Αφηρημένο

μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (SCLC) είναι μια ιδιαίτερα επιθετική νεοπλάσματα του πνεύμονα με εξαιρετικά κακή κλινική έκβαση και δεν ενέκρινε στοχευμένες θεραπείες. Για τη διαλεύκανση των μηχανισμών που ευθύνονται για την οδήγηση του φαινοτύπου SCLC με τις ελπίδες της αποκάλυψης νέων θεραπευτικών στόχων, μελετήσαμε αριθμό αντιγράφων και προφίλ μεθυλίωσης του SCLC. Βρήκαμε διακοπή του /Rb μονοπάτι E2F ήταν ένα ιδιαίτερο χαρακτηριστικό απελευθερωθεί στο 96% των δειγμάτων SCLC διερευνηθεί και συνδέθηκε έντονα με αυξημένη έκφραση του ΕΖΗ2, ενός ογκογονιδίου και βασικό μέλος της Polycomb κατασταλτική συγκρότημα 2 (PRC2). Μέσω καταλυτικό ρόλο του στο συγκρότημα PRC2, ΕΖΗ2 κανονικά λειτουργίες να σιγήσει επιγενετικώς γονιδίων κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης, ωστόσο, σιωπές παρεκκλίνοντα γονίδια σε ανθρώπινους καρκίνους. Εμείς παρέχουν αποδείξεις που υποστηρίζουν ότι ΕΖΗ2 είναι λειτουργικά ενεργά σε SCLC όγκους, ασκεί pro-ογκογόνο λειτουργίες

in vitro

, και συνδέεται με την παρεκκλίνουσα προφίλ μεθυλίωση των γονιδίων στόχων PRC2 ενδεικτική μιας «-βλαστικού κυττάρου όπως το» προφίλ hypermethylator στο SCLC όγκους. Επιπλέον, λεντοϊού μεσολάβηση knockdown του ΕΖΗ2 κατέδειξαν μία σημαντική μείωση στην ανάπτυξη του SCLC κυτταρικών γραμμών, υποδηλώνοντας ΕΖΗ2 έχει έναν βασικό ρόλο στην οδήγηση SCLC βιολογία. Συμπερασματικά, τα δεδομένα μας επιβεβαιώνουν το ρόλο της ΕΖΗ2 ως κρίσιμη ογκογονιδίου σε SCLC, και στηρίζει την ιεράρχηση των ΕΖΗ2 ως πιθανό θεραπευτικό στόχο στην κλινική νόσο

Παράθεση:. Coe BP, Πέμ KL, Aviel- Ronen S, Βούτσιτς ΕΑ, Gazdar AF, Lam S, et al. (2013) Γονιδιωματική Απελευθέρωση της E2F /Rb δρόμος οδηγεί στην ενεργοποίηση του ογκογονιδίου ΕΖΗ2 σε μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 8 (8): e71670. doi: 10.1371 /journal.pone.0071670

Επιμέλεια: Srikumar Π Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center & amp? Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 14 Ιανουαρίου 2013? Αποδεκτές: 2 Ιούλη, 2013? Δημοσιεύθηκε: 15 Αυγ του 2013

Copyright: © 2013 Coe et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το καναδικό Ινστιτούτο Έρευνας Υγείας (CIHR). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (SCLC) είναι ένα ιδιαίτερα επιθετικό νεόπλασμα του πνεύμονα με εξαιρετικά κακή κλινική έκβαση, η οποία έχει δει μικρή βελτίωση κατά τη διάρκεια των τελευταίων 25 ετών [1]. Λόγω της μοναδικής κλινική πορεία της, SCLC είναι συχνά σταδιακή χρησιμοποιώντας ξεχωριστό σύστημα κλινικής σταδιοποίησης από το πρότυπο σύστημα ΤΝΜ που χρησιμοποιείται για τις περισσότερες μορφές καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων όλων των μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), είτε ως περιορισμένη (33%) ή εκτεταμένη (67% ) στάδιο της νόσου με βάση την έκταση της εξάπλωσης του όγκου. Ασθενείς με περιορισμένη στάδιο της νόσου έχουν μια μέση επιβίωση 18 μηνών, ενώ για ασθενείς με εκτεταμένη στάδιο είναι μόλις 9 μηνών [2] – [4]. Λόγω πολύ επιθετική φύση του, η χειρουργική επέμβαση είναι σπάνια εκτελείται και χημειοθεραπεία με ή χωρίς ταυτόχρονη ακτινοθεραπεία είναι η συνηθισμένη θεραπεία. Παρά SCLC αρχικά παρουσιάζοντας ως χημειο-ευαίσθητο νόσου, σχεδόν όλοι οι ασθενείς υποτροπιάζουν μετά την αρχική θεραπεία, και δεν έχουν στοχευμένες θεραπευτικές ουσίες έχουν εγκριθεί για SCLC μέχρι σήμερα [5] – [9]. Ως εκ τούτου νέους στόχους για θεραπευτική παρέμβαση χρειάζονται επειγόντως για αυτή την ασθένεια.

Η ταυτοποίηση των ογκογονιδίων που ενεργοποιούνται επιλεκτικά και ότι λειτουργικά οδηγούν φαινότυποι όγκου, κάνουν ιδανικό θεραπευτικοί στόχοι για τους ασθενείς που φέρουν αυτές τις εκτροπές. Στο NSCLC, η ανακάλυψη αυτών των γεγονότων έχει οδηγήσει στην ανάπτυξη και την εφαρμογή στοχευμένων χημειοθεραπείες, που μεταφράζεται σε βελτιωμένη ελεύθερη εξέλιξης και τη συνολική επιβίωση για NSCLC για επιλεγμένους ασθενείς [10]. Πρόσφατες γονιδιακό προφίλ του προς το σκοπό αυτό στο SCLC έχουν αποκαλύψει χιλιάδες μεταλλάξεις και διαγραφές, που συμβαίνουν σε πολλαπλά μονοπάτια ογκοκατασταλτικό (π.χ..

TP53

,

RB1 ​​

,

PTEN

,

EPHA7

), και τα γονίδια που εμπλέκονται στην τροποποίηση της χρωματίνης (π.χ..

CREBBP

,

MLL

), καθώς και επιμηκύνσεις σε υποθετική SCLC γονίδια οδηγός του καρκίνου, όπως

SOX2

[5], [8]. Αυτά τα ευρήματα είναι σημαντικά και μπορεί να οδηγήσει στην ανάπτυξη και την εφαρμογή νέων στοχευμένων θεραπειών για πολύ συγκεκριμένες υποομάδες των SCLC ασθενείς, ωστόσο η διαλεύκανση ενός πιο πανταχού ενεργοποιημένο στόχο σε SCLC θα ήταν ακόμη πιο ευεργετική.

