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20a, miR-19b-1, και miR-92, οι οποίες ενισχύονται σε περισσότερους τύπους ιστών καρκίνο από ό, τι στην αντίστοιχοι φυσιολογικοί ιστοί [3] – [5]. Πρωτο-ογκογονιδίου c-MYC up-ρυθμίζει την μεταγραφή του συμπλέγματος miR-17-92 και οδηγεί σε ρύθμιση προς τα κάτω των E2F1 από miR-17 [6], του PTEN από miR-19 [7], και των Rb1 από ΜΙΚ 20a [8], υποδηλώνοντας ότι miR-17-92 λειτουργεί ως ογκογόνο παράγοντα. Μέχρι σήμερα, η πλειοψηφία των miRNAs έχουν χαρακτηριστεί ως έχοντες την ικανότητα να μεταβάλλουν το φαινότυπο και την ανάπτυξη του καρκίνου δημιουργούνται από το 5 ‘βραχίονα του προδρόμων miRNA. Ωστόσο, η παραγωγή και η λειτουργία του 3 ‘βραχίονα miRNA (miRNA *) παραμένουν ασαφείς.

Απελευθέρωση της οξειδοαναγωγικής κατάστασης εμπλέκεται σε μια ποικιλία από παθογένειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου. Αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) που παράγεται από το μεταβολισμό του οξυγόνου αποτοξινώνεται με πολλαπλές οδούς αντιοξειδωτικό [9]. Μιτοχονδριακή αντιοξειδωτικά ένζυμα, συμπεριλαμβανομένων υπεροξειδιομαγγανίου δισμουτάσης (MnSOD), γλουταθειόνη-εξαρτώμενη υπεροξειδάσης (GPX) και thioredoxin- εξαρτώμενη υπεροξειδάσης (TrxR2), περιλαμβάνει ένα πρωτεύον σύστημα άμυνας στα μιτοχόνδρια και είναι απαραίτητα για την αποτοξίνωση κατά ROS [10] – [12]. Μια συνέπεια της υψηλό μεταβολισμό των ταχέως αναπτυσσόμενων καρκινικών κυττάρων είναι η ταχεία παραγωγή των κυτταρικών ROS. Ως εκ τούτου, τα κύτταρα του καρκίνου απαιτούν υψηλό αντιοξειδωτικό σύστημα άμυνας για την αντιμετώπιση των υψηλών επιπέδων παραγωγής ROS [13], [14]. Έτσι, η επιλεκτική αναστολή των αντιοξειδωτικών συστημάτων είναι μια επιλογή για παρέμβαση του καρκίνου.

Ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι μια κοινή ασθένεια της Βορείου Αμερικής αρσενικά. Επειδή PCa αναπτύσσει μια ευνουχισμού ανθεκτικό φαινότυπο, τα επίπεδα των αντιοξειδωτικών πρωτεϊνών αυξήθηκε και συσχετίζονται να αποκτήσουν ικανότητες, όπως αυτάρκης ανάπτυξη, μειωμένη απόπτωση, παρατεταμένη αγγειογένεση, αυξημένη εισβολή και μετάσταση, καθώς και αντίσταση των καρκινικών κυττάρων στη θεραπεία [15 ] – [17]. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιούμε τέσσερις συμπληρωματικές προσεγγίσεις για τον εντοπισμό μεσολαβητές για τον όγκο κατασταλτικό αποτέλεσμα του miR-17 *. Τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι η καταστολή της μιτοχονδριακής αντιοξειδωτικών ενζύμων είναι ένας μηχανισμός για τη λειτουργία καταστολέα όγκου του miR-17 *. Αυτή είναι η πρώτη έκθεση που αποκαλύπτει τη σχέση μεταξύ του οξειδωτικού στρες και το ογκοκατασταλτικό ρόλο του miRNA που παράγεται από το 3 ‘βραχίονα του συμπλέγματος miR-17-92.

Αποτελέσματα

miR-17 * καταστέλλει τρεις μιτοχονδριακό αντιοξειδωτικό πρωτεΐνες

Μια σειρά από μελέτες έχουν αναφέρει ότι το miR-17 εκφράζεται έντονα σε κακοήθεις όγκους, συμπεριλαμβανομένων του προστάτη, αλλά το επίπεδο του συνεργάτη του, miR-17 *, είναι συνήθως χαμηλή σε καρκίνους [18 ]. Αυτή η απόδειξη προβλέπει ότι τα επίπεδα του miR-17 και miR-17 * ρυθμίζονται διαφορικά και ότι η αναλογία των δύο miRNAs μπορεί να είναι σημαντική για τη ρύθμιση των διαφόρων συνόλων των γονιδίων στόχου κατά την διάρκεια ογκογένεσης. Οι εκφράσεις αμφοτέρων των miRNAs σε διαφορετικά κύτταρα του προστάτη, συμπεριλαμβανομένων των κανονικών επιθηλίων, στρώματος, ιική μετασχηματισμένα, που αποκρίνονται στο ανδρογόνο και ανεξάρτητου από ανδρογόνα κύτταρα PCa, ποσοτικοποιήθηκαν με πραγματικού χρόνου RT-PCR. Το επίπεδο του miR-17 και η αναλογία του miR-17 έως miR-17 * σε κύτταρα προστάτη ήταν υψηλότερα από τα επίπεδα σε μη καρκινικά κύτταρα (Σχ. 1Α). Με την αναζήτηση miRbase, βρήκαμε ότι MnSOD, GPX2 και TrxR2, τρία σημαντικά μιτοχονδριακό αντιοξειδωτικό πρωτεΐνες που είναι απαραίτητες για την αποτοξίνωση του O

