έχουν

Αφηρημένο

Ιστορικό

Ρυθμιστικές Τ κύτταρα (Treg) που εκφράζει τον παράγοντα μεταγραφής πρωτεΐνης forkhead-box Ρ3 (Foxp3) έχουν ταυτοποιηθεί για την αντιμετώπιση αντικαρκινικές ανοσολογικές αντιδράσεις κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του όγκου. Εκτός αυτού, παρουσίαση Foxp3 από τα καρκινικά κύτταρα μόνη της μπορεί επίσης να τους επιτρέψει να αποφύγει από τελεστή αποκρίσεις Τ-κυττάρων, με αποτέλεσμα ένα όφελος επιβίωσης του όγκου. Για τον ορθοκολικό καρκίνο (CRC) η κλινική σημασία των Foxp3 δεν έχει αξιολογηθεί λεπτομερώς. Ως εκ τούτου, ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να μελετήσει τις επιπτώσεις της σε καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC).

Μέθοδοι και Ευρήματα

Gene και ανάλυση πρωτεϊνών των καρκινικών ιστών από ασθενείς με CRC πραγματοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση της έκφρασης του Foxp3 σε διηθούν όγκο Treg και καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. Τα αποτελέσματα συσχετίστηκαν με κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους και τους ασθενείς η συνολική επιβίωση. Serial μορφολογική ανάλυση κατέδειξε Foxp3 να εκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα. Υψηλή Foxp3 έκφραση των καρκινικών κυττάρων συνδέθηκε με κακή πρόγνωση σε σύγκριση με τους ασθενείς με χαμηλή έκφραση Foxp3. Σε αντίθεση, χαμηλό και υψηλό επίπεδο Foxp3 στο διηθούν όγκο κύτταρα Treg δεν έδειξαν σημαντικές διαφορές στη συνολική επιβίωση των ασθενών.

Συμπεράσματα

Τα ευρήματά μας υποδεικνύουν έντονα ότι η έκφραση Foxp3 που προκαλείται από τα καρκινικά κύτταρα και όχι από Treg κύτταρα συμβάλλουν στην εξέλιξη της νόσου

Παράθεση:. Kim M, Grimmig T, Grimm M, Lazariotou Μ, Meier Ε, Rosenwald A, et al. (2013) Έκφραση του Foxp3 στον Καρκίνο του παχέος εντέρου, αλλά όχι σε Treg κύτταρα συσχετίζεται με την εξέλιξη της νόσου σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 8 (1): e53630. doi: 10.1371 /journal.pone.0053630

Επιμέλεια: Jun Li, η Sun Yat-sen University Medical School, Κίνα

Ελήφθη: 7 Νοεμβρίου 2011? Αποδεκτές: 3 Δεκ 2012? Δημοσιεύθηκε: 30, Ιαν 2013

Copyright: © 2013 Kim et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο προσδιορισμός των CD4 + CD25 ρυθμιστικών κυττάρων Τ + ( Treg) έχει δειχθεί ότι παίζουν κρίσιμο ρόλο στη διατήρηση της ανοσολογικής ανοχής. Ο παράγοντας μεταγραφής πρωτεΐνη κουτί forkhead Ρ3 (Foxp3) έχει αναγνωριστεί ως βασικός παράγοντας στην λειτουργία Treg και αποτελεί υποχρεωτικό δείκτης των CD4 + CD25 + Treg [1]. Ορισμένες υποκατηγορίες Treg ασκούν κατασταλτική επιρροή τους μέσω της έκφρασης του ανοσοκατασταλτικού κυτοκινών, όπως η ιντερλευκίνη (IL) -10 και αυξητικό παράγοντα μετασχηματισμού (TGF) -β [2], [3]. Μία υψηλή πυκνότητα που διηθούν όγκο Foxp3 + Treg σε δείγμα όγκου έχει συσχετιστεί με κακή έκβαση σε διάφορους συμπαγείς όγκους, συμπεριλαμβανομένων των ωοθηκών [4], παγκρεατικό [5], και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [6]. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ένα κρίσιμο ρόλο για Treg σε διαφορετικές οντότητες του όγκου. Έτσι στόχευση Treg μπορεί να έχει σημαντικό αντίκτυπο στις ανοσοθεραπευτικές στρατηγικές για την καταπολέμηση του καρκίνου και την κλινική έκβαση των ασθενών με καρκίνο [7].

