Αφηρημένο

Το ενεργοποιημένο AHR /ARNT συγκρότημα (AHRC) ρυθμίζει την έκφραση των γονιδίων στόχων κατά έκθεση σε περιβαλλοντικούς ρύπους, όπως 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-

σ

διοξιν (TCDD). Είναι σημαντικό, τα στοιχεία έχουν δείξει ότι TCDD καταστέλλει την ενεργοποίηση του γονιδίου-στόχου οιστρογόνων υποδοχέων (ER) μέσω του AHRC. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι AHR και ARNT ενεργούν ανεξάρτητα το ένα από το άλλο και σε μη-διοξίνη sites στοιχείο απόκρισης. Ως εκ τούτου, επιδιώξαμε να καθορίσει τις συγκεκριμένες λειτουργίες του AHR και ARNT σε εξαρτώνται από οιστρογόνα σηματοδότηση στον ανθρώπινο καρκίνο του στήθους MCF7 και κύτταρα καρκινώματος ενδομητρίου ανθρώπινα ECC-1. Knockdown του AHR με siRNA καταργεί διοξιν-διεγέρσιμο καταστολή των οιστρογόνων εξαρτώμενη γονιδιακή μεταγραφή. Περιέργως, knockdown του ARNT δεν επηρεάζει TCDD διαμεσολαβούμενη καταστολή των οιστρογόνων-ρυθμιζόμενη μεταγραφή, γεγονός που υποδηλώνει ότι AHR καταστέλλει λειτουργία ER ανεξάρτητα από ARNT. Αυτή η θεωρία υποστηρίζεται από την ικανότητα της επιλεκτικής AHR διαμορφωτή 3 ‘, 4’-διμεθοξυ-α-ναφθοφλαβόνη (DiMNF) για να καταστείλουν οιστρογόνο επαγώγιμη μεταγραφή. Επιπλέον, τα βασικά και τα οιστρογόνα που ενεργοποιείται μεταγραφή των γονιδίων που κωδικοποιούν

καθεψίνης-D

και

pS2

ρυθμίζονται προς τα κάτω σε κύτταρα MCF7 αλλά πάνω ρυθμισμένα σε κύτταρα ECC-1 σε απόκριση σε απώλεια της ARNT. Αυτές οι αποκρίσεις αντικατοπτρίζονται στο επίπεδο πρωτεΐνης με καθεψίνη-D. Επιπλέον, knock-down της ARNT οδήγησαν σε αντίθετο, αλλά οι αντίστοιχες αλλαγές στον πολλαπλασιασμό των οιστρογόνων που διεγείρεται τόσο MCF7 και κύτταρα ECC-1. Έχουμε πάρει πειραματικά στοιχεία που να αποδεικνύουν μια λειτουργία καταστολέα των διοξινών που εξαρτώνται για την ΑΗΚ και λειτουργία συν-ενεργοποιητή /συν-καταστολέα διοξίνες-ανεξάρτητο για ARNT στη σηματοδότηση των οιστρογόνων. Τα αποτελέσματα αυτά μας παρέχουν περαιτέρω κατανόηση των μηχανισμών του μεταγραφικού παράγοντα στιχομυθία και υποθετικών θεραπευτικών στόχων σε καρκίνους οιστρογόνων-θετικό

Παράθεση:. Labrecque MP, Takhar ΜΚ, Hollingshead BD, Prefontaine GG, Perdew GH, Beischlag τηλεόραση ( 2012) διακριτούς ρόλους για Αρυλ υδρογονανθράκων πυρηνικό υποδοχέα Μεταθέτη και Receptor Ah των οιστρογόνων-σηματοδότηση μέσω των ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών γραμμών. PLoS ONE 7 (1): e29545. doi: 10.1371 /journal.pone.0029545

Επιμέλεια: Bernhard Ryffel, γαλλικό Εθνικό Κέντρο Επιστημονικών Ερευνών της Γαλλίας

Ελήφθη: 24 Οκτωβρίου του 2011? Αποδεκτές: 30 του Νοεμβρίου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 3 Γενάρη 2012

Copyright: © 2012 Labrecque et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την καναδική μαστού Ίδρυμα Καρκίνου – BC /Yukon, οι Φυσικές Επιστήμες και Μηχανική Συμβούλιο Έρευνας με τον Δρ Beischlag, και ένα Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας χορηγούν ES04869 με τον Δρ Perdew. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η διαλεύκανση των μηχανισμών που διέπουν τη μεταγραφή είναι ζωτικής σημασίας για την κατανόησή μας για το πώς τα κύτταρα και οι οργανισμοί ανταποκρίνονται σε φυσιολογικά σήματα και περιβαλλοντικά ερεθίσματα. Ο υποδοχέας αρυλ υδρογονάνθρακα (AHR) και ο πυρηνικός μεταθέτης υποδοχέα αρυλ υδρογονάνθρακα (ARNT) είναι μέλη της βασικής έλικας-βρόχου-έλικας /PER-ARNT-SIM (bHLH-PAS) οικογένεια των πρωτεϊνών και το σχηματισμό ενός ετεροδιμερικού παράγοντα μεταγραφής κατά τη δέσμευση ενός ποικιλία των περιβαλλοντικών ρύπων, συμπεριλαμβανομένου του 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-

σ

διοξιν (TCDD) [1]. Το ενεργοποιημένο AHR /ARNT συγκρότημα (AHRC) διαδραματίζει βασικό ρόλο στην καρκινογένεση και ρυθμίζει την έκφραση του

Το κυτόχρωμα P4501A1

(

CYP1A1

) και άλλα γονίδια ξενοβιοτικών στόχο την καταπολέμηση των επιπτώσεων των περιβαλλοντικών ρύπων [1 ]. Επιπλέον, AHR έχει αποδειχθεί ότι είναι σημαντική για τη φυσιολογική ανάπτυξη και φυσιολογική ομοιόσταση [2], [3], [4], και είναι απαραίτητη για ορισμένες λειτουργίες της ανοσολογικής απόκρισης, όπως η ρύθμιση της ιντερλευκίνης-17 που παράγουν Τ-βοηθητικά κύτταρα [5] και επαγωγή της κυτοκίνης ιντερλευκίνης-6 σε MCF7 κύτταρα καρκίνου του μαστού. [6]