επίπεδο DNA αδρανοποίηση της TSG

RB1 ​​

είναι σχεδόν καθολική σε SCLC. RB1 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό κανονικά μέσω της αναστολής των E2F μεταγραφικών παραγόντων. Τα μέλη της οικογένειας E2F συνήθως υπερεκφράζεται σε διάφορους όγκους, συμπεριλαμβανομένων των SCLC [11] – [15]. Εργασία από εμάς και άλλους εντόπισε κέρδη επίπεδο του DNA των

E2F

μέλη της οικογένειας σε SCLC κύτταρα γραμμών, όγκων και ποντικού μοντέλα [5], [16]. ΕΖΗ2, βασικό μέλος της Polycomb κατασταλτική συγκρότημα 2 (PRC2), είναι μεταγενέστερος στόχος του /E2F συγκρότημα Rb1. ΕΖΗ2 είναι κρίσιμη για την διατήρηση των επιγενετικών εμβρυϊκό κύτταρο «stem-κότητας» και την καθιέρωση της ειδικότητας γράμμωσης κατά τη διάρκεια της φυσιολογικής ανάπτυξης.

ΕΖΗ2

έχει πρόσφατα καθιερωθεί ως ένα ογκογονίδιο οδηγού, όπου συμμετέχουν στην παρεκκλίνουσα υπερμεθυλίωση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων (ΕΠΠΕ) σε πολλαπλούς τύπους καρκίνου. Η υπερέκφραση του ΕΖΗ2 περιγράφηκε πρόσφατα στο SCLC, όπου έχει προταθεί ως νέο SCLC θεραπευτικός στόχος [11].

Οι μηχανισμοί που διέπουν ΕΖΗ2 υπερκινητικότητα έχουν εντοπιστεί σε άλλους καρκίνους και περιλαμβάνουν μετάλλαξη του

ΕΖΗ2

η ίδια που προκαλεί υπερ-ενεργοποίηση των ιστονών τροποποίηση των ικανοτήτων του και φαινοτύπων hypermethylator DNA που σχετίζονται με την κακή έκβαση, χημειοθεραπεία αντίσταση και άκρως επιθετικό φαινότυπο όγκου. Να διερευνήσει τους μηχανισμούς οδήγησης ενεργοποίηση ΕΖΗ2 και να επιβεβαιώσει την ογκογόνο ρόλο της ΕΖΗ2 σε SCLC, μελετήσαμε αντίγραφο προφίλ αριθμό 14 SCLC όγκους και 14 SCLC κυτταρικές σειρές και αξιολογείται η βιωσιμότητα των κυττάρων μετά από ΕΖΗ2 νοκ ντάουν. Βρήκαμε ότι η διακοπή επίπεδο DNA της E2F /Rb συστατικά της οδού, είτε με την απώλεια του

RB1 ​​

ή ενίσχυση του

E2F

, παρατηρήθηκε στο 100% των δειγμάτων SCLC διερευνώνται, το οποίο βρήκαμε συνδέονται στενά με αυξημένη έκφραση του ΕΖΗ2. Επιβεβαιώνουμε ένα λειτουργικό ογκογόνο ρόλο για ΕΖΗ2 σε SCLC, και των συναφών και το DNA προφίλ hypermethylator για SCLC όγκους. Προτείνουμε ότι η γονιδιωματική διακοπή της E2F /Rb οδηγεί στην ενεργοποίηση του μεθυλοτρανσφεράση ΕΖΗ2 ιστονών που λειτουργεί ως ογκογονίδιο σε SCLC, υποστηρίζοντας περαιτέρω την υπόσχεσή του ως θεραπευτικός στόχος για SCLC ασθενείς.

Μέθοδοι

Προμήθεια Δείγμα και Array Συγκριτική Γονιδιωματική υβριδοποίηση

Μια μεγάλη πλειοψηφία των SCLC ασθενείς δεν είναι υποψήφιοι για χειρουργική επέμβαση, έτσι μόνο αρχειακό δείγματα βιοψίας είναι διαθέσιμα. Μια ομάδα 14 φορμόλη-σταθερές και ενσωματωμένα σε παραφίνη δείγματα όγκου SCLC λήφθηκαν από το αρχείο του Πανεπιστημίου Δικτύου Υγείας (UHN) Τμήμα Παθολογίας, με ένα πρωτόκολλο μελέτης εγκεκριμένο από το Διοικητικό Συμβούλιο Δεοντολογίας UHN, τα οποία δεν απαιτούν ειδική πληροφορημένες συγκαταθέσεις για τα υλικά από πριν από το 2000 και οι ασθενείς οι οποίοι είχαν αποβιώσει (Πίνακας S1). πυρήνες ιστού που επιλέγεται από τις περιοχές του μπλοκ του όγκου η οποία απέδειξε επαρκούς καθαρότητας για έναν πυρήνα 2 mm. Μετά την ιστολογική αξιολόγηση, τα δείγματα εκχυλίστηκαν με πρότυπες ξυλόλιο βασίζεται αποπαραφινώσεως και τυπική πρωτεϊνάση Κ πρωτόκολλο εκχύλισης του DNA με βάση με την προσθήκη της υδρόλυσης βάσης (επώασης 10 λεπτών 70 C με όγκο ½ 1Μ ΝαΟΗ ακολουθούμενη από εξουδετέρωση με όγκο ½ 1Μ HCl) για την απομάκρυνση τυχόν μολυσματικής RNA. Array CGH πραγματοποιήθηκε σε μια πλατφόρμα επιδέχονται υλικό FFPE, και να αντιγράψετε τον αριθμό κλήσεων που παράγεται όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16], [17].