2

.- και H

2O

2, οι πιθανοί στόχοι του miR -17 *. Για να βεβαιωθείτε ότι miR-17 * είναι σε θέση να καταστείλει αντιοξειδωτικό πρωτεΐνες, ώριμο miR-17 * επιμολύνθηκε σε κύτταρα PC-3, τα οποία έχουν ένα χαμηλό επίπεδο ενδογενούς miR-17 *. Η έκφραση των τριών αντιοξειδωτικών πρωτεϊνών ήταν μειωμένη κατά το επιμολυσμένα miR-17 * σε μια δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Ότι επιμόλυνση των miRNA ελέγχου και αντινόημα miR-17 * δεν είχε καμία επίδραση στους στόχους (Εικ. 1Β), το οξειδωτικό στρες ερεθίσματα όπως οι κυτοκίνες είναι σε θέση να επάγει την έκφραση του

SOD2

γονίδιο μέσω της ενεργοποίησης του NF -κB μονοπάτι [19] σηματοδότησης. Η επιμόλυνση του miR-17 * σημαντικά κατασταλεί ΤΝΡα επαγόμενη

SOD2

έκφραση σε ένα τρόπο που εξαρτάται από τη δόση (Εικ. 1 C). Για να επιβεβαιωθεί ότι η μείωση των αντιοξειδωτικών πρωτεϊνών με miR-17 * προκαλείται μέσω μεταφραστικής καταστολής, οι 3′-αμετάφραστες περιοχές, συμπεριλαμβανομένης της υποθετικής miR-17 * στόχευση τόπων των γονιδίων που κωδικοποιούν για τα τρία αντιοξειδωτικά ένζυμα, κλωνοποιήθηκαν προς τα κάτω του γονιδίου αναφοράς. Ένα όχημα και μια θέση στόχευσης miR-377 που βρίσκεται στην 3 ‘μη μεταφραζόμενη περιοχή του

SOD1

γονίδιο συμπεριλήφθηκαν ως έλεγχος του οχήματος και nonself αρνητικό έλεγχο. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1D, το κλωνοποιημένο miR-17 * ακολουθίες στόχευσης είναι αναγκαία για την καταστολή των απαντήσεων δημοσιογράφος από επιμολυσμένα miR-17 *.

Α, τα επίπεδα του miR-17 και miR-17 * που εκφράζονται σε προστάτη και των κυττάρων ελέγχου γραμμές μετρήθηκαν με RT-PCR. Η αναλογία του miR-17 στο miR-17 * σε κάθε κυτταρική σειρά που παρουσιάζονται. Β και Γ, η επιμόλυνση του miR-17 * σε PC-3 κύτταρα για την επικύρωση του αποστολή στην καταστολή της έκφρασης των αντιοξειδωτικών πρωτεϊνών και μειώνοντας την επαγωγή MnSOD διαμεσολάβηση του TNF. D, η κατασταλτική δράση του miR-17 * για τις αντιοξειδωτικές πρωτεΐνες υπολογίζεται με ποσοτική δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης. RNU24 και β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικοί έλεγχοι για την κανονικοποίηση των επιπέδων miRNA (Α), τα επίπεδα της πρωτεΐνης (Β και C). Εικόνες κανονικοποιήθηκαν με τους εσωτερικούς ελέγχους και στη συνέχεια κανονικοποιούνται PrEC (Α), από τον έλεγχο miRNA (Β), και με την απουσία θεραπείας TNF (C). β-gal ενεργότητα χρησιμοποιήθηκε για να ομαλοποιήσει λουσιφεράσης δραστηριότητες ανταποκριτή (D). Τρία δείγματα (η = 3) χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα και πολλαπλές μεταβολές σε κηλίδες Western υποδεικνύονται. * (Ρ & lt? 0,05) και ** (ρ & lt? 0,01) υποδεικνύουν σημασίες, σε σύγκριση με τους μάρτυρες: PrEC (Α), τον έλεγχο miRNA (Β) και (Δ), και μη επεξεργασμένα δείγματα (C)

Η.

