Αφηρημένο

Ιστορικό

Η κουρκουμίνη αναστέλλει την ανάπτυξη των παγκρεατικών μοσχευμάτων όγκων καρκίνου σε γυμνά ποντίκια? Ωστόσο, ο μηχανισμός δράσης δεν είναι πλήρως κατανοητή. Καθίσταται ολοένα και πιο σαφές ότι οι πρωτεΐνες που δεσμεύουν το RNA ρυθμίσουν μεταγραφικούς γονιδιακής έκφρασης και διαδραματίζουν κρίσιμο ρόλο στην σταθερότητα του RNA και τη μετάφραση. Εδώ, έχουμε διαπιστώσει ότι η κουρκουμίνη ρυθμίζει την έκφραση του RNA δεσμευτική πρωτεΐνη CUGBP2 να αναστέλλει την ανάπτυξη του καρκίνου του παγκρέατος.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι μοσχευμάτων όγκων αντιμετωπίζεται κουρκουμίνη έχουν σημαντική μείωση στον όγκο του όγκου και την αγγειογένεση. Η κουρκουμίνη ανέστειλαν τον πολλαπλασιασμό, ενώ επάγει G2-M σύλληψη και απόπτωση οδηγεί σε μιτωτική καταστροφή των διαφόρων καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος. Αυτό επιβεβαιώθηκε περαιτέρω από την αυξημένη φωσφορυλίωση της οδοφράγματος 2 κινάσης πρωτεΐνης (Chk2) σε συνδυασμό με υψηλότερα επίπεδα πυρηνικής κυκλίνης Β1 και CDC-2. Η κουρκουμίνη αύξησε την έκφραση της κυκλοοξυγενάσης-2 (COX-2) και αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) mRNA, αλλά τα επίπεδα πρωτεΐνης ήταν χαμηλότερα. Επιπλέον, η κουρκουμίνη αύξησε την έκφραση των πρωτεϊνών σύνδεσης RNA CUGBP2 /CELF2 και TIA-1. CUGBP2 πρόσδεση σε COX-2 και VEGF mRNA ενισχύθηκε επίσης, αυξάνοντας έτσι το mRNA σταθερότητα, την αλλαγή από 30 λεπτά έως 8 ώρες χρόνο ημίσειας ζωής. Από την άλλη πλευρά, σιγαστήρας μεσολάβηση knockdown του CUGBP2 αποκατασταθεί μερικώς την έκφραση της COX-2 και VEGF ακόμα και με θεραπεία κουρκουμίνη. COX-2 και VEGF mRNA επίπεδα μειώθηκαν στα επίπεδα του μάρτυρα, ενώ τα επίπεδα των πρωτεϊνών ήταν υψηλότερες.

Συμπέρασμα /σημαντικότητα

Η κουρκουμίνη αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου μέσω του παγκρέατος μιτωτική καταστροφή αυξάνοντας την έκφραση πρωτεΐνης που δεσμεύεται με RNA CUGBP2, αναστέλλοντας έτσι τη μετάφραση της COX-2 και VEGF mRNA. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η αναστολή μετάφραση είναι ένα νέο μηχανισμό δράσης για κουρκουμίνης κατά τη διάρκεια της θεραπευτικής παρέμβασης των καρκίνων του παγκρέατος

Παράθεση:. Subramaniam D, Ramalingam S, Linehan DC, Dieckgraefe BK, Postier RG, Houchen CW, κ.ά. . (2011) RNA Δεσμευτική Πρωτεΐνη CUGBP2 /CELF2 Μεσολαβεί κουρκουμίνη-Induced Μιτωτική Καταστροφή των Κυττάρων καρκίνο του παγκρέατος. PLoS ONE 6 (2): e16958. doi: 10.1371 /journal.pone.0016958

Επιμέλεια: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 14 Οκτωβρίου 2010? Αποδεκτές: 18 Ιαν 2011? Δημοσιεύθηκε: 11 Φεβρουαρίου 2011

Copyright: © 2011 Subramaniam et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Υποστηρίζεται από ΝΙΗ χορηγεί DK062265, CA109269 και CA135559. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Παρά τις προόδους στη μοριακή παθογένεση, καρκίνο του παγκρέατος παραμένει ένα σημαντικό πρόβλημα άλυτο υγείας στις Ηνωμένες Πολιτείες [1]. Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι μια ταχέως επεμβατική, μεταστατικού όγκου, το οποίο είναι ανθεκτικό σε καθιερωμένες θεραπείες [2], [3]. Προς το παρόν, μόνο παράγοντα χημειοθεραπείας με βάση (π.χ. Γεμσιταβίνη) είναι η θεραπεία στήριγμα για μεταστατικό αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος. θεραπεία γεμσιταμπίνη έχει ένα ποσοστό ανταπόκρισης του όγκου του κάτω από το 10%? Ομοίως κανένα από τα διαθέσιμα τρέχοντα χημειοθεραπευτικούς παράγοντες έχουν ένα ποσοστό αντικειμενικής ανταπόκρισης άνω του 10% [4], [5]. Πιο πρόσφατα, οι συνδυασμοί φαρμάκων με γεμσιταμπίνη επίσης εξετάζονται, αλλά είναι πολύ νωρίς για να πει αν είναι κλινικά ανώτερη. Παρ ‘όλα αυτά, το μέγεθος αυτού του προβλήματος εξουσιοδοτεί την ανάγκη για νέους θεραπευτικούς παράγοντες.

Επιδημιολογικές μελέτες δείχνουν ότι η διατροφή παίζει σημαντικό ρόλο στην πρόληψη πολλών μορφών καρκίνου. Η κουρκουμίνη, ένα ενεργό συστατικό στο κουρκούμη μπαχαρικών, έχει δείξει αποτελέσματα κατά του όγκου σε προκλινικές μελέτες [6], [7]. αντικαρκινικές ιδιότητες της κουρκουμίνης περιλαμβάνουν αναστολή της ανάπτυξης του όγκου και της επαγωγής της απόπτωσης [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16] . Πιλοτικές κλινικές δοκιμές φάσης Ι έδειξαν ότι η κουρκουμίνη είναι ασφαλές ακόμη και όταν καταναλώνεται σε ημερήσια δόση των 12 g για 3 μήνες [17], [18], [19]. Μια πιο πρόσφατη φάση I II μελέτη /απέδειξε ότι η θεραπεία συνδυασμού με χρήση 8 g από του στόματος κουρκουμίνη καθημερινά με γεμσιταμπίνη ήταν ασφαλές και εφικτό για τους ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος που δικαιολογούν περαιτέρω έρευνα σχετικά με την αποτελεσματικότητά του [20].