Ποσοτικοποίηση των E2F και ΕΖΗ2 επίπεδα έκφρασης

RT-PCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας TaqMan προσδιορισμούς γονιδιακής έκφρασης με πρότυπα πρωτόκολλα σε έναν ΑΒΙ 7500 Fast θερμοκυκλωτή (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Οι δοκιμασίες TaqMan που χρησιμοποιήθηκαν ήταν E2F1 (Hs00153451_m1), E2F2 (Hs00231667_m1), E2F3 (Hs00605457_m1), Rb (Hs00153108_m1), ΕΖΗ2 (Hs00172783_m1), και 18S RNA (HS99999901_s1). Οι απόλυτες τιμές έκφρασης υπολογίστηκαν για E2F1, E2F2, E2F3 και RB1 από την κλιμάκωση των τιμών Ct δέλτα (γονίδιο-18s) σε μια τιμή μεταξύ 0 και 1000. Τα επίπεδα πρωτεΐνης του ΕΖΗ2 και E2Fs σε κυτταρικές σειρές αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας πρότυπες μεθόδους κηλίδωση Western (Cell σηματοδότησης πρωτογενή αντισώματα: # 3147 (ΕΖΗ2) και # 2118 (GAPDH)? Santa Cruz πρωτογενή αντισώματα: SC-251 (E2F1), SC-632 (E2F2), και SC-878 (E2F3)) [18]. εντάσεις μπάντα ήταν ποσοτικά χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ. Ανοσοϊστοχημεία (IHC) διεξήχθη χρησιμοποιώντας πρότυπες τεχνικές με ένα πρωτεύον αντι-ΕΖΗ2 αντίσωμα (πολυκλωνικό κουνελιού, 18-7395, Life Technologies, Grand Island, ΝΥ). Εικόνες βαθμολογήθηκαν με βάση την ένταση της χρώσης που παρατηρήθηκε σε μια κλίμακα από 0 (χαμηλό) έως 3 (υψηλή).

μεθυλίωσης του DNA Ανάλυση

Λάβαμε προφίλ μεθυλίωσης DNA για 12 SCLC όγκους, και 21 έλεγχο των βρόγχων μικρών επιθηλιακών αεραγωγών (ΣΑΕ) των δειγμάτων χρησιμοποιώντας δοκιμασία Illumina του Infinium Ανθρωπίνων μεθυλίωση (HM27). SAE ελήφθησαν από βρογχική βούρτσα κατά τη διάρκεια της ρουτίνας βρογχοσκόπησης από μικρούς αεραγωγούς (που ορίζονται ως & lt? 2 mm σε διάμετρο) των ατόμων χωρίς την παρουσία ή προηγούμενο ιστορικό καρκίνου του πνεύμονα ή χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια [19]. δείγματα DNA ήταν όξινο θειώδες μετατρέπονται χρησιμοποιώντας το Zymo EZ μεθυλίωσης του DNA θειώδους κιτ μετατροπής (Zymo Research Corporation, Orange, CA) και τα προφίλ HM27 δημιουργείται όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Infinium HM27 μεθυλίωση sentrix αρχεία array (.sdf) and.idat αρχεία εικόνας φορτώθηκαν σε Illumina GenomeStudio. Ανεπεξέργαστα δεδομένα εξήχθησαν και να διαβάσετε σε R: μια γλώσσα και το περιβάλλον για στατιστικούς υπολογισμούς, και διορθώθηκε για κόκκινο πράσινο προκατάληψη χρώμα του καναλιού και το αποτέλεσμα της παρτίδας μεταξύ πολλών πειραμάτων μεθυλίωση, χρησιμοποιώντας το lumi πακέτο Bioconductor, η οποία εφαρμόζει μια διόρθωση χρώματος και αλγόριθμο κανονικοποίησης SSN [21 ]. Ανιχνευτές με ανίχνευση συστοιχίας Illumina p & lt? 0,05, παρουσιάζουν σε & gt? 58% των περιπτώσεων σε κάθε ομάδα διατηρήθηκαν. Ποσοστό μεθυλίωση για κάθε ανιχνευτή παρουσιάζεται ως τιμές β (max (yi, μεθυλ, 0) /(max (yi, unmethy, 0) + max (yi, μεθυλ, 0)) 100). Μια λίστα των ΕΖΗ2 δεσμευτικούς στόχους σε εμβρυονικά βλαστικά κύτταρα ποντικού λήφθηκε από μια δημοσίευση από Ku

et al

[22]. Στόχοι ήταν ευθυγραμμισμένες με ορθόλογα ανθρώπινων γονιδίων με τη χρήση της βάσης δεδομένων Mouse Genome [23]. Για την ταυτοποίηση ΕΖΗ2 στοχευόμενων γονιδίων που διαφορικά μεθυλιωμένα μεταξύ SCLC και φυσιολογικό ομάδες, μια μη παραμετρικά τεστ μετάθεσης χρησιμοποιώντας 10.000 παραλλαγές πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται από Chari

κ.ά.

. [24]. Μια M-αξία υπολογίστηκε από το αρχείο καταγραφής

2 αναλογία μετουσιωμένο έντασης καθετήρα πάνω από μη μεθυλιωμένα ένταση καθετήρα, και χρησιμοποιούνται ως εισροές για τη δοκιμή μετάθεση [25]. βαθμολογίες μετάθεση μεθυλίωση διορθώθηκαν για πολλαπλές δοκιμές με τη μέθοδο Benjamini και Hochberg (Β-Η). Οι μέσες τιμές β για SCLC όγκοι αφαιρέθηκαν από τις μέσες τιμές β από την κανονική αεραγωγών ελέγχει για να ληφθεί μία τιμή δέλτα β. Υπερμεθυλίωση και μεθυλιωμένος ανιχνευτές σε SCLC όγκοι που ορίζονται ως εκείνες με τιμές δέλτα β & gt? = 0,2 ή & lt? = – 0.2, αντίστοιχα. Ανιχνευτές που πληρούν τα ακόλουθα κριτήρια:

i

) μετάθεση Β-Η διορθωμένη p & lt? 0,05,

ii

) μια τιμή δέλτα βήτα & gt? = 0,2 ή & lt? = -0.2 Και

iii

) μία τυπική απόκλιση (SD) ≤2 εντός κάθε ομάδας, θεωρήθηκαν διαφορικά μεθυλιωμένη (DM) μεταξύ SCLC όγκους και κανονικό αεραγωγούς.

Συσχέτιση μεταξύ ΕΖΗ2 και E2F Έκφραση επίπεδα

Για να προσδιοριστεί η σχέση μεταξύ

ΕΖΗ2

και

E2F1

,

E2F2

,

E2F3

, και

RB1 ​​

τα επίπεδα έκφρασης του mRNA σε δείγματα SCLC, θα ερωτηθούν δημοσίως διαθέσιμα δεδομένα έκφρασης από Peifer et al. [5] και Sanger έργο Κυτταρικής Γραμμής Η ευρεία Ινστιτούτου (broadinstitute.org/cgi-bin/cancer/datasets.cgi). GraphPad Prism 6 χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό των συντελεστών συσχέτισης Spearman μεταξύ

ΕΖΗ2

και τις /τα γονίδια Rb μονοπάτι E2F.

