Αφηρημένο

Ιστορικό

Ο συντελεστής Pax6 μεταγραφής εκφράζεται κυρίως στα έμβρυα . Pax6 εκφράζεται επίσης σε αρκετά όγκους και διαδραματίζει ογκογόνο ρόλο. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για τον ρόλο των Pax6 στον καρκίνο του πνεύμονα.

Μέθοδοι

Η λειτουργία του Pax6 σε καρκινικά κύτταρα πνεύμονα εκτιμήθηκε με μικρό παρεμβαλλόμενο RNA διαμεσολαβούμενη εξάντληση της πρωτείνης που ακολουθείται από αναλύσεις του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη, και διακοπή του κυτταρικού κύκλου. Οι αλλαγές της κυκλίνης D1, pRB, ERK1 /2, η έκφραση της ρ38 που προκλήθηκε από την αναστολή Pax6 ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western. Το επίπεδο του mRNA Pax6 σε 52 ζεύγη των όγκων και των αντίστοιχων συμφωνημένα παρακείμενων φυσιολογικών ιστών από μη μικροκυτταρικό ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα και κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα ανιχνεύθηκε με PCR πραγματικού χρόνου.

Αποτελέσματα

Καταστολή του Pax6 έκφραση ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων και του σχηματισμού αποικιών σε Α549 και κύτταρα Η1299. Το ποσοστό των κυττάρων στην G1 φάση αυξήθηκε όταν η έκφραση Pax6 ανεστάλη. Η κυκλίνη επίπεδο πρωτεΐνης D1, καθώς και το επίπεδο φωσφορυλίωσης pRB, μειώνεται ως αποτέλεσμα της Pax6 ρύθμισης προς τα κάτω. Η δραστηριότητα των ERK1 /2 και p38 επίσης κατεστάλη στα κύτταρα Pax6 knock-down. Το mRNA Pax6 ήταν εντόνως εκφρασμένο σε ιστό καρκίνου του πνεύμονα και κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα. Στους περισσότερους ασθενείς (περίπου 65%), η σχετική αναλογία των Pax6 mRNA στην πρωτοβάθμια NSCLC έναντι παρακείμενους ιστούς υπέρβαση 100.

Συμπεράσματα

Τα στοιχεία μας ενοχοποιηθεί ότι Pax6 επιταχύνει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, με την ενεργοποίηση του σήματος ΜΑΡΚ μονοπάτι. επίπεδα Pax6 mRNA ήταν σημαντικά αυξημένα στην πρωτοβάθμια πνεύμονα καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με συμφωνημένα παρακείμενους ιστούς τους

Παράθεση:. Zhao Χ, Yue W, Zhang L, Ma L, Jia W, Qian Ζ, et al. (2014) Ελάττωση της Pax6 από shRNA παρεμποδίζει τον πολλαπλασιασμό και κυτταρικού κύκλου Εξέλιξη του Ανθρώπου μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα Γραμμές κυττάρων. PLoS ONE 9 (1): e85738. doi: 10.1371 /journal.pone.0085738

Επιμέλεια: Χριστίνα Lynn Addison, Οτάβα Νοσοκομείο Ίδρυμα Ερευνών, Καναδάς

Ελήφθη: 16 Ιούλη του 2013? Δεκτές: 1 Δεκεμβρίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 15 Ιανουαρίου του 2014

Copyright: © 2014 Zhao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορήγηση του Πεκίνου Μυθιστόρημα Πρόγραμμα (Αρ 2006B34)? Ίδρυμα Πεκίνο Έρευνας για εξαιρετικά ταλέντα (Αρ 20061D03)? Πεκίνο Καλλιέργεια Σχέδιο για Key Τεχνικής και Ιατρική προϊόντων (Αρ Z101100055610030)? η επιστημονική έρευνα Κοινό Πρόγραμμα του Πεκίνου Δημοτική Επιτροπή Παιδείας (αρ KM201210025024). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Μια πρόσφατη ανασκόπηση σχετικά με την παγκόσμια στατιστικά του καρκίνου έδειξαν ότι ο καρκίνος του πνεύμονα ήταν η πιο συχνά διαγιγνώσκεται καρκίνος, καθώς και την κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο [1]. Η έγκαιρη ανίχνευση και η στοχευμένη θεραπεία είναι μια πιθανή μέθοδος για την πρόληψη και τη θεραπεία [2] καρκίνο του πνεύμονα. Είναι σημαντικό να βρείτε ποια τις οδούς ή πρωτεΐνες δραστηριοποιούνται στον πνεύμονα εξέλιξη του όγκου [3]. Βάσει του «καρκίνος βλαστοκυττάρων υπόθεση,« Οι όγκοι πιστεύεται ότι προέρχονται μέσω της έκφρασης των βλαστικών κυττάρων ιστο-ειδική [4] – [6]? Με άλλα λόγια, οι όγκοι αποδίδονται σε παράγοντα βλαστοκυττάρων υπερέκφραση [3], [5], [7]. Αξιόπιστες-box 6 (Pax6) είναι ένας σημαντικός παράγοντας μεταγραφής κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης και ένας παράγοντας βλαστικών κυττάρων [3]. Ως εκ τούτου, Pax6 μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση.

