Αφηρημένο

Αυτή η μελέτη είναι η διερεύνηση της σχέσης μεταξύ ectonucleoside τριφωσφορική diphosphohydrolase 5 (ENTPD5) έκφρασης και του καρκίνου του πνεύμονα κλινικοπαθολογοανατομικές παράγοντες, καθώς και τον αντίκτυπο του ENTPD5 τις λειτουργίες καρκίνο του πνεύμονα. Καρκίνος του πνεύμονα δείγματα και συμφωνημένα παρακείμενων φυσιολογικών ιστών ελήφθησαν από ασθενείς χωρίς προεγχειρητική ακτινοθεραπεία ή χημειοθεραπεία. Knockdown έκφρασης ETNPD5 οδήγησε σε σημαντικά μειωμένη ποσοστό καρκίνου πνεύμονος ανάπτυξη, σημαντικά αυξημένη απόπτωση και την ικανότητα να επισκευάσει, και μείωσε σημαντικά την εισβολή. δοκιμών τσιπ γονιδίου έδειξε ότι το νοκ ντάουν της έκφρασης ENTPD5 προκάλεσε περισσότερους κασπάσης έκφρασης. Ποσοτική πραγματικό χρόνο αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης έδειξε ότι η έκφραση της κασπάσης 3 ήταν σημαντικά αυξημένη μετά την knockdown του ENTPD5. Επιπλέον, ανοσοϊστοχημεία έδειξε ότι ο δείκτης ανάπτυξης όγκου, πυρηνικό αντιγόνο πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων, μειώθηκε σημαντικά στο μοντέλο knockdown. δοκιμασία Ογκογονικότητα και τρανσφεράσης διαμεσολαβείται dUTP δοκιμής επισήμανσης nick-άκρο τερματική δεοξυνουκλεοτιδυλ έδειξαν ότι η απόπτωση των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα αυξήθηκε στο knockdown μοντέλο. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ENTPD5 επηρεάζει την απόπτωση καρκίνο του πνεύμονα μέσω της κασπάσης 3 μονοπατιού, και μπορούν να χρησιμοποιηθούν δυνητικά να παρακολουθεί την πρόγνωση ή να καθοδηγήσει κατάλληλα θεραπευτικά σχήματα

Παράθεση:. Xue Υ, Wu L, Liu Υ, Ma Υ, Ζανγκ L, Ma Χ, et al. (2015) ENTPD5 επάγει την απόπτωση σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα μέσω Ρύθμιση κασπάσης 3 Έκφραση. PLoS ONE 10 (3): e0120046. doi: 10.1371 /journal.pone.0120046

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Yi-Hsien Hsieh, Ινστιτούτο Βιοχημείας και Βιοτεχνολογίας, ΤΑΪΒΑΝ

Ελήφθη: 23 Οκτωβρίου του 2014? Αποδεκτές: τρίτης Φεβρουαρίου 2015? Δημοσιεύθηκε: 20, Μαρτίου, 2015

Copyright: © 2015 Xue et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Πεκίνο Επιστήμης Νέο σχέδιο Star (Νο Z11111005450000) και το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 81101598)

Ανταγωνιστικά συμφέροντα.: οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα, μία από τις πιο κοινές κακοήθεις όγκους, είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται με όλο τον κόσμο [1]. καρκίνο του πνεύμονα μη μικρών κυττάρων (NSCLC) αντιπροσωπεύει περίπου το 80% των περιπτώσεων καρκίνου του πνεύμονα [2]. Ο καρκίνος του πνεύμονα θεωρείται ως ένα είδος γενετική ασθένεια στην οποία παρεκκλίνουσα έκφραση ενδογενούς γονιδίου παθογόνου συμβάλλει στην γενωμική αστάθεια που ενισχύει την κινητικότητα και διεισδυτικότητα των καρκινικών κυττάρων, που οδηγεί προς τα χαρακτηριστικά του διεισδυτικότητα. Παρά την επιτυχή θεραπεία του πρωτογενούς κακοήθειας, η υποτροπή και η επακόλουθη μακρινή μετάσταση εξακολουθούν να συμβαίνουν σε περισσότερο από το ένα τέταρτο των μετεγχειρητικών ασθενών [3]. Ως εκ τούτου, μετεγχειρητική παρακολούθηση ups θα πρέπει να γίνεται σε τακτική βάση για να ψάξετε νωρίς μετάσταση σε μείωση της θνησιμότητας. Σύμφωνα με πρόσφατες έρευνες, η υπερέκφραση συγκεκριμένων γονιδίων κατά τη διάρκεια της καρκινογένεσης έχει ανιχνευθεί σε πολλά καρκίνων του πνεύμονα, όπως ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα [4-6], υποδοχέα-2 [7], p53 [8] και Β-κυττάρων του ανθρώπινου επιδερμικού αυξητικού παράγοντα λέμφωμα-2 [9]. Η αναστολή της απόπτωσης των καρκινικών κυττάρων περιλαμβάνει συνήθως πολλά σημαντικά γονίδια, τα οποία μπορούν να συνδέονται λειτουργικά με απεριόριστη καρκινικές κυτταρική εξέλιξης όπως ο πολλαπλασιασμός, η μετανάστευση και εισβολή. Τελικά, τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να μεταστάσεις σε απομακρυσμένα όργανα και να απειλήσει ζωής. Γονίδια και πρωτεΐνες που ρυθμίζουν την επιθετικότητα του όγκου θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως προγνωστικοί δείκτες ή /και θεραπευτικοί στόχοι του καρκίνου του πνεύμονα. Ως εκ τούτου, είναι αναγκαίο να αναπτυχθούν ιδιαίτερα ευαίσθητη και ειδική διαγνωστική γονιδίων /βιοδείκτες για την προώθηση ακρίβεια στην πρώιμη διάγνωση της μετάστασης. Μέχρι τώρα, έχουν διάφορα γονίδια έχουν αναφερθεί να συμμετάσχουν σε διάφορες παθολογικές διαδικασίες και επηρεάζουν σημαντικά την επιθετικότητα των καρκινικών κυττάρων, όπως ALK [10], καλλικρεϊνης που σχετίζονται με πεπτιδάση 8 γονίδιο [11], και RAS [12].