Νοκ ντάουν του

ΕΖΗ2 και E2F

στο SCLC γραμμές και

E2F

Έκφραση σε κύτταρα HBEC

κυτταρικές σειρές

293Τ, ΗΤΒ-175 και H524 SCLC ελήφθησαν από την ATCC και αναπτύχθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες ATCC. Αθανατοποιημένα ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα (HBEC) αναπτύχθηκαν σε KSFM μέσα συμπληρωμένα με εκχύλισμα βόειας υπόφυσης και EGF. Λεντοϊού PLKO-πουρομυκίνης ανθεκτικά πλασμίδια που κωδικοποιούν Τα siRNAs που στοχεύουν

E2F1

,

E2F2

,

E2F3

, και

ΕΖΗ2

αγοράστηκαν από την Open Biosystems (RHS3979-201768515 , RHS3979-201745380, RHS3979-201745384 και RHS4533-NM_004456). Λεντιϊοί δημιουργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Πολλαπλότητα της μόλυνσης (ΜΟΙ) προσδιορίστηκε τόσο για την PLKO (άδειο φορέα ελέγχου) και Ε1 (ΕΖΗ2 στόχευση shRNA) ιούς χρησιμοποιώντας έθιμο TaqMan εκκινητές (προς τα εμπρός 5 ‘- GCGGTGTTCGCCGAGAT – 3’ και να αντιστρέψει 5 ‘- GAGGCCTTCCATCTGTTGCT – 3’). Η επιμόλυνση πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στο Lockwood et al [26]. Εν συντομία, για κάθε γραμμή και ιός 150.000 κύτταρα μολύνθηκαν (χρησιμοποιώντας ΜΟΙ 15 για ιούς ΕΖΗ2) σε μέσα συμπληρωμένα με 2 μg /ml polybrene. Μέσα ανάπτυξης συμπληρώθηκε με 1 μg /ml πουρομυκίνη για να επιλεγούν τα μολυσμένα κύτταρα. Για να αξιολογηθεί η βιωσιμότητα του

ΕΖΗ2

knockdown σχέση με τους μάρτυρες κύτταρα προσδιορισμοί ΜΤΤ διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26].

E2F1

(EX-Z8212-M46),

E2F2

(EX-F0378-M46),

E2F3

(EX-T0731-M46), και τον έλεγχο της λουσιφεράσης (EX κλώνοι έκφρασης -hLUC-M46) ORF αγοράστηκαν από GeneCopoeia. Πειράματα παροδικής έκφρασης εκτελέστηκαν χρησιμοποιώντας Lipofectamine LTX ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αποτελεσματικότητα της E2F νοκ ντάουν και υπερέκφραση, και οι επιπτώσεις τους στα επίπεδα έκφρασης ΕΖΗ2 προσδιορίστηκαν με κηλίδωση Western.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

γονιδιακό προφίλ του SCLC Όγκοι και Σύγκριση με SCLC Γραμμές κυττάρων

οι λεπτομέρειες των προφίλ αριθμού αντιγράφων DNA αυτών των όγκων, μαζί με 14 μη συνδεδεμένους SCLC κυτταρικές σειρές που παρουσιάζονται στο Σχήμα S1, και είναι διαθέσιμα στο Omnibus γονιδιακής έκφρασης δεδομένων. Εντυπωσιακά, παρατηρήσαμε επανάληψη του αριθμού αντιγράφων του DNA αλλαγές στο SCLC όγκους, συμπεριλαμβανομένων των περιφερειών που περιλαμβάνει κορυφαία υποψήφιοι μονοπάτι από προηγούμενη μελέτη κυτταρική σειρά μας, όπως

TCF4

(18q21),

STMN1

(18q21) και

E2F2

(1ρ36) [16].

Η E2F /Rb οδός είναι Συγκεκριμένα απορρύθμιση σε SCLC

με βάση τις προηγούμενες παρατηρήσεις από εμάς και άλλους, υποθέσαμε ότι κυτταρικού κύκλου ενεργοποίηση σε SCLC μπορεί να συμβεί όσο κατάντη ως παράγοντες μεταγραφής που ρυθμίζουν την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου. Το μονοπάτι ρετινοβλάστωμα έχει από καιρό καθιερωθεί ως ένα βασικό στόχο της απορρύθμισης σε SCLC.

RB1 ​​

συχνά χάνονται ή μεταλλαγμένο (60-90%) σε SCLC και καταδεικνύει μειωμένη έκφραση στην πλειονότητα των περιπτώσεων [5], [8], [11] – [13], [27]. Μια πρωταρχική λειτουργία του Rb είναι φυσιολογική αναστολή της για τις E2F μεταγραφικών παραγόντων. Όταν Rb1 αδρανοποιείται με φωσφορυλίωση, E2F πρωτεΐνες είναι ελεύθερα να λειτουργούν ως παράγοντες μεταγραφής ενεργοποίησης μιας συλλογής παραγόντων προόδου του κυτταρικού κύκλου. Η οικογένεια E2F γονιδίων χωρίζεται σε ενεργοποίηση (E2F1, E2F2, E2F3) και ανασταλτική μέλη (E2F4, E2F5) που φυσικά αλληλεπιδρούν με Rb1 [15], [27] – [31].

Πρόσφατα στοιχεία έχει απέδειξαν οι E2F γονίδια μπορεί επίσης να είναι πρωταρχικοί στόχοι της απορρύθμισης. Άλλες μελέτες έχουν ανιχνεύσει υψηλά επίπεδα έκφρασης του E2F1 και E2F3 σε διάφορους όγκους, συμπεριλαμβανομένων των SCLC [11] – [15]. Επιπλέον, Peifer κ.ά. σημειωθεί ενίσχυση του DNA υψηλού επιπέδου

E2F2

σε μοντέλα ποντικών με SCLC [5]. Σε συνδυασμό με τις δικές μας παρατηρήσεις του

E2F2

αντιγράψετε κέρδος αριθμό και πάνω έκφραση ειδικά σε SCLC κυτταρικές σειρές και την επικύρωση των

E2F2

αριθμού αντιγράφων αλλαγές στο SCLC όγκους, αποφασίσαμε να αναλύσουμε περαιτέρω αυτό το μονοπάτι στο το πλαίσιο της αριθμού αντιγράφων και μεταγραφική απορύθμιση.