Pax6 ανήκει στην οικογένεια γονιδίων PAX, το οποίο κωδικοποιεί μια ομάδα εννέα ζεύγη-box παράγοντες μεταγραφής με σημαντικούς ρόλους στην ανάπτυξη και τη νόσο [3]. Pax6 είναι ένας σημαντικός παράγοντας μεταγραφής σε ανάπτυξη των ματιών, του παγκρέατος, και του κεντρικού νευρικού συστήματος [3], [8]. έκφραση Pax6 βρέθηκε πρόσφατα σε όγκους, γεγονός που υποδηλώνει μια ογκογόνο ρόλο [9]. Pax6 εκφράζεται συχνά σε ρετινοβλάστωμα, παγκρεατικών όγκων, και εντερικής όγκους [6], [10], [11]. Pax6 είναι επίσης εξαιρετικά εκφράζεται στον εγκέφαλο και του καρκίνου του μαστού κυτταρικές γραμμές [9]. Σε παγκρεατικό κυτταρικές γραμμές καρκινώματος, η αναστολή της έκφρασης Pax6 οδηγεί σε μια μείωση στην ανάπτυξη των κυττάρων και την επιβίωση [12]. Pax6 είναι επίσης ένας ρυθμιστής της έκφρασης του υποδοχέα ΜΕΤ κινάσης τυροσίνης σε παγκρεατικά κυτταρικές γραμμές καρκινώματος [12]. ΜΕΤ είναι ένας πιθανός βιοδεικτών και θεραπευτικός στόχος για όγκους, γεγονός που επιβεβαιώνει την ογκογόνο ρόλο των Pax6 στην ογκογένεση [13].

Ήταν αναφερθεί στο παρελθόν ότι PAX8 και PAX5 είναι εντόνως εκφρασμένα σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC ) και μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικές σειρές, αντίστοιχα [14]? αλλά λίγα είναι γνωστά σχετικά με την έκφραση και τη λειτουργία Pax6 στον καρκίνο του πνεύμονα. Σε αυτή τη μελέτη, ερευνήσαμε αν Pax6 ρύθμιση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του NSCLC. Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι Pax6 προωθεί την εξέλιξη G1-S ενεργοποιώντας το σηματοδοτικό μονοπάτι ΜΑΡΚ. Pax6 mRNA ήταν συχνά εκφράζεται σε ιστό καρκίνου του πνεύμονα σε σύγκριση με τα αντίστοιχα γειτονικά μη-νεοπλασματικό ιστό. Αυτό υποδηλώνει ότι Pax6 είναι ένα νέο πιθανός στόχος στον καρκίνο του πνεύμονα.

Υλικά και Μέθοδοι

RPMI 1640, βόειο εμβρυϊκό ορό (FBS), και το αντιδραστήριο ΤπζοΙ αγοράσθηκαν από την Invitrogen (Carlsbad, CA) ? M-MLV αντίστροφη μεταγραφή, ανίχνευση πολλαπλασιασμού κυττάρων CellTiter 96® υδατικό μη ραδιενεργή, ολιγο-άΤ, και dNTP ελήφθησαν από την Promega (Madison, WI)? Δάσκαλος Μείγμα SYBR® Πράσινη PCR ήταν από την Applied Biosystems (Carlsbad, CA)? αντισώματα αντι-Pax6 αγοράστηκαν από Abnova (Taibei, Ταϊβάν), αντι-pRB, -ERK1 /2, p38, -pERK, -pp38, -cyclin D1, και -pRB (S780 φωσφορυλίωση) αντισώματα ελήφθησαν από την Abcam (Cambridge, Αγγλία, Ηνωμένο Βασίλειο)? και ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL) αντιδραστήριο λήφθηκε από την Pierce (Rockford, IL). Ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ), RNase Α, και κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης αγοράστηκαν από τη Sigma (St. Louis, ΜΟ).

Δείγματα

Πενήντα δύο NSCLC δείγματα ελήφθησαν από ασθενείς που υποβάλλονται σε χειρουργική εκτομή στο Πεκίνο στήθος Νοσοκομείο. χρησιμοποιήθηκαν πρωτογενή δείγματα καρκίνου του πνεύμονα και συμφωνημένα, δίπλα φυσιολογικούς ιστούς.

Η μελέτη και η χρήση των δειγμάτων εξετάστηκε και εγκρίθηκε από την Research επιτροπή ηθική στο Πεκίνο Στήθος Νοσοκομείο Capital Πανεπιστήμιο Ιατρικής (Πεκίνο, Κίνα). Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς. Τα κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών παρατίθενται στον Πίνακα 1.

Η

Κυτταρική καλλιέργεια

Ανθρώπινο πνευμονικό αδενοκαρκίνωμα κυτταρικές γραμμές Α549 και ΝΟΙ-Η1299, ανθρώπινο μεγάλο πνεύμονα κυτταρικές γραμμές καρκινώματος ΝΟΙ-Η460 , μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα καρκίνο κυτταρική σειρά NCI-H446, ινοβλάστες πνεύμονα ανθρώπινου εμβρύου (MRC-5) ελήφθησαν από την Εθνική Πλατφόρμα της Πειραματικής κυττάρων Πόρων Sci-Tech. Ανθρώπινα μεγάλο κυτταρικές γραμμές καρκινώματος του πνεύμονα, 95C, 95d και 801D ελήφθησαν από το κέντρο του όγκου της Κινεζικής Ακαδημίας Ιατρικών Επιστημών. Ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα γραμμή Α2 και πλακωδών κυττάρων καρκίνωμα γραμμή L απομονώθηκαν και καθορίστηκε με το εργαστήριο μας. Οι κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS? Gibco, Los Angeles, CA, USA). MRC-5 διατηρήθηκαν σε ΜΕΜ-EBSS συμπληρωμένο με 10% FBS.

