You must be logged into post a comment.
Αφηρημένο
καρκίνος του παχέος εντέρου είναι μια κακοήθεια που αναπτύσσεται στο παχύ έντερο και το ορθό ιστούς. Η πρόγνωση για το μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου παραμένει φτωχή, και οι νέες θεραπευτικές επιλογές που απαιτούνται για τη μείωση της θνησιμότητας από καρκίνο του παχέος εντέρου. Πρόσφατα, τα ενδοκυτταρικά επίπεδα cAMP έχουν προταθεί για να επηρεάσει τη συμπεριφορά των καρκινικών κυττάρων. Περιέργως, κυκλικό φωσφατιδικό οξύ (CPA) και δομικά ανάλογα της αναστέλλουν την ανάπτυξη σε πολλές καρκινικές κυτταρικές σειρές, και προηγούμενη εργασία μας έχει προτείνει ότι CPA αυξάνει την παραγωγή cAMP. Φωσφοδιεστεράσης (PDE) τύπου 3 ισομορφές ΡϋΕ3Α και PDE3B εκφράζονται κυρίως σε καρδιαγγειακό ιστό και λιπώδη ιστό, αντίστοιχα. Επιπλέον, αύξηση στα ενδοκυτταρικά επίπεδα cAMP έχει συσχετιστεί με την αναστολή της ανάπτυξης καρκίνου του παχέος εντέρου σε κύτταρα. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι CPA θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί στη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου. Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι CPA ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων ΗΤ-29, τα οποία εκφράζουν υψηλά επίπεδα PDE3B, αλλά όχι την ανάπτυξη των κυττάρων DLD-1, τα οποία εκφράζουν χαμηλά επίπεδα PDE3B. Επιπλέον, CPA ανέστειλε την φωσφορυλίωση της Akt σε ΗΤ-29 κυττάρων σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η έκφραση PDE3B και ενδοκυτταρικά επίπεδα cAMP συσχετίζονται με τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου. Τα ευρήματα αυτά δείχνουν για πρώτη φορά ότι CPA μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα μόριο σε στοχευμένη θεραπεία για τον καρκίνο του παχέος εντέρου
Παράθεση:. Τσουκαχάρα Τ, Matsuda Υ, Haniu Η (2013) Κυκλικές φωσφατιδικό οξύ Διεγείρει cAMP Παραγωγής και αναστέλλει ανάπτυξης σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. PLoS ONE 8 (11): e81139. doi: 10.1371 /journal.pone.0081139
Επεξεργαστής: Ο Carl G. Μάκη, του Πανεπιστημίου Rush Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής
Ελήφθη: 22, Ιουν 2013? Αποδεκτές: 18, Οκτ, 2013? Δημοσιεύθηκε: 25 Νοέμβρη 2013
Copyright: © 2013 Τσουκαχάρα et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται
Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις-in-ενισχύσεις για την Επιστημονική έρευνα (C) 22591482 (σε ΤΤ) από την Ιαπωνία Εταιρείας για την Προώθηση της Επιστήμης, Grant-in-Aid από το Ίδρυμα Takeda Science (σε ΤΤ), Astellas θεμέλιο για έρευνα σχετικά με μεταβολικές διαταραχές (σε ΤΤ) και Ναγκάνο Εταιρείας για την Προώθηση της Επιστήμης (σε ΤΤ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου
Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα
Εισαγωγή
κυκλικής νουκλεοτιδικής φωσφοδιεστεράσης (PDE) είναι ένα ένζυμο που διασπά φωσφοδιεστερικούς δεσμούς [1]. Στους ανθρώπους, οι PDEs κωδικοποιούνται από 21 γονίδια PDE [1], τα οποία χωρίζονται σε 11 οικογένειες με βάση την δομική ομοιότητα όπως ομολογία αλληλουχίας πρωτεΐνης. Οι PDEs περιλαμβάνουν μια ομάδα ενζύμων που διασπούν το δεσμό φωσφοδιεστέρα στο δεύτερο αγγελιοφόρου cAMP, η οποία παίζει κεντρικό ρόλο στην κυτταρική αποκρίσεις σε ποικίλα εξωκυτταρικά ερεθίσματα [2]. Τα επίπεδα ενδοκυτταρικού cAMP ρυθμίζονται κανονικά από την ισορροπία μεταξύ των δραστηριοτήτων των δύο τύπων ενζύμων, τα ένζυμα cAMP δημιουργίας (αδενυλική κυκλάσες) και τα ένζυμα cAMP αποικοδόμησης (PDEs), κυρίως ως απάντηση σε ορμόνες και νευροδιαβιβαστές [3] [4] . PDE3B ταυτοποιήθηκε σε ανθρώπους και μεταγραφές του βρίσκονται κυρίως στο λιπώδη ιστό [5], και PDE3B έχει αναφερθεί ότι είναι φωσφορυλιωμένη και ενεργοποιείται σε απόκριση στην ινσουλίνη και ορμόνες που αυξάνουν τα επίπεδα της cAMP [6].