Ectonucleoside τριφωσφορική diphosphohydrolase 5 (ENTPD5) είναι ένα είδος του ενζύμου στο ενδοπλασματικό δίκτυο που υδρολύει UDP να UMP για την προώθηση της πρωτεΐνης Ν-γλυκοζυλίωσης και το δίπλωμα στο ενδοπλασματικό δίκτυο. ENTPD5 πρωτεΐνη είναι χαρακτηριστική από άλλα NTPDases καθώς είναι το μόνο μέλος που περιγράφεται ως πρωτο-ογκο πρωτεΐνη [13]. ENTPD5 φέρεται να προωθήσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την επίδραση Warburg [13]. Τα υπάρχοντα στοιχεία επιβεβαιώνουν ότι ENTPD5 συμμετέχει σε πολλαπλές κυτταρικές λειτουργικές διαδικασίες και προωθεί την ικανότητα εισβολής των κυττάρων καρκίνου του προστάτη με τη βοήθεια της πρωτεϊνικής κινάσης οδ [14]. Επιπλέον, δεν έχει αναγνωρισθεί ότι φάρμακα αντίσταση του καρκίνου του προστάτη κατά τη διάρκεια της με βάση την πλατίνα χημειοθεραπεία σχετίζεται με κινάση πρωτεΐνης οδ-μεσολάβηση σταθερή κατάσταση του Β-κυτταρικού λεμφώματος-2 [15]. Προηγούμενες μελέτες υπογραμμίζουν επίσης τη σημασία της ENTPD5 που σχετίζεται με σχηματισμό όγκου και καρκινικών εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη κυτταρικών γραμμών. Αυτά τα ευρήματα καταδεικνύουν ότι τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης ENTPD5 επηρεάζει αρνητικά την ικανότητα για καρκινικά κύτταρα να επιβιώσουν σε αντίξοες συνθήκες.

Υπάρχουν πολλές αναφορές για τη σχέση μεταξύ ENTPD5 και κακοήθη ανάπτυξη του όγκου, αλλά δεν υπάρχει σχεδόν καμία έκθεση σχετικά με την συσχέτιση μεταξύ ENTPD5 και τον καρκίνο του πνεύμονα. Πρόσφατα, Curry et al. ανέφεραν ότι η καταστολή της ENTPD5 σε ΡΤΕΝ null ζωικό μοντέλο είναι επαρκής για να μειώσουν τα επίπεδα υποδοχέα ινσουλίνης αυξητικού παράγοντα 1 και να ευαισθητοποιεί κύτταρα όγκου βρογχιολίων σε ορό ασιτίας

in vitro

και να διαιτητικό περιορισμό

in vivo

[16]. Αυτή η μελέτη επιβεβαιώνει ότι ENTPD5 ενδέχεται να σχετίζονται με την εμφάνιση του καρκίνου του πνεύμονα σε πειράματα σε ζώα.

Λαμβάνοντας υπόψη την ανεπάρκεια της έρευνας ENTPD5 στον καρκίνο του πνεύμονα και το σημαντικό ρόλο της ENTPD 5 στη διαδικασία της ανάπτυξης του όγκου, σχεδιάσαμε αυτή μελέτη για να κατανοήσουμε τη λεπτομερή ρόλος του ENTPD5 στην κυτταρική ανάπτυξη καρκίνου του πνεύμονα και τη διαδικασία εισβολής. Επιπλέον, θα θέλαμε να καθοριστεί αν ENTPD5 είναι ένας υποσχόμενος στόχος της θεραπείας για τον καρκίνο του πνεύμονα.

Υλικά και μέθοδοι

Cells

Όλα καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένων Α549, PC9, H1650, H1975, Η1299 SKMES-1, και GLC82, αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) και καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Gibco, USA ), 100 U /ml πενικιλίνη, και lg /ml στρεπτομυκίνη (Invitrogen, Grand Island, ΝΥ, USA) σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 και 37 ° C.

Οι αλληλουχίες των ENTPD5 siRNA και μη φίμωσης siRNA ελέγχου ήταν 5′- CCUGGGAUUUGGAUUGAAATT -3 ‘και 5′-UUUCAAUCCAAAUCCCAGGTT -3’, αντίστοιχα. Τα siRNAs δημιουργήθηκαν από Genepharma (Σαγκάη, Κίνα). Τα siRNAs επιμολύνθηκαν σε κύτταρα Α549 και κύτταρα PC9 χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Ασθενείς

πνεύμονα δείγματα καρκίνου (n = 131) και να συνδυαστούν γειτονικών φυσιολογικών ιστών ελήφθησαν από ασθενείς χωρίς προεγχειρητική ακτινοθεραπεία ή χημειοθεραπεία στο Πεκίνο Αντικαρκινικό Νοσοκομείο από το 1999 έως το 2011. Πριν από γραπτή και εν επιγνώσει συναίνεση ελήφθησαν από όλους τους ασθενείς και τις οικογένειές τους. Η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου του Πεκίνου. Κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά των όγκων είχαν καθοριστεί σύμφωνα με το σύστημα μετάσταση στάσης κόμβο του όγκου της Ένωσης για θέματα Διεθνούς Ελέγχου του Καρκίνου. Οι κλινικοπαθολογοανατομικές παράγοντες παρουσιάζονται στον Πίνακα 1.