Κατασκευή ενός φορέα λεντοϊού Pax6 shRNA και μόλυνση σε κύτταρα

Τέσσερις παρεμβολή RNA (RNAi) αλληλουχιών στόχου υποψήφιος σχεδιάστηκαν με βάση στο ανθρώπινο

Pax6

mRNA αλληλουχίας και κλωνοποιήθηκε στον φορέα pGCSIL-GFP (GeneChem, Σαγκάη, Κίνα). Η αλληλουχία RNAi GAGTAGCGACTCCAGAAGT ήταν η πιο αποτελεσματική στην καταστολή της Pax6 mRNA σε Η1299 και τα κύτταρα Α549, και χρησιμοποιήθηκε σε επόμενα πειράματα για να χτυπήσει κάτω ενδογενή Pax6. Nonsilencing (NS) -μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (shRNA) (TTCTCCGAACGTGTCACGT) επίσης κλωνοποιήθηκε στον φορέα pGCSIL-GFP και χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος (GeneChem). Ο ανασυνδυασμένος ιός συσκευάστηκε σε κύτταρα 293Τ χρησιμοποιώντας σύστημα έκφρασης Lentivector (GeneChem).

Για την κυτταρική μόλυνση, Η1299 και Α549 κύτταρα υποκαλλιεργήθηκαν σε 5000 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες καλλιέργειας των 96 φρεατίων και μολύνθηκαν με φακοϊό μεσολάβηση Pax6-shRNA ή NS-shRNA. Το επίπεδο έκφρασης GFP ανιχνεύθηκε μέσω μικροσκοπίας φθορισμού (Nikon, Tokyo, Japan) για να προσδιοριστεί η αποτελεσματικότητα μόλυνση.

απομόνωση RNA και PCR πραγματικού χρόνου

Το συνολικό RNA από ιστούς και κύτταρα απομονώθηκε με Αντιδραστήριο ΤπζοΙ σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η συνολική συγκέντρωση RNA υπολογίστηκε με τη μέτρηση της OD

260 και τα δείγματα φυλάχθηκαν στους -80 ° C.

Ολικό RNA (2 μα) μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας ένα κιτ M-MLV ανάστροφης μεταγραφάσης σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το cDNA (20 ng) αναμίχθηκε με SYBR® Πράσινο Master Mix, και τα γονίδια ενισχύθηκαν με κατάλληλους εκκινητές χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ανίχνευσης πραγματικού χρόνου PCR (ABI7500? Ϋίβ Technologies, Carlsbad, CA). Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του mRNA Pax6 υπολογίστηκαν με ομαλοποίηση στο επίπεδο mRNA β-ακτίνης. Οι εκκινητές PCR που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ως εξής: Pax6 εμπρός, 5′-TTCAGCACCAGTGTCTACCA-3 ‘? αντίστροφη Pax6, 5’-GCTGTAGGTGTTTGTGAGGG-3 ‘? β-ακτίνη προς τα εμπρός, 5’-TTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3 ‘? και β-ακτίνη αντίστροφη, 5’-GCTGTCACCTTCACCGTTC -. 3 ‘

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

Μια δοκιμασία πολλαπλασιασμού διεξήχθη χρησιμοποιώντας Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού Μη-ραδιενεργού κυττάρου σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, 5000 κύτταρα /φρεάτιο σπάρθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας 96 φρεατίων σε RPMI 1640 που περιείχε 10% FBS. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 5 ημέρες, στη συνέχεια 20 μL του 3- (4,5-διμεθυλο-θειαζολ-2-υλ) -5- (3-καρβοξυμεθοξυφαινυλ) -2- (4-σουλφοφαινυλ) -2Η-τετραζόλιο (MTS) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C για 3 ώρες κάθε 24 ώρες. Η απορρόφηση καταγράφηκε στα 490 nm με μια καθολική αναγνώστη μικροπλάκας (Bio-Rad, Hercules, CA). Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσες τιμές ± SEM.

Colony δοκιμασία σχηματισμού

Τα κύτταρα σπάρθηκαν εις τριπλούν σε 300 κύτταρα /φρεάτιο σε ένα 6-φρεατίων. Μετά από 7 ημέρες καλλιέργειας, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με NaCl (0.9%), χρωματίστηκαν με 2% ιώδες της γεντιανής για 20 λεπτά, πλύθηκε με νερό, και ξηραίνεται στον αέρα. Εστίες μετρήθηκαν με μικροσκοπία. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές και τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± SEM.

Soft-αγάρ δοκιμασίας

Τα κύτταρα (1000) σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων σε 2 κ.εκ. μέσου ανάπτυξης που περιείχε 0,3 % άγαρ και χρησιμοποιήθηκε για να επικαλύψει 1,4-mL στρώσεις μέσο ανάπτυξης που περιέχει 0,6% άγαρ. Μετά από 21 ημέρες καλλιέργειας, οι αποικίες μετρήθηκαν. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσες τιμές ± SEM.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με ψυχρό PBS δύο φορές και σταθεροποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη στους -20 ° C όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν (1500 rpm, 10 min) και πλύθηκε δύο φορές χρησιμοποιώντας ισοτονικό ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού (PBS). Στη συνέχεια, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 0.5 ml PBS που περιείχε 50 μg /mL RNase Α για 1 ώρα στους 37 ° C. Τα κύτταρα φορτώθηκαν στη συνέχεια με 65 μg /mL PI για 30 λεπτά στο σκοτάδι στους 4 ° C. Το ποσοστό των κυττάρων σε διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής (Πεκίνο Προσδιορισμός παραδοσιακή κινεζική ιατρική Research Institute). Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσες τιμές ± SEM.