Unliganded AHR υπάρχει στο κυτταρόπλασμα ως μέρος ενός πολυμερικό σύμπλοκο που περιέχει δύο μόρια του HSP90, HSP90 ο συν-συνοδός p23 και τον ιό της ηπατίτιδας Β X-πρωτεΐνης που συνδέεται με 2 (XAP2) [7], [8], [9], [10]. Μετά τη σύνδεση συνδετήρα, AHR μετατοπίζεται στον πυρήνα όπου συνδέεται με ARNT για να σχηματίσει ένα λειτουργικό σύμπλοκο παράγοντα μεταγραφής, ο AHRC. Ως ένα ενεργοποιημένο σύμπλοκο, ο AHRC είναι ικανή πρόσληψη ρυθμιστικών πρωτεϊνών, όπως υποδοχέα στεροειδών συνενεργοποιητή-1 (SRC-1), πρωτεΐνη δέσμευσης CREB (CBP /p300), NCoA2 /GRIP1 [11], [12], υποδοχέα Σε αλληλεπίδραση -πρωτεΐνη 140 (RIP 140) [13], το κακάο [14], GAC63 [15], NcoA4 [16] και TRIP230 [17], που παίζουν σημαντικό ρόλο στον προσδιορισμό της δραστικότητας του TCDD επαγόμενης γονιδιακής μεταγραφής. οι ίδιοι αυτοί οι συν-ενεργοποιητές και συν-καταστολείς ενσωματώσει σε πολυμερικά συμπλέγματα που τροποποιούν τη δομή της χρωματίνης, τη σταθεροποίηση του πυρήνα μεταγραφικό μηχανισμό, και μεσολαβούν επιμήκυνση της αλυσίδας RNA [18]. Εκτός από αυτά τα κλασικά μεταγραφική συν-ενεργοποιητές και συν-καταστολείς, AHR στρατολογείται από άλλους παράγοντες μεταγραφής κατά τη διάρκεια της μεταγραφής, συμπεριλαμβανομένων των οιστρογόνων υποδοχέα α (ΕΡα) [11], [19], [20] και NF-κΒ [21] να τροποποιήσουν εγγενή τους δραστηριότητες.

ΕΡα /β είναι ενεργοποιημένο συνδέτη παράγοντες μεταγραφής που ανήκουν στην υπεροικογένεια των πυρηνικών υποδοχέων ορμόνης (NR) [22] και δεσμεύουν 17β-οιστραδιόλη (Ε2) για να ρυθμίζει γονίδια που εμπλέκονται στην αναπαραγωγή και κυτταρική ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό [23]. Μετά τη σύνδεση συνδετήρα, ER σχηματίζει ένα λειτουργικό ομοδιμερές και δεσμεύει συγγενή στοιχεία απόκρισης της. Είναι ενδιαφέρον ότι, υπάρχει μια εξαρτώμενη από συνδετήρα αμοιβαίες διάσπαση μεταξύ ER και σηματοδότηση AHR. Για παράδειγμα, ενεργοποιείται ΕΡα αναστέλλει τη δράση της AHRC σε

CYP1A1

μέσω άμεσων αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης, που ονομάζεται

διακαταστολής

[11]. Αντιστρόφως, αντι-οιστρογονική ιδιότητες TCDD είναι καλά τεκμηριωμένη όπως καταστέλλει την E2-επαγώγιμων γονιδίων

pS2

και

καθεψίνης-D (CAT-D)

[24], [25], [26 ]. Ωστόσο, οι μηχανισμοί καταστολής που εμφανίζονται σε E2-αποκριτικών γονιδίων είναι ασαφείς. Προτείνεται θεωρίες για αυτή την καταστολή περιλαμβάνουν: (i) ο ανταγωνισμός για μια κοινή πισίνα των συν-ενεργοποιητών [27]? (Ii) μια άμεση ρύθμιση προς τα κάτω των

CAT-D

μεταγραφή μέσω ανοδικά στοιχεία ανασταλτική απάντηση διοξίνες [28]? (Iii) ενεργοποίηση ενός ανασταλτικού παράγοντα TCDD επαγόμενο [28]? (Iv) AHR-εξαρτώμενη Ε3-λιγάση που διασπά τις πρωτεΐνες ζωτικής σημασίας για την ER-σηματοδότηση [29], ή? (V) μια άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ μετακαταστολή AHR και ER [11], [19].

Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε το ρόλο του AHR και ARNT στη μεταγραφή ΕΚα εξαρτώμενη γονιδίου στόχου στον καρκίνο του μαστού MCF7 ανθρώπινο και οι ανθρώπινες ενδομήτριες-τραχηλικού καρκινικές κυτταρικές σειρές ECC-1. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η AHR και ARNT ενεργούν ανεξάρτητα από κάθε άλλους δικτυακούς τόπους σε off-στόχο και αποκάλυψε ότι ARNT δεν είναι απαραίτητη για την TCDD-εξαρτώμενη καταστολή της ER-σηματοδότηση. Επιπλέον, έχουμε καταδείξει ότι ARNT δρα ως ειδικό συνενεργοποιητή κυττάρου σε κύτταρα MCF7, και ως συν-καταστολέα στα κύτταρα ECC-1. Τέλος, δείχνουμε ότι ARNT knockdown επηρεάζει όχι μόνο συσσώρευση mRNA και της πρωτεΐνης των γονιδίων ΕΚα-στόχου, αλλά επίσης έχει φαινοτυπική συνέπειες επηρεάζοντας ΕΚα μεσολάβηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων.

Αποτελέσματα

AHR εξαρτώμενη καταστολή της σηματοδότησης των οιστρογόνων στο ECC-1 κύτταρα

Η παρουσία της AHR, ARNT και ΕΡα στο διοξίνης επαγόμενο

CYP1A1

ενισχυτή και το Ε2 που επάγεται από

pS2

ανάδοχος έχει ήδη τεκμηριωθεί σε κύτταρα MCF7 και άλλες καρκίνου του μαστού κυτταρικές γραμμές [11], [19], [20], [30]. Παρά το γεγονός ότι οι προκαταρκτικές μελέτες έχουν εντοπίσει ECC-1 ανθρώπινα κύτταρα του ενδομητρίου ως ένα ιδανικό σύστημα για τη μελέτη διακοπής της διοξίνης των οιστρογόνων σηματοδότησης [31], [32] Πολύ λίγα είναι γνωστά σχετικά με τους ρόλους των AHR, ARNT και ER και τις αντίστοιχες αλληλεπιδράσεις τους σε αυτή την κυτταρική σειρά . Χρησιμοποιήσαμε τη δοκιμασία τσιπ για να εξακριβωθεί η κατάσταση αυτών των πρωτεϊνών στο

pS2

υποκινητή και

CYP1A1

ενισχυτή τόσο στην παρουσία και απουσία Ε2 και TCDD. κύτταρα ECC-1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO, 10 ηΜ Ε2, 2 ηΜ TCDD ή ένα συνδυασμό της Ε2 και TCDD για 45 λεπτά. Μετά χημικά σταυροσύνδεσης πρωτεΐνη στο DNA με φορμαλδεΰδη, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και υπερηχήθηκε. Διασπασμένο συμπλέγματα ϋΝΑ-πρωτεΐνης κατακρημνίστηκαν με αντισώματα ειδικά προς AHR, ARNT ή ΕΚα και στη συνέχεια απομονώνονται σύμπλοκα ήταν αντίστροφης διασταυρωμένες και DNA υποβλήθηκε σε ενίσχυση PCR. Συνεπής με τις παρατηρήσεις άλλων ερευνητών σε κύτταρα καρκίνου του μαστού, παρατηρήσαμε την πρόσληψη AHR και ARNT στο ανθρώπινο