Οι αντικαρκινικές ιδιότητες της κουρκουμίνης έχουν αποδοθεί, τουλάχιστον εν μέρει, στην ικανότητά της να αναστέλλει την έκφραση και δραστικότητα της κυκλοοξυγενάσης-2 (COX-2) [21], [22]. Είναι ένα περιοριστικό του ρυθμού ένζυμο στην αραχιδονικού οξέος σε μονοπάτι σύνθεσης προσταγλανδίνης. Η πρωτεΐνη υπερεκφράζεται σε φλεγμονή και σε μία ποικιλία καρκίνων. Σε καρκίνοι του παγκρέατος, COX-2 overexpresssion σχετίζεται με την αναστολή της απόπτωσης, αυξημένη διεισδυτικότητα του όγκου, και την προώθηση της αγγειογένεσης. Η CELF (CUGBP-ETR3-σαν παράγοντες) οικογένεια πρωτεϊνών σύνδεσης RNA αποτελείται από έξι μέλη που εμπλέκονται σε διάφορες κυτταρικές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένων mRNA μάτισμα, την επεξεργασία, τη σταθερότητα και τη μετάφραση [23]. Ένα από τα μέλη, CUGBP2 (επίσης γνωστή ως CELF2, ETR3, BRUNOL2, Napor2) εκφράζεται παντού, αν και σε υψηλότερα επίπεδα σε μυϊκά κύτταρα [24], [25]. Σε προηγούμενες μελέτες, έχουμε αποδείξει ότι όταν CUGBP2 υπερεκφράζεται, τα κύτταρα υφίστανται μιτωτικά καταστροφή [26], [27]. Έχουμε επίσης καταδείξει ότι CUGBP2 μπορεί να συνδεθεί με AU-πλούσιες αλληλουχίες στην 3 ‘μη μεταφραζόμενη περιοχή του COX-2 mRNA και να αυξήσει την σταθερότητα του mRNA ενώ αναστέλλει μετάφραση του [28]. HuR, ένα σχετικό RNA πρωτεΐνη σύνδεσης με δομική ομοιότητα με CUGBP2 από την άλλη πλευρά εμπλέκεται στην αύξηση της COX-2 mRNA σταθερότητα και την ενίσχυση της μετάφρασης του συνδεόμενο με τους ίδιους AU πλούσια στοιχεία αλληλουχίας [29]. Μια τρίτη πρωτεΐνη σύνδεσης RNA που λειτουργεί ως μια μετα-μεταγραφικός ρυθμιστής της γονιδιακής έκφρασης μέσω της αναγνώρισης U-πλούσια αλληλουχία του RNA είναι ΤΙΑ-1 (Τ-κυττάρων-περιορισμένο ενδοκυτταρικό αντιγόνο-1). ΤΙΑ-1 έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλει τη μετάφραση του mRNA σε συνθήκες περιβαλλοντικής καταπόνησης [30], [31]. Στο άρθρο αυτό, έχουμε καθορίσει την επίδραση της κουρκουμίνης στην έκφραση του RNA δεσμευτικών πρωτεϊνών σε καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Όλα τα ζώα αντιμετωπίζονται σε αυστηρή συμφωνία με την ορθή πρακτική των ζώων, όπως ορίζεται από τις αρμόδιες εθνικές ή /και τοπικούς φορείς καλή διαβίωση των ζώων, καθώς και η εργασία των ζώων εγκρίθηκε από την Επιτροπή Θεσμικών ζωικά Φροντίδα και Χρήση (IACUC) (πρωτόκολλο # 07-009) του Πανεπιστημίου της Οκλαχόμα Υγείας Sciences Center.

κύτταρα και Αντιδραστήρια

AsPC-1, MiaPaCa-2, Panc-1, BxPC-3 του ανθρώπου και του καρκίνου του παγκρέατος κύτταρα Pan02 ποντικού (όλα από την American Type Culture Collection, Manassas, VA) αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 που περιέχει 10% θερμοαπενεργοποιημένο βόειο εμβρυϊκό ορό (Sigma Chemical Co, St. Louis, ΜΟ) και 1% διάλυμα αντιβιοτικό-αντιμυκητικό (Mediatech Inc, Herndon, VA) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2. Η κουρκουμίνη αγοράστηκε από LKT Laboratories, St Paul, ΜΝ.

Πολλαπλασιασμός και Δοκιμασίες απόπτωσης

Για την εκτίμηση του πολλαπλασιασμού, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε σε τρυβλία 96 φρεατίων και αναπτύχθηκαν όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με αυξανόμενες δόσεις της κουρκουμίνης σε RPMI 1640 μέσο που περιέχει 10% FBS. Ανάλυση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού πραγματοποιήθηκε με ενζυματική δοκιμασία [32]. Για την απόπτωση, δράση της κασπάσης 3/7 μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το Αρο-όνη Ομογενή Caspase-3/7 κιτ δοκιμασίας (Promega, Madison, WI).

Colony δοκιμασία σχηματισμού

Εν συντομία, 6 καλά πιάτα σπάρθηκαν με 500 βιώσιμα κύτταρα και αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάζονται παρουσία ή απουσία διαφόρων συγκεντρώσεων της κουρκουμίνης για έως και 48 ώρες. Το μέσο κουρκουμίνη που περιέχει στη συνέχεια απομακρύνθηκε, και τα κύτταρα πλύθηκαν σε PBS και επωάστηκαν για επιπλέον 10 d σε πλήρες μέσο. Κάθε αγωγή έγινε εις τριπλούν. Οι αποικίες που λαμβάνονται πλύθηκαν με PBS και σταθεροποιήθηκαν σε 10% φορμαλίνη για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS που ακολουθείται από χρώση με αιματοξυλίνη. Οι αποικίες μετρήθηκαν και συγκρίθηκαν με μη επεξεργασμένα κύτταρα.