Βιοδραστικών λιπίδια όπως κυκλικό φωσφατιδικό οξύ (CPA) [7] [8] έχουν προταθεί για την αύξηση της κυτταρικής cAMP επίπεδα και να οδηγήσει σε RhoA αδρανοποίηση σε κύτταρα ηπατώματος [9]. Προηγουμένως, δείξαμε ότι CPA μειώνεται ενδοκυτταρικά επίπεδα τριγλυκεριδίων και ανέστειλε την έκφραση PDE3B [8]. Επιπλέον, τα ενδοκυτταρικά επίπεδα cAMP στα κύτταρα 3T3-L1 βρέθηκαν να αυξάνουν μετά από έκθεση σε CPA. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν το μονοπάτι CPA-PDE3B-cAMP είναι ένα ειδικό μοριακό στόχο. Φωσφολιπάση D2 (PLD2) δημιουργεί CPA από λυσοφωσφατιδυλοχολίνη (LPC), και θεραπεία με ινσουλίνη χαμηλή δόση των κυττάρων που διεγείρει τη δραστηριότητα PLD2 και αυξάνει τα επίπεδα ενδοκυτταρικής CPA [7].
Πρόσφατα, PDE3 έχει προταθεί να διαδραματίσει καίριο ρόλο στον καρκίνο εισβολή κυττάρων και κυτταρική κινητικότητα [10]. αναστολείς PDE3 όπως κιλοσταζόλη ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων του καρκινώματος πνεύμονα μικρών κυττάρων [11], προσδιορίζοντας PDE3 ως στόχος για τη θεραπεία του καρκίνου αντι-πολλαπλασιαστική. Μείωση της δραστηριότητας PDE3B συνοδεύεται από αυξήσεις στα ενδοκυτταρικά επίπεδα του cAMP, η οποία ενεργοποιεί cAMP-εξαρτώμενη πρωτεϊνική κινάση Α (ΡΚΑ) [1]. Σε φυσιολογικά ανθρώπινα κύτταρα, cAMP προάγει πολλαπλασιασμό και διαφοροποίηση, αλλά σε καρκινικά κύτταρα, cAMP επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό ευδιάκριτα και καταστέλλει βασικός πολλαπλασιασμός σε επίπεδα σημαντικά από ό, τι φυσιολογικά ανθρώπινα κύτταρα [12]. Επιπλέον, τα υψηλά ενδοκυτταρικά επίπεδα cAMP μπορεί να μειώσει αποτελεσματικά in vitro ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων [1].
Akt (πρωτεΐνη κινάση Β) έχει αποδειχθεί πρόσφατα να μετριάσει σηματοδότησης cAMP ενεργοποιώντας PDE3B [13]. Από την ανακάλυψή του ως πρωτο-ογκογονίδιο, η κινάση σερίνης /θρεονίνης Akt έχει γίνει μια σημαντική εστίαση της προσοχής, διότι Akt ρυθμίζει διάφορες κυτταρικές διαδικασίες κριτικά, συμπεριλαμβανομένης της εξέλιξης του καρκίνου [14]. Στον καρκίνο, δραστικότητα Akt συχνά αυξημένα λόγω των πολλαπλών μηχανισμών, συμπεριλαμβανομένης της απώλειας της λειτουργίας του ογκοκατασταλτικού γονιδίου PTEN [15]. Όταν ενεργοποιηθεί, Akt μπορεί να φωσφορυλιώσει πολλαπλές κατάντη μορίων που εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και καταστέλλοντας την απόπτωση [16]. Akt σηματοδότηση συνδέεται με το σχηματισμό όγκων, και οι αναστολείς Akt έχουν αναπτυχθεί για να ελέγχουν την ανάπτυξη του καρκίνου [14]. Ωστόσο, για τον καρκίνο του παχέος εντέρου, οι θεραπευτικές επιλογές περιορίζονται σήμερα επειδή οι θεραπείες αυτές παράγουν δυσμενείς καρδιαγγειακές και θρομβωτικές επιδράσεις [17]. Ετσι, άλλες οδούς σηματοδότησης πρέπει να θεωρηθεί ότι μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών στρατηγικών για τη στόχευση του καρκίνου του παχέος εντέρου. Περιέργως, CPA έχει αναφερθεί για την παραγωγή αντι-μιτογονικά αποτελέσματα και την πρόληψη των καρκινικών κυττάρων in vitro εισβολή και μετάσταση in vivo [18] [19].