DSF επάγει miR-17 * έκφραση

DSF είναι ένα φάρμακο dithiolcarbomate που έχει αποδειχθεί για να καταστείλει καρκινικούς φαινοτύπους επάγοντας το αποπτωτικό μονοπάτι [20]. Βρήκαμε ότι η DSF αναστέλλει τις τρεις αντιοξειδωτικές πρωτεΐνες στα κύτταρα του προστάτη. Μετά από PC-3 και DU-145 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DSF για 24 ώρες, η μείωση των επιπέδων των αντιοξειδωτικών πρωτεϊνών αντιστοιχούσε σημαντικά με τις συγκεντρώσεις των DSF (Εικ. 2Α). Ωστόσο, τα επίπεδα mRNA των αντιοξειδωτικών γονιδίων δεν άλλαξαν σε DSF-κατεργασμένα κύτταρα (Σχ. 2Β). Είναι ενδιαφέρον ότι, RT-PCR και κηλίδες Northern δείχνουν ότι DSF επάγει miR-17 * αλλά δεν έχει καμία επίδραση στα επίπεδα έκφρασης του miR-17 (Σχ. 2C). Η επαγωγή του miR-17 * με DSF επιβεβαιώνεται και από τις απαντήσεις δημοσιογράφος που ρυθμίζονται από το miR-17 * ακολουθίες στόχευσης (Σχ. 2D). Επιπλέον, για να βεβαιωθείτε ότι η αρνητική επίδραση της DSF στην έκφραση των αντιοξειδωτικών πρωτεϊνών διαμεσολαβείται από την επαγωγή του miR-17 *, τα κύτταρα PC-3 επιμολύνθηκαν με αντινόημα HSA-miR-17 * που ακολουθείται από κατεργασία DSF. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα αντιπληροφοριακά HSA-miR-17 * είναι σε θέση να μειώσουν την επίδραση DSF (Σχ. 2Ε). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η μείωση των αντιοξειδωτικών πρωτεϊνών με DSF συμβαίνει, τουλάχιστον εν μέρει, μέσω miR-17 * μεσολαβούμενη μεταφραστικής καταστολής.

Α, τα κύτταρα του προστάτη υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DSF στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις. Τα επίπεδα των τριών αντιοξειδωτικών πρωτεΐνες μετρήθηκαν με κηλίδες Western. Β, τα επίπεδα mRNA των τριών αντιοξειδωτικών γονιδίων ποσοτικοποιήθηκαν με RT-PCR. C, τα επίπεδα του miR-17 και miR-17 * στα DSF-κατεργασμένα κύτταρα προσδιορίστηκαν ποσοτικά με RT-PCR. Οι miR-17 * επίπεδα επιβεβαιώθηκαν από Northern κηλίδες. D, η επίδραση της επαγόμενης DSF miR-17 * στις απαντήσεις ρεπόρτερ προσδιορίστηκε. Ε, μετά επιμολυσμένα αντι-miR-17 *, PC-3 κύτταρα επεξεργάστηκαν με DSF. Η επίδραση των αντι-miR-17 * στην αποκατάσταση αντιοξειδωτικό πρωτεΐνες ποσοτικοποιήθηκε με Western blots. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε για την κανονικοποίηση των επιπέδων των πρωτεϊνών (Α), (Ε), και τα επίπεδα του mRNA (Β). Τα φορές αλλαγές υποδεικνύονται. RNU24 χρησιμοποιήθηκε για την κανονικοποίηση των επιπέδων του miR-17 και miR-17 * (C). β-gal ενεργότητα χρησιμοποιήθηκε για να ομαλοποιήσει λουσιφεράσης δραστηριότητες ανταποκριτή (D). Τρία δείγματα (η = 3) χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα (με την εξαίρεση της κηλίδος Northern). * (Ρ & lt? 0,05) και ** (ρ & lt? 0,01) υποδεικνύουν σημασίες, σε σύγκριση με την απουσία θεραπείας DSF (Α), (Γ), (Δ), και σε σύγκριση με το μη DSF και δεν miRNA επιμολυσμένα δείγματα (Ε)

miR-17 * προκαλεί κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα προστάτη

για να προσδιοριστεί η τοξικότητα DSF στα κύτταρα του προστάτη, PC-3 και DU-145 κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με DSF και καλλιεργήθηκαν μέχρι αποικίες που σχηματίστηκαν. Επειδή η πυκνότητα των κυττάρων που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση του σχηματισμού αποικίας ήταν 100-φορές μικρότερη από την πυκνότητα που φαίνεται στο Σχ. 2, η περιοχή συγκεντρώσεων του DSF μειώθηκε 100 φορές σε πειράματα σχηματισμού αποικίας. Τα αποτελέσματα του κλάσματος επιβίωσης δείχνουν ότι τα κύτταρα του προστάτη είναι εξαιρετικά ευαίσθητα στο DSF. Περισσότερο από το 95% των κυττάρων σκοτώθηκαν από κατεργασία με 1 μΜ DSF (Σχ. 3Α). Για να επαληθευθεί αν miR-17 * συμβάλλει στην DSF μεσολάβηση κυτταρικό θάνατο, PC-3 κύτταρα επιμολύνθηκαν με miR-17 * και * πριν από την κατεργασία-miR-17 αντι DSF. ανάλυση επιβίωσης αποικίας δείχνει ότι το miR-17 * ενισχύει την τοξικότητα του DSF, ενώ αντι-miR-17 * είναι σε θέση να διασώσει κύτταρα από την επίδραση DSF (Σχ. 3Β). Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω ότι η μείωση των αντιοξειδωτικών πρωτεϊνών είναι μια σημαντική αιτία για την τοξικότητα του miR-17 *, οι PC-3 κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με miR-17 * και cDNA εκτοπικά εκφράζουν τις τρεις αντιοξειδωτικό πρωτεΐνες που δεν είναι επιρρεπή σε ΜΙΚ 17 * ρύθμιση. ανάλυση κυτταροτοξικότητας με δοκιμασία εξαίρεσης κυανούν τρυπανίου δείχνει ότι η έκφραση των τριών αντιοξειδωτικών γονιδίων διασώζει την επιβίωση των κυττάρων από την τοξικότητα του miR-17 * (Σχ. 3C). Τα αντίστοιχα επίπεδα των αντιοξειδωτικών πρωτεϊνών στα επιμολυσμένα κύτταρα PC-3 ελέγχθηκε από κηλίδες Western (Σχ. 3D).