Treg είναι ύποπτοι για τη μείωση της δραστηριότητας των κυττάρων Τ, αλλά δεν είναι γνωστό εάν η παρουσία του Treg μπορεί έχουν αντίκτυπο στην κλινική πορεία και στις σχετικές όγκου επιβίωση των ασθενών με CRC. Η προγνωστική σημασία της ανίχνευσης Treg στους ασθενείς με περιορισμένες και προχωρημένη νόσο παραμένει αμφιλεγόμενη. Μέχρι σήμερα, λίγες μελέτες έχουν αναλύσει διεισδύοντας Treg στο CRC χρησιμοποιώντας χρώση Foxp3 +. Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι Treg πυκνότητα ήταν υψηλότερη σε τοπικά περιορισμένη από ό, τι σε μεταστατική νόσο, αλλά δεν συσχετίστηκε με την επιβίωση των ασθενών CRC [8]. Σε αντίθεση με τα ευρήματα που παρατηρούνται στα περισσότερα άλλα ανθρώπινα καρκινώματα, καμία σημαντική σχέση μεταξύ του απόλυτου αριθμού Foxp3 + διηθητικά κύτταρα Τ και πρόγνωση παρατηρήθηκε σε αρκετές μελέτες με ασθενείς CRC. Επιπλέον, ορισμένες άλλες μελέτες υποδεικνύουν ότι η υψηλή συχνότητα των όγκων που διηθούν Foxp3 + Treg σχετίζεται με ευνοϊκή πρόγνωση σε CRC [9].

Πιο πρόσφατα κλινικά δεδομένα από πνεύμονα [10], του μαστού [11], [12] , παγκρεατικό [13], ηπατοκυτταρικό [14], και του καρκίνου της ουροδόχου κύστης [15], καθώς και μελάνωμα [16] που προβλέπονται πρώτα στοιχεία για μια έκφραση Foxp3 επίσης σε κύτταρα όγκου. Ωστόσο, η βιολογική σημασία της έκφρασης Foxp3 σε καρκινικά κύτταρα των ασθενών με CRC παραμένει άγνωστη. Ειδικότερα, η συνεισφορά της έκφρασης Foxp3 που σχετίζονται με τα καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με την έκφραση που σχετίζονται με Treg στην κλινική CRC δεν έχει αξιολογηθεί μέχρι στιγμής. Ως εκ τούτου, ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να αξιολογήσει έκφραση Foxp3 μεταξύ διηθούν όγκο Treg και καρκινικών κυττάρων σε ασθενείς με CRC σε διαφορετικά στάδια της νόσου, καθώς και για τη διάκριση προγνωστική σημασία της για την μακροπρόθεσμη.

Αποτελέσματα

Ανίχνευση των CD4, CD25, Foxp3 και ανοσοκατασταλτικές κυτταροκίνες IL-10 και γονιδίων ΤΟΡ-β με RT-qPCR και ανοσοϊστοχημική ανάλυση

Για να αναλυθεί το κατά πόσον CD4, CD25, Foxp3, IL-10, και η έκφραση του ΤΟΡ-β σε CRC μπορεί να σχετίζεται με την εξέλιξη του όγκου των κλινικών ερευνήσαμε όγκων περιορισμένης νόσου (UICC Ι /ΙΙ) και προχωρημένη νόσο (UICC III /IV). ανάλυση RT-qPCR έδειξαν σημαντικά αυξημένη γονιδιακή έκφραση των CD4 και CD25 σε περιορισμένες όγκους ασθένεια (UICC Ι /ΙΙ) σε σύγκριση με τους όγκους του προχωρημένη νόσο (UICC III /IV). Σύμφωνα προς αυτό το εύρημα, η γονιδιακή έκφραση του Foxp3 και ανοσοκατασταλτικών κυτοκινών IL-10 και ΤΟΡ-β ήταν σημαντικά μειωμένη σε περιορισμένες ασθένεια όγκους (UICC Ι /ΙΙ) σε σύγκριση με εκείνα του προχωρημένη νόσο (UICC III /IV) (

Σχήμα

1Α

).

