Αφηρημένο

Στόχοι

Η αιμοσφαιρίνη (Hgb) είναι ο κύριος οξυγόνο και το διοξείδιο του άνθρακα φορέα σε κύτταρα ερυθροειδούς γραμμής και είναι υπεύθυνος για την παράδοση οξυγόνου στους αναπνέοντα ιστούς του σώματος. Ωστόσο, Hgb εκφράζεται επίσης σε nonerythroid κύτταρα. Στην παρούσα μελέτη, η έκφραση του Hgb σε κύτταρα καρκινώματος τραχήλου της μήτρας του ανθρώπου και το ρόλο της στον καρκίνο του τραχήλου διερευνήθηκαν.

Μεθοδολογία

Το επίπεδο έκφρασης του Hgb στην τραχηλική καρκινικούς ιστούς εκτιμήθηκε με ποσοτική ανάστροφης μεταγραφάσης-PCR (qRT-PCR). Εφαρμόσαμε πολλαπλές μεθόδους, όπως RT-PCR, ανοσοαποτύπωση, και ανοσοϊστοχημική ανάλυση, για να επιβεβαιωθεί η έκφραση Hgb σε τραχήλου καρκινικά κύτταρα. Οι επιδράσεις της έκτοπη έκφραση της Hgb και Hgb μεταλλάξεις στο οξειδωτικό στρες και κυτταρική βιωσιμότητα ερευνήθηκαν από κυτταρικά αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) ανάλυση και γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH) array, αντίστοιχα. Χρησιμοποιήθηκαν δύο δοκιμασία χρώσης αννεξίνης V με κυτταρομετρία ροής και δοκιμασία δραστικότητας κασπάσης-3, αντίστοιχα, για την αξιολόγηση κυτταρικής απόπτωσης.

Αποτελέσματα

ανάλυση qRT-PCR έδειξε ότι Hgb-α- (HbA1) και έκφραση γονιδίου Hgb-β-σφαιρίνης (ΗΒΒ) ήταν σημαντικά υψηλότερο σε τραχηλικό καρκίνωμα σε σύγκριση με φυσιολογικό τραχηλικό ιστούς, ενώ η έκφραση των αιμοποιητικών παραγόντων μεταγραφής και συγκεκριμένα γονίδια σημειωτή ερυθροκυττάρων δεν αυξήθηκε. Η ανοσοχρώση πειράματα επιβεβαίωσαν την έκφραση των Hgb σε καρκινικά κύτταρα του τραχήλου της μήτρας. Hgb mRNA και η πρωτεΐνη ανιχνεύθηκαν επίσης στις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές τραχηλικού καρκινώματος SiHa και CaSki και η έκφραση Hgb ήταν πάνω ρυθμισμένα με υπεροξείδιο του υδρογόνου που προκαλείται από οξειδωτικό στρες. Είναι σημαντικό, έκτοπη έκφραση του άγριου τύπου HbA1 /HBB ή HbA1, παρά μεταλλάξεις HbA1

H88R /HBB

H93R σε θέση να δεσμεύσει αιμο, κατέστειλε το οξειδωτικό στρες και τη βελτίωση της βιωσιμότητας των κυττάρων.

Συμπεράσματα

Τα παρόντα ευρήματα δείχνουν για πρώτη φορά ότι Hgb εκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα του τραχήλου και μπορούν να ενεργούν ως ένα αντιοξειδωτικό, εξασθένηση οξειδωτικό στρες που προκαλείται από βλάβη του τραχήλου της μήτρας καρκινικά κύτταρα. Αυτά τα δεδομένα παρέχουν μια σημαντική επίδραση όχι μόνο στην σφαιρίνης βιολογία, αλλά και στην κατανόηση του τραχήλου της μήτρας παθογένεση του καρκίνου που σχετίζονται με το οξειδωτικό στρες

Παράθεση:. Λι Χ, Wu Ζ, Wang Υ, Mei Q, Fu Χ, Χαν W ( 2013) Χαρακτηρισμός των ενηλίκων α- και β-σφαιρίνης Αυξημένα με υπεροξείδιο του υδρογόνου σε καρκίνο του τραχήλου κύτταρα που παίζουν ένα κυτταροπροστατευτικό ρόλο έναντι της οξειδωτικής Προσβολές. PLoS ONE 8 (1): e54342. doi: 10.1371 /journal.pone.0054342

Συντάκτης: Russell Ο Pieper, Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνιας-Σαν Φρανσίσκο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 9 του Ιουλίου του 2012? Αποδεκτές: 12, Δεκ, 2012? Δημοσιεύθηκε: 17 Ιανουαρίου, 2013

Copyright: © 2013 Li et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από τις επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (της ιστοσελίδας είναι https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default 124.htm) (Αρ 31201033, 31270820, 81230061 και 81001184) και εν μέρει υποστηρίζεται από τις επιχορηγήσεις από το Εθνικό Βασικές πρόγραμμα Ανάπτυξης της Κίνας (της ιστοσελίδας είναι https://www.973.gov.cn/Default_3.aspx) (Αρ 2012CB518103 και 2012CB518105) Επιστήμη και. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η αιμοσφαιρίνη (Hgb), η κύρια πρωτεΐνη αίμης των ερυθροκυττάρων, διευκολύνει τη μεταφορά του οξυγόνου και του διοξειδίου του άνθρακα στο αίμα. Το μόριο Hgb είναι ένα συγκρότημα από τέσσερα σφαιρικά πρωτεϊνικές υπομονάδες. HgbA, ο πιο κοινός τύπος Hgb σε ενήλικες ανθρώπους, είναι ένα τετραμερές αποτελούμενο από δύο αίμης περιέχουν α- και β-υπομονάδες συγκρατούνται μεταξύ τους με μη ομοιοπολικές αλληλεπιδράσεις (α

2β

2) [1], [2] . Άλλες σπονδυλωτό αίμης περιέχουν πρωτεΐνες με δομική ομολογία με σφαιρίνης αλυσίδες περιλαμβάνουν μυοσφαιρίνη, η οποία είναι ευρέως βρεθεί σε σπονδυλωτά καρδιές και γραμμωτούς και λείων μυών [3], cytoglobin, που περιγράφεται ως επί το πλείστον σε συνδετικούς ιστούς [4], και neuroglobin, γενικά εκφράζεται στον εγκέφαλο [ ,,,0],5].