κηλίδωση Western

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε πέψη με θρυψίνη και φυγοκεντρήθηκε. Το κυτταρικό σφαιρίδιο πλύθηκε δύο φορές με PBS. Στη συνέχεια, τα κύτταρα διασπάστηκαν σε ρυθμιστικό λύσης (10 mM Tris-HCl, ρΗ 7,4, 1 mM EDTA, 0,1% Triton Χ-100, 0.1% SDS και 1 χ κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης) σε πάγο για 15 λεπτά και φυγοκεντρήθηκε στις 12.000 rpm για 20 λεπτά. Το αδιάλυτο υλικό απομακρύνθηκε και οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας κιτ δικιγχονινικού οξέος. Για την ανάλυση Western blot, λύματα κυττάρων (30 μg /φρεάτιο) υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες ηθμού νιτροκυτταρίνης. Οι μεμβράνες επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα (αντι-Pax6, -ERK1 /2, p38, -pERK, -pp38, -cyclin D1, -Rb, ή S780 φωσφορυλίωση -Rb) όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Δευτερογενής αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση ραδικιού χρησιμοποιήθηκαν στη συνέχεια. Σήματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ECL και εκτίθεται σε φιλμ Kodak Χ-ΟΜΑΤ. Τα αποτελέσματα σαρώθηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας την Alpha Προβολή Analysis Tools.

Η στατιστική ανάλυση

Όλες οι τιμές εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM. Μέσω πραγματικού χρόνου RT-PCR, δοκιμασία MTS, σχηματισμός αποικίας, δοκιμασίες μαλακού άγαρ, ανάλυση κυτταρικού κύκλου, και δοκιμασία δυτικού στυπώματος, για σύγκριση μεταξύ των μέσων του 2 ομάδων, στατιστικές διαφορές ελέγχθηκαν με unpaired Student

t

-ΜΕΛΕΤΕΣ. Η στατιστική σημαντικότητα ελέγχθηκε με τη χρήση SPSS Statistics, έκδοση 13.0. P & lt? 0,05 (*) θεωρήθηκε διαφορετικά? P & lt? 0.01 (**) θεωρήθηκε σημαντικά διαφορετικές

Αποτελέσματα

έκφραση του mRNA Pax6 ανεστάλη σε κύτταρα μολυσμένα με τον Pax6 shRNA φορέα λεντοϊού

έκφραση του mRNA Pax6 προσδιορίστηκε. σε αυτη τη ΜΕΛΕΤΗ. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, Pax6 ήταν εντόνως εκφρασμένο σε περισσότερες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα. Σε αντίθεση, MRC-5, ένα φυσιολογικό ανθρώπινο εμβρυϊκό πνεύμονα κυτταρική σειρά ινοβλαστών, δεν εκφράζουν Pax6 (Σχήμα 1Α).

Α, Real-time PCR ανάλυση για το επίπεδο έκφρασης του mRNA Pax6 σε Η460, Α2, 95C , 95d, Η1299, Η446, 801 Α, Α549, και L σειρές καρκίνου του πνεύμονα, καθώς επίσης και στο φυσιολογικό ανθρώπινο εμβρυϊκό πνεύμονα κυτταρική σειρά ινοβλαστών MRC-5. Β, -C, Επιβεβαίωση του mRNA Pax6 knockdown με πραγματικού χρόνου RT-PCR δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν σε ολικό RNA που απομονώθηκε από Α549 (Β) και Η1299 (C) κύτταρα μολυσμένα με Pax6-shRNA, ή ένα τυχαίο shRNA. Τα επίπεδα έκφρασης του mRNA Pax6 σε Α549 και κύτταρα Η1299 μετρήθηκαν με ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR. Ο γ-άξονας αντιπροσωπεύει την κανονικοποιημένη mRNA Pax6 έκφρασης σε σχέση με Α549 (Β) ή κύτταρα Η1299 (C). ** P & lt? & Lt? 0,01. D, τα επίπεδα πρωτεΐνης του Pax6 προσδιορίστηκαν με κηλίδωση Western και το επίπεδο έκφρασης GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Η ποσοτικοποίηση έγινε με προσδιορισμό του γκρίζου επιπέδου της πρωτεΐνης Pax6 οποία κανονικοποιήθηκε έναντι των επιπέδων GAPDH. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM των ανεξάρτητων πειραμάτων (οι χρόνοι των πειραμάτων που αναφέρονται παραπάνω ιστογράμματα). έκφραση Pax6 προφανώς εξασθένησε σε Α549 Pax6 KD και Η1299 Pax6 KD κύτταρα.

Η

Για να διευκρινιστεί αν η έκφραση Pax6 έχει καμία επίδραση στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα, RNAi χρησιμοποιήθηκε για να δημιουργήσει Pax6 knock-down ( Pax6 KD) κυτταρικές σειρές. Έχουμε επιλέξει κυτταρικές γραμμές δύο στόχους: Η1299, η οποία έδειξε υψηλά επίπεδα έκφρασης Pax6, και Α549, τα οποία έδειξαν χαμηλά επίπεδα έκφρασης. Στην παρούσα μελέτη, pGCSIL-Pax6 shRNA-GFP είχε προσβληθεί σε Η1299 και Α549 κύτταρα. Τα κύτταρα επίσης μολύνθηκαν με pGCSIL-NS shRNA-GFP (Pax6 NS) ως αρνητικός έλεγχος (NC). Για τον προσδιορισμό της λειτουργίας των Pax6, Η1299, H1299NC, Α549, ή κύτταρα A549NC χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες σε όλες τις δοκιμασίες.

Το επίπεδο του mRNA Pax6 σε Η1299 Pax6 KD και κύτταρα KD Α549 Pax6 προσδιορίστηκε με πραγματικού χρόνου PCR να επιβεβαιώσει αν η έκφραση Pax6 ανεστάλη συγκεκριμένα μέσω RNAi στο Α549 και κύτταρα Η1299. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β, έκφραση Pax6 σε κύτταρα Α549 KD Pax6 ανεστάλη κατά 80-90% σε σύγκριση με κύτταρα μολυσμένα με φακοϊό μεσολάβηση NS-shRNA. Βρήκαμε παρόμοια αποτελέσματα στα κύτταρα Η1299 Pax6 KD. έκφραση mRNA Pax6 σε αυτά τα κύτταρα αναστέλλεται επίσης από 90-95% σε σύγκριση με κύτταρα NC (*

* Ρ

& lt? 0,01? Σχήμα 1 C).