ερευνήσαμε την έκφραση του PDE3 ισομορφών ΡϋΕ3Α και 3Β σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές γραμμές ΗΤ-29 και DLD-1. Σε πραγματικό χρόνο αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR) και κηλίδωση Western αποκάλυψε ότι PDE3D ήταν η μόνη PDE3 ισομορφή εκφράζεται σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. PDE3B mRNA και πρωτεΐνης εκφράστηκαν σε υψηλά επίπεδα σε κύτταρα ΗΤ-29, και παρατηρήσαμε ότι τα επίπεδα έκφρασης PDE3B συσχετίζεται με τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου. Βρήκαμε ότι η θεραπεία CPA αυξημένα ενδοκυτταρικού cAMP και κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ΗΤ-29. Επιπλέον, CPA ανέστειλε Akt φωσφορυλίωση σε κύτταρα ΗΤ-29 με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η οδός CPA-PDE3B-cAMP παίζει ένα κρίσιμο στην εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου
Υλικά και Μέθοδοι
Αντιδραστήρια
CPA (18:. 1 ) αγοράστηκε από την Avanti Polar Lipids Inc. (Alabaster, AL). Η δεξαμεθαζόνη αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ). Σιλοσταζόλη, αντίσωμα αντι-PDE3B (sc-20793), και αντίσωμα αντι-β-ακτίνης (sc-47778) αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anti-Akt (# 9272) και αντι-pAkt S473 (9271S) αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ).
Κυτταρική καλλιέργεια
κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου ανθρώπου ΗΤ-29, LOVO, και Caco-2 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VS). DLD-1 κύτταρα ανθρώπινου αδενοκαρκινώματος ελήφθησαν από το Science Research Resources Bank Υγείας (Osaka, Japan). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε Τροποποιημένο κατά Dulbecco μέσου Eagle (ϋΜΕΜ? Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) ή μέσο RPMI-1640 (Nacalai Tesque) που περιείχε 10% (ν /ν) εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS), 100 U /mL πενικιλλίνη, 10 μg /mL στρεπτομυκίνη, και 2,5 μg /mL plasmocin
TM (Nacalai Tesque) στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή με 5% CO
2.
κηλίδος Western ανάλυση
Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων (Iwaki, Tokyo, Japan) σε πυκνότητα 1 × 10
5 κύτταρα /φρεάτιο. Μετά από διάφορες θεραπείες (όπως αναφέρεται), τα κύτταρα λύθηκαν επί πάγου για 30 λεπτά σε ρυθμιστικό διάλυμα κυττάρων-λύσης (20 mM Tris-HCl [ρΗ 7.4], 10% [ν /ν] γλυκερόλη, 100 mM NaCl, 1% [v /ν] Τπίοη Χ-100, 1/100 κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης [Sigma], 1 mM διθειοθρεϊτόλη) και φυγοκεντρήθηκε στις 16.000 χ
g
για 20 λεπτά στους 4 ° C. Τα υπερκείμενα αποθηκεύονται ως κυτταρολύματα και εξετάσθηκαν για περιεκτικότητα πρωτεΐνης με χρήση της μεθόδου Bradford (Bio-Rad Protein Assay kit? Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Τα κυτταρολύματα στη συνέχεια διαχωρίστηκαν επί 5% -20% δωδεκυλοθειικό νάτριο (SDS) πολυακρυλαμιδίου πηκτές (e-Pagel? ΑΤΤΟ, Tokyo, Japan) και ηλεκτρομεταφέρθηκαν σε μεμβράνες Immobilon-P (Millipore, Billerica, ΜΑ). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν για 1 ώρα με Block Ace (DS Πάρμα Biomedical Co. Ltd., Osaka, Japan) και επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα αραιώνονται σε TBS-T με 5% Block Ace για 12 ώρες σε 4 ° C. Οι ζώνες πρωτεΐνης έγιναν ορατές με τη χρήση EzWestLumi συν (ΑΤΤΟ).
ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση
Το συνολικό κυτταρικό RNA παρασκευάσθηκε χρησιμοποιώντας NucleoSpin RNA II (Takara, Shiga, Japan), και 0,5 μg ολικού RNA χρησιμοποιήθηκε για τη σύνθεση cDNA με τη ReverTra Ace qPCR RT Kit (Toyobo, Osaka, Japan) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Μετρήσαμε τα επίπεδα του mRNA χρησιμοποιώντας ECO σύστημα πραγματικού χρόνου PCR (Illumina Inc., San Diego, CA) και SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus (Toyobo) με τα ακόλουθα ζεύγη εκκινητών που χρησιμοποιούνται στις αντιδράσεις: ΡϋΕ3Α, 5′ AAAGACAAGCTTGCTTGCTATTCCAAA-3 ‘(F) και 5′-GTGGAAGAAACTCGTCTCAACA-3′ (R)? PDE3B, 5’-CCAGGTGTGCATCAAATTAGCA-3 ‘(F) και 5′-CAATGCCTTCTGTCCATCTCAA-3′ (R)? 18S rRNA, 5’- CAGCCACCCGAGATTGAGCA-3 ‘(F) και 5′-TAGTAGCGACGGGCGGTGTG-3’ (R). Όλες οι αντιδράσεις PCR πραγματοποιήθηκαν σε έναν όγκο 10 μι, με τη χρήση 48-βοθρίων πλάκες PCR (Illumina). Οι συνθήκες κυκλοποίησης ήταν 95 ° C για 10 λεπτά (ενεργοποίηση ενζύμου) που ακολουθείται από 40 κύκλους των 95 ° C για 15 s, 55 ° C για 15 s, και 72 ° C για 30 s. Μετά την ενίσχυση, τα δείγματα θερμάνθηκαν βραδέως από 55 ° C έως 95 ° C και ο φθορισμός μετρήθηκε συνεχώς για να ληφθεί μια καμπύλη τήξης. Σχετικά επίπεδα mRNA υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τον τύπο 2
-ΔΔCq, όπου ΔCq είναι η διαφορά μεταξύ του κύκλου κατωφλίου μιας δεδομένης cDNA στόχου και ότι ενός ενδογενούς cDNA αναφοράς. Παραγωγή των τύπων και των δοκιμών επικύρωσης έχουν περιγραφεί στην Applied Biosystems Bulletin Νο χρήστη 2.
Μέτρηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων
Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας 96 φρεατίων (5 χ 10
3 κύτταρα /φρεάτιο) και επωάστηκαν για 24 ώρες. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τον μέτρηση κυττάρων Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan): 10 μΐ κυτταρικού Μετρώντας διάλυμα Kit-8 προστέθηκε στο μέσον και επωάζονται για 2 ώρες σε ένα επωαστή με 5% CO
2? η ποσότητα της πορτοκαλί χρωστικής φορμαζάνης που παράγεται υπολογίστηκε με μέτρηση της απορρόφησης στα 450 nm σε μία συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας (Ευαισθητοποίηση Technology, Inc., Palm City, FL).
κυκλικού νουκλεοτιδίου φωσφοδιεστεράσης δοκιμασία
Η δραστικότητα της ανασυνδυασμένης PDE3B ετικέτα με GST (BPS Bioscience Inc., San Diego, CA) αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας PDE κυκλικού νουκλεοτιδίου (Enzo Life Science, Farmindale, ΝΥ) σε πλακίδια 96 φρεατίων και μετρώντας την απορρόφηση στα 620 nm με ένα φασματοφωτόμετρο ? προσδιορισμοί διεξήχθησαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.
Επίδραση της CPA επί της ενδοκυτταρικής cAMP επίπεδο
Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο άνευ ορού που περιέχει CPA για 60 λεπτά. Κυτταρικά επίπεδα cAMP μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ELISA (σύστημα ανοσοδοκιμασίας cAMP Biotrak Enzyme, Amersham Biosciences) σε πλάκες 96 φρεατίων και με προσδιορισμό της απορρόφησης στα 450 nm με φασματοφωτόμετρο, ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.
παρεμβολή RNA
καταστέλλεται PDE3B και Akt έκφραση σε κύτταρα ΗΤ-29 με επιμόλυνση των κυττάρων με μικρά RNAs παρεμβολής (siRNAs) που στοχεύουν PDE3B και Akt (Santa Cruz Biotechnology)? Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε για επιμολύνσεις. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων (Iwaki) σε πυκνότητα 5 χ 10
4 κύτταρα /φρεάτιο σε ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FBS και στη συνέχεια επιμολύνονται με 100 pmol /mL του mRNA ειδικών siRNAs ή κωδικοποιημένο (έλεγχος) siRNAs . Μείωση των επιπέδων PDE3B και Akt επιβεβαιώθηκε με κηλίδωση western.
Η στατιστική ανάλυση
Φοιτητών
t-test
χρησιμοποιήθηκε για στατιστικές συγκρίσεις. Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές στο
σ
& lt? 0.05 επίπεδο.
Αποτελέσματα
Η PDE3 ισομορφών ΡϋΕ3Α και PDE3B είναι γνωστό ότι εκφράζονται στον άνθρωπο [1]. Για να αξιολογηθεί η λειτουργία των PDE3 σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα κόλου, χρησιμοποιήσαμε 4 κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου, ΗΤ-29, LOVO, DLD-1, και Caco-2 (Σχήμα 1Α), και εξέτασαν την έκφραση της πρωτεΐνης PDE3B σε αυτές τις κυτταρικές σειρές . PDE3B εκφράστηκε σε υψηλά επίπεδα σε ΗΤ-29 και τα κύτταρα LOVO.