Η κοινή λειτουργία του Hgbs ως σπονδυλωτό κύριο φορέα οξυγόνου και διοξειδίου του άνθρακα είναι μια σχετικά πρόσφατη προσαρμογή κατά τη διάρκεια της εξέλιξης, που απαιτούνται για να εξασφαλιστεί η σωστή παροχή οξυγόνου σε όλα τα κύτταρα του σώματος δια μέσου του αγγειακού δικτύου . Εκτός από αυτή την κλασική ρόλο, Hgbs μπορεί να εκτελέσει άλλες κυτταρικές δραστηριότητες, συμπεριλαμβανομένων ενδοκυτταρική μεταφορά οξυγόνου, αισθητήρες οξυγόνου, ΝΟ σάρωσης, υπεροξείδιο του υδρογόνου σάρωσης, και η ρύθμιση του μεταβολισμού του σιδήρου [6]. Πρόσφατες μελέτες ανέφεραν την ανίχνευση Hgb αλυσίδες σε άλλα κύτταρα από εκείνα της σειράς ερυθροειδών, συμπεριλαμβανομένων των νευρώνων [7], [8], [9], κύτταρα του αμφιβληστροειδούς [10], [11], τα κυψελιδικά επιθηλιακά κύτταρα [12], [ ,,,0],13], [14], του ενδομητρίου [15], νεφρό αρουραίου κύτταρα μεσαγγειακά [16], ηπατοκύτταρα [17] και μακροφάγα [18]. Ήταν σκεφτεί ότι η λειτουργία της Hgb σε νευρώνες θα μπορούσε να είναι αποθήκευσης οξυγόνου [9]. Στα κυψελιδικά επιθηλιακά κύτταρα, υποξία-επαγόμενη έκφραση Hgb μπορεί να παίζει ρόλο στην ανίχνευση οξυγόνου μονοπάτι [14]. Microarray αναλύσεις των ντοπαμινεργικών κυτταρικών σειρών MN9D σταθερά επιμολυσμένα με Hgb-α-σφαιρίνης (HbA1) και Hgb-β-σφαιρίνης (ΗΒΒ) αλυσίδες αποκάλυψε αλλαγές στην έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στην ομοιόσταση του οξυγόνου και μιτοχονδριακή οξειδωτική φωσφορυλίωση [7]. Επιπλέον, Hgb υπερέκφραση δείχθηκε να μειώσει το οξειδωτικό στρες, γεγονός που υποδηλώνει ότι λειτουργεί Hgb ως αντιοξειδωτικό [16], [17].

Το οξειδωτικό στρες προκαλείται από μία ανισορροπία ανάμεσα στο σχηματισμό των ενεργών μεταβολιτών του οξυγόνου και του ρυθμού τα οποία είναι σαρώθηκαν με ενζυματική και μη ενζυματική αντιοξειδωτικά, και έχει συσχετισθεί με την παθογένεση και τις επιπλοκές αρκετών ασθενειών, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου [19]. Η υπερπαραγωγή ή ανεπαρκή απομάκρυνση των αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) όπως το υπεροξείδιο του υδρογόνου, ρίζες υδροξυλίου και ανιόντος υπεροξειδίου σχετίζεται με την καρκινογένεση [20] και διεισδυτικότητα [21]. Ενζυματική και μη ενζυματικών μηχανισμών αντιοξειδωτική άμυνα ρυθμίζουν την κυτταρική ισορροπία οξειδοαναγωγικά και ως εκ τούτου την παθογένεση πολλών ασθενειών. Όμως, η κατανόηση των ρόλων των οξειδωτικών και αντιοξειδωτικών συστημάτων στην καρκινογένεση και την ανάπτυξη του όγκου παραμένει περιορισμένη. Αξίζει να σημειωθεί ότι, μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι οι λειτουργίες Hgb ως αντιοξειδωτικό υπεροξειδάσης, εξασθένηση του υπεροξειδίου του υδρογόνου που προκαλείται από το οξειδωτικό στρες [22].

Η πρόοδος στην τεχνολογία των μικροσυστοιχιών υψηλής απόδοσης επέτρεψαν τη σύγκριση των προφίλ γονιδιακής έκφρασης μεταξύ πρωτογενών όγκων και φυσιολογικό ιστούς. Οι αναλύσεις έκφρασης του γονιδίου που βασίζεται σε μικροδιάταξη ταυτοποιημένα γονίδια Hgb εκφράζονται διαφορικά σε συμπαγείς όγκους, συμπεριλαμβανομένων του καρκίνου του μαστού [23], των ωοθηκών ορώδες καρκίνωμα [24], και ορθοκολικό καρκίνωμα [25]. Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε πρωτεομική ότι HbA1 ορού και τα επίπεδα HBB ήταν σημαντικά αυξημένα σε ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών σε σύγκριση με φυσιολογικούς υγιείς γυναίκες [26]. Αν και η πηγή των ελευθέρων Hgb στον ορό ήταν άγνωστη, θεωρήθηκε ότι είναι το αποτέλεσμα του οξειδωτικού στρες που προκαλείται από αιμόλυση. Οι μηχανισμοί που διέπουν τη ρύθμιση των Hgb και λειτουργικές συνέπειες της σε συμπαγείς όγκους παραμένουν να γίνουν πλήρως κατανοητές.

Στην παρούσα μελέτη, δείχνουμε ότι Hgb-α, ενηλίκων αλυσίδα 1 (HBA-Α1), και Hgb- β, ενήλικος αλυσίδας 1 (ΗΒΒ-b1) εκφράζονται σε κύτταρα καρκινώματος του διάφορους τύπους των συμπαγών όγκων. έκφραση Hgb ανιχνεύθηκε σε κλινικά εκτομή δείγματα ανθρώπινου τραχηλικού ιστού και ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω σε τραχήλου καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς. Επιπλέον, τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι το οξειδωτικό στρες up-ρυθμίζει την έκφραση Hgb. Σημαντικά, Hgb υπερέκφραση μειωμένη οξειδωτικό στρες και βελτίωσε την βιωσιμότητα του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων. Συλλογικά, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι Hgb μπορεί να είναι συστατικό του ενδογενούς συστήματος αντιοξειδωτικής άμυνας, προστατεύοντας τα κύτταρα από οξειδωτική βλάβη σε ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας.