E2F /Rb επικεντρώθηκε ανάλυση του αριθμού αντιγράφων σε SCLC κυτταρικές γραμμές (n = 14) και όγκους (n = 14) έδειξε αύξηση τουλάχιστον ένα από τα ενεργοποίησης

E2F

s ή απώλεια του

RB1 ​​

σε 14/14 δείγματα όγκου και κυτταρικές σειρές 13/14 (96% όλων των δειγμάτων? 95% CI 80% έως 100%) (Σχήμα 1Α). Αυτό είναι σύμφωνη με τις γονιδιωματικές προφίλ που δημοσιεύθηκαν πρόσφατα από Peifer et al [5], το οποίο βρέθηκε να παρουσιάζει το ίδιο μοτίβο μεταβολής σε 56/63 δείγματα όγκου (εφαρμόζοντας αριθμού αντιγράφων όρια του & lt? 1,7 για γενωμική απώλεια και & gt? 2.3 για γονιδιωματική κέρδος για τμηματοποιημένων δεδομένων που προσδιορίζονται γεγονότα στο 84% των δειγμάτων, 95% CI 72% έως 92%). Παρά το γεγονός ότι η εμπιστοσύνη δεσμεύεται δεν περιλαμβάνουν 100% στη μελέτη Peifer et al, αξίζει να σημειωθεί ότι στις 29 περιπτώσεις με τα δεδομένα ακολουθίας, το 100% των περιπτώσεων είχαν είτε

RB1 ​​

διαγραφή ή ένα γεγονός περικοπή μετάλλαξη [5 ]. Αυτό σε συνδυασμό με τις προηγούμενες εκτιμήσεις του

RB1 ​​

της ρυθμούς μετάλλαξης σε μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (60% έως 90%) [32], [33] δείχνει ότι η E2F /διακοπή RB1 είναι σχεδόν καθολική σε SCLC περιπτώσεις.

αριθμός (Α) Αντίγραφο μεταβολές του ειδικού /μελών Rb μονοπάτι E2F σε SCLC κυτταρικές γραμμές (κορυφή) και όγκων (κάτω). Πράσινο σκίαση αντιπροσωπεύει την απώλεια, ενώ το κόκκινο αντιπροσωπεύει το κέρδος και το μαύρο αντιπροσωπεύει καμία αλλαγή. (Β) Έκφραση των μελών μονοπατιού E2F /Rb με RT-PCR. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως box-οικόπεδα των απόλυτων επιπέδων έκφρασης που προέρχονται από την κλίμακα δεδομένα κανονικοποιούνται PCR. Η κεντρική γραμμή σε κάθε κουτί αντιπροσωπεύει το μέσο επίπεδο, ενώ το κουτί αντιπροσωπεύει το ενδοτεταρτημοριακό εύρος, με μουστάκια επέκταση στην τελευταία μη-ακραία σημείου δεδομένων (που ορίζεται ως 1,5 φορές το διατεταρτημοριακό εύρος). Οι ακραίες τιμές παρουσιάζονται ως σταυρούς. (Γ) Σημαντικές υπερέκφραση ΕΖΗ2 παρατηρήθηκε σε μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα σε σύγκριση με τα δείγματα NSCLC, που συμπίπτει με περίσσεια ενεργοποίηση του /Rb μονοπάτι E2F. (D) IHC διεξήχθη χρησιμοποιώντας πρότυπες τεχνικές με ένα πρωτεύον αντίσωμα αντι-ΕΖΗ2 και οι εικόνες λήφθηκαν σε 200 × μεγέθυνση. Που παρουσιάζονται είναι τυπικά παραδείγματα της πρωτεϊνικής έκφρασης ΕΖΗ2 στο βρογχικό επιθήλιο, καρκινοειδή και SCLC όγκων.

Η

Σε πραγματικό χρόνο PCR ανάλυση των επιπέδων μεταγραφής έδειξε ένα εντυπωσιακό μοτίβο των E2F ενεργοποίηση, όπως τουλάχιστον δύο ενεργοποίηση E2F μέλη ήταν πάνω από εκφράζεται από 10 × φυσιολογικά επίπεδα τους σε κάθε SCLC κυτταρική γραμμή, ενώ Rb1 mRNA ήταν εξαιρετικά μειωμένη σε πιο SCLC κυτταρικές σειρές (Σχήμα 1Β και S2). Αυτά τα επίπεδα της απορρύθμισης είναι σημαντικά μεγαλύτερες από αυτές που παρατηρήθηκαν για ένα πάνελ των κυτταρικών σειρών NSCLC βασίζεται σε μία ουρά Mann-Whitney τεστ U, υποστηρίζοντας την ιδιαιτερότητα SCLC των γεγονότων αυτών (SCLC vs NSCLC:

E2F1

p = 0,0034,

E2F2

p = 2.310 × 10

-5,

E2F3

p = 1.744 × 10

-5,

Rb1

p = 0.0078? Εικόνα S2). Απορρύθμιση των E2F και Rb1 μεταγραφές είναι δωρεάν για τα πρόσφατα αποτελέσματα των Byers et al που ανιχνεύεται SCLC συγκεκριμένο επίπεδο πρωτεΐνης απορρύθμιση των Rb και E2F1 σε πρωτεομική μελέτη των χαρακτηριστικών των SCLC, NSCLC και φυσιολογικό πνεύμονα κυτταρικών σειρών [11].

Συλλογικά, φαίνεται ότι η οδός Rb είναι απορυθμισμένη όχι μόνο μέσω της απώλειας του Rb αντίγραφα /λειτουργία, αλλά και μέσω γονιδιωματικών κέρδη των E2F μεταγραφικών παραγόντων σε SCLC. Στο σύνολό τους, το γεγονός αυτό δείχνει ότι ο /Rb μονοπάτι E2F ενεργοποιείται σε όλα τα δείγματα SCLC σε αυτή τη μελέτη, είτε με την απώλεια του

RB1 ​​

ή να αντιγράψετε το κέρδος ενός

E2F

γονίδιο μέλος. Με βάση την ανάλυσή μας των εξωτερικών δεδομένων, αυτό ισχύει σε άλλες επιπρόσθετες κλινικές ομάδες SCLC όγκου [5].