Α, τα κύτταρα του προστάτη υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DSF στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για ανάλυση επιβίωσης αποικίας. Τα σχηματισθέντα αποικίες μετρήθηκαν και απεικονίζονται σε μια λογαριθμική κλίμακα. Β, τα κύτταρα PC-3 επιμολύνθηκαν με miR-17 * και ελέγχου miRNAs πριν από την κατεργασία DSF. Προσδιορίστηκαν οι επιδράσεις του miR-17 * και αντινόημα miR-17 * στην επιβίωση των αποικιών. Γ και Δ, miR-17 * συν-επιμολυσμένα με κατασκευάσματα για έκφραση των τριών αντιοξειδωτικών πρωτεϊνών. Οι υπερεκφράζεται αντιοξειδωτικές πρωτεΐνες επιβεβαιώθηκε με κηλίδες Western με β-ακτίνη ομαλοποίηση και πολλαπλές μεταβολές υποδεικνύονται (D). Προστατευτικά αποτελέσματα των επιμολυσμένων αντιοξειδωτικών ενζύμων στα κύτταρα κατά miR-17 * τοξικότητα προσδιορίστηκαν με trypan blue δοκιμασία αποκλεισμού (C). Τρία δείγματα (η = 3) χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα. * (Ρ & lt? 0,05) και ** (ρ & lt? 0,01) υποδεικνύουν σημασίες, σε σύγκριση με τον έλεγχο δειγμάτων miRNA (Β) και σε σύγκριση με δείγματα ελέγχου οχήματος (C), (D)

Η

ΜΙΚ. 17 * καταστέλλει την ογκογονικότητα του προστάτη

για να προσδιοριστεί η επίδραση της miR-17 * στην ανάπτυξη του όγκου, η αλληλουχία του ώριμου miR-17 * κλωνοποιήθηκε σε βραδέος ιού φορέα έκφρασης Tet-on βάση. Η φακοϊό εκφράζουν miR-17 * ήταν transducted σε PC-3 κύτταρα, και ταυτοποιήθηκε μία σταθερή κυτταρική γραμμή με Tet-on έκφραση RFP βάση. Η επίδραση του miR-17 * επί των τριών αντιοξειδωτικών πρωτεϊνών υπό Tet-on επαγώγιμη συνθήκες επιβεβαιώθηκε με κηλίδες Western (Σχ. 4Α). Ένα μοντέλο όγκου ξενομοσχεύματος ποντικού χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η επίδραση της miR-17 * στην ανάπτυξη του όγκου. Όταν ο κλώνος εγχύθηκε υποδόρια σε γυμνούς αρσενικούς ποντικούς, η έκφραση του miR-17 *

in vivo

προκλήθηκε με χορήγηση Dox που περιέχουν νερό. Ένας έλεγχος όχημα συμπεριλήφθηκε για τον έλεγχο της τοξική επίδραση του Dox. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Β, ο μέσος χρόνος για να φτάσουν οι όγκοι 500 χιλιοστά

3 στον έλεγχο του οχήματος και miR-17 *, χωρίς ομάδες ελέγχου Dox είναι 12 έως 13 ημέρες (έλεγχος του οχήματος, χωρίς να Dox, 12.2 ± 2.1? Τον έλεγχο του οχήματος με Dox, 12.3 ± 2.8? και miR-17 * χωρίς Dox, 12.6 ± 2.8). Αξίζει να σημειωθεί ότι ο αριθμός των ημερών για την miR-17 * με την ομάδα Dox να φθάσουν 500 mm

3 το μέγεθος του όγκου είναι 24 ± 4.9, η οποία είναι δύο φορές όσο τις ομάδες ελέγχου. Για τη συνεχή μέτρηση της ανάπτυξης του όγκου, τα ποντίκια στις ομάδες ελέγχου κρατήθηκαν για 18 ημέρες μετά την ένεση, όταν το μέγεθος του όγκου έφτασε το μέγιστο επιτρεπόμενο μέγεθος 2000 mm

3. Οι ρυθμοί ανάπτυξης όγκου που φαίνεται στο Σχ. 4C δείχνουν ότι η ανάπτυξη του όγκου στον miR-17 * με την ομάδα Dox καθυστέρησε σημαντικά σε σύγκριση με την ανάπτυξη του όγκου στις ομάδες ελέγχου. Για να επαληθευθεί αν η έκφραση του miR-17 * οδηγεί σε μειωμένη αντιοξειδωτική πρωτεϊνών στο miR-17 * εκφράζεται ιστούς όγκων, τα επίπεδα του miR-17 * και τις δραστηριότητες των αντιοξειδωτικών ενζύμων στους ιστούς του όγκου ποσοτικοποιήθηκαν. Αντίστοιχα στην αύξηση των επιπέδων του miR-17 * στην ομάδα Dox-αγωγή, οι δραστηριότητες των τριών αντιοξειδωτικών ενζύμων ήταν σημαντικά μειωμένες σε σύγκριση με την ομάδα άνευ αγωγής (Σχ. 4D). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι η έκφραση του miR-17 * στην PC-3 κυττάρου μειώνει την ογκογονικότητα, τουλάχιστον εν μέρει, με αναστολή μιτοχονδριακής αντιοξειδωτική λειτουργία. Αυτό το αποτέλεσμα υποδηλώνει ότι σε αντίθεση με την ογκογόνο δράση του miR-17, miR-17 * παίζει ένα ρόλο κατασταλτικό όγκου σε κύτταρα PCa.