CYP1A1

ενισχυτή σε ένα TCDD τρόπο εξαρτώμενο και ΕΚα εμπλουτίστηκε σημαντικά μόνο μετά από αγωγή με ένα συνδυασμό 2 ηΜ TCDD και 10 ηΜ Ε2 (Σχήμα 1Α). Επιπλέον, η πρόσληψη των ΕΚα στο

pS2

προαγωγού λαμβάνει χώρα σε ένα Ε2-εξαρτώμενο τρόπο ενώ AHR και ARNT υπάρχουν μετά την κατεργασία με είτε συνδέτη αλλά εμπλουτίζονται κατά την διάρκεια συν-θεραπείας (Σχήμα 1Β).

χρωματίνης δοκιμασίες ανοσοκατακρήμνισης του

CYP1A1

pS2

υποψήφιος (Β) περιοχές ενισχυτή (Α) και στα κύτταρα ECC-1 με τη χρήση αντισωμάτων που στοχεύουν AHR, ARNT ή Ετα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 45 λεπτά με είτε DMSO, Ε2 (10 ηΜ), TCDD (2 ηΜ) ή ένα συνδυασμό της Ε2 και TCDD. (C και D) Ο λειτουργικός ρόλος του AHR σε TCDD διαμεσολαβούμενη μεταγραφή. κύτταρα ECC-1 επιμολύνθηκαν με siRNAs είτε GFP (siGFP) ως αρνητικός έλεγχος ή AHR (siAHR # 3 ή siAHR # 4) 24 ώρες πριν την προσδέματος θεραπεία, τότε τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO, Ε2 (10 ηΜ), TCDD (2 ηΜ) ή ένα συνδυασμό της Ε2 και TCDD. Τα επίπεδα mRNA για

pS2

(C) και

CYP1A1

(D) προσδιορίσθηκαν μέσω πραγματικού χρόνου RT-PCR και ομαλοποιήθηκε ως προς την έκφραση ιδιοσυστατικά ενεργό GAPDH. (Ε) κύτταρα ECC-1 επιμολύνθηκαν με siRNA στα AHR και συλλέχθηκαν για προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου για ανάλυση Western Blot των επιπέδων της πρωτεΐνης AHR, ΕΚα και XAP2.

Η

Έχουμε προηγουμένως δείξει ότι ΕΚα συνεργάτες με το AHRC να μεσολαβήσει οιστραδιόλη-εξαρτώμενη διακαταστολής διοξίνης επαγόμενο γονίδιο μεταγραφής [11]. Ως εκ τούτου, στόχος μας ήταν να προσδιοριστεί η λειτουργική σημασία της AHR σε οιστρογόνο επαγώγιμη γονιδιακή μεταγραφή. Εμείς επιμολυσμένα κύτταρα ECC-1 με μικρή ανασταλτική RNA που κατευθύνονται είτε προς ΑΗΚ (siAHR) ή αρνητική ελέγχου GFP (siGFP). Μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα στερήθηκαν ορού για 24 ώρες, ακολουθούμενη από κατεργασία συνδέτη 24 ώρες και στη συνέχεια συλλέχθηκαν για ολική mRNA που ποσοτικοποιήθηκε μέσω ποσοτικής PCR. Όπως ήταν αναμενόμενο, εκτομή του AHR και συν-θεραπεία με 2 ηΜ TCDD και 10 αποτελέσματα ηΜ Ε2 στην απώλεια TCDD προκαλούμενη καταστολή του

pS2

μεταγραφής (Σχήμα 1 C). Ωστόσο, η απώλεια της AHR δεν είχε καμία μετρήσιμη επίδραση επί της βασικής ή οιστρογόνων ενεργοποιηθεί

pS2

συσσώρευση του mRNA. Ως έλεγχος για την ειδικότητα siRNA, κηλίδες Western των AHR πρωτεΐνης δείχνουν μια πολύ μειωμένη έκφραση της πρωτεΐνης μετά AHR επίπεδα επιμόλυνσης και αμετάβλητη πρωτεΐνη του ΕΚα και XAP2 η οποία χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης (Σχήμα 1 Ε). Αυτά αποδεικνύουν την ειδικότητα των siRNA στα AHR, και ότι η απώλεια του AHR δεν επηρεάζει τη συσσώρευση ή κύκλου εργασιών βασικά επίπεδα πρωτεΐνης ΕΚα. Επιπλέον, η επαγωγή του

CYP1A1

μεταγραφή με TCDD μετά AHR knockdown εξασθενεί σε σύγκριση με το siGFP αρνητικό μάρτυρα (Σχήμα 1 D). Έτσι, AHR είναι μια απαίτηση για TCDD επαγόμενη καταστολή της Ε2-απόκρισης μεταγραφή του γονιδίου και την αυξημένη μεταγραφική απόκριση με συνδυαστική θεραπεία οφείλεται αποκλειστικά στην απώλεια της AHR και άλλων υποθετικών μεταγραφική τροποποιητές που συνδέονται με την παρουσία του. Τέλος, θα ληφθούν ουσιαστικά τα ίδια αποτελέσματα και στις δύο MCF7 και κυτταρικές σειρές ECC-1 κάτω από ορό πεινασμένο ή ξυλάνθρακα-απογυμνωμένο συνθήκες ορό υποδηλώνοντας ότι οι διαφορές στην ικανότητα των κυτταρικών σειρών «να περάσουν από τον κυτταρικό κύκλο δεν επηρεάζει το φαινόμενο αυτό. Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν την ιδέα ότι η κυτταρική γραμμή ECC-1 είναι ένα εξαιρετικό μοντέλο εναλλακτική λύση των κυττάρων για τη μελέτη της διοξίνης που προκαλείται από διαταραχή της σηματοδότησης υποδοχέα οιστρογόνου.