κυτταρικού κύκλου αναλύσεις

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με κουρκουμίνη για 12 ώρες και 24 ώρες, και εν συνεχεία σε επεξεργασία με θρυψίνη και εναιωρούνται σε αλατούχο ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS). Single-κυτταρικά εναιωρήματα σταθεροποιήθηκαν χρησιμοποιώντας 70% αιθανόλη για 2 ώρες, και στη συνέχεια κατέστησαν διαπερατά με PBS που περιείχε 1 mg ml ιωδιούχου προπιδίου /(Sigma-Aldrich), 0,1% Triton Χ-100 (Sigma-Aldrich) και 2 μg άνευ ϋΝάσης RNase (Sigma-Aldrich) σε θερμοκρασία δωματίου. Κυτταρομετρία ροής έγινε με αναλυτή FACSCalibur (Becton Dickinson, Mountain, Θέα, CA), συλλαμβάνοντας 50.000 γεγονότα για κάθε δείγμα. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με το λογισμικό ModFit LT ™ (Verity Software House, Topsham, ΜΕ).

Real Time αντίστροφη μεταγραφή Ανάλυση αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

Το συνολικό RNA απομονώθηκε από MiaPaCa-2, τα κύτταρα Pan02 και ξενομοσχεύματα όγκου χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο TRIZOL μεταγράφηκε αντίστροφα με ανάστροφη μεταγραφάση Superscript II παρουσία τυχαίων εναρκτήρων εξανουκλεοτιδίου (όλα από την Invitrogen, Carlsbad, CA). Συμπληρωματικά DNAs στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν για πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας Jumpstart Taq DNA πολυμεράσης (Sigma Chemical Co, St. Louis, ΜΟ) και SYBR Green χρωστική νουκλεϊκού οξέος (Molecular Probes, Eugene, OR). Διασχίζοντας το κατώφλι ανά γονιδίων ομαλοποιήθηκαν σε β-ακτίνη. Αλλαγές στην έκφραση του mRNA εκφράστηκαν ως φορές μεταβολής σε σχέση με τον έλεγχο. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ήταν ως ακολούθως: β-ακτίνης: 5′-GCTGATCCACATCTGCTGG-3 ‘και 5′-ATCATTGCTCCTCCTCAGCG-3′? COX-2: 5’-GAATCATTCACCAGGCAAATTG-3 ‘και 5′-TCTGTACTGCGGGTGGAACA-3′? VEGF: 5’-AGCGCAAGAAATCCCGGTA-3 ‘και 5′-TGCTTTCTCCGCTCTGAGC-3′? HuR: 5’-3 ‘και GTGAACTACGTGACCGCGAA-5′-GACTGGAGCCTCAAGCCG-3′? CUGBP2: 5’-TGCTTCAACCCCCAACTCC-3 ‘και 5′-GTCCTTGCAGAGTCCCGAGA-3′? ΤΙΑ-1: 5’-3 ‘και ACCCATCTGTTGAATGGCGT-5′- GGCAACAGGAAAGTCTAAGGGAT-3′? Η κυκλίνη D1: 5’-AATGACCCCGCACGATTTC-3 ‘και 5′-TCAGGTTCAGGCCTTGCAC-3’

RNA Σταθερότητας δοκιμασία

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με κουρκουμίνη για 2 ώρες.. Ακτινομυκίνη-D (10 μg /ml τελική συγκέντρωση), ένας ισχυρός αναστολέας του mRNA σύνθεση προστέθηκε στα κύτταρα και συνολικού mRNA εκχυλίζεται 0-8 h. RNA υποβλήθηκε σε πραγματικό χρόνο PCR όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως σχετική με τα κύτταρα ελέγχου, κατά τη στιγμή της προσθήκης της ακτινομυκίνης D.

Ανάλυση Western Blot

Τα κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου και στυπώθηκε σε μεμβράνες Immobilin διφθοριούχο πολυβινυλιδένιο (Millipore , Bedford, ΜΑ). Αντισώματα τα προμηθευτήκαμε από την Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ), Abcam Inc (Cambridge, ΜΑ) και Santa Cruz Biotechnology Inc (Santa Cruz, CA) και ανιχνεύθηκαν ειδικών πρωτεϊνών από το ενισχυμένο σύστημα χημειοφωταύγειας (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) .

ανοσοκαταβύθιση

Για την ανοσοκατακρήμνιση, τα κύτταρα καθηλώθηκαν με 1% φορμαλίνη. Τα προϊόντα λύσης παρασκευάστηκαν και ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-CUGBP2 αντίσωμα. Το σφαιρίδιο και το υπερκείμενο στη συνέχεια επωάστηκαν στους 70 ° C για 1 ώρα για να αντιστρέψει τις διασυνδέσεις, και RNA καθαρίστηκε και υποβλήθηκε σε RT-PCR για τον προσδιορισμό της COX-2 και VEGF mRNA επίπεδα.

siRNA

Ακολουθία στόχευση του mRNA CUGBP2 5′-GCAAACCUUACUGAUCCUA-3 ‘(προσχώρηση mumber ns. NM_001025076) και μια ομελέτα siRNA ελέγχου δεν ταιριάζουν οποιοδήποτε από τα ανθρώπινα γονίδια ελήφθησαν από Ambion Inc, Texas, USA και επιμολύνονται με αντιδραστήριο επιμόλυνσης siPORT (Ambion).

Pan02 όγκους ξενομοσχεύματος

Πέντε-εβδομάδων αρσενικών αθυμικών γυμνών ποντικών αγοράστηκε από την Jackson Laboratories χρησιμοποιήθηκαν για

in vivo

πειράματα. Τα ποντίκια διατηρήθηκαν με νερό και τυπική τροφή του ποντικιού

διαφήμισή αρεσκείας

που χρησιμοποιείται στα πρωτόκολλα εγκεκριμένα από την Επιτροπή των ζώων Σπουδών του Πανεπιστημίου. Τα ζώα εγχύθηκαν με 1 χ 10

6 Pan02 κύτταρα σε αριστερό και το δεξί πλευρό του και αφέθηκαν να σχηματίσουν ξενομοσχεύματα. Μία εβδομάδα μετά τη φύτευση των κυττάρων και μετά την παρατήρηση της παρουσίας ενός ψηλαφητών όγκων, κουρκουμίνη (200 μg /kg σωματικού βάρους) σε 5% Na

2 ΕΤ

3 μόνος ρυθμιστικό χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκώς καθημερινά επί 23 d. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε σε εβδομαδιαία βάση. Στο τέλος της θεραπείας τα ζώα θυσιάστηκαν, και οι όγκοι αφαιρέθηκαν, ζυγίστηκαν, και προετοιμάστηκαν για χρήση σε ιστολογία (αιματοξυλίνη & amp? Ηωσίνη, COX-2, VEGF, και CD31) και μελέτες γονιδιακής έκφρασης