Τέσσερις ανθρώπινου καρκίνου κόλου κυτταρικές γραμμές (ΗΤ-29, LOVO, DLD-1, και τα κύτταρα Caco-2) καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10 % FBS? επίπεδα πρωτεΐνης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας SDS-PAGE και κηλίδωση Western με ένα αντι-PDE3B αντίσωμα, και πρωτεϊνικές ζώνες έγιναν ορατές με χρήση αντιδραστηρίου ενισχυμένης χημειοφωταύγειας. Κάθε λωρίδα φορτώθηκε με 20 μα ολικού κυτταρικού λύματος. β-ακτίνη χρωματίστηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) σε πραγματικό χρόνο μέτρηση PCR της έκφρασης του ΡϋΕ3Α και 3Β mRNAs και 18S rRNA (εσωτερικός έλεγχος) σε ΗΤ-29 και DLD-1 κύτταρα (μέση ± SEM, η = 3, ** ρ & lt? 0,01, του Student
t
test). (Γ) ανάλυση σε πραγματικό χρόνο PCR (αριστερά) και κηλίδωση Western (δεξιά) για τη σύγκριση της έκφρασης PDE3B σε ΗΤ-29 κυττάρων μετά τη θεραπεία με CPA (1, 3, και 10 μΜ) για 60 λεπτά (μέση τιμή ± SEM, η = 3 , ** p & lt? 0,01, του Student
t
test)
Η
Για περισσότερες μελέτες, επιλέξαμε μια κυτταρική γραμμή που εκφράζει υψηλά επίπεδα PDE3B, ΗΤ-29, και ένα κύτταρο. γραμμή που εκφράζει χαμηλά επίπεδα PDE3B, DLD-1. Συμφωνώντας με τα αποτελέσματα έκφρασης πρωτεΐνης, PDE3B mRNA ήταν επίσης παρούσα σε υψηλότερα επίπεδα σε κύτταρα ΗΤ-29 από ό, τι σε DLD-1 κύτταρα (Σχήμα 1Β). Αντιθέτως, ΡϋΕ3Α mRNA δεν ανιχνεύθηκε σε δύο κυτταρικές σειρές. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι PDE3B είναι η κύρια ισομορφή PDE σε ΗΤ-29 και τα κύτταρα DLD-1. Ελέγξαμε την επίδραση του CPA επί της έκφρασης PDE3B mRNA και της πρωτεΐνης σε κύτταρα ΗΤ-29 (Σχήμα 1 C), και βρήκαν ότι CPA δεν επηρέασε την έκφραση γονιδίου PDE3B, γεγονός που υποδηλώνει ότι CPA δεν παράγει τα αποτελέσματά της μειώνοντας την έκφραση PDE3B σε HT- 29 κύτταρα. Στη συνέχεια, εξετάσαμε την επίδραση της CPA για ενδοκυτταρικά επίπεδα cAMP σε ΗΤ-29 και τα κύτταρα DLD-1. Αν και cAMP μπορεί είτε προάγει ή να καταστέλλουν τον πολλαπλασιασμό σε πολλούς τύπους κυττάρων, στις περισσότερες περιπτώσεις cAMP φαίνεται να είναι αντι-πολλαπλασιαστικά. Η θεραπεία με CPA αυξημένα επίπεδα cAMP ουσιαστικά σε ΗΤ-29 κύτταρα αλλά όχι σε κύτταρα DLD-1 (Σχήμα 2Α). Τα παραπάνω αποτελέσματα έδειξαν ότι το επίπεδο έκφρασης PDE3B συσχετίστηκε με το δυναμικό πολλαπλασιασμού των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα πειράματα χρονικής πορείας έδειξε ότι η θεραπεία CPA ανέστειλε cAMP υδρόλυση με PDE (Σχήμα 2Β), γεγονός που υποδηλώνει ότι η παρεμπόδιση δραστηριότητας PDE3 με CPA ενισχύει τη συσσώρευση ενδοκυτταρικού cAMP. Ωστόσο, cAMP μπορεί να ασκήσει αντι-πολλαπλασιαστική δράση του μέσω διαφορετικών μηχανισμών σε διάφορες κυτταρικές σειρές.
επίπεδα ενδοκυτταρικού cAMP σε λύματα καλλιέργειας μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα ανοσοδοκιμασίας cAMP Biotrak ένζυμο. Σιλοσταζόλη (5 μΜ? Cilo) χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± SEM (n = 4), ** ρ & lt? 0.01. (Β) Χρονική πορεία της CPA-εξαρτώμενη αναστολή του cAMP υδρόλυση από PDE3B. PDE3B επωάστηκε με cAMP και 5′-νουκλεοτιδάση, με ή χωρίς την CPA (10 μΜ) για 10-50 λεπτά? ο αναστολέας PDE ΙΒΜΧ (50 μΜ) χρησιμοποιήθηκε ως ένας θετικός έλεγχος.