ARNT έχει κυττάρου ειδικό συν-ενεργοποιητή /συν-καταστολέα λειτουργίες

Ο προσδιορισμός των ARNT ως συν-ενεργοποιητή στη σηματοδότηση των οιστρογόνων [27], [30], σε αντιπαράθεση με τα γνωστά αποτελέσματα transrepressor της TCDD, μας οδήγησε να διερευνήσει το ρόλο που διαδραματίζουν οι ARNT σε TCDD μεσολάβηση διακαταστολής του ER λειτουργία σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές γραμμές του ανθρώπου, δηλαδή MCF7 και κύτταρα ECC-1. Μέσω siRNA που κατευθύνεται προς ARNT και ένα κωδικοποιημένο αρνητικού ελέγχου (siSCX), και εν συνεχεία ανάλυση qPCR της ενδογενούς

pS2

και

CAT-D

μεταγραφή του γονιδίου, κάναμε αρκετές ενδιαφέρουσες παρατηρήσεις. Κατ ‘αρχάς, ARNT εμφανίζει ιδιότητες συν-καταστολέα στα κύτταρα ECC-1. Συσσώρευση

pS2

(Σχήμα 2Α) και

CAT-D

Τα επίπεδα (Σχήμα 2Β) mRNA επιδεινώθηκαν κατά τη διάρκεια θεραπείας Ε2 μετά την απώλεια του ARNT υποδηλώνει μια ειδική κυτταρική λειτουργία για ARNT ανεξάρτητη από AHR. Επιπλέον, παρατηρείται αυτό το φαινόμενο με τρία ξεχωριστά siRNAs κατευθύνεται προς ARNT (siRNA 1 και 3 δείχνονται στο Σχήμα 2Α, Β και C). Χρησιμοποιήσαμε δύο τουλάχιστον siRNA για όλες τις άλλες πειραματικές παραμέτρους με ουσιαστικά ταυτόσημα αποτελέσματα, αλλά για λόγους συντομίας, εφεξής μπορούμε μόνο παρουσιάζουν δεδομένα που απεικονίζει τη χρήση ενός siRNA. Δεύτερον, σύμφωνα με τα ευρήματα αρκετών άλλων ερευνητών, ARNT εμφανίζεται ιδιότητες συν-ενεργοποιητής σε κύτταρα MCF7 [27], [30]. Πράγματι, knockdown του ARNT πρωτεΐνης υγραίνει Ε2 επαγόμενη μεταγραφή του

pS2

(Σχήμα 2C) και

CAT-D

(Σχήμα 2D). Τέλος, σε ένα πείραμα δόσης-απόκρισης, παρατηρήσαμε μια συνακόλουθη μείωση των επιπέδων της πρωτεΐνης CAT-D με αυξανόμενες συγκεντρώσεις TCDD σε αμφότερα τα κύτταρα MCF7 (Εικόνα 2Ε) ECC-1 και. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ARNT λειτουργία που σχετίζεται με σηματοδότηση ER είναι πιθανή υπαγορεύεται από άλλους παράγοντες που αφορούν ειδικά το κυτταρικό περιβάλλον.

ECC-1 κύτταρα (Α και Β) και κύτταρα MCF7 (C και D) επιμολύνθηκαν με είτε κωδικοποιημένα siRNA (siSCX) ή siRNA που κατευθύνεται προς ARNT (siARNT # 1 ή siARNT 3 #). Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα (DMSO), Ε2 (10 ηΜ), TCDD (2 ηΜ) ή ένα συνδυασμό της Ε2 και TCDD. Η γονιδιακή έκφραση προσδιορίστηκε με πραγματικού χρόνου RT-PCR μετά από απομόνωση και αντίστροφη μεταγραφή του συνολικού RNA.

CAT-D

και

pS2

έκφρασης κανονικοποιήθηκαν σε ουσιαστικά δραστική 36Β4 γονιδιακής έκφρασης. (Ε) Ανάλυση Western blot των επιπέδων της πρωτεΐνης CAT-D σε MCF7 και κύτταρα ECC-1. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO ή Ε2 (10 ηΜ) και διάφορες συγκεντρώσεις του TCDD (10 ρΜ, 50 ρΜ, 100 ρΜ, 500 ρΜ, 1 ηΜ ή 5 ηΜ). Μετά από 24 ώρες επεξεργασίας, τα προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου συλλέχθηκαν, και δοκιμασίες Western Blot εκτελέσθηκαν χρησιμοποιώντας αντισώματα που κατευθύνονται έναντι CAT-D και α-τουμπουλίνης. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν ± S.D. * P & lt?. 0.05

Η

Για να καθοριστεί εάν η ρύθμιση της μεταγραφικής δραστηριότητας μεταφράζεται σε παρόμοιο προφίλ έκφρασης πρωτεΐνης, χρησιμοποιήσαμε ανάλυση κηλίδος Western για να απεικονίσει το επίπεδο της πρωτεΐνης CAT-D μετά ARNT νοκ ντάουν. Τα κύτταρα διαμολύνθηκαν και συνδέτη κατεργασία υπό τις ίδιες συνθήκες όπως τις παραμέτρους qPCR. Σε σύγκριση με το κωδικοποιημένο αρνητικό έλεγχο, η έκφραση της πρωτεΐνης CAT-D μετά την αγωγή Ε2 επιδεινώνεται σε ECC-1 κύτταρα με ARNT knockdown (Σχήμα 3Α). Αντιστρόφως, τα κύτταρα MCF7 διαμολυσμένα με ARNT siRNA οδήγησε σε άμβλυνση έκφραση της πρωτεΐνης CAT-D κατά τη διάρκεια της θεραπείας Ε2 (Σχήμα 3C). Επιπλέον, τα επίπεδα ΕΚα παρέμεινε συνεπής, ανεξάρτητα από την κατάσταση ARNT (Σχήμα 3Α και C). Το πιο σημαντικό, διοξίνες επαγόμενη καταστολή της σηματοδότησης ΥΟ διατηρήθηκε στο επίπεδο πρωτεΐνης μετά ARNT knockdown (Σχήμα 3Α και C). Οι αντιπροσωπευτικές στυπώματα κανονικοποιήθηκαν προς α-τουμπουλίνης και φωταύγεια μετρήθηκε χρησιμοποιώντας GeneTools 4.01.2 λογισμικού (Syngene). Αυτές οι κανονικοποιημένες τιμές έδειξαν μια διπλάσια επαγωγή CAT-D σε ECC-1 κύτταρα με ARNT knockdown μετά τη θεραπεία Ε2 (Σχήμα 3Β, στήλες 2 και 6), ενώ σε κύτταρα MCF7, knock-down του ARNT είχε ως αποτέλεσμα μείωση κατά 40% στην έκφραση CAT-D E2-εξαρτώμενο (Σχήμα 3D, colunms 2 και 6). Αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν συγκεκριμένες ενδείξεις ότι το επίπεδο της έκφρασης πρωτεΐνης αντικατοπτρίζει την μεταγραφική απόκριση στις δύο κυτταρικές σειρές και ότι φυσιολογικές συνέπειες πρέπει να προκύψουν με την απώλεια της ARNT.