έκφραση πρωτεΐνης Pax6 σε αυτά τα κύτταρα ήταν ανιχνεύεται με κηλίδωση Western. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1ϋ, πρωτεΐνη Pax6 σε Η1299 Pax6 KD και κύτταρα Α549 KD Pax6 δεν ανιχνεύθηκε εύκολα, ενώ μία σαφής ζώνη πρωτεΐνης Pax6 ήταν εμφανής στα κύτταρα ελέγχου.

Η αναστολή της έκφρασης Pax6 οδηγεί σε μείωση της τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων

Pax6 είναι ένας κρίσιμος παράγοντας μεταγραφής που παίζει σημαντικό ρόλο στην ρύθμιση πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης κατά τη διάρκεια της ανθρώπινης εμβρυϊκής ανάπτυξης [3]. Μία δοκιμασία πολλαπλασιασμού κυττάρου διεξήχθη για να προσδιοριστεί εάν Pax6 παίζει ρόλο στην κυτταρική ανάπτυξη. Α549 Pax6 KD, Η1299 Pax6 KD, και έλεγχος τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και δραστικότητα κυτταρικού πολλαπλασιασμού μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ Δοκιμασία Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού. Α549 και την ανάπτυξη των κυττάρων Η1299 είχε προφανώς κατασταλεί όταν η έκφραση Pax6 ανεστάλη από RNAi (Σχήμα 2Α και Β). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α και Β, η μείωση του ρυθμού αύξησης των κυττάρων που προκαλείται από την αναστολή της έκφρασης Pax6 σε Η1299 ήταν πολύ ισχυρότερη από ότι σε κύτταρα Α549. Αυτά τα διαφορετικά αποτελέσματα μπορούν να αποδοθούν στα διαφορετικά επίπεδα έκφρασης Pax6 μεταξύ Η1299 και Α549 κύτταρα εμφανίζονται στο Σχήμα 1Α και D.

Α, -Β, Α549 Pax6 KD, κύτταρα Η1299 Pax6 KD, και κύτταρα ελέγχου σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων και μια δοκιμασία MTS διεξήχθη. Η απορρόφηση στα 490 nm (άξονα y) μετρήθηκε σε διαστήματα 24 ωρών, έως 120 ώρες. C, -D, αποτελεσματικότητα σχηματισμού αποικίας σε Α549 Pax6 KD, κύτταρα Η1299 Pax6 KD, και κύτταρα ελέγχου. Η άξονα y αντιπροσωπεύει το κανονικοποιημένο ρυθμό σχηματισμού αποικίας σε σχέση με το Α549 (C) ή κύτταρα Η1299 (D). E, -F, ένα μαλακό -agar δοκιμασία εκτελέστηκε για να διερευνήσει τις επιδράσεις της Pax6 επί ογκογένεση in vitro. Η άξονα y αντιπροσωπεύει την κανονικοποιημένη μαλακό -agar ταχύτητα σχηματισμού αποικιών σε σχέση με κύτταρα Η1299 (F) Α549 (Ε) ή. Τα δεδομένα εκφράζονται ως το μέσο ± SEM από τρία ξεχωριστά πειράματα. Οι χρόνοι των πειραμάτων που αναφέρονται παραπάνω γράφημα * P & lt?. 0.05, ** P & lt?. 0.01

Η

Ο μειωμένος σχηματισμός αποικίας και σχηματισμού μαλακό άγαρ των αποικιών σε κύτταρα Pax6 KD

σχηματισμό αποικιών αντιπροσωπεύει μια απώλεια της αναστολής επαφής ή την ικανότητα να διατηρηθεί η ανάπτυξη των κυττάρων και την κυκλοφορία παρά επαφή με τον περιβάλλοντα κύτταρα. Για να διευκρινιστεί εάν Pax6 μπορούσε παρέχουν απώλεια αναστολής επαφής, κύτταρα μολυσμένα με pGCSIL-Pax6 shRNA-GFP, καθώς και κύτταρα ελέγχου τους σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και καλλιεργήθηκαν για 7 ημέρες. Μετά από 2% χρώση βιολετί γεντιανή, αποικίες που περιέχουν περισσότερο από 50 κύτταρα μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο φωτός. Όπως εμφανίζεται στο Σχήμα 2C και D, η αναστολή της έκφρασης Pax6 σε Α549 και Η1299 κυττάρων οδήγησε σε εμφανή μείωση του αριθμού των εστιών δημιουργείται σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (*

* Ρ

& lt? 0,01).

για την περαιτέρω μελέτη της λειτουργίας των Pax6, σχηματισμός μαλακό άγαρ αποικία αναλύθηκε για να προσδιοριστεί αν Pax6 συνέβαλε στο σχηματισμό αποικιών από αγκύρωση ανεξάρτητος σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Ο ρυθμός σχηματισμού μαλακού άγαρ αποικία μειώθηκαν σε Α549 Pax6 KD και κυττάρων Η1299 Pax6 KD σύγκριση με τα κύτταρα NC (*

* Ρ

& lt? 0,01,

* Ρ

& lt? 0,05? Σχήμα 2Ε και F).