(Α) σημαντικά αυξημένη γονιδιακή έκφραση των CD4 και CD25 στο στάδιο UICC I /II σε σχέση με τους όγκους στο στάδιο της UICC III /IV. Γονιδιακή έκφραση του Foxp3, IL-10, και ΤΟΡ-β ήταν σημαντικά μειωμένη στο στάδιο I /II σε σύγκριση με εκείνους στο UICC III /IV. Η ομαλοποίηση εκτελέστηκε με φυσιολογικό ιστό. Η σχετική αξία ποσοτικοποίηση, πλάσια διαφορά, εκφράζεται ως 2

-ΔΔCt. * P R

2, συντελεστής προσδιορισμού. (C /D) Αντιπροσωπευτικό παράδειγμα ανοσοφθορισμού διπλή χρώση του IL-10 + (C) και ΤΟΡ-β + (D) σε Foxp3 + καρκινικά κύτταρα (βέλη). FITC πράσινο φθορεσκεϊνισοθειοκυανικό, Cy3 και ϋΑΡΙ κόκκινο 4 ‘, 6-διαμιδινο-2- phenylindoldihydrochlorid μπλε -. Πυρηνική αντιχρωματισμός

Η

διπλή χρώση ανοσοφθορισμού έδειξε ότι η έκφραση των ανοσοκατασταλτικών κυτοκινών IL-10 και ΤΟΡ-β σε Foxp3 + εκφράζουν τα καρκινικά κύτταρα (βέλη) (

Εικόνα

5C και D

).

Συσχέτιση των Foxp3 + Treg με Foxp3 + καρκινικά κύτταρα

Για να εξεταστεί αν Foxp3 + έκφραση Treg αντιστοιχούσε με την έκφραση των καρκινικών κυττάρων Foxp3 +, μπορούμε στρωματοποιημένη δύο διαφορετικές ομάδες, ανάλογα με τα ποσοστά έκφρασης των ανοσοϊστοχημική ανάλυση. Λαμβάνοντας υπόψη την έκφραση των καρκινικών κυττάρων Foxp3 + ως συνεχή μεταβλητή, η ανάλυση παλινδρόμησης έδειξε ότι η έκφραση των καρκινικών κυττάρων Foxp3 + είχε ένα ασθενές αλλά σημαντική αντίστροφη συσχέτιση με την έκφραση Foxp3 + Treg (R

2 = 0.17, ρ = 0.01, η = 65? R = -0.41) (

Εικόνα

6Α

). Ανοσοϊστοχημείας έδειξαν αυξημένη έκφραση Foxp3 + Treg στο Foxp3 αρνητική καρκινικό ιστό στρωματικά (βέλος) (

Εικόνα

6Β

). Αντίθετα, δεν υπήρχε καμία ή αμελητέα έκφραση Foxp3 + Treg βρέθηκαν σε Foxp3 θετικό καρκίνο του ιστού (βέλος) (

Εικόνα

6C

).

(Α) Σημαντική αντίστροφη συσχέτιση της έκφραση κυττάρου Foxp3 + καρκίνο με την έκφραση Foxp3 Treg. Ανάλυση παλινδρόμησης; R

2, συντελεστής προσδιορισμού. (Β) Αύξηση του αριθμού των Foxp3 + Treg στο Foxp3 αρνητική καρκινικό ιστό (βέλος). (Γ) Μόνο περιστασιακά ή καθόλου Foxp3 + Treg στο Foxp3 θετικό καρκινικό ιστό (βέλος). DAB καφέ χρώμα, Haemalaun μπλε χρώμα – πυρηνική αντιχρωματισμός. Αντιπροσωπευτικό παράδειγμα καταδεικνύει περιοχή του μεγεθύνσεις x100 (αριστερά) και x200 (δεξιά).