Αποτελέσματα

Αυξημένη Hgb Gene Expression σε καρκίνο του τραχήλου Δείγματα

Για να διερευνήσουν διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, αναλύσαμε προηγουμένως δημοσιευθεί σύνολο δεδομένων μικροσυστοιχιών συμπεριλαμβανομένων 33 καρκίνο του τραχήλου και 24 φυσιολογικά δείγματα. Σε σύγκριση με φυσιολογικό επιθήλιο του τραχήλου, του τραχήλου της μήτρας δείγματα καρκίνος έδειξαν σημαντική ανύψωση στην έκφραση των γονιδίων HbA1 και ΗΒΒ (Πίνακας 1). Ωστόσο, η έκφραση των παραγόντων μεταγραφής για τη διαφοροποίηση ερυθροειδών [27], συμπεριλαμβανομένων NFE2, KLF1 /EKLF, TAL1 /SCL και GATA1 δεν αυξήθηκε. Επιπλέον, η έκφραση άλλων γονιδίων αιμοσφαιρίνης (HBD, HBE1, HBG2, HBQ1 και HBZ) και των ερυθρών αιμοσφαιρίων συγκεκριμένων γονιδίων δείκτη, όπως SPTB, ERAF και ALAS2 δεν παρουσίασαν σημαντική αύξηση. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα αυξημένα HbA1 και HBB έκφραση στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας δεν ήταν αποτέλεσμα της ερυθροποίησης, αλλά από έναν διαφορετικό μηχανισμό.

Η

Για να επικυρώσετε το δυναμικό ρόλο της Hgb σε ανθρώπινο καρκίνωμα του τραχήλου, τα επίπεδα έκφρασης του HbA1 και HBB ερευνήθηκαν σε 20 κολπικών δειγμάτων καρκίνου και 10 δείγματα φυσιολογικού ιστού του τραχήλου με ανάλυση qRT-PCR. Οι ειδικοί εκκινητές του HbA1 και HBB σχεδιάστηκαν για qRT-PCR, σύμφωνα με την National Center for Biotechnology Information (NCBI) βάση δεδομένων. Η ειδικότητα των εκκινητών για HbA1 και ενίσχυση HBB επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας RNA που εξάγεται από ανθρώπινο μυελό των οστών και το περιφερικό αίμα ως θετικός έλεγχος (Σχ. 1Α). Πρώτον, πείραμα RT-PCR πραγματοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων HbA1 και ΗΒΒ σε 20 τραχηλικών δειγμάτων καρκίνου (Εικ. 1Β). Συνεπής με το σύνολο δεδομένων μικροσυστοιχιών, ανάλυση qRT-PCR έδειξε ότι η έκφραση του HbA1 και HBB ήταν σημαντικά υψηλότερη σε καρκινικούς ιστούς του τραχήλου της μήτρας σε σχέση με το φυσιολογικό τράχηλο ιστούς (Εικ. 1 C και D). Ωστόσο, η έκφραση των παραγόντων μεταγραφής για την ερυθροποίηση, συμπεριλαμβανομένων GATA-1, KLF1, και SCL /ΤΑΙ_1 [27], δεν άλλαξε σημαντικά σε τραχήλου καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με τους ελέγχους (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η έκφραση των ερυθροκυττάρων συγκεκριμένων γονιδίων δείκτη, όπως SPTB, ERAF, δεν είχε επάνω ρυθμισμένη σε καρκινικούς ιστούς του τραχήλου της μήτρας, υποδεικνύοντας ότι η αύξηση στην έκφραση Hgb δεν συσχετίστηκε με ερυθροποίηση. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι Hgb μπορεί να παίζει ένα ρόλο στην ανάπτυξη του ανθρώπινου καρκίνου του τραχήλου.

(Α) Για να επιβεβαιωθεί η ειδικότητα των HbA1 και ΗΒΒ εκκινητές για qRT-PCR, η έκφραση του HbA1 και HBB εξετάστηκε σε ανθρώπινο μυελό των οστών και κυττάρων περιφερικού αίματος. Retrotranscriptase ελεύθερη (-) ως αρνητικός έλεγχος, H

2O ως έλεγχος του συστήματος. Κ, Marker. (Β) cDNA από δείγματα καρκίνου του τραχήλου παρασκευάστηκε και αναλύθηκε για έκφραση HbA1 και HBB με RT-PCR. Τα προϊόντα PCR διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα αγαρόζης 2% και οπτικοποιήθηκαν με βρωμιούχο αιθίδιο. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. H

2O ως σύστημα ελέγχου, Τ, αντιπροσωπεύει δείγματα πρωτογενούς όγκου. Τα επίπεδα έκφρασης του HbA1 και HBB μετρήθηκαν με qRT-PCR σε 20 δείγματα ανθρώπινου τραχηλικού καρκίνου και 10 φυσιολογικούς ελέγχους τραχηλικού ιστού. Ποσοτικοποίηση της ενδεικνυόμενης κανονικοποιημένης HbA1 και τα επίπεδα HBB (log

10) της συνολικής μη ζευγαρωμένου φυσιολογικού τράχηλου (n = 10) και τον καρκίνο του τραχήλου είναι (n = 20) δείγματα που φαίνονται. Οι Tukey κουτιά αντιπροσωπεύουν τα ανώτερα και κατώτερα τεταρτημόρια διαιρείται με το μέσο και τα μουστάκια είναι οι μεγαλύτερες και μικρότερες τιμές, εξαιρουμένων των ακραίων τιμών που αντιπροσωπεύεται από τους κύκλους. Όλες οι διαφορές ήταν στατιστικά σημαντικές σε

P

& lt?. 0.05 (Γ και Δ)