Η

Η ανοσοϊστοχημεία

Πρωτοβάθμια πνευμονική δείγματα καρκίνου μονιμοποιήθηκαν και ενσωματωμένες σε παραφίνη. Τμήματα (5 μm) συνήθως σε επεξεργασία, και χρωματίστηκαν με ένα μονοκλωνικό αντι-ENTPD5 αντίσωμα (Sigma-Aldrich, Poole, Dorset, UK) σε συγκέντρωση 2 μg /ml, ακολουθούμενο από την επώαση με ραφανιδική υπεροξειδάση συζευγμένο αντι κουνελιού Κουνέλι δευτερεύον αντίσωμα (Sigma-Aldrich, Poole, Dorset, UK). Θετική χρώση περιοχές σε ολόκληρο το τμήμα του ιστού βαθμολογήθηκαν από το ποσοστό των θετικώς χρωματισμένων κυττάρων: 0, για & lt? 25%? 1, για το 25-49%? 2, για το 50-74%? και 3, για 75-100%. Σε αυτή τη μελέτη, 0 θεωρήθηκε αρνητικό ή μέτρια χρώση, ενώ 1, 2 και 3 θεωρήθηκαν θετική χρώση.

ποσοτική πραγματικού χρόνου αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR qRT-)

Ολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Για ώριμη ποσοτικοποίηση miRNA, μια ουρά πολυΑ προστέθηκε σε ολικό RNA (100 ng) από ροΙγΑ πολυμεράση (New England Biolabs, Beverly, ΜΑ, USA), που ακολουθείται από αντίστροφη μεταγραφή με ολιγο-dT εκκινητές προσαρμογέα και ιού λευχαιμίας ποντικού Moloney (Invitrogen, ΗΠΑ). cDNAs συντέθηκαν με χρήση 2 μg ολικού RNA χρησιμοποιώντας το κιτ σύνθεσης cDNA iScript (Bio-Rad, Hemel Hempstead, UK). Εναρκτήρες για ENTPD5 και GAPDH αναφέρονται στον Πίνακα 2. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. qRT-PCR χρησιμοποιώντας SYBR Green ΡΟΚ Master Mix (Toyobo, Osaka, Japan) σε Φως-Cycler 480 Real-Time PCR System (Roche, USA). Η σχετική ποσότητα miRNAs ή γονιδίων κανονικοποιήθηκε προς GAPDH. Τα δεδομένα υπολογίστηκαν με βάση 2

-ΔCt όπου ΔCt = Ct (Target) -Ct (αναφοράς). Διπλώστε αλλαγή αυτή υπολογίζεται με βάση την 2

-ΔΔCt μέθοδο.

Η

κηλίδωση Western

Οι πρωτεΐνες που προέρχονται από τα κύτταρα χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα ΚΙΡΑ που περιέχει πλήρες κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche, Mannheim, Γερμανία ). Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με χρήση ηλεκτροφόρησης πηκτής πολυακρυλαμιδίου δωδεκυλ θειικού νατρίου και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες πολυβινυλιδενο φθορίδιο. Οι μεμβράνες στη συνέχεια αποκλείστηκαν με 5% άπαχο ξηρό γάλα σε TBST (15 mM Tris-HCl, ρΗ 7,4, 0,9% NaCl, και 0,05% Tween-20, ρΗ 7.4) που ακολουθείται από ανάλυση κηλίδος χρησιμοποιώντας προσδιορισμένα αντισώματα: μονοκλωνικά κουνελιού αντι-ανθρώπου αντίσωμα ENTPD5 (Sigma-Aldrich, Poole, Dorset, UK), και δευτερογενές αντίσωμα αντι-κουνελιού κουνελιού (1: 1000). Ανοσοδραστικές ταινίες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας SuperSignal Δυτική Femto Χημειοφωταυγές υπόστρωμα. Διεξήχθησαν πειράματα τουλάχιστον δύο φορές με συνεπή αποτελέσματα.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μέτρηση κυττάρων κιτ-8 δοκιμασίας. Τα κύτταρα (2 χ 10

3) καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία καλλιέργειας 96 φρεατίων. Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε RPMI-1640 που περιέχει 10% FBS, και χωρίζονται σε ομάδες προτού καλλιεργήθηκαν για 0, 24, ή 48 ώρες. Ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων προσδιορίστηκε με μέτρηση της απορρόφησης στα 450 nm χρησιμοποιώντας Fluostar OPTIMA (BMG LAB-TECH, Offenburg, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν

Η κυτταρομετρία ροής

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν για απόπτωση με χρήση αννεξίνης V-FITC & amp.? κιτ ανίχνευσης απόπτωσης ΡΙ (Imgenex, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα αναλύθηκαν σε FACSCalibur αναλυτή (Becton-Dickinson, USA) χρησιμοποιώντας το λογισμικό CellQuest Pro.