. Η ανοσοκυτταροχημεία και ανοσοϊστοχημεία

τα κύτταρα απλώθηκαν σε σε καλυπτρίδα και αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με 10% ρυθμισμένη φορμαλίνη για 10 λεπτά και στη συνέχεια πλένονται με PBS. Τα κύτταρα στη συνέχεια κατέστησαν διαπερατά με PBS που περιείχε 0,5% Triton Χ-100 για 10 λεπτά. Οι καλυπτρίδες επωάστηκαν με αντι-κυκλίνη Β1 κουνελιού (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA) και κουνελιού αντι-Cdc2 αντισώματα (Abcam Inc, Cambridge, ΜΑ), που ακολουθείται από βιοτινυλιωμένο IgG αντι-κουνελιού. Οι πλάκες περαιτέρω επεξεργασία χρησιμοποιώντας κιτ ABC Vectastatin (Vector Laboratories, Burlingame, CA) ακολουθούμενη από χρώση DAB.

Οι ιστοί εγκλείστηκαν σε παραφίνη κόπηκαν σε ένα τμήμα 4 μΜ, αποπαραφινοποιήθηκαν και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διάλυμα κιτρικού οξέος. Στη συνέχεια μπλοκαρίστηκαν με αβιδίνη /βιοτίνη για 20 λεπτά. Τα πλακίδια επωάστηκαν με αντι-COX-2 ή τον VEGF ή CD31 ή HuR ή CUGBP2 ή ΤΙΑ-1 ή Κυκλίνη D1 για όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Επόμενη τα πλακίδια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το δευτερογενές αντίσωμα όπως ΗΡνΡ- κατσίκας αντι-κουνελιού για επακόλουθη COX-2, VEGF, HuR, CUGBP2, ΤΙΑ-1, και χρώση Κυκλίνη D1. Για CD31staining κατσίκας αντι-αρουραίου HRP χρησιμοποιήθηκε. Κάθε δευτερεύον αντίσωμα επωάστηκε για μία ώρα και στη συνέχεια αναπτύχθηκαν με DAB (Sigma Aldrich). Τέλος, τα πλακίδια με αιματοξυλίνη.

Στατιστική ανάλυση

Όλες οι τιμές εκφράζονται ως μέσος όρος ± SEM. Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μη ζευγαρωμένο 2-tailed t test. Ένα

P

τιμή μικρότερη του 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

Η κουρκουμίνη αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου των ξενομοσχευμάτων όγκου Pan02 και την αγγειογένεση

Για να ξεκινήσετε την αξιολόγηση ο ρόλος της κουρκουμίνης επί του πολλαπλασιασμού του όγκου

in vivo

, εξετάσαμε την ικανότητα της κουρκουμίνης να καταστέλλει την ανάπτυξη των ξενομοσχευμάτων παγκρεατικού καρκίνου κύτταρο ποντικού σε γυμνούς ποντικούς. Ο καρκίνος του παγκρέατος κυττάρων που προκαλείται ξενομοσχεύματος όγκοι αφέθηκαν να αναπτυχθούν και να αυξηθούν σε μέγεθος 200 mm

3, μετά την οποία η κουρκουμίνη χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκά για τρεις εβδομάδες καθημερινά. Η κουρκουμίνη ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη των ξενομοσχευμάτων όγκου (Σχ. 1Α). Οι αποκόπηκε όγκους από ζώα ελέγχου κυμαινόταν από 700 έως 800 mg, ενώ εκείνοι που έλαβαν θεραπεία με κουρκουμίνη ζύγιζαν λιγότερο από 400 mg (Εικ. 1Β). Επιπλέον, ο όγκος του όγκου ήταν σημαντικά μειωμένη (Εικ. 1Α). Δεν υπήρξε καμία εμφανής μεταβολή στο βάρος του ήπατος, το βάρος της σπλήνας, ή το σωματικό βάρος των ζώων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η κουρκουμίνη είναι ένας ισχυρός θεραπευτικός παράγοντας για την θεραπεία καρκίνων του παγκρέατος και είναι σχετικά μη-τοξικό για τους ποντικούς. Προσδιορίσαμε επίσης την επίδραση της κουρκουμίνης επί αγγείωσης του όγκου με χρώση για την ενδοθηλιακά ειδικά CD31 αντιγόνο. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1 C, θεραπεία κουρκουμίνη μείωσε σημαντικά χρώση CD31 και σβηστεί τα καρκινικά αγγεία υποδηλώνοντας μειώθηκε αγγειογένεση. Υπολογίσαμε επίσης την μικροαγγειακή πυκνότητα και διαπίστωσε ότι είναι μειώθηκαν σημαντικά μετά τη θεραπεία κουρκουμίνη (Εικ. 1D).

(Α) Γυμνοί ποντικοί που φέρουν Pan02 ξενομοσχεύματα καρκινικών κυττάρων στα πλευρά χορηγήθηκαν κουρκουμίνη ενδοπεριτοναϊκά για 3 εβδομάδες. Υπήρξε μια σημαντική μείωση στο μέγεθος του όγκου από ζώα που κουρκουμίνη αγωγή σε σύγκριση με χωρίς θεραπεία ελέγχους (* ρ & lt? 0,05). (Β) θεραπεία κουρκουμίνη είχε ως αποτέλεσμα σημαντικά χαμηλότερο βάρος του όγκου σε σύγκριση με τους ελέγχους (* ρ & lt? 0,05). (Γ) τμήματα των όγκων χρωματίστηκαν για CD31, ένα ειδικό ενδοθηλιακού κυττάρου δείκτη επιφάνειας και με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε). Μια αντιπροσωπευτική εικόνα παρουσιάζεται παρουσιάζει σημαντική μείωση σε μικροαγγεία. (D) Ο αριθμός των μικροαγγείων σε ιστούς όγκων μετρήθηκαν σε 12 πεδία υψηλής ισχύος και ο μέσος όρος. Τα στοιχεία δείχνουν ότι η μικροαγγειακή πυκνότητα ήταν σημαντικά μειωμένη στα ξενομοσχεύματα ζώων που έλαβαν θεραπεία κουρκουμίνη (* p & lt? 0,05)