Η
Η επίδραση της CPA στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας έναν χρωματομετρικό προσδιορισμό. Βρήκαμε ότι CPA ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των ΗΤ-29 και τα κύτταρα LOVO αλλά όχι από DLD-1 και τα κύτταρα Caco-2 (Σχήμα 3Α), τα οποία έχουν χαμηλότερα ενδογενή επίπεδα PDE3B από ΗΤ-29 και τα κύτταρα LOVO [8]. Για να ελέγξετε αν PDE3B επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ΗΤ-29, η έκφραση PDE3B χτυπήθηκε κάτω χρησιμοποιώντας τα siRNA. Η PDE3B στόχευση siRNA γκρέμισε PDE3B αποτελεσματικά, όπως φαίνεται με κηλίδωση Western με ένα αντι-PDE3B αντίσωμα (Εικόνα 3Β). Αξιοσημείωτα, 24 ώρες μετά την επιμόλυνση με τον PDE3B-siRNA, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ΗΤ-29 μειώθηκε σημαντικά. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι χτυπήσει κάτω PDE3B αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων ΗΤ-29.
Κύτταρα (1 χ 10
5 κύτταρα /φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και επωάστηκαν για 24 ώρες ή 48 ώρες στους 37 ° C με 5% CO
2, μετά από το οποίο το 10 μΙ του κυτταρικού Μετρώντας διάλυμα Kit-8 προστέθηκε στο μέσο. Μετά από επώαση για 2 ώρες περισσότερο, η ποσότητα του πορτοκαλί χρωστικής φορμαζάνης παραγόμενων προσδιορίσθηκε με μέτρηση της απορρόφησης στα 450 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλακός. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± SEM (n = 4), ** ρ & lt? 0.01. (Β) Η κατάρριψη έκφραση PDE3B σε ΗΤ-29 κύτταρα. Η συνολική πρωτεΐνη εκχυλίζεται από μη επιμολυσμένα κύτταρα και από κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA ελέγχου ή PDE3B ειδικό siRNA και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western με ένα αντι-αντίσωμα PDE3B? β-ακτίνη χρωματίστηκε ως μάρτυρας πρωτεΐνη-φόρτωσης. (C) Αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης μετά PDE3B knockdown μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη μέτρηση κυττάρων Kit-8. Κύτταρα (1 χ 10
5 κύτταρα /φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και επωάστηκαν για 24 ώρες στους 37 ° C με 5% CO
2, μετά από το οποίο το 10 μL από το μέτρηση κυττάρων Kit-8 διάλυμα προστέθηκε στο μέσο. Μετά από επώαση για 2 ώρες περισσότερο, η ποσότητα του πορτοκαλί χρωστικής φορμαζάνης παραγόμενων προσδιορίσθηκε με λήψη της απορρόφησης στα 450 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλακός. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± SEM (n = 4), ** ρ & lt? 0.01.
Η
Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι τα επίπεδα PDE3B συσχετίζεται με τα ποσοστά πολλαπλασιασμού των κυττάρων και ότι η επίδραση της PDE3B εξαρτάται από τον τύπο του κυττάρου. Στη συνέχεια, προσδιορίσαμε αν CPA αναστέλλει Akt φωσφορυλίωση σε κύτταρα ΗΤ-29, επειδή πολλές επιδράσεις του cAMP διαμεσολαβούνται μέσω της ενεργοποίησης του Akt [20] [21]. Akt συνδέεται με την επιβίωση καρκινικών κυττάρων, τον πολλαπλασιασμό και διεισδυτικότητα [22] [23]. Για να εξακριβωθεί αν CPA συμβάλλει στις επιπτώσεις της Akt σε ΗΤ-29 κύτταρα, ελέγξαμε το πώς CPA επηρεάζει την ενεργοποίηση Akt. Η αναστολή της Akt σηματοδότησης έχει συσχετισθεί με τις βιολογικές δράσεις του χημειο-προληπτικών ενώσεις όπως επιγαλλοκατεχίνη, η οποία καταστέλλει σημαντικά pAkt επίπεδα στην εντερική όγκους χωρίς να μεταβάλλεται ουσιαστικά [24] συνολικά επίπεδα Akt. ενεργοποίηση Akt περιλαμβάνει τη φωσφορυλίωση των δύο καταλοίπων, Thr308 στον βρόχο ενεργοποίησης και Ser473 στο Ο-τερματικό υδρόφοβο μοτίβο? φωσφορυλίωση Ser473 έχει εξεταστεί ευρέως σε δείγματα όγκων ως δείκτη της Akt δραστηριότητα [25]. Πρώτον, εξετάσαμε την αρχική τιμή φωσφορυλίωσης Akt Ser473 σε κύτταρα ΗΤ-29 και βρέθηκε αυτό το site σε Akt να είναι ιδιοσυστατικά φωσφορυλιωμένη (Σχήμα 4Α). Επιπλέον, προσδιορίσαμε αν CPA ανέστειλε Akt φωσφορυλίωση σε κύτταρα ΗΤ-29. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι CPA μπλοκάρει την ιδιοσυστατική φωσφορυλίωση της Akt σε έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 4, Α και Β), και ότι αυτή η CPA μεσολάβηση αναστολή της φωσφορυλίωσης Akt διήρκεσε μέχρι 120 min (Σχήμα 4C). Μολονότι CPA είναι σταθερός λιπίδιο και 75% του μορίου μπορεί να παραμείνει ανέπαφο σε μέσο καλλιέργειας για 24 ώρες [19], CPA μπορεί να μετατραπεί σε ΙΡΑ με το άνοιγμα της δομής του δακτυλίου του CPA. Αυτό εγείρει την πιθανότητα ότι υδρολυτική διάσπαση του κυκλικού δακτυλίου φωσφορικού CPA με φωσφολιπιδίων φωσφατάσες σε κύτταρα ΗΤ-29 οδηγεί στο σχηματισμό LPA, τα οποία μπορούν να ενεργοποιήσουν Akt [26].