Η υπερέκφραση της E2F /Rb Target ΕΖΗ2

Το εντυπωσιακό μοτίβο των E2F /Rb απορρύθμιση κυτταρικές σειρές SCLC και όγκους μας ώθησε να εξετάσουμε γονίδια κατάντη των E2F μεταγραφικών παραγόντων. Ένας στόχος της /Rb μονοπάτι E2F η οποία έχει πρόσφατα περιγραφεί ως ογκογονίδιο σε πολλαπλούς τύπους καρκίνου είναι

ΕΖΗ2

. ΕΖΗ2 είναι ένα γονίδιο ομάδα Polycomb (PCG) με ένα ρόλο στην εμβρυϊκή ανάπτυξη και διαφοροποίηση μέσω επιγενετική ρύθμιση μεταγραφικής γονιδίων κρίσιμες για τη διατήρηση στέλεχος-όπως ιδιότητες των εμβρυϊκών κυττάρων και για την ίδρυση γράμμωσης ειδικότητα [34] – [36]. Ελέγχει άμεσα μεθυλίωσης του DNA πολλών γονιδίων στόχων συμπεριλαμβανομένων των

WNT1

, επιβεβαιώνοντας προηγούμενες μελέτες, στις οποίες παρατηρήθηκαν πολλαπλές γενετικές χτυπήματα για να κλείσει το μονοπάτι WNT στο SCLC κυτταρικές σειρές [16], [36]. ΕΖΗ2 υπερέκφραση έχει παρατηρηθεί σε πολλές υποτύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου: του προστάτη, του μαστού, της ουροδόχου κύστης, πλακωδών καρκίνου του πνεύμονα και του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος [37] – [44]. Στην περίπτωση του πλακώδους καρκίνου του πνεύμονα, έκφραση ΕΖΗ2 έχει παρατηρηθεί σε δυσπλαστικά πλακωδών κυττάρων και όγκων, αλλά όχι σε φυσιολογικά βρογχικών επιθηλιακών κυττάρων, υποδηλώνοντας

ΕΖΗ2

ενεργοποίηση θα μπορούσε επίσης να είναι ένα πρώιμο συμβάν στον NSCLC [39]. Επιπλέον, οι μελέτες των διαφόρων τύπων καρκίνου έχουν συνδέσει την έκφραση της ΕΖΗ2 να επιθετικότητα, την εισβολή και την αντίσταση σισπλατίνη εμπλέκουν ένα ρόλο για ΕΖΗ2 στην επιθετική συμπεριφορά του όγκου [43], [45] – [47]

Στη μελέτη μας,. ανάλυση έκφρασης του ΕΖΗ2 σε NSCLC και SCLC κυτταρικές σειρές αποκάλυψαν μια εντυπωσιακή κατάσταση υπερδραστηριότητας σε SCLC σύγκριση με κύτταρα NSCLC (Mann-Whitney τεστ U, p = 4,52 × 10

-6? Σχήμα 1Γ). Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ΕΖΗ2 είναι κατά μέσο όρο, 42 φορές υπερεκφράζεται σε SCLC γραμμές σε σύγκριση με 13-πλάσια υπερεκφράζεται σε κυτταρικές σειρές NSCLC. Για να επιβεβαιωθεί αν η υπερέκφραση του ΕΖΗ2 είναι επίσης παρούσα σε όγκους, αναλύσαμε τα δεδομένα από μια μελέτη ανεξάρτητη συστοιχία έκφρασης cDNA [13], η οποία μορφοποιημένης ένα ξεχωριστό σύνολο 11 κυτταρικών σειρών και ένα πάνελ 15 πρωτογενών SCLC όγκων, εκτός από την 12 αδενοκαρκινώματα (NSCLC υπότυπο). Αν και τα ακριβή επίπεδα αλλαγής φορές δεν ήταν άμεσα ισοδύναμα (πιθανώς λόγω των διαφορών μεταξύ των RT-PCR και το cDNA μικροσυστοιχιών δυναμικό εύρος), η τάση στα επίπεδα έκφρασης είναι εντυπωσιακά παρόμοια με τη μελέτη μας, με σημαντικά υψηλότερη έκφραση του ΕΖΗ2 στο SCLC κυτταρικές σειρές και όγκους σε σύγκριση με τα δείγματα NSCLC (Εικόνα S2). Αυτό είναι σύμφωνο με τα αποτελέσματα της Byers et al που πρόσφατα παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης ΕΖΗ2 στο SCLC κυτταρικές σειρές [11].

Για να επιβεβαιώσετε ότι τα επίπεδα mRNA μεταφράζεται σε αυξημένα επίπεδα της πρωτεΐνης σε κλινικές όγκους, θα πραγματοποιηθεί IHC σε μια συστοιχίας ιστού του SCLC όγκων, καρκινοειδές και φυσιολογικούς ιστούς των πνευμόνων, και παρατήρησε αυξημένη χρώση ΕΖΗ2 στα SCLC δείγματα όγκου (n = 13), σε σύγκριση με καρκινοειδή, και βρογχικά επιθήλια (Σχήμα 1 D, Πίνακας S3). Bracken et al [38] πρότεινε ότι τόσο οι άμεσες

E2F

ενίσχυση του DNA και

RB1 ​​

διαταραχή μπορεί να οδηγήσει σε απορρύθμιση της έκφρασης ΕΖΗ2. Η σημαντική ΕΖΗ2 υπερ-έκφραση έχουμε περιγράψει σε SCLC δεν είναι πιθανό να οφείλεται στις αριθμού αντιγράφων χαμηλό επίπεδο κερδών που παρατηρούμε στα SCLC κυτταρικές γραμμές και όγκους, καθώς προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι κατά μέσο όρο αύξηση κατά 2 φορές αριθμός αντιγράφου είναι συνδεδεμένη με ένα κατά μέσο όρο 1,5 φορές αλλαγή στην συναφή επίπεδα mRNA [38], [48], γεγονός που υποδηλώνει ότι η υπερέκφραση της ΕΖΗ2 σε SCLC, ελέγχεται κατά κύριο λόγο από E2F /Rb αναστάτωση, παρά την άμεση αριθμού αντιγράφων αλλαγές.

Για να να αξιολογήσει περαιτέρω την υπόθεση μας ότι η E2F /Rb διατάραξη οδηγεί στην ενεργοποίηση ΕΖΗ2, αξιολογήσαμε τις συσχετίσεις μεταξύ ΕΖΗ2 και τα επίπεδα έκφρασης του mRNA E2F /RB1 σε δύο δημόσια SCLC σύνολα δεδομένων. Σε μια μικροσυστοιχία σύνολο δεδομένων των 56 SCLC γραμμές, βρήκαμε θετική συσχέτιση μεταξύ ΕΖΗ2 και E2F1 (r

2 = 0,3957, p = 0,0013) και E2F2 (r

2 = 0,3124, p = 0.0095), και χωρίς σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ ΕΖΗ2 και E2F3 (r

2 = 0,1689, p = 0,1067) ή RB1 (r

2 = 0,0712, p = 0,6989) (Πίνακας S4). Σε 15 SCLC όγκων με δεδομένα RNA αλληλουχίας, παρατηρήσαμε ισχυρή θετική συσχέτιση μεταξύ ΕΖΗ2 και E2F1 (r

2 = 0,5179, p = 0,0253) και E2F2 (r

2 = 0,6357, p = 0,0064), και όχι σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ ΕΖΗ2 και E2F3 (r

2 = -0,1571, p = 0,7166) και RB1 (r

2 = -0,1929, p = 0,2450) (Πίνακας S4). Το γεγονός ότι RB1 δεν συσχετιζόταν σημαντικά με E2F έκφραση σε αυτά τα σύνολα δεδομένων πιθανότατα αντανακλά τη χαμηλή συνολική έκφραση της RB1 ολόκληρη αυτών των δειγμάτων, καθώς και το ρόλο της φωσφορυλίωσης στη λειτουργία του RB1, η οποία δεν λογίζεται σε αυτά τα δεδομένα. Τα αποτελέσματα αυτά παρέχουν περαιτέρω ενδείξεις ότι η ενεργοποίηση του E2F1 και E2F2 συνδέεται με την ενεργοποίηση των ΕΖΗ2.