ECC-1 (Α και Β) και MCF7 (C και D κύτταρα) επιμολύνθηκαν με είτε siSCX ή siARNT και συνδέτη σε επεξεργασία όπως περιγράφεται στο Σχήμα 2. (Α και C) Αντιπρόσωπος Western blots του ARNT, CAT-D, ΕΚα και α-τουμπουλίνης επίπεδα πρωτεΐνης. Ιστογράμματα των επιπέδων της πρωτεΐνης CAT-D σε κύτταρα ECC-1 (Β) και MCF7 (D) μετά την ομαλοποίηση τιμές φωταύγειας σε α-τουμπουλίνης. Ανοικτό μπάρες αντιπροσωπεύουν συνδέτη θεραπείες μετά siRNA στα ανακατωμένα αρνητικό μάρτυρα (siSCX) και κλειστού (μαύρο) μπάρες αντιπροσωπεύουν συνδέτη θεραπείες μετά siRNA να ARNT (siARNT). Τα πειράματα διεξήχθησαν τρεις φορές με ουσιαστικά πανομοιότυπα αποτελέσματα.

Η

Αυτά τα εκπληκτικά αποτελέσματα σε συνδυασμό με την παρατήρηση ότι TCDD επαγόμενη καταστολή της ER-σηματοδότηση διατηρείται και στις δύο κυτταρικές γραμμές μετά ARNT knockdown (Σχήμα 2 και 3 ) παρέχοντας έτσι αποδείξεις ότι ARNT δεν απαιτείται για TCDD /AHR εξαρτώμενη καταστολή του ΕΚα σηματοδότησης. Αυτή η υπόθεση υποστηρίζεται από την ικανότητα ενός εκλεκτικού ρυθμιστή υποδοχέα αρυλ υδρογονάνθρακα (SAHRM) για να καταστείλουν σηματοδότηση των οιστρογόνων. Εξετάσαμε την ικανότητα της γνωστής SAHRM, DiMNF [33], [34] για την καταστολή της Ε2-διαμεσολαβούμενη μεταγραφή με RT-PCR σε MCF7 και κύτταρα ECC-1 (Σχήμα 4). DiMNF ήταν εξίσου αποτελεσματική στην καταστολή της συσσώρευσης mRNA CAT-D ως TCDD. DiMNF είναι ένας ισχυρός ανταγωνιστής του AHR και μετατοπίζει αποτελεσματικά TCDD από τον υποδοχέα σε 1 μΜ [34]. Επιπλέον, DiMNF αποτυγχάνει να διεγείρει το σχηματισμό AHR-ARNT-διοξίνη στοιχείο απόκρισης σε μία δοκιμασία ηλεκτροφορητικής μετατόπισης κινητικότητας, γεγονός που υποδηλώνει ότι δεν μπορεί να συμβεί AHR-ARNT διμερισμού [34], έτσι, φαίνεται πιθανό ότι η λειτουργία μετακαταστολή AHR είναι εντελώς ARNT-ανεξάρτητη.

Η επίδραση του 1 μΜ DiMNF στο Ε2-επαγόμενη έκφραση CAT-D σε MCF7 και κύτταρα ECC-1. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συνδετήρες για 24 ώρες πριν από την απομόνωση του RNA. Η γονιδιακή έκφραση προσδιορίστηκε όπως περιγράφεται παραπάνω. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν ± S.D. * Ρ & lt?. 0.05

Η

ARNT knockdown προκαλεί αυξημένο πολλαπλασιασμό σε κύτταρα ECC-1 και μείωσε τον πολλαπλασιασμό σε κύτταρα MCF7

Ευαισθησία σε οιστρογόνου έχει συνδεθεί με πολλαπλασιασμό και μετασχηματισμό κυττάρου σε ER- θετικών κυττάρων καρκινώματος [35]. Για να διαπιστωθεί αν ARNT μπορεί να επηρεάσει Ε2-εξαρτώμενο κυτταρικό πολλαπλασιασμό, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς πολλαπλασιασμού για ECC-1 και κύτταρα MCF7 μετά τη θεραπεία ARNT siRNA. Συνεπής με ποσοτική PCR μας και Western blot δεδομένα, ECC1 και MCF7 κύτταρα εμφάνισαν μεταβληθείσα ποσοστά πολλαπλασιασμού μετά ARNT knockdown σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με το περιπλεγμένο αρνητικού ελέγχου siRNA (Σχήμα 5Α και Β). Εξόντωση ARNT παρακολουθήθηκε για 72 ώρες και η σημαντική knock-down που παρατηρήθηκε ήταν αμετάβλητη ουσιαστικά σε κάθε χρονικό σημείο (Σχήμα 5C). Ούτε κυτταρική γραμμή εμφανίζεται αλλαγμένη πρότυπα ανάπτυξης μέχρι το χρονικό σημείο των 48 ωρών. Στις 48 ώρες, ECC-1 κύτταρα σε αμφότερες τις συνθήκες siSCX και siARNT έδειξε μέτρια πολλαπλασιασμό σε απόκριση σε αγωγές Ε2. Στο χρονικό σημείο 96 ωρών, υπήρχε μια ιδιαίτερα σημαντική αύξηση στην E2-διεγέρσιμο πολλαπλασιασμό των ECC-1 κύτταρα κατεργασμένα με siARNT, σε σύγκριση με κύτταρα κατεργασμένα κωδικοποιημένα ελέγχου. Περιέργως, ARNT νοκ ντάουν αυξημένο βασικό ρυθμούς ανάπτυξης και προκάλεσε οξυμένες απάντηση Ε2 με τον αριθμό των κυττάρων σχεδόν διπλασιασμό στις θεραπείες siARNT Ε2 σε σύγκριση με τις θεραπείες siSCX Ε2. Αντιστρόφως, τα κύτταρα MCF7 παρουσίασαν μειωμένο ρυθμό πολλαπλασιασμού μετά ARNT knockdown (Σχήμα 5Β). Οι ρυθμοί ανάπτυξης δεν ήταν σημαντικά διαφορετικές μέχρι το χρονικό σημείο 48 ώρες, όταν η E2-επαγώγιμη πολλαπλασιαστική απόκριση στο κωδικοποιημένο αρνητικό έλεγχο ήταν εμφανής. Τα siARNT επιμολυσμένα κύτταρα είχαν μια αμβλεία απόκριση ανάπτυξη τόσο κατά τον έλεγχο και τις συνθήκες Ε2. Σε 96 ώρες, τα κύτταρα άρχισαν να χάνουν την ευαισθησία στην Ε2 και τέθηκε σε γηρασμένα κατάσταση. Είτε αυτό ήταν λόγω των συνθηκών ανάπτυξης ή δεν είναι ασαφής. Ωστόσο, αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν περαιτέρω την υπόθεση ότι ARNT έχει ιδιότητες συν-καταστολέα σε ECC-1 κύτταρα και τις ιδιότητες συν-ενεργοποιητή σε κύτταρα MCF7. Επιπλέον, η ευαισθησία στο Ε2 και οι αμοιβαίες αποκρίσεις ανάπτυξης εκτεθεί από τις δύο κυτταρικές σειρές είναι φαινοτυπικά bona fide συνέπειες της ARNT κατάλυσης.