Η

Η συνολική επιβίωση

ανάλυση παλινδρόμησης πολυπαραγοντική Cox έγινε κατά στάδια όπως η ηλικία, το φύλο, πρωτοπαθούς όγκου (παχέος εντέρου ή του ορθού), UICC (I /II ή III /IV), το βάθος της εισβολής των όγκων (κατηγορία Τ 1/2 ή 3/4), διαφοροποίηση (1/2 ή 3/4), λεμφαδένα μετάσταση (κατηγορία N), Foxp3 (%), Treg (%), ΤΟΡ-β (%), και IL-10 (%). Η σταδιακή διαδικασία τηρείται στο μοντέλο της κατηγορίας Ν και η έκφραση Foxp3 στο παχύ έντερο καρκινικά κύτταρα ως προγνωστικοί παραμέτρους (στατιστικά στοιχεία Chi-τετραγώνων, σ & lt? 0,01,

Πίνακας

2

).

μονοπαραγοντική αποτελέσματα χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Kaplan-Meier

Τα προσδιοριζόμενα προγνωστικούς παράγοντες από το μοντέλο παλινδρόμησης Cox παρουσιάζονται στα Σχήματα 7Α και C. Η μέση τιμή της έκφρασης των καρκινικών κυττάρων Foxp3 + με ανοσοϊστοχημική ανάλυση για όλες τις μελετήθηκαν δείγματα ιστού οι 65 όγκοι προσδιορίστηκε στο 16%. Μεταξύ των ασθενών με CRC, εκείνοι με την έκφραση των καρκινικών κυττάρων υψηλής Foxp3 + (& gt? 16%) είχαν χειρότερη πρόγνωση από εκείνους με χαμηλά επίπεδα Foxp3 + έκφρασης (& lt? 16%) (p & lt? 0,001, δοκιμασία log-rank) (

Εικόνα

7Α

και

Πίνακας

3

).

(Α) Οι ασθενείς με την έκφραση των καρκινικών κυττάρων υψηλής Foxp3 + ( & gt? 16%, ως μέση τιμή cut-off) είχε χειρότερη πρόγνωση από εκείνους με προφίλ χαμηλού Foxp3 + καρκινικών κυττάρων έκφρασης (& lt? 16%? σημαίνει cut-off: 16%), (p & lt? 0,001, δοκιμασία log-rank). (Β) Δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στη συνολική επιβίωση συγκρίνοντας ασθενείς με χαμηλό και υψηλό προφίλ έκφρασης Foxp3 + Treg (μέση τιμή cut-off: 12%), (p = 0,202, δοκιμασία log-rank). (Γ) Οι ασθενείς με μετάσταση στους λεμφαδένες είχαν χειρότερη πρόγνωση από εκείνους που δεν λεμφαδένα μετάσταση (p & lt? 0,001, δοκιμασία log-rank). Οι χρόνοι των λογοκρίνονται δεδομένων έδειξε από μικρή κάθετες γραμμές.

Η

Θεωρώντας ανοσοϊστοχημική ανάλυση των δειγμάτων από τα δείγματα 65 ιστού για την έκφραση Foxp3 + Treg η μέση αξία υπολογίστηκε σε 12%. Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στη συνολική επιβίωση συγκρίνοντας ασθενείς με χαμηλά και υψηλά επίπεδα έκφρασης Foxp3 + Treg (& gt? 12% ή & lt? 12%) (ρ = 0,204, δοκιμασία log-rank) (

Σχήμα

7Β

και

Πίνακας

3

).

σε ασθενείς χωρίς μετάσταση στους λεμφαδένες ήταν σημαντικές διαφορές στη συνολική επιβίωση συγκριτικά με τους ασθενείς με λέμφος μετάσταση στους λεμφαδένες. (p & lt? 0,001, δοκιμασία log-rank) (

Εικόνα

7C

)

Άλλες παράμετροι όπως η TGF-β, IL-10, UICC, και T κατηγορία έδειξαν επιπλέον σημαντικές διαφορές στη συνολική επιβίωση για την αντίστοιχη χαμηλότερη έκφραση και την ταξινόμηση, αντίστοιχα (p & lt? 0.001, Log-Rank τεστ)

η ηλικία, το φύλο, την πρωτοπαθή όγκο, και ιστολογική διαφοροποίηση δεν ήταν συνδέονται με. πρόγνωση σε μονοπαραγοντική ανάλυση.