Επίδραση της E2F χειραγώγηση των ΕΖΗ2 Έκφραση

επόμενο εκτελούνται πειράματα νοκ ντάουν E2F να εκτιμήσει άμεσα τις συνέπειες της E2F διαφοροποίηση στα επίπεδα έκφρασης ΕΖΗ2 σε SCLC. ShRNA μεσολάβηση knockdowns του E2F1, E2F2, και E2F3 έδειξε μειώσεις στα επίπεδα πρωτεΐνης ΕΖΗ2, τοποθέτηση με την υπόθεση μας ότι E2Fs ρυθμίζουν την έκφραση ΕΖΗ2 σε μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (Σχήμα S3A). Επιπλέον, εκτελέσαμε πειράματα υπερέκφραση σε αθανατοποιημένα ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα (HBEC) [49], τα οποία είναι ένας μη-κακοήθεις μοντέλο που χρησιμοποιείται για να μελετηθεί η μοριακή παθογένεση του μη-μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα, επειδή μέχρι σήμερα, δεν υπάρχει καμία μη-κακοήθη μοντέλο νευροενδοκρινείς σήμερα διαθέσιμα για την αξιολόγηση του δυναμικού μετασχηματισμού των γονιδίων σε ένα συγκεκριμένο τύπο SCLC πρόδρομο κύτταρο. Παρατηρήσαμε αυξημένη έκφραση του ΕΖΗ2 κατά την επαγωγή του E2F2 (Σχήμα S3b). Τα αποτελέσματα της E2F knockdown και υπερέκφραση στα επίπεδα ΕΖΗ2 λαμβανόμενα μαζί με τα θετικές συσχετίσεις παρατηρήσαμε μεταξύ E2F και τα επίπεδα έκφρασης του mRNA ΕΖΗ2 υποδηλώνουν ότι η ενεργοποίηση των E2Fs οδηγεί σε αντίστοιχη αύξηση στα επίπεδα ΕΖΗ2. Αυτές οι παρατηρήσεις υποστηρίζουν την υπόθεσή μας ότι η αυξημένη έκφραση της E2F μελών οδηγεί σε ενεργοποίηση ΕΖΗ2 σε SCLC.

Οι στόχοι

PRC2 υπερμεθυλίωση στο SCLC

Η PCG υπήρξε μεγάλο ενδιαφέρον σε πολλούς τύπους όγκων κατά τα τελευταία χρόνια , λόγω του ρόλου της στην μεταγραφικά αποσιώπηση της έκφρασης των ογκοκατασταλτικών γονιδίων μέσω αναδιαμόρφωσης χρωματίνης και την καθοδήγηση μεθυλίωσης DNA. PCG πρωτεΐνες σχηματίζουν σύμπλοκα πολλαπλών πρωτεϊνών που καταστέλλουν μεταγραφή μέσω μετα-μεταφραστική τροποποίηση ιστονών, ειδικά τρι-μεθυλίωση του 27ου λυσίνης επί ιστόνης 3 (H3K27Me3). Ένα υψηλό ποσοστό (50-80%) των γονιδίων που έκτροπα επιγενετικώς σιγήσει από υπερμεθυλίωση προαγωγέα DNA σε πιο ανθρώπινους καρκίνους είναι εκείνες που χαρακτηρίζονται από την Polycomb Κατασταλτικά Συγκρότημα 2 (PRC2) κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης, όπου καταπιεστικά σημάδια της ιστόνης λειτουργεί σε «απενεργοποίηση» κύτταρο η μοίρα τον προσδιορισμό των γονιδίων, παραχωρούμε αδιαφοροποίητη ικανότητες αυτο-ανανέωση με τα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα [50] – [53]. Δεδομένου ότι ΕΖΗ2 είναι το κρίσιμο καταλυτικό μέλος του συγκροτήματος PRC2, και η ικανότητα αυτού του περίπλοκου να προσλάβει τους

de novo

DNA μεθυλίωση ένζυμα (Dnmt3a /β), μας ενδιαφέρει να εκτιμηθεί αν μεθυλίωση CpG προαγωγό σε SCLC όγκοι εμφανίσθηκαν κατά προτίμηση σε γονίδια που χαρακτηρίζεται από PRC2 σε εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα. Ως εκ τούτου, αναλύσαμε την κατάσταση μεθυλίωσης των γονιδίων στόχων ΕΖΗ2-PRC2 σε δείγματα μας πρωτογενούς όγκου [22]. Τα δεδομένα είναι διαθέσιμα στην έκφραση του γονιδίου Omnibus.

Βρήκαμε ένα συντριπτικό ποσοστό των γονιδίων που στοχεύει ΕΖΗ2 και το συγκρότημα PRC2 να υπερμεθυλίωση στο SCLC όγκους σε σύγκριση με φυσιολογικά επιθήλια των αεραγωγών από υγιή άτομα (Σχήμα 2). Μετά την εφαρμογή αυστηρών κριτηρίων φιλτραρίσματος, εντοπίσαμε 2756 υπερμεθυλιωμένων ανιχνευτές (τιμή p & lt? 0,05, δέλτα β & gt? = 0,2), και 1372 μεθυλιωμένος ανιχνευτές (τιμή p & lt? 0,05, δέλτα β & lt? = -0.2) Σε μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα σε σχέση με υγιείς επιθηλιακών αεραγωγών κύτταρα. Από τις 3.497 ανιχνευτές που συνδέονται με γονίδια που είναι γνωστό ότι είναι εμβρυϊκά αρχέγονα κύτταρα στόχους ΕΖΗ2 [22], βρήκαμε 18% (640 ανιχνευτές) αυτών των γονιδίων που πρόκειται να υπερμεθυλιωμένο, σε σύγκριση με μόνο 3% (93 ανιχνευτές) μεθυλιωμένος εις SCLC. Εντυπωσιακά, ΕΖΗ2-PRC2 γονιδίων στόχων αντιπροσώπευαν το 23% του συνόλου των υπερμεθυλιωμένων ανιχνευτές σε αυτούς τους όγκους συνολικά. Σε σύγκριση με τους στόχους μη PRC2, εμπλουτισμός των γονιδίων στόχων PRC2 στο υπερμεθυλιωμένων σύνολο ανιχνευτών μας ήταν στατιστικά σημαντική (ακριβής δοκιμασία του Fisher, p = 2.2 × 10