έκφραση Pax6 αυξημένη κυτταρική ανάπτυξη με την προώθηση της ταχύτερης εξέλιξης σε φάση S του κυτταρικού κύκλου

για να ανιχνευθεί η επίδραση των Pax6 για την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου του Α549 Pax6 KD, Η1299 Pax6 KD, Α549 Pax6 NC, Η1299 Pax6 NC, Α549, και Η1299 κύτταρα αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, το ποσοστό των κυττάρων που εισέρχονται στην S φάση μειώθηκε στα Α549 κυτταρική γραμμή Pax6 KD μαζί με μια αύξηση στον πληθυσμό των κυττάρων G0-G1 φάση. Ένα παρόμοιο αποτέλεσμα παρατηρήθηκε σε Η1299 Pax6 KD, Η1299 Pax6 NC, και τα κύτταρα Η1299 (Σχήμα 3Β). Σε αυτά τα πειράματα, η έκφραση Pax6 οδήγησε στην ανάπτυξη των κυττάρων επάγοντας την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου.

Α, Β, ανάλυση κυτταρικού κύκλου. Τα κύτταρα βάφτηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) και αναλύθηκαν για διανομή φάση του κυτταρικού κύκλου. Το ιστόγραμμα ήταν τα στατιστικά στοιχεία από τρεις ανεξάρτητες πειραματικών αντιγράφων. * P & lt? 0.05, ** P & lt?. 0.01

Η

Σε αυτή τη μελέτη, το επίπεδο έκφρασης της κυκλίνης D1, σχετικής κυκλίνης ρυθμίζουν G1-S εξέλιξη [15], [16], ήταν ανιχνεύθηκαν σε Α549 Pax6 KD και Η1299 Pax6 KD κύτταρα. Όπως υποδεικνύεται στο Σχήμα 4Α, η έκφραση της κυκλίνης D1 ήταν μειωμένη σε κυτταρικές σειρές Α549 Pax6 KD σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Βρήκαμε ένα παρόμοιο αποτέλεσμα σε Η1299 Pax6 KD κύτταρα (Σχήμα 4Α). Ένα άλλο σχετικό κυκλίνης ρυθμίζουν /S εξέλιξη G1 είναι κυκλίνης Ε [17]. Πρέπει επίσης να καθοριστεί αν η κυκλίνη Ε ρυθμίζονται από την έκφραση Pax6. Ως αποτέλεσμα, η έκφραση της κυκλίνης Ε δεν επηρεάστηκε από την σταθερή shRNA μεσολάβηση knockdown του Pax6 στον καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτό αποδεικνύει ότι θα μπορούσε να Pax6 προάγουν την ανάπτυξη των κυττάρων με διέγερση έκφρασης κυκλίνης D1.

Α, Β, η έκφραση της κυκλίνης D1, pRB και φωσφορυλιωμένου pRB σε Α549 Pax6 KD, Α549 NC, κύτταρα Α549, καθώς και Η1299 PAX6KD , H1299NC, Η1299 κυττάρων προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western. β-ακτίνης επίπεδο έκφρασης GAPDH και μετρήθηκε ως εσωτερικοί έλεγχοι φόρτωσης αντίστοιχα. επίπεδα κυκλίνης D1 και pRB μετρήθηκαν με το γκρίζο επίπεδο και ομαλοποιήθηκαν από τους εσωτερικούς ελέγχους φόρτωσης. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM. Οι χρόνοι των πειραμάτων που αναφέρονται παραπάνω ιστογράμματα. * P & lt? 0.05, ** P & lt?. 0.01

Η

Το κύριο υπόστρωμα της κυκλίνης D1-CDK4 /6 σύμπλοκα είναι η πρωτεΐνη ρετινοβλαστώματος (pRB) [18]. Έτσι, η φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης pRB S780 ανιχνεύθηκε επίσης με κηλίδωση Western (Σχήμα 4Β). Η φωσφορυλίωση S780 του pRB μειώθηκε όταν η έκφραση Pax6 αναστάλθηκε σε κύτταρα Α549. Ένα παρόμοιο αποτέλεσμα ελήφθη όταν τα κύτταρα Η1299 Pax6 KD χρησιμοποιήθηκαν (Εικόνα 4Β).

σηματοδοτικό μονοπάτι ΜΑΡΚ καταστάλθηκε από την αναστολή της Pax6

Η ΜΑΡΚ (μιτογόνα ενεργοποιημένη πρωτεϊνική κινάση) οδός υπήρξε εμπλέκεται στη ρύθμιση των μεταβάσεων G1 /S και κυτταρική μίτωση [19]. Στη μελέτη μας, ορισμένες κεντρικές ρυθμιστικά μόρια του ΜΑΡΚ εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας ανάλυση κηλίδος Western. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5, τα επίπεδα φωσφορυλίωση των ERK1 /2 και p38 μειώθηκαν τόσο στην Α549 Pax6 KD και κυττάρων Η1299 Pax6 KD. Επισήμανε ότι το σήμα ΜΑΡΚ αποδυναμώθηκε προέκυψε από την παρεμβολή RNAi του Pax6.

ανάλυση Western κηλίδας του Α549, Α549 NC, Α549 Pax6 KD, Η1299, H1299NC, Η1299 Pax6 KD με αντισώματα για την ERK1 /2 ( Α), ρ38 (Β) και φωσφορυλιωμένες μορφές τους παρουσιάστηκαν στο σχήμα. GAPDH και β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικοί έλεγχοι φόρτωσης αντίστοιχα. επίπεδα ERK1 /2 και p38 ομαλοποιήθηκαν με GAPDH και β-ακτίνης, αντίστοιχα. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές. * Ρ & lt? 0,05, ** Ρ & lt?. 0.01