Η

Η κουρκουμίνη αναστέλλει τον καρκίνο του παγκρέατος κυτταρική ανάπτυξη

Για τον προσδιορισμό του μηχανισμού της curcumin-. μεσολαβεί διακοπή της ανάπτυξης, μελετήσαμε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα

in vitro

. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήσαμε πέντε διαφορετικές καλλιεργημένες κυτταρικές γραμμές MiaPaCa-2, Panc-1, AsPC-1, BxPC-3 και Pan02. Η κουρκουμίνη κατέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των παγκρεατικών καρκινικών κυτταρικών γραμμών MiaPaCa-2, Pan02, AsPC-1, BxPC-3 και Panc-1 σε μια δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο. Αυτό το αποτέλεσμα αντι-πολλαπλασιασμού επί κυττάρων όγκου παρατηρήθηκε σε διάστημα 24 h, η οποία συνέχισαν να αυξάνουν σημαντικά κατά την επόμενη 72 ώρες (Εικ. 2Α). Για να προσδιοριστεί η μακροπρόθεσμη επίδραση της θεραπείας κουρκουμίνη, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 30 μΜ κουρκουμίνη για 24 ώρες, μετά το οποίο τα κύτταρα αφέθηκαν να αναπτυχθούν σε φυσιολογικά μέσα. θεραπεία κουρκουμίνη κατέστειλε το σχηματισμό αποικιών σε όλες τις παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές (Σχ. 2Β), γεγονός που υποδηλώνει ότι η κουρκουμίνη επιδράσεις επί των κυττάρων του όγκου ήταν μη αναστρέψιμη. Η κυκλίνη D1 είναι μία ρυθμιστική πρωτεΐνη του κυτταρικού κύκλου που ρυθμίζει την G1 στην μετάβαση στη φάση S του κυτταρικού κύκλου και λειτουργεί ως συμπαράγοντας για διάφορους μεταγραφικούς παράγοντες [33]. Η κυκλίνη D1 υπερέκφραση έχει συνδεθεί με την ανάπτυξη και την εξέλιξη του καρκίνου [34]. Σε αμφότερες κύτταρα MiaPaCa-2 και Pan02, θεραπεία κουρκουμίνη οδήγησε σε μειωμένη έκφραση D1 κυκλίνης στις 24 ώρες (Σχ. 2C, D). Επιπλέον, η κυκλίνη Α2, η οποία ρυθμίζει την εξέλιξη του S /G2, ήταν μειωτικά δυνητικά επιβράδυνση της εξέλιξης των κυττάρων εκτός φάσης S (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα).

(Α) Η κουρκουμίνη αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων. MiaPaCa-2, Pan02, AsPC-1 και BxPC-3 κύτταρα επωάστηκαν με κουρκουμίνη (1-50 μΜ) για μέχρι 72 ώρες. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων αναλύθηκε χρησιμοποιώντας εξοζαμινιδάσης ενζυμικής δραστικότητας. θεραπεία κουρκουμίνη είχε ως αποτέλεσμα μια σημαντική δόση-και χρονο-εξαρτώμενη μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε όλα τα κύτταρα σε σύγκριση με μη κατεργασμένους μάρτυρες. (Β) Η κουρκουμίνη αναστέλλει το σχηματισμό αποικιών. MiaPaCa-2 και Pan02 κύτταρα επωάστηκαν με 30 μΜ της κουρκουμίνης για 24 ώρες και οι αποικίες αφέθηκαν να σχηματίσουν με επώαση σε τακτική μέσα που περιέχουν 10% FBS για επιπλέον 10 d. Η θεραπεία με το σχηματισμό ανέστειλε αποικία κουρκουμίνη. Ένα αντιπροσωπευτικό τριών ανεξάρτητων πειραμάτων παρουσιάζεται. (Γ) έκφραση της κυκλίνης D1 καταστέλλεται σε 24 ώρες. RNA από MiaPaCa-2 και Pan02 κύτταρα επωάζονται με 30 μΜ κουρκουμίνη υποβλήθηκαν σε πραγματικό χρόνο PCR για κυκλίνης D1 έκφραση mRNA. Υπήρξε σημαντική καταστολή του mRNA στις 24 ώρες, αλλά όχι στις 12 ώρες (* ρ & lt? 0,05). (D) Κυτταρολύματα από MiaPaCa-2 ή Pan02 επωάστηκαν με 30 μΜ κουρκουμίνη αναλύθηκαν με κηλίδωση Western για τα επίπεδα έκφρασης κυκλίνης D1. θεραπεία κουρκουμίνη αναστέλλει κυκλίνης D1 mRNA και της πρωτεΐνης έκφρασης.

Η

Η κουρκουμίνη προκαλεί G2-M του κυτταρικού κύκλου σύλληψης πριν από μιτωτική καταστροφή

επόμενο καθοριστεί αν η κουρκουμίνη επηρεάζει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και την συνέπεια του γεγονότος αυτού αποτέλεσμα. που προκαλείται κουρκουμίνη ανάπτυξη σύλληψη του MiaPaCa-2 μέσα σε 24 ώρες στο G

στάδιο 2Μ (Εικ. 3Α). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε Panc-1 και Pan02 κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η κουρκουμίνη είναι γνωστό ότι επάγουν απόπτωση σε ποικιλία καρκινικών κυττάρων. Κασπάση-3 και 7 είναι βασικά μόρια τελεστές που είναι γνωστό ότι επάγουν απόπτωση σε ποικιλία καρκινικών κυττάρων με την ενίσχυση του σήματος από κασπάσες έναρξης, όπως κασπάση 8 ή κασπάση 10 [35], [36]. Capsase 3 και 7 αυξήθηκαν μέσα σε 24 ώρες στα κύτταρα MiaPaCa-2 γραμμών που έλαβαν θεραπεία με κουρκουμίνη που υποδηλώνει την επαγωγή απόπτωσης (Σχ. 3Β). αναλύσεις Western blot MiaPaCa-2 και τα προϊόντα λύσης κυττάρου Pan02 έδειξαν σημαντική αύξηση στην ενεργοποιημένη κασπάση-3 σε κύτταρα κατεργασμένα κουρκουμίνη (Σχ. 3Β ένθετο). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι τα κύτταρα του όγκου αγωγή κουρκουμίνη υπέστησαν απόπτωση. Για να προσδιοριστεί εάν μια σύλληψη στη φάση G2 ή την έλλειψη προόδου σε μίτωση συμβάλλει στο υψηλότερο επίπεδο των κυττάρων δει σε G