Α, έχει-miR-17 * κλωνοποιήθηκε σε ένα Tet-on βραδέος φορέα και σταθερώς διατέμνεται σε PC-3 κύτταρα. Ο κλώνος δοκιμάσθηκε με διαλογή RFP υπό Dox- επαγωγική συνθήκες και στη συνέχεια επιβεβαιώθηκε με μέτρηση της έκφρασης των τριών γονιδίων στόχων χρησιμοποιώντας κηλίδες Western με β-ακτίνη ομαλοποίηση. Β και C, η παραγόμενη κλώνος εγχύθηκε σε αρσενικούς γυμνούς ποντικούς για να προσδιοριστεί ογκογονικότητας της. Ο έλεγχος του οχήματος είχε συμπεριληφθεί. Ο αριθμός των ημερών που απαιτούνται για το μέγεθος του όγκου να φθάσει 500 mm

3 φαίνεται στο (Β) και υπολογίζονται τα ποσοστά ανάπτυξης όγκου σε (C). D, ολικό RNA και πρωτεΐνες απομονώθηκαν από τους ιστούς όγκου και το επίπεδο των miR-17 * και αντίστοιχες δραστηριότητες των τριών αντιοξειδωτικών πρωτεΐνες ποσοτικοποιήθηκαν. Τρία δείγματα (η = 3) χρησιμοποιήθηκαν σε δοκιμή της δημιουργείται miR-17 * επαγώγιμο κλώνος (Α). Εννέα ζώα ελέγχου οχήματος (n = 9), με ή χωρίς θεραπεία DOX και δεκαοχτώ miR-17 * εκφράζεται ζώα (n = 18) με ή χωρίς επεξεργασία DOX χρησιμοποιήθηκαν για να δοκιμαστεί η επίδραση του miR-17 * στην ανάπτυξη του όγκου (Β), (Γ), (Δ). * (P & lt? 0,05) και ** (p & lt? 0.01) δείχνουν έννοιες, σε σύγκριση με χωρίς έλεγχο DOX (Α) και (Γ)

Η

Συζήτηση

miRNA γενικά λειτουργεί ως. ένα μετα-μεταγραφικό καταστολέα, η οποία πιστεύεται ότι είναι ένας σημαντικός μηχανισμός της γονιδιακής ρύθμισης. miRNA βιογένεση περιλαμβάνει κανονικά πρωτογενή μεταγραφή miRNA, Drosha /διασπάσεις Dicer μεσολάβηση, και το σκέλος προνομιακή επιλογή μέσω Argonaute (AGO) πρωτεΐνες [21]. Όταν ένας κλώνος επιλέγεται για την καταστολή των στόχων, σκέλος της εταίρο τεκμαίρεται ότι αποικοδομείται [22]. Ωστόσο, πρόσφατες μελέτες έχουν ανιχνεύσει τόσο miR-17 και miR-17 * σε πολλούς τύπους ανθρώπινων ιστών [23]. Σε όλες τις κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι miR-17 * είναι παρούσα σε χαμηλότερο επίπεδο από ό, τι miR-17. Ωστόσο, τα επίπεδα των δύο miRNAs είναι υψηλότερα σε κύτταρα προστάτη σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Δεδομένου ότι το επίπεδο του miR-17 είναι υψηλότερο από το miR-17 *, ο λόγος του miR-17 στο miR-17 * στα κύτταρα του προστάτη αυξάνεται, γεγονός που υποδηλώνει ότι το miR-17 είναι ένα κατά προτίμηση επιλεγμένες σκέλος, αν και τόσο miR-17 και miR -17 * οι πρόδρομοι μεταγράφονται. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι ago1 μεσολαβεί παραγωγή miRNA στη Drosophila, ενώ ago2 συνδέεται με miRNA * παραγωγή [24]. Ωστόσο, ο ακριβής μηχανισμός με τον οποίο ρυθμίζει ΠΡΙΝ miRNA βιογένεση πρέπει να προσδιοριστεί για να αποκαλύψει προνομιακή συσσώρευση των κλώνων miRNA κάτω από διαφορετικές συνθήκες.

Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι το miR-17 * καταστέλλει ογκογονικότητα των κυττάρων του προστάτη, γεγονός που υποδηλώνει ότι η λειτουργία του miR-17 * είναι αντίθετη προς την ογκογόνο λειτουργία του miR-17. Έκφραση του συμπλέγματος miR-17-92 είναι στενά ρυθμίζεται ως απάντηση στην μεσοκυττάρια και εξωκυττάριο περιβάλλον. Η μεταγραφή αυτού του συμπλέγματος είναι up-ρυθμίζεται από c-Myc υπό οξειδωτικές συνθήκες [25] και ρυθμισμένα προς τα κάτω από το ρ53 κάτω από συνθήκες υποξίας [26]. Είναι ενδιαφέρον, DSF, ένα dithiolcarbomate, προκαλεί μόνο το επίπεδο του miR-17 * και δεν miR-17. Αυτή η επιλεκτική επαγωγή είναι συνεπής με την επίδραση κατασταλτική του όγκου του miR-17 * και είναι σε συμφωνία με τον προηγούμενο εύρημα ότι DSF διεγείρει απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα [20]. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι DSF μπορεί να είναι αποτελεσματική ως αντικαρκινικός παράγοντας, εν μέρει από την επαγωγή του miR-17 *.

miRNA με βάση γονίδιο καταστολή θεωρείται ένα κρίσιμο ρυθμιστή που ελέγχει την τύχη του κυττάρου. Ωστόσο, είναι ένα πολύπλοκο σύστημα ρύθμισης επειδή ένα γονίδιο μπορεί να ρυθμίζεται με πολλαπλούς miRNAs και ένα miRNA έχει πολλές διαφορετικές στόχους. Σε γενικές γραμμές, η επίδραση των miRNA στη ρύθμιση γονιδίου εξαρτάται σε συγκεκριμένους τύπους ιστών, την ανάπτυξη καταστάσεις, ή ερεθίσματα. Έτσι, ο προσδιορισμός των στόχων των miRNAs είναι κρίσιμη για να καθορίσει τις πραγματικές λειτουργίες του miRNA υπό φυσιολογικές ή παθολογικές καταστάσεις. Η μελέτη μας δείχνει ότι miR-17 * είναι ένας αρνητικός ρυθμιστής για τρία σημαντικά αντιοξειδωτικά ένζυμα που βρίσκονται στα μιτοχόνδρια. Αυτά τα αντιοξειδωτικά ένζυμα είναι βασικά συστατικά του πρωτογενούς αντιοξειδωτικό σύστημα και εργάζονται από κοινού για να αφαιρέσετε με ασφάλεια ROS παράγονται στα μιτοχόνδρια. Η αναστολή αυτών των πρωτεϊνών θα πρέπει να οδηγήσει, ως εκ τούτου, σε μια συσσώρευση των ROS, με αποτέλεσμα την κυτταροτοξικότητα. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν μια νέα θεραπευτική προσέγγιση για την ενίσχυση του κυτταρικού θανάτου από miR-17 * στόχευση. Επιπλέον, μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι miR-17 είναι σε θέση να σιγήσει έκφραση HIF-1α, έναν παράγοντα μεταγραφής για διατήρηση της ομοιόστασης οξειδοαναγωγής και την επιβίωση των κυττάρων κάτω από συνθήκες υποξίας [27]. Μαζί, αυτά τα ευρήματα προβλέπουν ότι η αναλογία του miR-17 στο miR-17 * μπορεί να έχει ένα σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της κατάστασης κυτταρικής οξειδοαναγωγής.

Αν και το φαινόμενο Warburg, ένα υψηλό ποσοστό των αερόβια γλυκόλυση σε όγκους, έχει παρατηρηθεί σε διάφορους τύπους καρκίνου, καρκίνους έχουν λειτουργικά μιτοχόνδρια και μιτοχονδριακή αναπνοή είναι απαραίτητη για τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων [28]. Επιπλέον, τα καρκινικά κύτταρα έχουν υψηλά επίπεδα των ROS και επίσης εκφράζουν υψηλά επίπεδα των αντιοξειδωτικών πρωτεϊνών για να αποτοξινώσει τα αυξημένα ποσοστά της παραγωγής ROS [29]. Για παράδειγμα, MnSOD εκφράζεται σε υψηλό επίπεδο σε επιθετικά κύτταρα PCa, η οποία είναι απαραίτητη για την προστασία των κυττάρων του προστάτη έναντι προκαλούμενη από ακτινοβολία ROS [30]. Έτσι, προκαλώντας μονοπάτια προ-αποπτωτική σηματοδότηση μέσω στόχευσης μιτοχόνδρια αντιοξειδωτικών ενζύμων θα μπορούσε επίσης να θεωρηθεί ένα αντι-καρκινικό θεραπευτική στρατηγική. Τα αποτελέσματά μας, που δείχνουν ότι το miR-17 * αναστολή των μιτοχονδριακών αντιοξειδωτικών πρωτεϊνών καταστέλλει ογκογονικότητα των κυττάρων του προστάτη in vivo, παρέχουν πειραματική απόδειξη για την απόδειξη της ιδέας ότι miRNA * μπορεί να λειτουργήσει ως καταστολέας των όγκων με αναστολή της αμυντικής ικανότητας των μιτοχονδρίων.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρική καλλιέργεια και κυτταρική τοξικότητα ανάλυση