Η

Pax6 ήταν εντόνως εκφρασμένο σε ιστό καρκίνου του πνεύμονα

Pax6 mRNA σε ιστό καρκίνου του πνεύμονα, καθώς και συμφωνημένα γειτονικό ιστό, ανιχνεύθηκε για να επιβεβαιώσει το ρόλο της Pax6 στον καρκίνο του πνεύμονα. Τα κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών 52 παρατίθενται στον Πίνακα 1. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Α, το mRNA Pax6 εκφράζεται σε αφθονία στον ιστό του όγκου, σε σύγκριση με παρακείμενες φυσιολογικούς ιστούς. Η έκφραση του Pax6 αντιπροσωπεύεται από ένα nontumorous αναλογία καρκινικού ιστού-προς-παρακείμενες για κάθε άτομο ήταν υποδεικνύεται στο Σχήμα 5Β. έκφραση Pax6 σε ιστό καρκίνου του πνεύμονα ήταν υψηλότερη από ότι σε κάθε συμφωνημένα παρακείμενο φυσιολογικό ιστό σε όλες εκτός από τρεις περιπτώσεις (Σχήμα 6Β). Τα αποτελέσματα στατιστική εισήχθησαν στον πίνακα 2 και ο λόγος (όγκος /γειτονικό ιστό) του 65% των ασθενών (34 δείγματα) υπερέβη 100. Δηλαδή, στις περισσότερες περιπτώσεις, Pax6 εκφράστηκε κυρίως σε ιστούς καρκίνου του πνεύμονα.

Α, σε πραγματικό χρόνο PCR ανάλυση του επιπέδου Pax6 έκφρασης σε ιστούς καρκίνου του πνεύμονα, καθώς και τα συμφωνημένα παρακείμενους ιστούς, από 52 ασθενείς. Το επίπεδο του mRNA Pax6 ομαλοποιήθηκε με επίπεδο έκφρασης β-ακτίνης. Β, κάθε στήλη αντιπροσωπεύει τη σχετική αναλογία του mRNA Pax6 σε πρωτογενείς NSCLC έναντι παρακείμενο πνευμονικό ιστό, και η γραμμή κατά μήκος του γραφήματος αντιπροσωπεύει την τιμή 1 και 10 αντίστοιχα. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές. ** P & lt?. 0.01

Η

Συζήτηση

Στη μελέτη μας, η λειτουργία του Pax6 στα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα διερευνήθηκε. Η ικανότητα ανάπτυξης των Α549 και κύτταρα Η1299 απορρίφθηκε όταν η έκφραση Pax6 ανεστάλη από συγκεκριμένους Pax6 shRNA. Προτείνουμε Pax6 προωθεί την εξέλιξη G1-S ενεργοποιώντας το σηματοδοτικό μονοπάτι ΜΑΡΚ. Και Pax6 ήταν άκρως εκφράζεται σε πνεύμονα ιστούς του καρκίνου και καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικών σειρών.

Η Pax6 μεταγραφικός παράγοντας παίζει διαφορετικούς ρόλους σε διαφορετικούς όγκους. Είναι συχνά εκφράζεται σε καρκίνο του παγκρέατος και ρετινοβλάστωμα κύτταρα, εμπλέκοντας ένα ογκογόνο λειτουργία, ενώ Pax6 αναγνωρίζεται ως καταστολέας όγκων σε γλοιώματα και του καρκίνου του προστάτη [6], [10], [11], [20], [21] .PAX6 έκφραση μειώνεται σημαντικά σε γλοιοβλαστώματα και το επίπεδο έκφρασης συσχετίζεται με μεγαλύτερη επιβίωση των ασθενών [22]. Pax6 καταστέλλει την ανάπτυξη γλοιοβλαστώματος κυττάρων, ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη και γλοιώματος αγγειογένεση καθώς και διεισδυτικότητα του κυττάρου γλοιοβλάστωμα, μέσω αναστολής της μεταλλοπρωτεϊνάσης-2 (ΜΜΡ2) έκφραση και αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα Α (VEGFA) έκφραση [20], [23], [24]. Στον καρκίνο του προστάτη, η έκφραση Pax6 ήταν χαμηλότερη σε καρκινικούς ιστούς και κυτταρικές σειρές καρκίνου από τα φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα [21]. Η υπερέκφραση του Pax6 κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό και αποικία σχηματισμό κυττάρων καρκίνου του προστάτη [8].

Αλλά Pax6 διαδραματίζει ογκογόνο ρόλο στην παγκρεατικό καρκίνο και ρετινοβλάστωμα [4], [22] .Στην παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα και παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές , προς τα κάτω ρύθμιση των Pax6 από συγκεκριμένες siRNA οδηγεί σε μια μείωση στην ανάπτυξη των κυττάρων και την κυτταρική απόπτωση [12]. Η μεθυλίωση του Pax6-υποκινητών είναι αυξημένη σε πρώιμο καρκίνο της ουροδόχου κύστης και μεθυλιωμένα Pax6-υποκινητές θα μπορούσε να είναι ένας βιολογικός δείκτης αντιπροσωπεύει για τη νόσο αυτή [25]. Και η καταστολή της έκφρασης του mRNA Pax6 οδήγησε σε αναστολή της ανάπτυξης και αυξημένη απόπτωση των καλλιεργημένα ανθρώπινα κύτταρα ρετινοβλάστωμα [26]. Τα ευρήματά μας αποκαλύπτουν επίσης ότι Pax6 εμπλέκει ένα ογκογόνο λειτουργία στον καρκίνο του πνεύμονα. Στα αποτελέσματα μας, Pax6 το mRNA εκφράζεται έντονα σε αμφότερες πνεύμονα καρκινικούς ιστούς και κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα. Α549 και Η1299 κυτταρική ανάπτυξη αναστάλθηκε από ειδικές Pax6 shRNA. Η καταστολή της έκφρασης Pax6 οδηγούν σε μειωμένη ανάπτυξη των κυττάρων και σχηματισμό αποικιών, καθώς και ο σχηματισμός αποικίας αγκύρωση-ανεξάρτητη. Αλλά τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι η απόπτωση των κυττάρων δεν επηρεάστηκε από την αναστολή της Pax6 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Και η κυτταρική μετανάστευση επίσης δεν επηρεάζεται από την καταστολή της Pax6 mRNA (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται)