ECC-1 (Α) και MCF7 κύτταρα (Β) επιμολύνθηκαν με είτε siSCX ή siARNT για 6 ώρες, στη συνέχεια σε επεξεργασία με θρυψίνη και επανακαλλιεργήθηκαν σε 10.000 κύτταρα /φρεάτιο σε τρυβλία 12 φρεατίων. Εικοσιτέσσερις ώρες μετά την σπορά, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με είτε DMSO ή Ε2 (10 ηΜ) και ο αριθμός των κυττάρων διεξήχθησαν σε 0, 48 και 96 ώρες μετά την αγωγή με ένα Fuchs-Rosenthal Μετρώντας τμήμα. Στο χρονικό σημείο 48 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για δεύτερη φορά με 10 ηΜ Ε2. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και κάθε δοκιμή μετρήθηκε τρεις φορές. (Γ) ανάλυση κηλίδας Western των ARNT μετά siRNA knock-down αποκαλύπτει ότι σημαντικές knock-down επιτεύχθηκε και παραμένει επί μία περίοδο 72 h. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν ± S.D. * P & lt?. 0.05

Η

Συζήτηση

Πολλοί περιβαλλοντικών ρύπων που χρησιμεύουν ως οι ενεργοποιητές του υποδοχέα αρυλο υδρογονανθράκων γνωστή ως υποθετικό ενδοκρινικής διαταραχής ενώσεις. Η έκθεση σε πολλές από αυτές τις ενώσεις συμβαίνουν σε καθημερινή βάση και αντιπροσωπεύει σημαντικούς κινδύνους για την ανθρώπινη υγεία. Ειδικότερα, οι κατασταλτικές επιδράσεις που προκαλούνται από συνδετήρες της AHR επί σηματοδότηση ER έχουν τεκμηριωθεί καλώς [11], [19], [36], [37], [38]. Άλλες αναφορές έχουν περιγράψει την δυνατότητα συν-ενεργοποιητής της ARNT για ER-διαμεσολαβούμενη μεταγραφή [27]. Παρά το αυξανόμενο σώμα της στοιχεία που να υποστηρίζουν ρόλους για AHR και ARNT στη λειτουργία του ER, λίγα είναι γνωστά για την κανονική φυσιολογικό ρόλο αυτών των πρωτεϊνών που σχετίζονται με τη σηματοδότηση των οιστρογόνων ή μοριακών καθοριστικών παραγόντων της τοξικής ουσίας που προκαλείται διακαταστολής της λειτουργίας ER από AHR. Τέλος, αυτή η έρευνα αποκάλυψε ότι ARNT δεν είναι απαραίτητη για την AHR μεσολάβηση μετακαταστολή εκτός στόχου. Προκειμένου να οριοθετηθούν οι μοριακοί μηχανισμοί υποκείμενη AHR μεσολάβηση μετακαταστολή επιδιώξαμε να αποσυνδεθούν AHR και ARNT λειτουργία στο ER-θετικών ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών. Με αυτόν τον τρόπο, ανακαλύψαμε ότι ARNT εξασθενίζει ενεργοποιημένη μεταγραφή γονιδίου ER-στόχο σε ECC-1 κύτταρα, σε άμεση αντίθεση με τη λειτουργία συν-ενεργοποιητή του που περιγράφονται στα κύτταρα MCF7 [27].

ARNT ταυτοποιήθηκε αρχικά ως ένα καλόπιστους μεταγραφικού παράγοντα [39] και διμερισμό εταίρος της AHR [40]. Πέρα από τη λειτουργία του παράγοντα κανονική μεταγραφή, ARNT μπορεί να αλληλεπιδράσει με πολλούς άλλους παράγοντες μεταγραφής, συμπεριλαμβανομένων των ΕΚα [11] και συν-ενεργοποιητή λειτουργία της για σηματοδότηση ER έχει καλά περιγραφεί [27], [30]. Ως εκ τούτου, αναμένεται ότι τα knockdown του ARNT σε ECC-1 ενδομητρίου-τραχήλου καρκινικά κύτταρα θα μπορούσε να οδηγήσει σε μια μείωση της έκφρασης του γονιδίου-στόχου ER. Η προκύπτουσα αύξηση στην συσσώρευση mRNA, έκφραση πρωτεΐνης και Ε2 που επάγεται πολλαπλασιασμό υποδηλώνει έντονα ότι ARNT δρα ως μεταγραφικός συν-καταστολέα σε αυτή την κυτταρική γραμμή. Ο μοριακός μηχανισμός (ες) που διέπουν τις διαφορές που παρατηρούνται στα MCF7 και κύτταρα ECC-1 πιθανόν σχετίζεται με διαφορές ως προς τη φύση και τη σύνθεση των βοηθητικών μηχανημάτων μεταγραφικό προσλαμβάνονται από ARNT σε κάθε κυτταρική σειρά. ARNT παρουσιάζει αρκετά διαφορετικούς τομείς αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης για την πρόσληψη των πρωτεϊνών συν-ενεργοποιητή, συμπεριλαμβανομένου ενός καρβοξυ-τερματικό τομέα διενεργοποίησης [18], PAS-Β περιοχή του [41] και τον τομέα βασική έλικα-βρόχος-έλικα του [12] . Επιπλέον, μια σύνδεση μεταξύ ARNT και πρωτεΐνης μεταγραφικής συν-καταστολέα, SMRT έχει δειχθεί [42]. Ωστόσο, πιστεύουμε ότι αυτή είναι η πρώτη απόδειξη ότι ARNT έχει διπλή λειτουργία συν-ενεργοποιητή /συν-καταστολέα σε ένα κύτταρο-ειδικό τρόπο (Σχήμα 6). Επιπλέον, οι επιπτώσεις αυτών των μεταγραφικών επιπτώσεις μπορεί να παρατηρηθεί στα επίπεδα της μετάφρασης και φαινοτυπική.