PrEC, ανθρώπινου προστάτη επιθηλιακά πρωτογενή κύτταρα (Cambrex Corp.), και pRSC, τα ανθρώπινα στρωματικά κύτταρα προστάτη (Clonetics), αναπτύχθηκαν σε μέσο PrEBM (Lonza). PZ-HPV-7, HPV-18 μετασχηματισμένα επιθηλιακά κύτταρα ανθρώπινου προστάτη (American Type Culture Collection, ATCC), αναπτύχθηκε σε μέσο κερατινοκυττάρου-SFM (Invitrogen). Ανθρώπινα κύτταρα καρκινώματος επιθηλιακά LNCaP, DU-145 και αδενοκαρκίνωμα PC-3 κύτταρα (ATCC) αναπτύχθηκαν σε μέσο RPMI (Invitrogen) που περιέχει 10% FCS (Hyclone). δοκιμασία σχηματισμού αποικίας χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση της τοξικότητας του miR-17 * σε κύτταρα προστάτη επιστρώθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων σε χαμηλές πυκνότητες. Για να προκληθεί miR-17 * έκφραση, τα κύτταρα του προστάτη υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DSF σε περιοχή συγκέντρωσης από 0 έως 1 μΜ για 24 ώρες. Οι αποικίες πλύθηκαν με 1χ PBS και βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες χρώμα. Το κλάσμα επιβίωσης υπολογίστηκε ως η αναλογία του αριθμού των αποικιών που σχηματίστηκαν προς τον αριθμό κυττάρων αποτελεσματικά επιμεταλλωμένα. δοκιμασία αποκλεισμό μπλε Τρυπάνης χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των προστατευτικών αποτελεσμάτων της αυξημένης αντιοξειδωτικών ενζύμων για την τοξικότητα του miR-17 *. Τα κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με miR-17 * και έκφραση κατασκευασμάτων των τριών αντιοξειδωτικών γονίδια. Μετά από καλλιέργεια για 48 ώρες, τα επιμολυσμένα κύτταρα χρωματίστηκαν με ένα 0,4% trypan blue χρωστικής και μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα αναλυτή Vi-Cell κυτταρικής βιωσιμότητας (Beckman Coulter).

μικρο έκφραση RNA δοκιμασίας ρεπόρτερ

Για να ελεγχθεί αν miR-17 * ρυθμίζει την έκφραση των γονιδίων-στόχων, οι 3′-αμετάφραστες περιοχές των γονιδίων στόχων που περιέχουν τις θέσεις πρόσδεσης * υποθετική miR-17 κλωνοποιήθηκαν μεταξύ

Sac

Ι και

Hind

ΙΙΙ θέσεις του φορέα pMIR-ρεπόρτερ (Ambion). Τα παραγόμενα κατασκευάσματα ανταποκριτή έκφραση miRNA συν-επιμολύνθηκαν με φορέα β-gal εσωτερικού ελέγχου (Ambion) σε PC-3 κύτταρα χρησιμοποιώντας λιποφεκταμίνη (Invitrogen). Μετά από καλλιέργεια επί 36 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν? δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας λουσιφεράσης (Promega)? και η δραστικότητα β-gal μετρήθηκε χρησιμοποιώντας χλωροφαινόλης κόκκινου-α-D-glactopyranoside υπόστρωμα μονονάτριο (Roche Molecular Biochemicals). Σχετική λουσιφεράσης απαντήσεις εκτιμήθηκαν από τη δραστηριότητα της λουσιφεράσης β-gal-κανονικοποιημένη.

Η έκφραση του miR-17 *

Για να αυξήσετε miR-17 * επίπεδο στα κύτταρα του προστάτη, του miR-17 * μορίων και των ελέγχων (Ambion) επιμολύνθηκαν στα κύτταρα χρησιμοποιώντας Oligofectamine (Invitrogen). Για να προκληθεί miR-17 * έκφραση σε κύτταρα PCa, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με disulfiram (Sigma) σε συγκέντρωση από 0 έως 100 μΜ για 24 ώρες. Ώστε να εκφράζουν σταθερά miR-17 * σε κύτταρα PCa, ένα ώριμο miR-17 * αλληλουχία εκτείνεται από θέσεις διάσπασης Drosha και Dicer κλωνοποιήθηκε σε ένα Tet-on επαγώγιμο φορέα λεντοϊού, TRIPZ (Open Biosystems), χρησιμοποιώντας Xho Ι και θέσεις EcoR Ι. Αλληλουχία ενθέτου που περιέχει το miR-17 * (που παρουσιάζεται με υπογράμμιση) είναι CTCGAGTGCTGTTGACAGTGAGCGAACTGCAGTGAAGGCACTTGTAGTAGTGAAGCCACAGATGTACTACAAGTGCCTTCACTGCAGTCTGCCTACTGCCTCGGAGAATTC. Το κλωνοποιημένο miR-17 * συσκευάστηκε χρησιμοποιώντας ένα translentiviral σύστημα συσκευασίας (Open Biosystems). Το miR-17 * φακοϊό συμπυκνώθηκε και τιτλοδοτήθηκαν πριν μεταγωγή εντός των κυττάρων κάτω από 2 μg /ml πουρομυκίνη επιλεκτικές συνθήκες. Το miR-17 * κλώνος περαιτέρω επιλεγεί από Tet-on επαγώγιμη έκφραση μιας πρωτεΐνης ερυθρού φθορισμού (RFP) ετικέτα χρησιμοποιώντας μέσο που περιέχει 1 μg /ml δοξυκυκλίνης (Dox). Η σταθερή κλώνος πιστοποιήθηκε με διαλογή της έκφρασης των στόχων χρησιμοποιώντας κηλίδες Western.