Η

ανίχνευση της πρωτεΐνης Hgb σε τραχήλου της μήτρας ιστοί Καρκίνωμα

Η έκφραση της Hgb στο επίπεδο της πρωτεΐνης εξετάσθηκε με τη χρήση εμπορικών αντισώματα κατά της υψηλής καθαρισμένο ανθρώπινο Hgb. Λόγω της υψηλής ομολογίας μεταξύ σφαιρίνης οικογένεια πρωτεϊνών, η ειδικότητα του αντισώματος για την ανίχνευση των αλυσίδων HbA1 και ΗΒΒ επαληθεύθηκε με επιμόλυνση ανθρώπινων εμβρυϊκών νεφρικών ΗΕΚ293 κυττάρων με φορείς έκφρασης που φέρουν EGFP-tagged σφαιρίνης ισομορφές (HbA-Α1, ΗΒΒ-b1 , Hba-x, ΗΒΒ-y, Hba-z), το οποίο δεν έδειξε καμία διασταυρούμενη αντίδραση με άλλες σφαιρίνες σε πειράματα ανοσοχρώση (Εικ. S1). Για να αποφευχθεί η διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με τα κύτταρα του αίματος, του τραχήλου της μήτρας καρκινικούς ιστούς πλύθηκαν εκτενώς σε PBS πριν την μονιμοποίηση. Αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε) χρώση του τραχήλου της μήτρας τομές καρκινικού ιστού έδειξε καλά διαφοροποιημένο καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων (Σχήμα 2Α και Β.). Σε καρκινικούς ιστούς, HbA1 και ΗΒΒ έδειξε μια διάχυτη κυτταροπλασματική πρότυπο χρώσης (Σχ. 2D και F). Ένα μη-ειδικό IgG μονοκλωνικό αντίσωμα αραιωμένο με PBS χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος (Εικόνα 2C και Ε.)

Τμήματα από εγκλεισμένοι σε παραφίνη ανθρώπινου τραχηλικού καρκινικούς ιστούς υποβλήθηκαν σε είτε Η &?. Ε χρώση ή immnunohistochemical ανάλυση με HbA1 και αντισώματα HBB. Τραχηλικών δειγμάτων του καρκίνου έδειξαν καλά διαφοροποιημένο καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων (Α και Β). S, στρώμα. Κυτταροπλασματική χρώση του HbA1 και HBB ανιχνεύθηκε σε δείγματα βιοψίας από μήτρας τραχήλου ιστούς (D και F). Ένα μη-ειδικό IgG μονοκλωνικό αντίσωμα αραιωμένο με PBS χρησιμοποιήθηκε ως ένας αρνητικός έλεγχος (C και Ε). Double-ανοσοχρώση έναντι ρ16

ΙΝΚ4 &, ένα ειδικό δείκτη του καρκίνου του τραχήλου, απέδειξαν ότι Hgb εκφράστηκε σε τραχήλου καρκινικά κύτταρα (Ι, Κ, Μ και Ο). Λευκό διακεκομμένη κουτιά ψηφιακά μεγεθυνθεί (J, L, Ν και Ρ). Ανοσοφθορισμός χωρίς πρωτογενές αντίσωμα αποκάλυψε αμελητέα σήματα σε τραχήλου καρκινικά κύτταρα (G και Η).

Η

Η έκφραση της πρωτεΐνης Hgb σε ιστούς καρκινώματος της μήτρας επιβεβαιώθηκε με ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας ένα ειδικό αντίσωμα εναντίον Hgb, η οποία έδειξε διακριτή μοτίβα της διάχυτης κυτταροπλασματική χρώση σε καρκινικούς ιστούς του τραχήλου της μήτρας (Σχ. 2I). Η παράλειψη του πρωτογενούς αντισώματος στο ίδιο σύστημα ανοσοχρώσης χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος (Σχ. 2G και Η). Double-ανοσοχρώση χρησιμοποιώντας πολυκλωνικά αντισώματα με διασταυρούμενη αντιδραστικότητα έναντι HbA1 και ΗΒΒ και ένα αντίσωμα ειδικό για ρ16

ΙΝΚ4 &, ένας ειδικός δείκτης του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας που χρησιμοποιείται για κυτταρολογία και ιστολογική διάγνωση [28], [29], έδειξε την συν-εντοπισμό της Hgb με p16

ΙΝΚ4 & του τραχήλου της μήτρας καρκινικούς ιστούς (Εικ. 2Θ-P). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι η πρωτεΐνη Hgb εκφράζεται σε μήτρας τραχήλου καρκινικά κύτταρα.

Ανίχνευση Hgb mRNA και της πρωτεΐνης σε καλλιεργημένα κύτταρα του τραχήλου Cancer

Η έκφραση της Hgb εξετάστηκε σε mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας το ανθρώπινο κύτταρο καρκινώματος του τραχήλου γραμμές CaSki SiHa και καλλιεργούνται

in vitro

να ελέγξει μας

in vivo

ευρήματα της έκφρασης Hgb σε τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα. RT-PCR ανάλυση χρησιμοποιώντας κυττάρων αίματος RNA ανθρώπινης ως θετικός έλεγχος έδειξε την παρουσία του mRNA για το HbA1 και ΗΒΒ αλυσίδων ανθρώπινων Hgb σε καλλιεργημένα κύτταρα καρκίνου του τραχήλου (Εικ. 3Α). Ο προσδιορισμός αλληλουχίας των προϊόντων PCR έδειξαν ότι ταιριάζει 100% με HbA1 (NM_000558) και οι αλληλουχίες mRNA HBB (NM_000518). Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες σε κυψελιδικά κύτταρα και ηπατοκύτταρα [12], [17], η έκφραση του HbA1 ήταν περίπου 9,6 φορές υψηλότερη από εκείνη του HBB με qRT-PCR (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Η ανάλυση στυπώματος Western χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα εναντίον HbA1 και ΗΒΒ έδειξαν χαμηλά επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης Hgb στις κυτταρικές σειρές που αναλύθηκαν. Πρωτεΐνη που εξάγεται από λευκοκύτταρα περιφερικού αίματος (PBL) χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος (Σχ. 3Β). Ανοσοκαταβύθιση αποκάλυψε μια σαφή band του 17-kDa που ειδικώς εμπλουτισμένο από λύματα κυττάρων (Σχ. 3C). Εκμεταλλευόμενοι εμπορικών andibodies παράγονται κατά ανθρώπινων HbA1 και HBB, ανάλυση ανοσοφθορισμού διεξήχθη για να εξετάσει την εντόπιση της πρωτεΐνης Hgb σε κύτταρα SiHa, η οποία έδειξε μια παρόμοια κυτταροπλασματική πρότυπο χρώσης του HbA1 και μορφές HBB όπως εκείνη του τραχήλου της μήτρας καρκινικούς ιστούς (Σχ. 3D-G). Διπλό-ανοσοχρώση αποκάλυψε ότι Hgb ήταν συν-εντοπισμένη με την p16 δείκτη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας

ΙΝΚ4 & (Σχ. 3Η-J). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε ένα άλλο καρκίνο του τραχήλου κυτταρική γραμμή, CaSki (Εικ. S2), επιβεβαιώνοντας την έκφραση της Hgb σε καλλιεργημένα τραχήλου καρκινικά κύτταρα. Ειδικότερα, οι δύο τύποι κυττάρων εκφράζεται περισσότερο HbA1 από HBB στα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης. Όπως Hgb είναι πιθανό να δράσουν ως ετεροτετραμερές από δύο διαφορετικές υπομονάδες, επωφεληθήκαμε από πειράματα συν-ανοσοκατακρήμνισης να ανακρίνει αν HbA1 και έκφραση HBB σε καρκίνο του τραχήλου είναι σε θέση να σχηματίζουν ετεροδιμερή. Όπως μπορεί να φανεί στο Σχ. S3, η ασθενής παρουσία ενδογενούς HbA1 /HBB ετεροδιμερή επιβεβαιώθηκε με πειράματα συν-ανοσοκαταβύθιση.

(Α) RT-PCR ενίσχυση του HbA1 και HBB από SiHa, τα κύτταρα CaSki και ανθρώπινο RNA αίμα. Η HbA1 και μεταγραφές HBB ενισχύθηκαν σαφώς από τις ανθρώπινες τραχηλικού καρκινικές κυτταρικές σειρές, SiHa και CaSki. RNA που εκχυλίζεται από το αίμα χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος και GAPDH ανιχνεύθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. ταυτότητες αμπλικονίου επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση. (Β) HbA1 και ΗΒΒ αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. Λευκοκύτταρα περιφερικού αίματος (PBL) χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος και β-ακτίνη ανιχνεύθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Γ) Κυτταρολύματα από κύτταρα SiHa και CaSki ανοσοκαταβυθίστηκαν και ανοσοστυπώθηκαν με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. Μια σαφής ζώνη 17 kDa ήταν εμπλουτισμένο από SiHa και CaSki λύματα με ανοσοκαταβύθιση χρησιμοποιώντας ένα αντι-ανθρώπινο αντίσωμα Hgb. Η μη ειδική IgG χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος ανοσοκαθίζηση. Κυτταροπλασματική χρώση του HbA1 και HBB ανιχνεύθηκε σε τραχήλου καρκινικά κύτταρα (D και Ε, F και G). Διπλή-ανοσοχρώση με ρ16

ΙΝΚ4 &, ένας ειδικός δείκτης για τον καρκίνο του τραχήλου κυτταρολογία και ιστολογική διάγνωση, έδειξαν ότι Hgb εκφράστηκε από του τραχήλου της μήτρας καρκινικά κύτταρα (H-J). Τα ένθετα μεγεθύνονται εικόνες από επιλεγμένες περιοχές (μικρά τετράγωνα).

Η

Up-ρύθμιση των HbA1 και HBB έκφραση στα κύτταρα του καρκίνου του τραχήλου από το οξειδωτικό στρες

Για να καθοριστεί αν η λειτουργία του Hgb σε nonerythrocytes είναι διαφορετικό από το γνωστό ρόλο της ως φορέας οξυγόνου, εξετάσαμε την έκφραση της πρωτεΐνης σε κύτταρα SiHa και CaSki σε απόκριση προς οξειδωτικό στρες που βασίζεται σε προηγούμενη απόδειξη των αντιοξειδωτικών ιδιοτήτων της Hgb. Η επεξεργασία των κυττάρων SiHa με H

2O

2 αύξησε την έκφραση του HbA1 και HBB στο mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης (Σχ. 4Α και Β). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε ένα άλλο καρκίνο του τραχήλου κυτταρική γραμμή, CaSki (Εικ. S4). Η επαγωγή της Hgb από H

2O

2 επιβεβαιώθηκε σε κύτταρα ΗΕΚ293 (Εικ. 4C), προτείνοντας ότι η έκφραση μπορεί να είναι Hgb up-ρυθμίζεται από το οξειδωτικό στρες σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων.

(Α ) HbA1 και έκφραση HBB mRNA σε κύτταρα SiHa προκλήθηκε με H

2O

2 θεραπεία. κύτταρα SiHa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με H

2O

2 (1 mM) για 24 ώρες και τα επίπεδα mRNA Hgb προσδιορίστηκαν με qRT-PCR. επίπεδα Hgb σε ελέγχους κανονικοποιήθηκαν προς εκφράστηκαν 1. Δεδομένα ως μέση ± SD (η = 3)

**

P

& lt?. 0.01. (Β) HbA1 και πρωτεΐνη HBB έκφραση προκλήθηκε από H

2O

2 θεραπεία. Προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου που λαμβάνεται από κύτταρα SiHa σε επεξεργασία με ή χωρίς H

2O

2 (1 mM, 48 ώρες) αναλύθηκαν για HbA1 και τα επίπεδα HBB. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Γ) HbA1 και ΗΒΒ mRNAs ήταν πάνω ρυθμισμένα με H

2O θεραπεία

2 σε κύτταρα ΗΕΚ293. ΗΕΚ293 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με H

2O

2 (1 mM, 36 ώρες). Η αντίστροφη μεταγραφή PCR προϊόντα διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα αγαρόζης 2% και οπτικοποιήθηκαν με βρωμιούχο αιθίδιο. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (D) δόση και το χρόνο εξάρτηση της απόκρισης των κυττάρων SiHa να H

2O

2 θεραπεία. κύτταρα SiHa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μία σειρά συγκεντρώσεων (0, 0,25, 0,5 και 1 mM) H

2O

2 για 8, 16, 24 ή 36 ώρες. Σχετικό επίπεδο mRNA HbA1 καθορίστηκε με qRT-PCR. Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SD (η = 3). Οι τιμές κανονικοποιήθηκαν στο επίπεδο HbA1 στον έλεγχο (0 mM, 8 ώρες), η οποία τέθηκε σε 1. Μονόδρομη ANOVA τεστ για πολλαπλές συγκρίσεις χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθούν οι διαφορές μεταξύ θεραπειών.