(Α) Akt φωσφορυλίωση σε HT- 29 κύτταρα κατεργασμένα με CPA (1, 3, και 10 μΜ), NGF (50 ng /mL, θετικός έλεγχος), ή δεξαμεθαζόνη (αναστολέας Akt, 25 μΜ). Η φωσφορυλιωμένη Akt (ρ-Akt) και ολική Akt ανιχνεύθηκαν με ανοσοκηλίδωση. (Β) Οι εντάσεις των ζωνών Akt ποσοτικοποιήθηκαν, και η αναλογία του φωσφορυλιωμένου να ολική Akt υπολογίστηκε. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± SEM (n = 3), ** ρ & lt? 0.01. (C) ΗΤ-29 κύτταρα κατεργάστηκαν με CPA (10 μΜ) και τα προϊόντα λύσης συλλέχθηκαν σε 30, 60, 90, και 120 λεπτά. Akt αναστολής μετρήθηκε ως απώλεια της φωσφορυλίωσης Ser473. (Δ) Η κατάρριψη Akt έκφρασης σε κύτταρα ΗΤ-29. Η συνολική πρωτεΐνη εκχυλίζεται από μη επιμολυσμένα κύτταρα και από κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA ελέγχου ή Akt-ειδικό siRNA και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western με ένα αντι-Ακί αντίσωμα? β-ακτίνη χρωματίστηκε ως μάρτυρας πρωτεΐνη-φόρτωσης. επίπεδα (Ε) Η ενδοκυτταρική cAMP σε ΗΤ-29 υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 1, 3, ή 10 μΜ CPA για 60 λεπτά μετά Akt knockdown? επίπεδα cAMP προσδιορίστηκαν σε προϊόντα λύσης κυττάρου χρησιμοποιώντας το σύστημα ανοσοδοκιμασίας cAMP Biotrak ένζυμο. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± SEM (n = 3), ** ρ & lt? . 0.01
Η
Τέλος, μετρήσαμε τα επίπεδα cAMP σε κύτταρα ΗΤ-29 με την παρουσία και απουσία του CPA μετά να χτυπήσει κάτω Akt? κηλίδωση Western με ένα αντι-Ακί αντίσωμα επιβεβαίωσε ότι το Akt-στόχευσης siRNA χτυπηθεί κάτω Akt έκφραση αποτελεσματικά σε κύτταρα ΗΤ-29 (Σχήμα 4D). Αξίζει να σημειωθεί ότι, η θεραπεία CPA των ΗΤ-29 κυττάρων με μειωμένη επίπεδα Akt απέτυχε να αυξήσει τα επίπεδα της cAMP σημαντικά (Σχήμα 4Ε).