Η παρουσία του Ε2 διευκολύνει την συναρμολόγηση της μεταγραφικής τροποποιητές που επάγουν τη μεταγραφή του Ε2-απόκρισης γονίδια. Συνδέτη ενεργοποιηθεί AHR καταστέλλει ER-σηματοδότηση ανεξάρτητα από ARNT. Η απώλεια ARNT σε κύτταρα ECC-1, όπου δρα ως συν-καταστολέα, οδηγεί σε αυξημένη ευαισθησία σε Ε2 και αυξημένη μεταγραφική δραστικότητα σε ER ρυθμιζόμενα γονίδια. Η απώλεια ARNT σε κύτταρα MCF7, όπου δρα ως συν-ενεργοποιητή, οδηγεί σε μειωμένη ευαισθησία στην Ε2 και μειώνει την μεταγραφική δραστικότητα στο ER ρυθμιζόμενα γονίδια.

Η

Πολλά μοντέλα έχουν υποτεθεί για να εξηγήσει το μοριακό μηχανισμών που διέπουν μεταγραφικού παράγοντα μεσολάβηση cross-talk, ιδιαίτερα την ικανότητα ενός μεταγραφικού παράγοντα για την καταστολή του άλλου λειτουργία [18]. Reugg και οι συνεργάτες του, μεταξύ άλλων, έχουν προτείνει ότι η μεταγραφή μετακαταστολή παράγοντας μεσολάβηση μπορεί να είναι το αποτέλεσμα του ανταγωνισμού για περιορισμένη δεξαμενή πρωτεϊνών συν-ενεργοποιητή [27]. Ωστόσο, η ταυτοποίηση των ARNT ως συν-καταστολέα στα κύτταρα ECC-1 αποκαλύπτει μια πιο σύνθετη μηχανισμό μετακαταστολή σε E2-επαγώγιμων γονιδίων τότε το μοντέλο ανταγωνισμού συνενεργοποιητή προτείνει. Αν και τα στοιχεία αυτά δεν αναιρεί οριστικά το μοντέλο αυτό, πιστεύουμε ότι τα στοιχεία μας δείχνουν ότι είναι απίθανο λόγω του ανταγωνισμού συν-ενεργοποιητής δεν μπορούν να εξηγήσουν TCDD επαγόμενο καταστολής στα κύτταρα ECC-1, όπως ενεργοποιούνται AHR πρέπει φίμωσης συν-καταστολέα ARNT του. Επιπλέον, ARNT, μια πρωτεΐνη που έχει αποδείξει την ικανότητα να προσλαμβάνουν πολλές συν-ενεργοποιητές [12], [15], [17], [41], [43], [44] θα πρέπει παράνομης ένα αποτέλεσμα παρόμοιο με συνδέτη-ενεργοποιημένη AHR αν πισίνες συν-ενεργοποιητή ήταν σε τέτοια περιορισμένη προσφορά ότι ο ανταγωνισμός θα εμπόδιζε επιμέρους λειτουργία παράγοντα μεταγραφής. Αυτό σαφώς δεν συμβαίνει στην κυτταρική σειρά ECC-1.

Η πειραματική στοιχεία που παρουσιάστηκαν παραπάνω δείχνουν ότι AHR δεν απαιτεί ARNT να μεσολαβήσει off-στόχο της transrepressor αποτελέσματα. Απώλεια ARNT τόσο MCF7 και κύτταρα ECC-1 απέτυχε να καταργήσει την κατασταλτική επιδράσεις της TCDD στην έκφραση Ε2-επαγώγιμη μεταγραφή και πρωτεΐνη (Σχήματα 2 και 3). Τα αποτελέσματα DiMNF-δεσμεύεται AHR είναι ανεξάρτητες από το στοιχείο απόκρισης διοξίνης δεσμευτικός ως πυρηνικό εκχύλισμα από κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με DiMNF δεν επιβραδύνει την κυκλοφορία ενός επισημασμένου ιχνηλάτη στοιχείο απόκρισης διοξίνης σε δοκιμασίες μετατόπισης πηκτής [34]. Επιπλέον, AHR-ARNT διμερισμού είναι μια απαίτηση για το DNA δεσμευτική, υποδηλώνοντας ότι αυτό δεν μπορεί να συμβεί με την παρουσία DiMNF. Αυτό αντιπροσωπεύει μια παραδειγματική αλλαγή στην κατανόηση της λειτουργίας AHR και έχει συνέπειες για τη χρήση και την αποτελεσματικότητα των εκλεκτικών ρυθμιστών AHR. Πράγματι, μία νέα ανταγωνιστής AHR έχει αποδειχθεί ότι είναι ένας ισχυρός διεγέρτης της επέκτασης AHR εξαρτώμενη βλαστικών κυττάρων [45]. Έτσι, οι ανταγωνιστές που δεν προκαλούν AHR-ARNT διμερισμού μπορεί να είναι περισσότερο αποτελεσματικός καταστολείς της λειτουργίας ER από το καθαρό αγωνιστές ως AHR δεν θα squelched με σύνδεση ARNT. Το SARHM DiMNF είναι ένας ισχυρός AHR εξαρτώμενη καταστολέα της κυτοκίνης σηματοδότηση [33], [34]. Επιπλέον, DiMNF ήταν αποτελεσματικό στην καταστολή ER-ρυθμιζόμενη έκφραση του γονιδίου-στόχου (Σχήμα 4). μελέτες μοριακής μοντελοποίησης δείχνουν ότι DiMNF σχηματίζει έναν επιπλέον δεσμό υδρογόνου με AHR σε Thr289 [34], ένα χαρακτηριστικό που δεν μοιράζεται με το μερικό αγωνιστή α-ναφθοφλαβόνη γεγονός που υποδηλώνει ότι η DiMNF-AHR υιοθετεί μια μοναδική επιβεβαίωση. Έτσι, τα φλαβονοειδή αντιπροσωπεύουν μια κατηγορία ενώσεων που μπορεί να είναι ελκυστικοί στόχοι για περαιτέρω δοκιμές και την ανάπτυξη να προσδιοριστεί η επίδρασή τους επί της έκφρασης γονιδίου-στόχου ER.