Transwell δοκιμασία εισβολής

δοκιμασία εισβολή Transwell εκτελέσθηκε ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 5 χ 10

4 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 0,1% FBS απλώθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων που περιέχει RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% FBS ως χημειοπροσελκυστικό. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα τα οποία μετανάστευσαν μέσα από και προσκολλάται στην άλλη πλευρά του ενθέματος μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με 0,5% (w /v) κρυσταλλικό ιώδες. Εισβάλλοντα κύτταρα στον πυθμένα των φίλτρων απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκοπία φθορισμού. Πέντε πεδία υψηλής ισχύος μετρήθηκαν ανά φίλτρο να σκοράρει για την εισβολή. Ο αριθμός των κυττάρων προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ.

πληγών επούλωσης δοκιμασία

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν μέχρι συρροής σε 6-φρεατίων πριν ξύσιμο με ένα ρύγχος πιπέτας 200 μΐ. Συντρίμματα απομακρύνθηκαν με εκτεταμένη πλύση με φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS) και τα κύτταρα επωάστηκαν περαιτέρω για άλλες 24 ώρες ή 48 ώρες μετά τον τραυματισμό.

cDNA microarray ανάλυση

Το ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας ΤΚΙζοΙ μέθοδο (Invitrogen, Carlsbad, CA), καθαρίζεται με RNeasy κιτ μίνι (Qiagen, Valencia, CA, USA), επεξεργασία χρησιμοποιώντας μια έκφραση GeneChip 3′-ενίσχυση Αντιδραστήρια κιτ (Affymetrix, USA), και ανακρίθηκε με Affymetrix PrimeView Human Gene έκφραση Array. RNA καθαρίστηκε περαιτέρω χρησιμοποιώντας RNeasy κιτ mini (Qiagen, Valencia, CA, USA) σύμφωνα με την Affymetrix εισαγωγές. Για την ανάλυση συστοιχία έκφρασης, ολικό RNA (250 ng) χρησιμοποιείται για να παράγει επισημασμένα με βιοτίνη cRNA χρησιμοποιώντας την έκφραση GeneChip 3′-Amplification Αντιδραστήρια Kit (Affymetrix, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το cRNA υβριδοποιήθηκε σε Affymetrix PrimeView Human Gene Expression Array και σαρώθηκαν με τη χρήση ενός Affymetrix GeneChip σειρά Scanner 3000 7G.

Ογκογονικότητα δοκιμασία

Έξι εβδομάδων θηλυκά Balb /c αθυμικά γυμνά ποντίκια (Vitalriver πειραματόζωα, Πεκίνο, Κίνα) υποδόρια ένεση στο δεξιό πλευρό με 2,0 × 10

6 κυττάρων σε 0,1 mL PBS. Μόλις σχηματίσθηκαν όγκοι, οι μετρήσεις δαγκάνα πραγματοποιήθηκαν καθημερινά και ο όγκος του όγκου (V) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο V = (L χ W

2) /2, όπου L είναι η διάρκεια και το W ήταν το πλάτος του όγκου. Όταν οι όγκοι έφθασαν έναν μέσο όγκο 30-69 mm

3, οι ποντικοί διαιρέθηκαν τυχαία σε τρεις ομάδες (η = 6) για την καθημερινή ένεση εντός του όγκου ENTPD5-siRNA και αρνητικού ελέγχου για 16 ημέρες. Για κάθε ένεση, 15 μg miRNA αναμίχθηκαν με 15 μί

in vivo

αντιδραστήριο επιμόλυνσης (Entranster-in vivo, Engreen, Κίνα). Καμπύλες ανάπτυξης σχεδιάσθηκαν χρησιμοποιώντας μέσος όγκος του όγκου σε κάθε πειραματική ομάδα σε διάφορα χρονικά σημεία. Οι όγκοι των όγκων των ποντικών καταγράφηκαν για 16 ημέρες, μετά τις οποίες υποβλήθηκαν σε ευθανασία των ποντικών. Οι όγκοι αποκόπηκαν συλλέχθηκαν και παρασκευάζονται για τις επόμενες αναλύσεις. Όλα τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από το κέντρο ζώο του Πεκίνου Αντικαρκινικό Νοσοκομείο.

Terminal δεοξυνουκλεοτιδυλοτρανσφεράσης μεσολάβηση dUTP nick-end επισήμανση (ΤΟΥΝΕΛ) δοκιμασία

Terminal δεοξυνουκλεοτιδυλοτρανσφεράσης μεσολάβηση dUTP nick-end επισήμανση (TUNEL) κιτ δοκιμασίας (in situ κυτταρικού θανάτου Detection Kit, Beyotime Ινστιτούτο Βιοτεχνολογίας, Κίνα) χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση του αριθμού των αποπτωτικών κυττάρων. Κατεψυγμένες τομές σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεϋδη σε ρΗ 7,4 PBS για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και διαπερατά σε PBS με 1.0% Triton Χ-100 για 2 λεπτά. Τα σπασμένα άκρα DNA των νεκρών κυττάρων σημάνθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ TUNEL ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση του SPSS έκδοση 18.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA ). Mann-Whitney test χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των συνεχών μεταβλητών. Chi-square test, ακριβές τεστ του Fisher ή μονόδρομη δοκιμή ANOVA χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των κατηγορικών μεταβλητών. P & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

Οι βαθμολογίες ENTPD5 συσχετίζεται με τα φύλα, την ιστορία του καπνού και τα στάδια του όγκου, με την αρνητική έκφραση του ENTPD5 που οδηγεί σε μεγαλύτερο χρόνο επιβίωσης