**

P

& lt? 0,01?

***

P

& lt?. 0.001, σε σύγκριση με 0 θεραπεία mM

Η

Για να εξεταστεί η δυνατή δόση και το χρόνο της εξάρτησης της H

2O

2 επαγόμενη πάνω ρύθμιση Hgb, τα κύτταρα SiHa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές

2O

2 συγκεντρώσεις H για διάφορες χρονικές περιόδους και αναλύθηκε με τυποποιημένες qRT-PCR. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4D, H

2O

2 αυξημένα επίπεδα Hgb mRNA σε ένα δόση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Η επίδραση του οξειδωτικού στρες στην έκφραση του GATA-1 και KLF1, που είναι παράγοντες μεταγραφής που ρυθμίζουν έκφραση Hgb κατά τη διάρκεια της ερυθροποίησης, εξετάστηκε. Συνεπής με μια προηγούμενη μελέτη σε ηπατοκύτταρα [17], η αυξητική ρύθμιση του Hgb από H

2O

2 δεν διαμεσολαβείται από GATA-1 και KLF1, γεγονός που υποδηλώνει ότι ένα διαφορετικό υποκείμενο μηχανισμό μπορεί να εμπλέκεται (εικ. S5 ).

Εξασθένηση των ROS γενιάς και την απόπτωση επαγωγή από HbA1 /HBB ή HbA1, αλλά δεν HbA1

H88R /HBB

H93R υπερέκφραση σε κύτταρα του τραχήλου του καρκίνου

Για τη διερεύνηση της βιολογικής ρόλος της Hgb σε τραχήλου καρκινικά κύτταρα, HbA1 και ΗΒΒ υπερεκφράστηκαν με παροδική επιμόλυνση των κυττάρων SiHa. Αυξημένη έκφραση του HbA1 και HBB επιβεβαιώθηκε με ανοσοαποτύπωση (Εικ. 5Α). Με βάση την προηγούμενη μελέτη που δείχνει ότι ορισμένα οξειδωτικό στρες διεγέρσιμο γονίδια έχουν αντιοξειδωτικές λειτουργίες [30], υποθέσαμε ότι Hgb μπορεί να έχουν αντιοξειδωτικές ιδιότητες του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα σε απόκριση προς οξειδωτικό στρες. Κατά συνέπεια, εξετάσαμε τα ενδοκυτταρικά επίπεδα των ROS σε κύτταρα κατεργασμένα με H

2O

2 χρησιμοποιώντας φθορισμογόνων ανιχνευτών και του ανιόντος υπεροξειδίου. Η έκτοπη έκφραση του HbA1 /HBB σε κύτταρα SiHa αγωγή με εξωγενή H

2O

2 κατέστειλε την ενδοκυτταρική παραγωγή H

2O

2 και ανιόντος υπεροξειδίου όπως προσδιορίζεται με ανάλυση ανοσοφθορισμού (Σχ. 5Β και C) . Ποσοτικοποίηση της παραγωγής ROS με κυτταρομετρία ροής έδειξε ότι η ένταση φθορισμού σε κύτταρα που υπερεκφράζουν HbA1 /HBB ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ό, τι στα κύτταρα σε μεταγωγή με φακοϊό ελέγχου (Σχ. 5D και Ε). Ποσοστό ανά συνολική κύτταρο μετράνε με υψηλά επίπεδα κάθε ROS σε κύτταρα που υπερεκφράζουν HbA1 /HBB μειώθηκε σημαντικά σε σύγκριση με την επιμόλυνση με τον κενό φορέα ως μάρτυρα (

P

& lt? 0,05, η = 3 για κάθε ομάδα? Εικ . 5F και G). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε κύτταρα CaSki (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Το γεγονός ότι το επίπεδο έκφρασης της HbA1 σε καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές γραμμές είναι υψηλότερη από εκείνη του HBB υποδηλώνει ότι πολλαπλές βιοδραστικά μόρια, όχι μόνο οι μορφές ετεροδιμερές αλλά επίσης μονομερές ή ομοδιμερές μορφές της πρωτείνης HbA1 μπορεί να είναι παρούσα κατά την ίδια στιγμή σε καρκίνο του τραχήλου κύτταρα. Προς στήριξη αυτής της έννοιας, τα κύτταρα SiHa ήταν απλώς επιμολυσμένα με HbA1 και στη συνέχεια κατεργάζεται με εξωγενή H

2O

2. Συνεπής με μια πρόσφατη μελέτη [31], ποσοστό ανά συνολικό αριθμό των κυττάρων με ενδοκυτταρικά επίπεδα ROS σε κύτταρα που υπερεκφράζουν HbA1 ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ότι σε κύτταρα επιμολυσμένα με τον φορέα ελέγχου (Εικ. 5Η). Να απορρίψει οποιαδήποτε γενικευμένη ή μη επιλεκτική δράση οφείλεται στην μη ειδική υπερέκφραση του protiens, δημιουργήσαμε μια κυτταρική γραμμή που εκφράζει ένα ανενεργό μορφή Hgb που μεταφέρουν ένα αμινοξύ αλλαγή στην υπεύθυνη του για τον συντονισμό της αιμο προσθετική ομάδα (HbA1

H88R [ ,,,0],31] και HBB

H93R, Εικ. S6). Όπως μπορεί να φανεί στο Σχ. 5Θ, τα ενδοκυτταρικά επίπεδα ROS σε κύτταρα που υπερεκφράζουν HbA1

H88R /HBB

H93R δεν είχαν μειωθεί σημαντικά, σε σύγκριση με εκείνη σε κύτταρα επιμολυσμένα με άδειο φορέα, γεγονός που υποδηλώνει ότι η δραστηριότητα σύνδεσης αίμης απαιτείται για Hgb αντιοξειδωτική λειτουργία.