Έκφραση των αντιοξειδωτικών ενζύμων

Για να διασώσει την επιβίωση των κυττάρων από την τοξικότητα του miR-17 *, cDNA κατασκευάσματα για έκφραση του οι τρεις αντιοξειδωτικές πρωτεΐνες επιμολύνθηκαν σε κύτταρα PC-3 προηγούμενη επεξεργασία DSF. Τα εκτοπικά εξέφρασε αντιοξειδωτικές πρωτεΐνες δεν επηρεάζονται από την έχει-miR-17 *, γιατί οι κατασκευές cDNA δεν έχουν τα 3′-untranslational περιοχές όπου οι θέσεις δέσμευσης που προσδιορίζονται για έχει-miR-17 * δεσμευτική.

Ζώα

Τέσσερις εβδομάδες ηλικίας αρσενικό NCRNU (ηυ /ηυ αθυμικοί γυμνοί) ποντικοί αγοράστηκαν από την Taconic (Hudson, ΝΥ). 10

6 κύτταρα αναμιγνύονται με Matrigel (BD Biosciences) εγχύθηκαν στο δεξί πλευρό των ποντικών. Τα ποντίκια ενέθηκαν χωρίστηκαν σε δύο ομάδες: δύο ημέρες πριν από την ένεση, μία ομάδα ποντικών άρχισε να πίνουν νερό που περιέχει 2 mg /L δοξυκυκλίνη και η ομάδα ελέγχου συνέχισαν να πίνουν κανονικό νερό. Οι όγκοι των όγκων υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα πρότυπο τύπο (Α × Β

2 × 0,52? Α και Β αντιπροσωπεύουν το διαγώνιο μήκη όγκου)

Δυτική κηλίδες

Οι πρωτεΐνες που προέρχονται από καλλιεργημένα κύτταρα. και ιστοί όγκου όπως περιγράφηκε προηγουμένως (11) και 100 μα εκχυλίζεται πρωτεΐνες υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε μια 8% (w /v) γέλη SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, και στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα εναντίον MnSOD (Upstate Biotech). , GPX2 (Abcam), TrxR2 και β-ακτίνη (Santa Cruz Biotech). Western κηλίδες ορατές χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ενισχυμένης ανίχνευσης χημειοφωταύγειας (ECL, Amersham Pharmacia Biotech.).

Real-time PCR (RT-PCR)

Για να εμπλουτίσει miRNA στο πλαίσιο της προετοιμασίας του RNA, συνολικό RNA απομονώνεται από τα καλλιεργημένα κύτταρα και ιστούς όγκου χρησιμοποιώντας ένα κιτ απομόνωσης mirVana miRNA (Ambion). Για τον ποσοτικό προσδιορισμό των miR-17 και miR-17 *, το RNA αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ένα TaqMan microRNA αντίστροφη Transcription Kit με εσωτερικούς ελέγχους RNU6B, RNU24 και RNU48 (Applied Biosystems). Για την ποσοτικοποίηση των επιπέδων mRNA των γονιδίων στόχων miR-17 *, το RNA αναλύθηκε χρησιμοποιώντας TaqMan Reverse Transcription Αντιδραστήρια (Applied Biosystems) και RT-PCR με την καθολική ProbeLibrary Set (Roche Applied Science). RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα TaqMan Οικουμενική PCR Master Mix χρησιμοποιώντας ένα LightCycler 480 Real-Time PCR System (Roche Applied Science).

Northern κηλίδες

Το επίπεδο του miR-17 * προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας ένα miRtect-IT miRNA επισήμανσης και ανίχνευσης kit (USB Corp.), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

η δραστικότητα των ενζύμων προσδιορισμού

δραστηριότητες MnSOD μετρήθηκαν από το νιτροτετραζολίου (NBT) -bathocuproin σουλφονικό μέθοδο αναστολής (BCS) μείωση. κυανιούχο νάτριο (2 mM) χρησιμοποιήθηκε για να αναστέλλουν δραστικότητα Cu /ZnSOD [31]. δραστικότητα GPx μετρήθηκε με τη χρήση ενός μίγματος αντίδρασης που αποτελείται από 0,2 mM H

2O

2, 1,0 mM GSH, 0,14 U αναγωγάσης γλουταθειόνης (GR), 1.5 mM ΝΑϋΡΗ, 1.0 mM αζίδιο του νατρίου, και 0.1 Μ φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (ρΗ 7.4) και 1 mg /ml υπερκειμένου πρωτεΐνης [32]. TrxR δραστηριότητα μετρήθηκε χρησιμοποιώντας αναγωγάση της θειορεδοξίνης Δραστηριότητα Assay Kit (Redoxica) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή

Στατιστικά στοιχεία αναλύσεων

.

Πολλαπλές ανεξάρτητα πειράματα για κάθε σύνολο δεδομένων. Εικόνες στη Βόρεια κηλίδες και κηλίδες Western ήταν ποσοτικά με τη χρήση του λογισμικού Carestream Μοριακής Απεικόνισης (Carestream Health Inc.). Η στατιστική σημαντικότητα αναλύθηκε χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA και της εξέτασης πολλαπλού Σύγκριση του Tukey, ακολουθούμενη από ανάλυση των δεδομένων με Graphpad Prism.