φάσης 2Μ, αξιολογήσαμε την έκφραση, και τον εντοπισμό της κυκλίνης Β1 και τη σερίνη /thereonine κινάση CDC- 2. Κυκλίνης Β1 /σύμπλοκο CDC-2 παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην G

2Μ μετάπτωσης φάσης του κυτταρικού κύκλου. Για την επαγωγή της μίτωσης, η κυκλίνη Β1 και CDC-2 ετεροδιμερή και εντοπίζονται στον πυρήνα, η οποία με τη σειρά της ενεργοποιεί τα ένζυμα που ρυθμίζει τη συμπύκνωση της χρωματίνης, διάσπαση της πυρηνικής μεμβράνης και μίτωση ειδική αναδιοργάνωση μικροσωληνίσκων [37], [27]. Η ανοσοκυτταροχημική ανάλυση έδειξε σημαντικά υψηλότερα πυρηνική επίπεδα τόσο κυκλίνης Β1 και CDC-2 σε κύτταρα επεξεργασμένα κουρκουμίνη υποδηλώνοντας ότι τα κύτταρα που κατεργάζονται κουρκουμίνη υποβάλλονταν μιτωτική καταστροφή (Σχ. 3C). Εκτός από αυτό, η ανάλυση στυπώματος western κατέδειξε αυξημένη έκφραση τόσο κυκλίνης Β1 και CDC-2 σε κύτταρα επεξεργασμένα κουρκουμίνη και φωσφορυλίωση Chk2 κινάσης στα δύο κύτταρα MiaPaCa-2 σε καλλιέργεια και τα Pan02 ξενομοσχεύματος όγκου ιστούς (Σχ. 3D). Δεδομένου ότι τα κύτταρα που υφίστανται απόπτωση κατά την ίδια στιγμή που ήταν σε G2-M σύλληψης, υποδηλώνει ότι η κουρκουμίνη επάγει τα κύτταρα να υποστούν μιτωτική καταστροφή.

προφίλ Α) κυτταρικού κύκλου των κυττάρων MiaPaCa-2 υποβάλλεται σε επεξεργασία με κουρκουμίνη για 12 ώρες και 24 ώρες και προσδιορίστηκαν με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας χρώση ιωδιούχου προπιδίου για την περιεκτικότητα σε DNA. θεραπεία κουρκουμίνη αυξήθηκε σημαντικά κυττάρων στην S και G

φάση 2Μ κυτταρικού κύκλου μέσα σε 12 ώρες. (Β) θεραπεία κουρκουμίνη προκαλεί απόπτωση. MiaPaCa-2 και Pan02 κύτταρα επωάζονται με 30 μΜ της κουρκουμίνης αναλύθηκαν για απόπτωση με κασπάσης 3/7 ενεργοποίησης. θεραπεία κουρκουμίνη αύξησε τον αριθμό των κυττάρων που υφίστανται απόπτωση σε σύγκριση με χωρίς θεραπεία ελέγχους (* ρ & lt? 0,05). (Ένθετο) Η κουρκουμίνη προκαλεί κασπάσης 3, η απόπτωση μεσολαβητής. Κυτταρολύματα από MiaPaCa-2 ή Pan02 κύτταρα επωάζονται με 30 μΜ κουρκουμίνη αναλύθηκαν με κηλίδωση Western για την πρωτεΐνη κασπάσης 3. Η κουρκουμίνη κατεργασμένα κύτταρα δείχνει διασπαστεί (ενεργοποιημένη) κασπάσης 3 ενώ τα μη επεξεργασμένα κύτταρα δεν έχουν διασπασμένης κασπάσης-3. (Γ) κατεργασία κουρκουμίνη αύξησε τα επίπεδα της κυκλίνης Β1, CDC-2 και φωσφορυλιωμένο οδοφράγματος Chk2 κινάση. Κυτταρολύματα από κουρκουμίνη επεξεργασμένα κύτταρα MiaPaCa-2 (αριστερά) και ξενομοσχεύματα Pan02 όγκου (δεξιά) αναλύθηκαν με κηλίδωση Western για φωσφο Chk2, και κυκλίνη Β1 και τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης CDC-2. θεραπεία κουρκουμίνη φωσφορυλιώνει οδοφράγματος κινάσες και αυξημένα επίπεδα της κυκλίνης Β1 και CDC-2 σε αμφότερα MiaPaCa-2 κύτταρα και ξενομοσχεύματα όγκων Pan02. αποτελέσματα (D) αγωγή κουρκουμίνη σε πυρηνικό εντοπισμό της κυκλίνης Β1 και CDC-2. Η ανοσοκυτταροχημεία της κουρκουμίνης σε επεξεργασία με MiaPaCa-2 κύτταρα τόσο η cyclinB1 και CDC-2 επίπεδα πρωτεΐνης ήταν κυρίως στον πυρήνα σε σύγκριση από τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. Η φωσφορυλίωση του Chk2, σε συνδυασμό με την αυξημένη έκφραση και πυρηνική μετατόπιση της κυκλίνης Β1 και CDC-2 καταδεικνύει μιτωτική πρόοδο των κυττάρων.