πειραματική απόδειξη μας επιδεικνύει μια λειτουργία καταστολέα TCDD εξαρτώμενη για AHR και TCDD /AHR-ανεξάρτητη λειτουργία συν-ενεργοποιητή /συν-καταστολέα για ARNT στη σηματοδότηση των οιστρογόνων. Τα αποτελέσματα αυτά μας παρέχουν περαιτέρω κατανόηση των μηχανισμών του μεταγραφικού παράγοντα στιχομυθία και υποθετικών θεραπευτικών στόχων σε καρκίνους οιστρογόνων-θετικό. Στο σύνολό τους, τα στοιχεία μας δείχνουν ένα πιο σύνθετο μηχανισμό της λειτουργίας ARNT και AHR μεσολάβηση διακαταστολής της ER-σηματοδότηση από ό, τι στο παρελθόν προταθεί. Η κλινική χρησιμότητα αυτών των ευρημάτων παραμένει να δοκιμαστεί και θα αποτελέσουν αντικείμενο μελλοντικών ερευνών.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά και κυττάρων πολιτισμού

3 ‘, 4’ διμεθοξυ-α-ναφθοφλαβόνη (DiMNF) ελήφθη από το εμπόριο (Indofine Chemical Co., Hillsborough, NJ). ECC-1 και MCF7 κύτταρα (ATCC) διατηρήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (ϋΜΕΜ? BioWhittaker, Lonza,) με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS? HyClone, PerBio, Thermo Fisher Scientific Inc.) και συμπληρωμένο με 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη-100 μg /ml στρεπτομυκίνη θειικό κάλιο (BioWhittaker, Lonza) στους 37 ° C, 20% O

2, και 5% CO

2. Είκοσι-τέσσερις ώρες πριν από κάθε πειραματική διαταραχή, τα κύτταρα πλύθηκαν 2 × με PBS, και διατηρείται σε φαινόλης-Red-ελεύθερα μέσα ενημέρωσης, χωρίς FBS [46].

δοκιμασίες ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης.

χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση (μάρκας) δοκιμασίες διεξήχθησαν όπως περιγράφεται από τους προηγουμένως [17]. Εν συντομία, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 150 cm

2 πιάτα και 24 ώρες στερήθηκαν ορού πριν από τη θεραπεία. Η επεξεργασία των κυττάρων έγινε εντός μέσου χωρίς ορό συμπληρωμένο με /mL λευκωματίνης βοείου ορού 3 mg για 45 min. σύμπλοκα χρωματίνης ήταν χημικώς σταυροειδείς δεσμούς με χρήση 1% φορμαλδεΰδη /διάλυμα /L HEPES 0,7 mol (τελική συγκέντρωση), ρΗ 7,8, και τα σύμπλοκα υποβλήθηκαν σε κατεργασία υπερήχων για να παραχθούν θραύσματα DNA 200 έως 900 bp μεγέθους. Τα συμπλέγματα προκαταρκτική διαύγαση με πρωτεΐνη Α ρητίνη αγαρόζης (Calbiochem) και επωάστηκαν για μία νύχτα με ειδικά αντισώματα [ΕΡα κουνελιού πολυκλωνικό ή ARNT κατσίκα πολυκλωνικό (Santa Cruz) ή AHR πολυκλωνικό κουνελιού που περιγράφηκε προηγουμένως [47]. Ανοσοπροσροφήθηκαν συμπλέγματα συλλήφθηκαν σε πρωτεΐνη Α ρητίνη αγαρόζης και πλύθηκε δύο φορές με 0,5 χ RIPA, ακολουθούμενο από τρεις πλύσεις με 10 mmol /L Tris-HCl (ρΗ 8.0) και 1 mmol /L EDTA. Τα δείγματα εκλούσθηκαν μακριά από την ρητίνη χρησιμοποιώντας 100 mmol /L NaHCO3 και 1% SDS, και διασυνδέσεις αντιστράφηκαν στους 65 ° C όλη τη νύκτα. Τα δείγματα με φαινόλη-χλωροφόρμιο και καταβυθίζεται με 70% EtOH και Pellet Paint (Novagen). Ανοσο-προσροφημένο DNA αναλύθηκε με PCR. Εκκινητές για το

CYP1A1

ενισχυτή και προαγωγό pS2 έχουν περιγραφεί προηγουμένως [20], [48].

Παροδικές επιμολύνσεις

MCF7 και κύτταρα ECC-1 καλλιεργήθηκαν συνθήκες που περιγράφονται παραπάνω, μέχρι περίπου το 70% συρροή πριν siRNA επιμόλυνση. Τα κύτταρα επιμολυσμένα με είτε πράσινου φθορισμού πρωτεΐνη (GFP) siRNA (Dharmacon), ομελέτα (SCX) siRNA (DS Κωδικοποιημένα αρνητικού ελέγχου siRNA, Integrated DNA Technologies Inc.), AHR siRNAs (Dharmacon) ή ARNT siRNAs (Integrated DNA Technologies Inc., . Cat Νο HSC.RNAI.N187426.11.1, HSC.RNAI.N178426.11.2, HSC.RNAI.N178426.11.3? siARNT 1, siARNT 2, και siARNT 3 αντίστοιχα). Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 10-15 ηΜ siRNA χρησιμοποιώντας 0,3% (ν /ν) Trifectin (Integrated DNA Technologies) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα κύτταρα αφέθηκαν να επωαστούν σε μίγμα επιμόλυνσης για 6 ώρες στους 37 ° C, και 5% CO

2 μετά από το οποίο αφαιρέθηκε το μίγμα διαμόλυνσης και αντικαταστάθηκε με μέσο χωρίς ορό.

ανάστροφη μεταγραφή και Σε πραγματικό Time PCR

η αντίστροφη μεταγραφή και PCR πραγματικού χρόνου διεξήχθησαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [11]. Εν συντομία, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία είτε με DMSO (Me

2SO), TCDD (2 ηΜ), Ε2 (10 ηΜ), ή ένας συνδυασμός TCDD και Ε2, για 24 ώρες.