Για να ανίχνευση της έκφρασης ENTPD5 σε ιστούς καρκίνου του πνεύμονα, ο καρκίνος του πνεύμονα κύτταρα χρωματίστηκαν για ανοσοϊστοχημική ανάλυση. Τα καρκινικά κύτταρα παρουσίασαν ισχυρή και διάχυτη κυτταροπλασματική χρώση του ENTPD5 (Σχ. 1Α-D). Υψηλές βαθμολογίες των ENTPD5 (1-3) σε NSCLC βρέθηκαν σε 32 περιπτώσεις (24,4%). Μεταξύ όλων των διαθέσιμων παραμέτρων, το φύλο, την ιστορία του καπνού και του όγκου στάδια έδειξε σημαντική συσχέτιση να ENTPD5 βαθμολογίες (Ρ & lt? 0,05) (Πίνακας 1). Μονοπαραγοντική ανάλυση των επιπτώσεων της κατάστασης έκφρασης ENTPD5 για την πρόγνωση έδειξε ότι μεγαλύτερο χρόνο επιβίωσης συσχετίστηκε σημαντικά με αρνητική έκφραση του ENTPD5 (μέσος χρόνος επιβίωσης 81 μήνες έναντι 45,6 μηνών, η P & lt? 0.001). Καμπύλη επιβίωσης Kaplan-Meier, με βάση την βαθμολογία έκφραση ENTPD5, έδειξε ότι ο συσσωρευμένος χρόνος επιβίωσης για τους ασθενείς με ENTPD5 αρνητική έκφραση (βαθμολογία = 0, n = 96) ήταν σημαντικά μεγαλύτερη από εκείνη για τους ασθενείς με υψηλά επίπεδα ENTPD5 (βαθμολογία = 1- 3, n = 31) (Σχ. 1Ε). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι οι ENTPD5 βαθμολογίες συσχετίζεται με τα φύλα, την ιστορία του καπνού και τα στάδια του όγκου, με την αρνητική έκφραση του ENTPD5 που οδηγεί σε μεγαλύτερο χρόνο επιβίωσης.

ENTPD5 χρώση των ιστών του καρκίνου του πνεύμονα με (Α) σκοράρει 0, (Β ) βαθμολογία 1+, (C) 2+, και (Δ) αποτέλεσμα 3+. (Ε) Kaplan-Meier ανάλυση της συσχέτισης μεταξύ της συνολικής επιβίωσης των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα και του καθεστώτος έκφραση ENTPD5 πρωτεΐνης (Ρ & lt? 0.001).

Η

Η αναστολή της έκφρασης ENTPD5 μειώνει την ανάπτυξη των πνευμόνων των καρκινικών κυττάρων και αυξάνει το ρυθμό απόπτωσης τους

in vitro

η

για να δοκιμαστεί η επίδραση του ENTPD5 στην ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα και την απόπτωση

in vitro

, κατασκευάσαμε με επιτυχία τα μοντέλα παροδικής διαμόλυνσης κυττάρων. Αξιολόγηση των επιπέδων έκφρασης ENTPD5 σε διαφορετικές γραμμές καρκίνου του πνεύμονα, συμπεριλαμβανομένων των H1975, H1650, Η1299, Α549, GLC82, PC9 και SKMES1, έδειξαν ότι SKMES-1 είχε την υψηλότερη σχετική έκφραση ENTPD5 (Εικ. 2Α). Επιπλέον, knockdown του ENTPD5 επάγεται σημαντικά μειωμένα επίπεδα έκφρασης ENTPD5 σε PC9 και Α549 κύτταρα (Σχ. 2Β και C). Επιπλέον, δοκιμασία κυτταρικής ανάπτυξης επί PC9 και Α549 κύτταρα με μέτρια έκφραση του ENTPD5 έδειξε ότι knockdown του ENTPD5 μείωσε σημαντικά την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα (Εικ 2Δ και Ε.) (Ρ & lt? 0.001). ανάλυση απόπτωση σε PC9 και Α549 κύτταρα έδειξαν ότι knockdown του ENTPD5 αυξημένο ρυθμό κυτταρικής απόπτωσης σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου (Ρ & lt? 0,05) (Σχ 2F.). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η αναστολή της έκφρασης ENTPD5 μειώνει την ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα και αυξημένο ρυθμό απόπτωσης τους

in vitro

.

(Α) Εκφραση ENTPD5 σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα. Σχετική έκφραση ENTPD5 σε κύτταρα (Β) PC9 και (C) προσδιορίζεται με Α549 qRT-PCR και κηλίδωση Western. ικανότητα ανάπτυξης του (D) PC9 και (Ε) κύτταρα Α549 μετά την knockdown του ENTPD5 γονιδίου προσδιορίζεται με δοκιμασία ανάπτυξης. (F) Απόπτωση των PC9 και κυττάρων Α549 μετά την knockdown του γονιδίου ENTPD5 προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής. Τα δεδομένα είναι μέσα ± SD. Διπλό αστερίσκοι υποδεικνύουν τιμές που είναι σημαντικά διαφορετικό από κάθε άλλο.