Η

Η κουρκουμίνη αναστέλλει την COX-2 και VEGF έκφραση, ενώ επάγει CUGBP2 και TIA-1

COX-2 παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση, συμπεριλαμβανομένης της αυξημένης διεισδυτικότητας, προαγωγή της αγγειογένεσης και της αντίστασης σε απόπτωση [38]. Ως εκ τούτου, προσδιορίζεται η έκφραση του σε ξενομοσχεύματα όγκου. Οι αναλύσεις πραγματικού χρόνου PCR κατέδειξε ότι η COX-2 mRNA έκφρασης ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε ξενομοσχεύματα όγκου αγωγή κουρκουμίνης σε σύγκριση με τους όγκους ελέγχου (Σχ. 4Α). Αυτό επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με στύπωμα western και ανοσοϊστοχημεία αναλύσεις, όπου παρατηρήθηκαν χαμηλότερα επίπεδα της πρωτεΐνης COX-2 στις κουρκουμίνη αγωγή ιστούς (Σχ. 4Β, C). Οι προσταγλανδίνες και οι άλλοι υποκινητές όγκων είναι γνωστό ότι επάγουν την έκφραση του VEGF σε επιθηλιακά κύτταρα η οποία προάγει την αγγειογένεση και έτσι την ανάπτυξη του όγκου [39]. VEGF mRNA και η έκφραση πρωτεΐνης αναλύθηκε και βρέθηκε επίσης να είναι σημαντικά χαμηλότερη σε ξενομοσχεύματα όγκου αγωγή κουρκουμίνης σε σύγκριση με τους όγκους ελέγχου (Σχ. 4Α, Β). Ανοσοϊστοχημεία έδειξαν επίσης ότι η θεραπεία με κουρκουμίνη μείωσε σημαντικά τη χρώση VEGF σε σύγκριση με τον έλεγχο του όγκου (Σχ. 4C). Η κυκλίνη D1 είναι μία ρυθμιστική πρωτεΐνη του κυτταρικού κύκλου που ρυθμίζει την G1 στην μετάβαση στη φάση S και λειτουργεί ως συμπαράγοντας για διάφορους μεταγραφικούς παράγοντες [40]. Η κυκλίνη D1 υπερέκφραση έχει επίσης συνδεθεί με την ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου [34]. θεραπεία κουρκουμίνη έκφραση D1 αναστέλλεται κυκλίνης στα ξενομοσχεύματα όγκου υποδηλώνει ότι αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων (Σχ. 4Α, Β). Ένας αριθμός πρωτεϊνών RNA πρόσδεσης έχουν ταυτοποιηθεί να αναγνωρίζουν ARE που περιέχουν αλληλουχίες και να ρυθμίζουν τη σταθερότητα του mRNA. Τα μέλη της CELF (CUGBP2) και elav (HuR) οικογένεια πρωτεϊνών σύνδεσης RNA που εμπλέκονται σε διάφορες κυτταρικές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένων mRNA μάτισμα, την επεξεργασία, τη σταθερότητα και τη μετάφραση [23], [41]. Έχουμε αποδείξει στο παρελθόν ότι CUGBP2 επάγεται σε κύτταρα που υφίστανται απόπτωση και λειτουργίες για την αναστολή της COX-2 mRNA μετάφραση [28], [42]. T-σε κύτταρα περιορίζονται ενδοκυτταρικό αντιγόνο-1 (ΤΙΑ-1) είναι επίσης ένας πρωτεΐνη σύνδεσης RNA που λειτουργεί ως μεταφραστικό καταστολέα, ιδιαίτερα κάτω από συνθήκες στρες [43]. Εδώ παρατηρήσαμε ότι η θεραπεία κουρκουμίνη οδήγησε σε σημαντική αύξηση τόσο CUGBP2 και TIA-1 mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης σε ξενομοσχεύματα όγκου (Σχ. 4Α, Β, D). Από την άλλη πλευρά, δεν υπήρξε σημαντική μεταβολή παρατηρήθηκε και στα δύο επίπεδα HuR mRNA και της πρωτεΐνης σε απόκριση σε κουρκουμίνη (Εικ. 3Α, Β, D).

(Α) Ολικό RNA από ξενομοσχεύματα όγκου Pan02 υποβλήθηκαν σε πραγματικού χρόνου PCR. θεραπεία κουρκουμίνη οδήγησε σε μείωση του COX-2, VEGF και κυκλίνης D1 επίπεδα mRNA σε σύγκριση με τους ελέγχους. Από την άλλη πλευρά, CUGBP2 και mRNA έκφραση TIA-1 αυξήθηκε (* ρ & lt? 0,05). Τα δεδομένα είναι ο μέσος όρος από ξενομοσχεύματα σε 5 ποντικούς. (Β) Ανάλυση στυπώματος Western έδειξαν ότι προϊόντα λύσης ιστού από τα ζώα που υπέστησαν αγωγή κουρκουμίνη έχουν σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα των COX-2, VEGF, και πρωτεΐνες κυκλίνης D1 αλλά αυξημένα επίπεδα CUGBP2 και πρωτεϊνών TIA-1. (Γ) Η ανοσοϊστοχημεία επιδεικνύει ότι η θεραπεία κουρκουμίνη μείωσε σημαντικά την έκφραση της COX-2 και VEGF. (Δ) Ανοσοϊστοχημεία δείχνει αυξημένη έκφραση του CUGBP2 και ΤΙΑ-1 σε ξενομοσχεύματα όγκου.

Η

Η κουρκουμίνη αναστέλλει την COX-2 και VEGF mRNA μετάφραση σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα

Προηγούμενες μελέτες έχουν καταδείξει αυξημένα επίπεδα COX-2 mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης σε παγκρεατικά αδενοκαρκινώματα [38]. Ως εκ τούτου, προσδιορίζεται αμέσως μετά τα αποτελέσματα της αγωγής επί της έκφρασης κουρκουμίνη COX-2. θεραπεία κουρκουμίνη αύξησε σημαντικά τα επίπεδα COX-2 mRNA σε MiaPaCa-2 κύτταρα (Σχ. 5Α). Ωστόσο, υπήρξε μια σημαντική μείωση των επιπέδων της πρωτεΐνης COX-2 (Σχ. 5Β). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε κύτταρα Pan02 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Προσδιορίσαμε επίσης την επίδραση της κουρκουμίνης στη γονιδιακή έκφραση του VEGF στα κύτταρα. θεραπεία κουρκουμίνη αύξησε σημαντικά VEGF mRNA ενώ αναστέλλει τα επίπεδα πρωτεΐνης σε MiaPaCa-2 κύτταρα (Σχ. 5Α, Β). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε κύτταρα Pan02 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Από την άλλη πλευρά, η κουρκουμίνη αύξησε σημαντικά τόσο την έκφραση CUGBP2 και TIA-1 mRNA και της πρωτεΐνης (σχ. 5Α, Β). Ωστόσο, δεν υπήρξε καμία σημαντική αλλαγή που παρατηρήθηκε με έκφραση HuR (Εικ. 5Α, Β). Σε προηγούμενες μελέτες, έχουμε αποδείξει ότι CUGBP2 προσδένεται σε COX-2 3’UTR να αναστέλλουν μετάφραση του [28]. Δεδομένου ότι τα επίπεδα COX-2 mRNA είναι υψηλότερα, αλλά τα επίπεδα της πρωτεΐνης είναι χαμηλότερα σε απόκριση σε θεραπεία κουρκουμίνη, προσδιορίσαμε αν η κουρκουμίνη αυξάνει την πρόσδεση του CUGBP2 να COX-2 mRNA. Ανοσοκαταβύθιση συζευγμένο RT-PCR έδειξε ότι υπήρχε ένα υψηλότερο επίπεδο CUGBP2 σύνδεσης προς COX-2 και VEGF mRNA όταν συγκρίθηκαν με τον έλεγχο, τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχ. 5C). Επιπλέον, ακτινομυκίνη D πειράματα έδειξαν ότι η θεραπεία κουρκουμίνη οδήγησε σε σημαντικά υψηλότερα επίπεδα COX-2 mRNA σταθερότητα, η ημιζωή αυξάνεται από 30 λεπτά στα μη επεξεργασμένα κύτταρα να ~ 8 h (Σχ. 5D). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν με τον VEGF? η ημιζωή του VEGF mRNA αυξήθηκε επίσης από 30 λεπτά έως & gt? (Εικ. 5D). 8 h σε κύτταρα κατεργασμένα κουρκουμίνη