(Α) κυτταρολύματα Σύνολο από κύτταρα SiHa επιμολυσμένα με ένα πλασμίδιο ελέγχου ή HbA1 και πλασμίδια έκφρασης HBB αναλύθηκαν με ένα αντίσωμα αντι-Hb για να επιβεβαιωθεί η υπερέκφραση σφαιρίνης πρωτεϊνών. Έλεγχος και HbA1 /HBB- υπερεκφράζουν κύτταρα χρωματίστηκαν με φθορογόνο ανιχνευτές για την ανίχνευση ενδοκυτταρικής H

2O

2 και ανιόντος υπεροξειδίου και εκτέθηκαν σε εξωκυτταρικό H

2O

2 (1 mM) για 10 λεπτά. Ανοσοχρώση επιβεβαίωσε ότι η ενδοκυτταρική παραγωγή του H

2O

2 (Β) και ανιόντος υπεροξειδίου (C) κατεστάλη σε HbA1 /ΗΒΒ-κύτταρα που υπερεκφράζουν. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής επιβεβαίωσε αυτά τα αποτελέσματα (D και Ε) και έδειξαν ότι τα ενδοκυτταρικά επίπεδα του H

2O

2 και ανιόντος υπεροξειδίου ήταν υψηλότερα στα κύτταρα που εκτίθενται σε εξωκυτταρικά ερεθίσματα από ό, τι χωρίς θεραπεία κύτταρα (Β και C). Ποσοτικές αναλύσεις επιβεβαίωσαν ότι η ενδοκυτταρική παραγωγή του H

2O

2 (F) και ανιόντος υπεροξειδίου (G) αναστάλθηκε σε κύτταρα HbA1 /ΗΒΒ-υπερεκφράζουν (μαύρη στήλη) περισσότερο από ότι στα κύτταρα ελέγχου (γκρι στήλη?

P

& lt? 0,05). Ποσοτικές αναλύσεις επιβεβαίωσαν ότι η ενδοκυτταρική παραγωγή των ROS μειώθηκε στα κύτταρα HbA1-υπερεκφράζουν (μαύρη στήλη, H), αλλά όχι σε HbA1

H88R /HBB

H93R-κύτταρα που υπερεκφράζουν (μαύρη στήλη, Ι) περισσότερο από ό, τι στον έλεγχο κύτταρα φορέα που υπερεκφράζουν (γκρι στήλη). *

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01?

N

P

& gt?. 0.05

Η

Ένα γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH) δοκιμασία κυτταροτοξικότητας, η οποία μετρά την απελευθέρωση της LDH στο μέσο καλλιέργειας, διεξήχθη για να εξετάσει κυτταρικής βιωσιμότητας υπό οξειδωτικό στρες. κύτταρα SiHa υπερεκφράζουν HbA1 και ΗΒΒ έδειξαν ρυθμούς απελευθέρωσης LDH από 22,1 ± 2,2% και 32,5 ± 3,4% σε απόκριση σε θεραπεία με 0.5 mM και 1 mM H

2O

2 για 24 ώρες, αντίστοιχα, σε σύγκριση με 29,6 ± 3,1 % και 34,6 ± 2,1%, αντίστοιχα, σε κύτταρα επιμολυσμένα με άδειο φορέα (

P

& lt? 0,01 και

P

& lt? 0,05 για 0,5 και 1 mM H

2O

2, αντίστοιχα? η = 3 για κάθε ομάδα) (Σχήμα 6Α).. η βιωσιμότητα των κυττάρων SiHa επίσης βελτιωθεί με HbA1 και ΗΒΒ υπερέκφραση όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0.5 mM και 1 mM H

2O

2 για 36 ώρες (

P

& lt? 0,01). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε HbA1-υπερέκφραση κύτταρα SiHa (Εικ. 6Β). Στη συνέχεια διερευνήθηκε κατά πόσον η λειτουργία του Hgb για τη βελτίωση της βιωσιμότητας των κυττάρων εξαρτάται από τη δραστηριότητα σύνδεσης αίμης του, χρησιμοποιώντας το HbA1

H88R /HBB

H93R μεταλλάξεις, οι οποίες είναι σε θέση να δεσμεύσει αίμης, αλλά διατηρούν τη διαμόρφωση της αλυσίδας. Όπως μπορεί να φανεί στο Σχ. 6Β, η μετάλλαξη του υπεύθυνου του για τον συντονισμό της προσθετικής ομάδας αίμης (HbA1

H88R και HBB

H93R) της HgbA μειώνει την ικανότητά της να βελτιώσει τη βιωσιμότητα των κυττάρων.

(Α) Η βιωσιμότητα των κυττάρων SiHa υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 0, 0,5 και 1 mM h

2O

2 για 12, 24 και 36 ώρες ως εξωκυτταρικό οξειδωτικό στρες αξιολογήθηκε με την δοκιμασία απελευθερώσεως LDH. κύτταρα SiHa επιμολύνθηκαν με τα HbA1 /ΗΒΒ εκφράζουν φορείς (μαύρη στήλη) έδειξαν αυξημένη αντίσταση ενάντια H

2O

2-επαγόμενο κυτταρικό σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με τον φορέα ελέγχου (γκρι στήλη). Παρόμοια πειράματα εκτελέσθηκαν σε αμφότερες HbA1-υπερέκφραση κύτταρα και HbA1

H88R /HBB

H93R-υπερέκφραση κύτταρα (Β). κύτταρα SiHa επιμολύνθηκαν με τα υποδεικνυόμενα πλασμίδια. Σαράντα οκτώ ώρες αργότερα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 mM H

2O

2 ή αφέθηκαν χωρίς θεραπεία για 22 ώρες. Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων παρακολουθήθηκε με χρώση αννεξίνης V που ακολουθείται από ανάλυση FACS (C). κύτταρα SiHa επιμολύνθηκαν με τα υποδεικνυόμενα πλασμίδια σαράντα ώρα αργότερα, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως στο (Α), Κασπάση-3 δραστικότητα σε διαφορετική ομάδα μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ειδικό υπόστρωμα κασπάσης AcDEVD-ρΝΑ όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Οι τιμές της απορρόφησης εκφράστηκαν ως έλεγχος που ορίστηκε σαν 1 (D και Ε). Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές, και τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσοι όροι ± S.E.M *

P

& lt?. 0,05? **

P

& lt? 0,01?