Η

κάτω ρύθμιση της έκφρασης ENTPD5 μειώνει την ικανότητα εισβολής και την κινητικότητα του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων

in vitro

Η

για να διερευνηθεί η επίδραση της ENTPD5 για τον καρκίνο του πνεύμονα εισβολή των κυττάρων και την κινητικότητα

in vitro

, μεταξύ φρεατίων δοκιμασία εισβολής και πληγών δοκιμασία επούλωση έγιναν. Transwell δοκιμασία εισβολή έδειξαν ότι κάτω ρύθμιση της έκφρασης ENTPD5 ανέστειλε σημαντικά την ικανότητα εισβολής των PC9 και Α549 κύτταρα (Ρ = 0.000142 και Ρ = 0,00158, αντίστοιχα) (Σχ. 3Α). Τραύματος δοκιμασία επούλωσης απέδειξαν ότι κάτω-ρυθμιζόμενη έκφραση του ENTPD5 μειωθεί δραματικά την κινητικότητα του PC9 και Α549 κύτταρα από 24 ώρες έως το τέλος των πειραμάτων σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχ. 3Β και C). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης ENTPD5 μειώνει την ικανότητα εισβολής και κινητικότητα των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα

in vitro

.

ENTPD5-KD ή KD υποδεικνύει την knockdown των κυτταρικών γραμμών καρκίνου του πνεύμονα. Τα δεδομένα είναι μέσα ± SD. Διπλό αστερίσκοι υποδεικνύουν τιμές που διαφέρουν σημαντικά μεταξύ τους (P & lt? 0,05). (Β) Η επούλωση πληγών του PC9 και Α549 κύτταρα μετά την knockdown του γονιδίου ENTPD5 σύγκριση με την άγριου τύπου (WT) και φυσιολογικό έλεγχο (NC) τα μοντέλα σε 0, 24 ή 48 ώρες. Κατά τη διάρκεια της εισβολής και επούλωσης τραυμάτων πειράματα, κασπάσης 3 προστέθηκε για την αναστολή της κυτταρικής απόπτωσης.

Η

κασπάσης 3 θα μπορούσε να διαδραματίσει ένα σημαντικό ρόλο στην απόπτωση των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα μετά την knockdown του ENTPD5

για να κατανοήσουμε τους μηχανισμούς της δράσης των πρωτεϊνών που σχετίζονται με την απόπτωση των κυττάρων του καρκίνου του πνεύμονα μετά το νοκ ντάουν της ENTPD5, πραγματοποιήσαμε ανάλυση τσιπ γονιδίων σε PC9 και Α549 κυττάρων, η οποία επικεντρώθηκε κυρίως για τις δοκιμές του μονοπατιού κυτταρικής απόπτωσης. Για τα κύτταρα PC9, νοκ ντάουν της ENTPD5 αύξησε την έκφραση ορισμένων γονιδίων πάνω από 1,5 φορές σε σχέση με τον έλεγχο, συμπεριλαμβανομένων των CASP4, APAF1, BCL2L11, CASP7 και BCL2A1. Για τα κύτταρα Α549, knockdown του ENTPD5 αύξησε την έκφραση ορισμένων γονιδίων κατά τουλάχιστον 2 φορές σε σύγκριση με τον έλεγχο, συμπεριλαμβανομένων CASP7, MDM2, και BIRC3 (Σχ. 4Α). Της σημείωσης, κασπάση 7 (CASP7), ένα μέλος της κασπάσης 3 υποομάδας, έδειξαν σημαντικά αυξημένη έκφραση μετά ENTPD5 νοκ ντάουν στις δύο κυτταρικές σειρές PC9 και Α549 (Σχ. 4Α). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι κασπάσης 3 θα μπορούσε να διαδραματίσει ένα σημαντικό ρόλο στην απόπτωση των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα μετά την knockdown του ENTPD5.

(Α) δοκιμή τσιπ Gene δείχνει ανάλυση μονοπατιού που σχετίζεται με την απόπτωση. γονίδιο Κασπάση υπερέκφραση παρατηρήθηκε σε PC9 και Α549 κύτταρα μετά την knockdown του ENTPD5. (Β) δοκιμή qRT-PCR δείχνει κασπάσης 3 έκφρασης σε PC9 και Α549 κύτταρα μετά την νοκ ντάουν της ENTPD5. Τα δεδομένα είναι μέσα ± SD. Οι αστερίσκοι δείχνουν τιμές που είναι σημαντικά διαφορετική από την ομάδα NC (P & lt? 0,05). (Γ) Η απόπτωση των PC9 και Α549 κύτταρα μετά την knockdown του ENTPD5 παρουσία του αναστολέα κασπάσης 3.

Η

Caspase αναστολέα 3 αποτρέπει την αύξηση του ρυθμού απόπτωσης των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα που προκαλείται από την knockdown του ENTPD5

Για να επιβεβαιώσετε τη σημασία της κασπάσης 3 στην απόπτωση των κυττάρων του καρκίνου του πνεύμονα μετά το νοκ ντάουν της ENTPD5, qRT-PCR και κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκαν. Τα αποτελέσματα της qRT-PCR έδειξε ότι η σχετική έκφραση της κασπάσης 3 mRNA αυξήθηκε σημαντικά με την knockdown του ENTPD5 στις δύο PC9 και Α549 κύτταρα (Σχ. 4Β). Επιπλέον, κυτταρομετρία ροής έδειξε ότι ENTPD5 knockdown απέτυχε να επάγει σημαντική αύξηση του ρυθμού απόπτωσης σε PC9 και Α549 κύτταρα παρουσία του αναστολέα Casepase 3 (Εικ. 4C). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ο αναστολέας κασπάσης 3 αποτρέπει την αύξηση του ρυθμού απόπτωσης των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα που προκαλείται από την knockdown του ENTPD5.