-16). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι, ανάλογη προς εργάζονται από αρκετές άλλες ομάδες σε μία ποικιλία καρκίνων [50] – [55], SCLCs εμφανίζει ένα προφίλ υπερμεθυλίωση προαγωγού εξαιρετικά σύμφωνη με το πρότυπο των γονιδίων σιγήσει σε εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα από το σύμπλοκο PRC2. Προτείνουμε ότι σε SCLC, ΕΖΗ2 υπερέκφραση προκαλείται από τα αποτελέσματα DNA επίπεδο Ε2Ρ /Rb διακοπή μονοπάτι στην πρόσληψη των ενζύμων μεθυλίωσης

de novo

DNA και τη δημιουργία ενός «βλαστικών κυττάρων όπως το» προφίλ hypermethylator.

Η μεθυλίωση τιμές β για 1.683 γονίδια στοχεύονται για PRC2 H3KMe3 σε εμβρυονικά βλαστικά κύτταρα ποντικού σχεδιάστηκαν για κάθε ομάδα. Αυτά τα 1683 γονίδια χαρτογραφούνται σε 3497 Illumina HM27 ιχνηλάτες, των οποίων το 18% (640 ανιχνευτές) είναι υπερμεθυλιωμένο και 3% (93 ανιχνευτές) μεθυλιωμένος εις SCLC όγκους σε σχέση με το κανονικό αεραγωγούς. Γονίδια στόχο για H3KMe3 στο ποντίκι εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων από ΕΖΗ2 και το συγκρότημα PRC2 είναι κατά προτίμηση υπερμεθυλίωση SCLC όγκους που αποδεικνύουν ότι ΕΖΗ2 είναι λειτουργικά ενεργά σε SCLCs.

Η

ΕΖΗ2 απαιτείται για ταχεία αύξηση των SCLC Γραμμές κυττάρων

στη συνέχεια εκτιμήσαμε την ογκογόνο δυναμικό του ΕΖΗ2 σε SCLC, χρησιμοποιώντας τη μεσολάβηση λεντοϊού knockdowns σε δύο SCLC κυτταρικές σειρές (H524, HTB175). Αμφότερες knockdown γραμμές κατέδειξαν μια εντυπωσιακή μείωση της ανάπτυξης σε σύγκριση με τα κενά στοιχεία ελέγχου φορέα (έλεγχος τ, ρ & lt? 0,05) (Σχήμα 3). Επιβεβαιώνοντας τα ευρήματά μας, μια πρόσφατη μελέτη στην οποία συμμετείχαν πρωτεομική χαρακτηριστικών των κυτταρικών σειρών SCLC αποδειχθεί υπερέκφραση του ΕΖΗ2 στο SCLC και επέδειξε μειωμένη ανάπτυξη σε Η69 κύτταρα μετά από παροδική νοκ ντάουν siRNA [11]. Οι προ-πολλαπλασιαστική και αντι-διαφοροποίηση λειτουργίες του ΕΖΗ2 είναι συνεπείς με την εξαιρετικά επιθετική και αδιαφοροποίητο κλινικά και παθολογικά παρουσίαση του SCLC. Η ισχυρή προ-πολλαπλασιαστική φύση του ΕΖΗ2, θα μπορούσε επίσης να εξηγήσει εν μέρει την ανοχή των κυττάρων SCLC σε τέτοια υψηλά επίπεδα E2F mRNA, καθώς ορισμένοι E2F πρωτεΐνες είναι ικανές αντι-πολλαπλασιαστική και προ-αποπτωτικά λειτουργίες όταν υπερεκφράζεται [15], [28] -. [30], [38]

(Α, Ε) Για να επιβεβαιωθεί knockdown του ΕΖΗ2, RNA εκχυλίστηκε από τα επιμολυσμένα γραμμές και qPCR διεξήχθη. Έκφρασης σε γραμμές νοκ ντάουν (Ε1) παρουσιάζεται σε σχέση με τους μάρτυρες PLKO. (B, F) Επιβεβαίωση των επιπέδων της πρωτεΐνης του ΕΖΗ2 στις γραμμές knockdown διεξήχθη χρησιμοποιώντας πρότυπες μεθόδους κηλίδωση Western. Τόσο qPCR και κηλίδωση Western επαλήθευσε επίπεδα ΕΖΗ2 μειώθηκαν κατά περισσότερο από 50% σε ΗΤΒ-175 και τα κύτταρα H524 κατά shRNA μεσολάβηση νοκ ντάουν. (C, D, G, H) Για την εκτίμηση της βιωσιμότητας των

ΕΖΗ2

knockdown σχέση με τους μάρτυρες κύτταρα πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς ΜΤΤ. Νοκ ντάουν της ΕΖΗ2 προκάλεσε σημαντική και επαναλήψιμη μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων τόσο SCLC κυτταρικές σειρές (t-test, p & lt Φοιτητών? 0,05).

Η

Συμπεράσματα

Από το έργο αυτό, προτείνουμε ότι η οδός E2F /Rb δεν διαταράσσεται μόνο μέσω της απώλειας ή μετάλλαξη του Rb, αλλά και μέσω του DNA κέρδη αριθμός αντιγράφου των E2F μεταγραφικών παραγόντων. Προτείνουμε ότι αυτός ο μηχανισμός οδηγεί την ειδική υπερέκφραση πολλών γονιδίων στόχων, συμπεριλαμβανομένων ΕΖΗ2, η οποία οδηγεί σε ενεργοποίηση του συμπλόκου PRC2 και προώθηση των παρεκκλίνουσα μεθυλίωση σε SCLC. Τα ευρήματά μας επιβεβαιώνουν προηγούμενες μελέτες και έχουν ισχυρές επιπτώσεις για την αντιμετώπιση των SCLC.

Πολλαπλές μιτογόνο οδών, όπως ΜΑΡΚ απορρύθμιση είναι επίσης ικανό να οδηγεί E2F λειτουργίας, ελλείψει συγκεκριμένων ανάντη επισκέψεις σε SCLC, όπως η συχνή