N

P

& gt?. 0.05

Η

ROS (υπεροξειδίου, υπεροξείδιο του υδρογόνου, και ρίζες υδροξυλίου) είναι ισχυροί ενδοκυτταρικά οξειδωτικά και επαγωγείς της οξειδωτικής βλάβης, τα οποία έχουν προταθεί ως κρίσιμη ρυθμιστές της απόπτωσης [32] και θεραπείες με αντιοξειδωτικά προστατεύουν τα κύτταρα από την απόπτωση [33]. Δεδομένου ότι η παρουσία του Hgb (είτε HbA1 ή HbA1 /HBB) οδηγεί σε μείωση της παραγωγής ROS interacellular, είναι κατανοητό ότι αυτά τα κύτταρα διατηρούν την ικανότητα να προστατεύουν τους εαυτούς τους από την οξειδωτική προσβολές. Έτσι, θέσαμε το ερώτημα αν Hgb μεσολάβηση προστασία ενάντια κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα SiHa ήταν απλώς και μόνο επειδή της μειωμένης ενδοκυτταρική συσσώρευση των ROS. Ερευνήσαμε τη δυνατότητα αυτή με τον προσδιορισμό της επίδρασης του άγριου τύπου HbA1 /HBB, HbA1 και μεταλλάκτες HbA1

H88R /HBB

H93R-υπερέκφρασης κατόπιν H

2O

2-απόπτωση που επάγεται με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής με τη χρήση κύτταρα SiHa. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6C, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο πληθυσμός των αποπτωτικών κυττάρων που επάγεται από την H

2O

2 ανεστάλη τόσο HbA1 και HbA1 /ΗΒΒ-υπερέκφραση κύτταρα, αλλά όχι σε HbA1

H88R /HBB

H93R -overexpression κύτταρα. Η ενεργοποίηση μιας πρωτεάσης κυστεΐνης, που ονομάζεται κασπάση-3 και η παραγωγή ROS θεωρήθηκαν βασικά βήματα στην επαγωγή κυτταρικού θανάτου [34] και είναι γνωστό ότι η παραγωγή ROS στα μιτοχόνδρια ενεργοποιεί κασπάση-3 μέσω της συνεργασίας του κυτοχρώματος

γ

, Apaf-1 και κασπάσης-9 [35]. Στη συνέχεια ερευνήσαμε την επίδραση της Hgb επί κασπάσης-3 ενεργοποίησης. Συνεπής με τον προσδιορισμό δέσμευσης αννεξίνης V, βρήκαμε ότι η αύξηση της ενεργοποίησης της κασπάσης-3 που προκαλείται από 0,5 mm και 1 mm H

2O

2 μετά από επώαση για 12, 24 και 36 ώρες, αντίστοιχα, θα μπορούσε να μειωθεί σημαντικά τόσο HbA1 και κύτταρα HbA1 /HBB-υπερέκφραση, συγκριτικά με τον κενό φορέα (Εικ. 6D). Σε αντίθεση, έκτοπη έκφραση του HbA1

H88R /HBB

H93R σε κύτταρα SiHa δεν ήταν αποτελεσματική στην πρόληψη H

2O

2 επαγόμενη κασπάσης-3 ενεργοποίησης (Σχ. 6Ε), γεγονός που υποδηλώνει ότι heme- δραστικότητα δέσμευσης είναι απαραίτητη για τη λειτουργία του. Συνοπτικά, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τόσο HbA1 και HbA1 /HBB υπερέκφραση μπορεί να έχει μια αντιοξειδωτική δράση μέσω σάρωσης των ROS, προστατεύοντας έτσι τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα από το οξειδωτικό στρες που προκαλείται από βλάβη.

Συζήτηση

η παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι η έκφραση Hgb ανυψώθηκε σε τραχηλικό καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με το φυσιολογικό τράχηλο ιστούς. Αυτή είναι η πρώτη απόδειξη ότι οι α- και β-σφαιρίνης αλυσίδες Hgb που εκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα του τραχήλου της μήτρας. Χρησιμοποιήσαμε τα τραχηλικού κυτταρικές γραμμές καρκινώματος SiHa και CaSki να εξετάσει Hgb-α και Hgb-β mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας τρεις διαφορετικές προσεγγίσεις: RT-PCR, ανοσοχρώση και ανάλυση στυπώματος western. Επιπλέον, Hgb εξασθενημένο προκαλείται από το υπεροξείδιο του υδρογόνου το οξειδωτικό στρες σε τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα, που ενεργεί ως αντιοξειδωτικό.

Η μακρόχρονη αντίληψη ότι η Hgb εκφράζεται μόνο στα κύτταρα της γραμμής ερυθροειδούς έχει αμφισβητηθεί σε πρόσφατες μελέτες δείχνουν Hgb έκφραση σε nonerythrocytes, συμπεριλαμβανομένων των νευρώνων [7], [8], [9], κύτταρα του αμφιβληστροειδούς [10], [11], τα κυψελιδικά επιθηλιακά κύτταρα [12], [13], [14], του ενδομητρίου [15], νεφρό αρουραίου μεσαγγειακά κύτταρα [16], ηπατοκύτταρα [17] και μακροφάγα [18]. Η κύρια λειτουργία του Hgb στα ερυθροκύτταρα είναι να μεταφέρει οξυγόνο από τον πνεύμονα προς τους ιστούς και να μεταφέρει το διοξείδιο του άνθρακα από τους ιστούς στους πνεύμονες. Η βιολογική λειτουργία της Hgb σε nonerythroid κύτταρα μένει να διευκρινιστεί και φυσιολογική λειτουργία του είναι ακόμα ένα θέμα συζήτησης. Hgb υπερέκφραση σε μυϊκό ντοπαμινεργική κυτταρική γραμμή, MN9D, μετέβαλε την έκφραση διαφόρων γονιδίων που εμπλέκονται στην ομοιόσταση του οξυγόνου και μιτοχονδριακή οξειδωτική φωσφορυλίωση, γεγονός που υποδηλώνει ότι Hgb μπορεί να λειτουργήσει ως ένα μόριο αποθήκευσης οξυγόνου στους νευρώνες [9]. Hgb υπερέκφραση σε αρουραίους νεφρικά μεσαγγειακά κυτταρική σειρά SV40-MES13 και το ανθρώπινο ηπατοκυτταρικό καρκίνο κυτταρική γραμμή HepG2 ελαττωμένη υδρογόνο peroxide- επάγεται οξειδωτικό στρες, γεγονός που υποδηλώνει ότι λειτουργεί Hgb ως αντιοξειδωτικό [16], [17].

Αν και