εξόντωση ENTPD5 αναστέλλει την ανάπτυξη και προάγει την απόπτωση των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα

in vivo

Για να επικυρώσετε την επίδραση της ENTPD5 σε ζωικά μοντέλα, δοκιμασία ογκογενετικότητας, Western δοκιμασία κηλίδωσης, ανοσοϊστοχημεία και δοκιμασία TUNEL πραγματοποιήθηκαν. Tumor κατάσταση ανάπτυξης σε ποντικούς που έχουν εγχυθεί με κύτταρα Α549 έδειξε ότι ENTP5-KD ομάδα ποντικών είχε μικρότερα μεγέθη του όγκου, βραδύτερο ρυθμό ανάπτυξης όγκου του όγκου, και χαμηλότερη τελική βάρος όγκου από εκείνες WT και NC ομάδες (Σχ. 5Α-C). Western blotting ανάλυση ιστών όγκου έδειξε ότι η έκφραση της πρωτεΐνης του πυρηνικό αντιγόνο πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων και ENTPD5 μειώθηκε αλλά ότι της κασπάσης 3 αυξήθηκε στην ομάδα ENTPD5-KD ποντικών σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου (Εικ. 5D).

(Β) μεταβολή του όγκου των όγκων σε διαφορετικές ομάδες των ενέσεων Α549 κυττάρων. (C) αλλαγή του βάρους του όγκου σε διαφορετικές ομάδες. Τα δεδομένα είναι μέσα ± SD. Διπλό αστερίσκοι υποδεικνύουν τιμές που είναι σημαντικά διαφορετική από την ομάδα NC (P & lt? 0,05). (D) πυρηνικό αντιγόνο πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων, κασπάσης 3 και ENTPD5 κατάσταση έκφρασης σε διαφορετικές ομάδες ζώων μοντέλο προσδιορίζεται με κηλίδωση Western. (Ε) δοκιμές Ανοσοϊστοχημεία δείχνει ENTPD5, κασπάσης 3 και πολλαπλασιαζόμενα κατάσταση έκφρασης του πυρηνικού αντιγόνου των κυττάρων σε διαφορετικές ομάδες ζωικό μοντέλο. (F) απόπτωση κυττάρων ιστού όγκου σε ζωικά μοντέλα μετά την knockdown του ENTPD5 προσδιορίζεται επί τόπου χρησιμοποιώντας δοκιμασία TUNEL.

Η

Ανοσοϊστοχημική ανάλυση της έκφρασης του πυρηνικού αντιγόνου πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων, ENTPD5 και Casepase 3 συμφώνησε με την δεδομένα που λαμβάνονται από κηλίδωση Western (Σχ. 5Ε). Επιπλέον, TUNEL δοκιμασία ιστών όγκου έδειξε ότι τα επίπεδα της απόπτωσης των καρκινικών κυττάρων στην ομάδα ENTP5-KD των ποντικών ήταν υψηλότερες από εκείνες στην ομάδα ελέγχου (Εικ. 5F). Αυτά τα δεδομένα προτείνουν ότι knockdown του ENTPD5 αναστέλλει την ανάπτυξη και προάγει την απόπτωση των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα

in vivo

.

Συζήτηση

Ο καρκίνος του πνεύμονα δείκτες πρόγνωση σχετίζονται παίζουν σημαντικό ρόλο στην πολλές διαδικασίες, όπως η αύξηση των καρκινικών κυττάρων, την απόπτωση, αγγειογένεση όγκου, και εισβολής καρκινικών κυττάρων. Στον καρκίνο του πνεύμονα, η εισαγωγή των στοχευμένων παραγόντων σε ασθενείς που φέρουν γενετικές ανωμαλίες έχει οδηγήσει σε καλύτερα κλινικά αποτελέσματα με καλύτερη ποιότητα ζωής. Γενωμική αστάθεια ή επιλογή οδηγεί σε εκτροπές που μπορούν να ομαδοποιηθούν σε έξι απαραίτητη οδών: i) η απόκτηση αυτάρκης ή αυτόνομη ανάπτυξη σήματα? ii) αναισθησία σε σήματα ανασταλτικές της ανάπτυξης? iii) η αντίσταση στα σήματα της απόπτωσης? iv) απεριόριστες δυνατότητες πολλαπλασιασμό? v) υπέστησαν αγγειογένεση? και vi) εισβολή και τη μετάσταση [17]. Καρκινικά κύτταρα πρόδηλη πολύπλοκες γενετικές ανωμαλίες που συμβαίνουν κατά τη διάρκεια πολλών σταδίων καρκινογένεση. Μερικά μοριακό εκτροπές έχουν περισσότερες πιθανότητες από άλλους να επηρεάσει την κλινική συμπεριφορά του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του κινδύνου μετάστασης. Τέτοιες εκτροπές, άπαξ προσδιοριστεί, θα μπορούσε ενδεχομένως να χρησιμεύσει ως προγνωστικούς δείκτες, οι οποίοι είναι χαρακτηριστικά του όγκου που μπορούν να επηρεάσουν και την πρόβλεψη της κλινικής έκβασης των ασθενών με καρκίνο.

Η υπερέκφραση κάποιων δεικτών, όπως ο αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας [18] , υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα [4-6], ανθρώπινο υποδοχέα επιδερμικού αυξητικού παράγοντα-2 [7], p53 [8] και Β-κυττάρου λέμφωμα-2 [9], έχει δείξει συσχέτιση με κακή πρόγνωση. Σε αυτή τη μελέτη, η ανάλυση ανοσοϊστοχημείας επιβεβαίωσε την ειδική υπερέκφραση του ENTPD5 πρωτεΐνης σε ιστούς καρκίνου του πνεύμονα. Περαιτέρω έρευνες σχετικά με τη συνολική επιβίωση υποδεικνύουν ότι η ενισχυμένη έκφραση της ENTPD5 συνδέεται με φτωχότερη πρόγνωση. Αυτές οι παρατηρήσεις αποκαλύπτουν τις δυνατότητες του ENTPD5 ως προγνωστικός δείκτης.