mRNA έκφραση

(Α). κύτταρα MiaPaCa-2 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με κουρκουμίνη για 2 ώρες. θεραπεία κουρκουμίνη αύξησε τα επίπεδα της COX-2, VEGF, CUGBP2 και TIA-1 mRNA. Δεν υπήρχε σημαντική μεταβολή της έκφρασης HuR mRNA (* ρ & lt? 0,05). Τα δεδομένα από τρία ανεξάρτητα πειράματα. (Β) κηλίδος Western αναλύσεις καταδεικνύουν ότι προϊόντα λύσης με κουρκουμίνη κατεργασμένων κυττάρων MiaPaCa-2 έχουν χαμηλότερα επίπεδα της COX-2 και πρωτεΐνες VEGF και αυξανόμενα επίπεδα CUGBP2 και TIA-1. Εκπρόσωπος των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (C) (αριστερό πάνελ), αυξημένη πρόσδεση της πρόσδεσης CUGBP2 να COX-2 ή VEGF mRNA μετά από αγωγή κουρκουμίνης. εκχύλισμα ολόκληρου κυττάρου (Τ) από κύτταρα κατεργασμένα με κουρκουμίνη ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-CUGBP2 αντίσωμα, και RNA από τα ανοσοϊζήματα (Ρ) και υπερκείμενο (S) απομονώθηκαν και υποβλήθηκαν σε RT-PCR για την COX-2 και VEGF mRNA. Δεδομένα επιδεικνύουν αυξημένη COX-2 ή VEGF mRNA στη σφαιρίδιο κυττάρων κουρκουμίνης φάρμακο. (Δεξί πάνελ) Τα δεδομένα ποσοτικοποιούνται και υπήρχε σαφής αύξηση στην COX-2 και VEGF mRNA στο σφαιρίδιο κυττάρων αγωγή κουρκουμίνης. (D) κύτταρα MiaPaCa-2 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με κουρκουμίνη για 2 ώρες και στη σταθερότητα της COX-2 και VEGF mRNA προσδιορίστηκαν ακόλουθη προσθήκη ακτινομυκίνης D (τελική συγκέντρωση: 10 μg /ml). Η κουρκουμίνη αυξάνει την ημιζωή του COX-2 mRNA από 30 λεπτά έως 8 ώρες. Ομοίως, η κουρκουμίνη αύξησε την ημιζωή του VEGF mRNA από 30 λεπτά έως 8 ώρες. Δεδομένων καταδεικνύει τη θεραπεία κουρκουμίνη σημαντικά αυξημένη σταθερότητα της COX-2 ή VEGF mRNA.

Η

Η κουρκουμίνη μεσολάβηση της COX-2 και VEGF mRNA σταθερότητα απαιτεί CUGBP2

Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι η δέσμευση CUGBP2 να COX -2 3’UTR αυξάνει τη σταθερότητα του COX-2 mRNA, ενώ αναστέλλει τη μετάφραση του [28]. Ως εκ τούτου, προσδιορίστηκε η επίδραση της CUGBP2 knockdown σε κουρκουμίνη μεσολάβηση καταστολή μετάφραση του COX-2 και VEGF mRNA. Πραγματικές μετρήσεις Time PCR έδειξαν ότι η θεραπεία κουρκουμίνη οδήγησε σε σημαντικά υψηλότερα επίπεδα COX-2 και VEGF mRNA, το οποίο μειώθηκε σε επίπεδα ελέγχου όταν η έκφραση CUGBP2 ήταν knockdown (Σχ. 6Α). Είμαστε δίπλα καθοριστεί εάν υπήρχαν επιπτώσεις στην έκφραση της πρωτεΐνης. θεραπεία κουρκουμίνη μείωσε σημαντικά τα επίπεδα τόσο COX-2 και VEGF πρωτεΐνης. Ωστόσο, όταν CUGBP2 χτυπήθηκε κάτω με ένα ειδικό siRNA, COX-2 και οι πρωτεΐνες VEGF επίπεδα δεν είχαν επηρεαστεί από τη θεραπεία κουρκουμίνη (Εικ. 6Β). Μπορούμε επίσης προσδιοριστεί εάν οι κουρκουμίνη μεσολάβηση αποτελέσματα επί της COX-2 και VEGF mRNA σταθερότητα επηρεάζεται από CUGBP2 knockdown. Ενώ η κουρκουμίνη θεραπεία αύξησε τη σταθερότητα της COX-2 και VEGF mRNA, υπήρχε μια μικρότερη επίδραση όταν CUGBP2 επίσης χτυπήθηκε κάτω χρησιμοποιώντας ειδικά siRNA. Ο χρόνος ημίσειας ζωής του COX-2 mRNA αυξήθηκε από 30 λεπτά έως ~ 8 ώρες μετά τη θεραπεία κουρκουμίνη, η οποία μειώθηκε σε ~ 2 h, όταν η έκφραση CUGBP2 ανεστάλη (Εικ. 6C). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν για VEGF όπου knockdown του CUGBP2 μείωσε την κουρκουμίνη μεσολάβηση σταθερότητα από 8 ώρες έως 1 ώρα (Εικ. 6C). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η κουρκουμίνη μεσολάβηση αύξηση στη σταθερότητα της COX-2 και VEGF mRNA συμβαίνει εν μέρει μέσω CUGBP2.

(Α) CUGBP2 είναι απαραίτητη για κουρκουμίνη επαγόμενη COX-2 και VEGF mRNA επίπεδα.