Συζήτηση
λυσοφωσφολιπιδίων έχει από καιρό αναγνωριστεί ως φωσφολιπιδίων μεταβολίτης της μεμβράνης. Πρόσφατα, ωστόσο, η λυσοφωσφολιπίδιο έχει αναδειχθεί ως ένα υποψήφιο μόριο για διαγνωστικούς και φαρμακολογικές σκοπούς και Ι_ΡΑ έχει αναφερθεί ότι είναι ένας ισχυρός επαγωγέας της εξέλιξης του καρκίνου σε πολλαπλά επίπεδα. Μολονότι CPA είναι παρόμοια χημικά να LPA, οι λειτουργίες του CPA είναι διακριτά από ή ακόμα και αντίθετες με εκείνες του LPA. Για παράδειγμα, το ΙΡΑ διεγείρει αλλά CPA αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και του καρκίνου των κυττάρων εισβολής [19] [27] [9]. Επιπλέον, μπορεί να καταστείλει CPA εισβολή καρκίνου και να αυξήσει τα ενδοκυτταρικά επίπεδα cAMP [27]. PDE3 ένζυμα αποτελούν ένα από τα πιο εκτεταμένα μελετηθεί οικογένειες cAMP-υδρόλυση PDEs, επειδή PDE3 ένζυμα παίξει διάφορους ρόλους σε φυσιολογικές και παθοφυσιολογικές διεργασίες στον καρκίνο [28]. Στο πλαίσιο του καρκίνου του παχέος εντέρου, ο ΡϋΕ3-ειδική κιλοσταζόλης αναστολέα, το οποίο έχει χρησιμοποιηθεί προηγουμένως για τη θεραπεία ασθενών με θρόμβωση, χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση των επιδράσεων της αναστολής PDE3B στην κυτταρική ανάπτυξη. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων αναστέλλεται από cAMP μέσω διαφόρων μηχανισμών που μπορούν να επάγουν διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε G1 και απόπτωση [29]. Ωστόσο, ο μηχανισμός μέσω του οποίου PDE3B εμπλέκεται στην ενδοκυτταρική παραγωγή cAMP σε απόκριση προς CPA έχει παραμείνει ασαφής. Διενεργήσαμε αυτή τη μελέτη για τον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα χρησιμοποιώντας CPA, το οποίο είχε δειχθεί προηγουμένως να αυξήσει άμεσα ενδοκυτταρικά επίπεδα cAMP [8], μια λειτουργία του CPA που προτείνεται επίσης από τα αντι-επεμβατική ιδιότητες του CPA [9]. Βρήκαμε ότι CPA ανέστειλε την ανάπτυξη των ΗΤ-29 και τα κύτταρα LOVO, τα οποία εκφράζουν υψηλά επίπεδα PDE3B, αλλά όχι την ανάπτυξη του DLD-1 και Caco-2 κύτταρα, τα οποία εκφράζουν χαμηλά επίπεδα του PDE3B. Υποστηρίζοντας αυτά τα ευρήματα, CPA ανέστειλε δραστηριότητα PDE3B σε κύτταρα που εκφράζουν υψηλά επίπεδα PDE3B, και siRNA μεσολάβηση καταστολή της έκφρασης PDE3B ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι PDE3B ρυθμίζει τα ενδοκυτταρικά επίπεδα cAMP στα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου και εμπλέκεται στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων. Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι CPA ανέστειλε την φωσφορυλίωση της Akt σε ΗΤ-29 κυττάρων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Akt ρυθμίζει πολλαπλές κυτταρικές λειτουργίες, όπως την κυτταρική επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό και διάφορες πτυχές των ενδιάμεσο μεταβολισμό. Στην νεοπλασματικών κολονικό επιθήλιο, Akt βρέθηκε να εκφράζεται όχι μόνο σε υψηλότερα επίπεδα, αλλά και υπερδραστηριοποιημένο [30], και μελέτες σχετικά με τις χημικές μοντέλα έχουν επιβεβαιώσει ότι Akt ρυθμίζεται αυξητικά στα πρώτα στάδια των εντερικών ογκογένεσης. έκφραση PDE3B και ενδοκυτταρικά επίπεδα cAMP συσχετίζονται με το δυναμικό πολλαπλασιασμού των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου. Εμείς επιβεβαιώνονται τα ευρήματά μας χρησιμοποιώντας την ανάλυση siRNA και έδειξε μια μείωση στην pSer473-Akt με καλή συσχέτιση μεταξύ του βαθμού της παραγωγής cAMP και αρνητική ρύθμιση της φωσφορυλίωσης της Akt. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι Akt μονοπάτι σηματοδότησης που σχετίζονται συνδέεται στενά με την οδό CPA-PDE3B-cAMP και συνεπώς υποδηλώνουν για πρώτη φορά ότι CPA μπορούν να χρησιμεύσουν ως ένα χρήσιμο μόριο στη στοχευμένη θεραπεία για τον καρκίνο του παχέος εντέρου.
Συμπεράσματα
Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι η cAMP διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην αναστολή της ανάπτυξης καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων από CPA. Με βάση τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι η αποσαφήνιση των μοριακών μηχανισμών με τους οποίους CPA επάγει την παραγωγή cAMP αναστέλλοντας PDE3B στα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου μπορεί να παρέχει πολύτιμες πληροφορίες που βοηθούν να εξηγήσει πώς την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων ρυθμίζεται. Η κατανόηση του πώς ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων ρυθμίζεται, με τη σειρά, να βοηθήσει ξετυλίξουν των μοριακών μηχανισμών του καρκινικού κυττάρου εισβολή και τη μετάσταση και τη διευκόλυνση της ανάλυσης των οδών μεταγωγής σήματος που οδηγούν σε κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Αν και απαιτείται περαιτέρω έρευνα για την εξέταση της στιχομυθία μεταξύ των μορίων σηματοδότησης που περιγράψαμε εδώ, τα αποτελέσματά μας συλλογικά στηρίζουν την πιθανή χρήση του CPA ως μια θεραπευτική ένωση για τη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου.
You must be logged into post a comment.