ENTPD5 αναγνωρίζεται ως βασική συνιστώσα στην /φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης 3-κινάσης /φωσφατάσης και tensin ομόλογο ρυθμιστικές βρόχο Akt, ικανή να δρα συνεργικά αερόβια γλυκόλυση [19,20 ]. Μερικοί ερευνητές δείχνουν ότι η υπερέκφραση του ENTPD5 επηρεάζει την ανάπτυξη πολλών όγκων, όπως gliomablastoma [20], του καρκίνου του μαστού [21], τον καρκίνο του τραχήλου [22], ορχικό όγκο γεννητικών κυττάρων [23], και του λάρυγγα νεοπλασία [24]. Ογκογένεση μια διαδικασία πολλών σταδίων που περιλαμβάνει την κυτταρική ανάπτυξη, εισβολή, μετάσταση, και την αγγειογένεση. Έρευνα για την επίδραση της ENTPD5 στη διαδικασία κυτταρικής εξέλιξης δείχνει ότι κάτω-έκφραση της ENTPD5 σε Α549 και κυτταρικές σειρές PC9 μειώνει σημαντικά τους βαθμούς του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, την απόπτωση και τη μετανάστευση. Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ENTPD5 μπορεί να δράσει ως ένα ογκογονίδιο να παίξει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση διαφόρων κυτταρικών διεργασιών που προωθούν νεοπλασματική εξέλιξη σε πολλαπλά επίπεδα. Παρ ‘όλα αυτά, οι μηχανισμοί με τους οποίους ENTPD5 επιδρά σε συγκεκριμένα μονοπάτια σηματοδότησης χρειάζονται περαιτέρω μελέτες. Κύτταρα

NSCLC είναι η απόπτωση ανθεκτικά. Στρατηγικές για την απο-καταστείλει ενδογενείς αναστολείς κασπάσης σε NSCLC υποδηλώνουν υποσχόμενη δραστηριότητα σε συστήματα μοντέλων και παρουσιάζουν μια ορθολογική και εντελώς νέα στρατηγική για τη βελτίωση της θεραπείας του καρκίνου του πνεύμονα. Η απόπτωση είναι ενορχηστρωμένη από τη διαδοχική ενεργοποίηση κασπασών, μιας οικογένειας πρωτεασών κυστεΐνης με ειδικότητα για υπολείμματα ασπαρτικού οξέος. Δύο οδοί μπορεί να μεσολαβεί απόπτωση: i) ο θάνατος υποδοχείς οδού (παράγοντας νέκρωσης όγκου, συνδέτη Fas ή TRAIL υποδοχείς) που ενεργοποιεί κασπάση 8 και 10, και ii) το μιτοχονδριακό μονοπάτι που ενεργοποιεί κασπάση 9. Και τα δύο μονοπάτια οδηγούν σε κασπάσες ενέργειας 3, 6 και 7 [25]. Η έρευνά μας έχει επιβεβαιώσει τη σχέση μεταξύ ENTPD5 και κασπάσης 3 σε πειράματα κυτταρικό επίπεδο και των ζώων. Η κατανόηση της μοριακής βάσης αυτού του φαινοτύπου είναι κρίσιμη, εάν η θεραπεία είναι να προχωρήσουμε πέρα ​​από τη θεραπευτική οροπέδιο που έχει επιτευχθεί με τη συμβατική χημειοθεραπεία. Κασπάσης 3 έκφραση μπορεί να σχετίζεται με ευαίσθητη διαδικασία της χημειοθεραπείας ή ακτινοβολίας [26]. MacCarthy et al. ανέφεραν ότι η ανώμαλη έκφραση του ENTPD5 σε ανθρώπινα κύτταρα καρκινώματος παχέος θα μπορούσαν να επηρεάσουν τα επίπεδα ΑΤΡ και την αντίσταση σε οξαλιπλατίνη, μία ορθοκολικού καρκίνου-σχετικό χημειοθεραπευτικό παράγοντα [27]. Villar et al. βρέθηκε επίσης τη σχέση μεταξύ ENTPD 5 και απόκριση χημειοθεραπεία στον καρκίνο του προστάτη 15]. Φαίνεται ότι η έκφραση ENTPD5 μπορεί όχι μόνο να αποτελέσει ένα ισχυρό ρεπόρτερ για την μεταβολική μετατόπιση σε κύτταρα όγκου, αλλά επίσης μια πιθανή προγνωστικό για αποκρίσεις σε χημειοθεραπεία όγκων. Αυτή η μελέτη διαπίστωσε ότι ENTPD5 ανέστειλε την απόπτωση των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα μέσω της κασπάσης 3. Ωστόσο, η σχέση μεταξύ της επίδρασης της χημειοθεραπείας και ENTPD5 χρειάζεται περαιτέρω έρευνα στο μέλλον. Εν κατακλείδι, ENTPD5 γονίδιο είναι ζωτικής σημασίας για NSCLC. Θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ενδεχομένως να παρακολουθεί την πρόγνωση ή να καθοδηγήσει κατάλληλα θεραπευτικά σχήματα.

Ευχαριστίες

Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Πεκίνο Επιστήμης Νέο σχέδιο Star (Νο Z11111005450000) και το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 81101598).