Pax6 είναι καρκίνος που εξαρτάται από και έχει διαφορετικές οδούς σηματοδότησης σε διαφορετικούς όγκους [13], [20] – [24]., [26]. Σε κύτταρα HeLa, Pax6 ρυθμίζει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου με αποσπά την έκφραση της ανθρώπινης RFPL1 (hRFPL1), η οποία ρυθμίζει προς τα κάτω την κυκλίνη Β1 και έκφραση Cdc2 και οδηγεί στη συσσώρευση των κυττάρων στη φάση G2-M [27]. Μπορούμε επίσης επικεντρώθηκε στο ρόλο του Pax6 στη ρύθμιση της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου σε καρκίνο του πνεύμονα. Στην ανάλυση του κυτταρικού κύκλου μας, κυκλίνη D1 κατεστάλη στο Α549 Pax6 KD και τα κύτταρα Η1299 Pax6 KD. Ανέφερε ότι η έκφραση Pax6 προώθησε την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου από τη μετάβαση των κυττάρων από G1 προς S φάση. Συνεπής με τα ευρήματα αυτά, η ανάλυση του κυτταρικού κύκλου έδειξαν σημαντική μείωση της G0 /G1 σύλληψη και μια σημαντική επαγωγή της G2 /M σύλληψη στην Pax6 υπερέκφραση ανθρώπινα κύτταρα ρετινοβλάστωμα [28].

Η κυκλίνη D1-CDK4 και κυκλίνη D1- συγκροτήματα CDK6 στις αρχές του να φωσφορυλιώνει φάση μέσα G1 και αδρανοποιούν pRB [29], [30]. Τα ευρήματά μας σε αυτή τη μελέτη εμπλέκουν ότι το επίπεδο φωσφορυλίωσης pRB S780 αποδυναμώθηκε όταν η έκφραση Pax6 ανεστάλη. Έτσι, αποδεικνύεται ότι Pax6 αύξησε την έκφραση της κυκλίνης D1 και αυξημένη ανάπτυξη των κυττάρων με την προώθηση της μετάβασης G1-S. Μιτογόνο-επαγόμενη σηματοδότηση Ras προάγει τη μεταγραφή του γονιδίου της κυκλίνης D1 και αυτό εξαρτάται από το μονοπάτι ΜΑΡΚ σήματος [31]. Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι η αναστολή του Pax6 μειώνει το επίπεδο φωσφορυλίωση των ERK1 /2 και p38. Αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι Pax6 ρυθμίζει κελί G1 /S εξέλιξη μέσω της ΜΑΡΚ μονοπάτι σήματος σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.

Ωστόσο, ο ρυθμιστικός μηχανισμός Pax6 στον καρκίνο του πνεύμονα είναι ακόμα ασαφής. Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι Pax6 προάγει την ανάπτυξη των κυττάρων με την ενεργοποίηση του γονιδίου του υποδοχέα της κινάσης της τυροσίνης ΜΕΤ σε παγκρεατικό καρκίνωμα [13]. Σε καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα, ERK1 /2 σηματοδοτικό μονοπάτι εμπλέκεται στο μονοπάτι ΜΕΤ [32]. εύρημα μας έδειξε ότι ERK1 /2 ενεργοποιήθηκε από την έκφραση Pax6. Έτσι ώστε να υποθέσουμε ότι Pax6 ενεργοποιεί ΜΑΡΚ σηματοδότησης και προωθεί την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου μέσω της γονιδιακής μεταγραφής ΚΟΑ στον καρκίνο του πνεύμονα

Pax6 εκφράζεται κυρίως κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης.? λίγο ή καθόλου πρωτεΐνη Pax6 ανιχνεύεται σε ιστούς ενηλίκων [3]. Όπως Pax6 εκφράζεται συχνά σε όγκους [9], προσδιορίσαμε το επίπεδο Pax6 σε πρωτογενείς ιστούς καρκίνου του πνεύμονα. Το επίπεδο έκφρασης Pax6 σε συμφωνημένα γειτονικούς ιστούς μετρήθηκε ως μάρτυρας. Παρόμοια με όγκους του παγκρέατος, η έκφραση Pax6 ήταν ισχυρότερη σε ιστούς καρκίνου του πνεύμονα από ό, τι σε γειτονικούς ιστούς. Η nontumorous αναλογία καρκινικού ιστού-προς-γειτονικά της έκφρασης mRNA Pax6 για κάθε άτομο υπολογίστηκε. Μόνο 3 λόγοι ήταν λιγότερο από 1 και οι περισσότερες από τις αναλογίες ήταν πολύ πάνω από 100. Όλα αυτά τα ευρήματα έδειξαν ότι Pax6 λειτούργησε ως ογκογόνο παράγοντα στον καρκίνο του πνεύμονα.

Συμπεράσματα

Σε αυτή τη μελέτη, αναφέρουμε ότι η αυξημένη έκφραση του Pax6 σημειώθηκε σε πρωτεύοντες ιστούς καρκίνου του πνεύμονα. Pax6 προωθείται ανάπτυξη των κυττάρων με την ενεργοποίηση της ΜΑΡΚ σηματοδότησης και επιταχύνοντας την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου. Επιπλέον, Pax6 ρυθμίζεται εξέλιξη G1-S με διέγερση έκφρασης κυκλίνης D1 και φωσφορυλίωση pRB. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι Pax6 είναι ένας νέος πιθανός στόχος στον καρκίνο του πνεύμονα.

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς θα ήθελαν να ευχαριστήσω Meng Gu για βοήθεια σχετικά με τη συλλογή δειγμάτων.