Συζήτηση

Η τρέχουσα μελέτη παρέχει για πρώτη φορά αποδείξεις σημαντικά αυξημένη έκφραση του όγκου που σχετίζονται με του παράγοντα μεταγραφής Foxp3 σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα που σχετίζεται με δυσμενή πρόγνωση . Λεπτομερής πρωτεΐνης και ανάλυση γονίδιο χρησιμοποιήθηκε για να μελετηθεί προφίλ έκφρασης του σε κάθε ιστό του όγκου των ασθενών. Βάσει περιγράφεται πιο πρόσφατα κλινικά ευρήματα μιας έκφρασης Foxp3 σε καρκινικά κύτταρα των όγκων, όπως του πνεύμονα, στο ήπαρ, και καρκίνο της ουροδόχου κύστεως όπως επίσης και μελάνωμα προτείναμε ότι τα επίπεδα έκφρασης αυξημένα Foxp3 δεν συνδέονται κατ ‘ανάγκη να Treg μόνο, αλλά επίσης σε κύτταρα καρκίνου [10 ], [14], [15]. Η έκφραση του Foxp3 από καρκινικά κύτταρα, θα τους επιτρέψει να ρυθμίζουν προς τα κάτω αποκρίσεις Τ κυττάρων τελεστών που κατευθύνονται εναντίον του όγκου. Αυτό θα δώσει κλινικά στοιχεία για έναν αποτελεσματικό μηχανισμό άμεσης φοροδιαφυγής όγκους που προέρχονται από ανοσολογική καταστροφή CRC. Με διακρίσεις Foxp3 έκφραση των καρκινικών κυττάρων από την διείσδυση Treg και συσχετίζεται με τη συνολική επιβίωση κατά τη διάρκεια μιας μακροχρόνιας παρακολούθησης παρέχουμε νέες ιδέες στην προγνωστική σημασία της.

Σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες σε διάφορες κακοήθεις νόσους βρήκαμε σημαντικά μεγαλύτερους αριθμούς από διηθητικά Treg (CD4 + CD25 + Foxp3 +) σε όλα τα δείγματα CRC σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ιστούς κόλον [4] – [6], [17] – [20]. Ωστόσο, η συσχέτιση της έκφρασης Foxp3 στο Treg και τις επιπτώσεις της στην συνολική επιβίωση παραμένει αμφιλεγόμενη. Διφορούμενη δεδομένα υποδεικνύουν ότι η διείσδυση του όγκου με Foxp3 + Treg δεν συνδέεται πάντα με κακή πρόγνωση, αλλά, αντίθετα, μπορεί να συνδέεται με μια βελτιωμένη πρόγνωση σε ορισμένους τύπους καρκίνου, όπως σε CRC [8], [9], [21], [22]. Επιπλέον, δεν παρατηρήθηκε σημαντική σχέση μεταξύ του απόλυτου αριθμού Foxp3 + Treg και πρόγνωση σε CRC [23], [24]. Βελτιωμένη επιβίωση και ο δυνητικά προστατευτικός ρόλος του Treg μπορεί να εξηγηθεί από την ικανότητά τους για τη μείωση της ανάπτυξης της επιθετικής και κυτταροτοξικών, ενδεχομένως proliferogenic περιβάλλον κυτοκίνη, η οποία είναι η βάση για μια φλεγμονή με γνώμονα την πρόοδο των κακοήθων νόσων [25], [26] .

Πειραματικές μελέτες σε ποντίκια έδειξαν ότι CD4 + CD25 + Treg δεν παίζουν μόνο ένα ρόλο στη διατήρηση της ανοσολογικής ανοχής αλλά ότι Treg είναι επίσης ισχυροί αναστολείς της κατά του όγκου ανοσοαποκρίσεων [27], [28]. Προηγούμενες μελέτες έχουν εξετάσει τις κατασταλτική ικανότητα των CD8 + CD25 + Foxp3 + Τ κυττάρων σε ορθοκολικό καρκίνο ιστούς [29]. Σε CRC δείγματα τον απόλυτο αριθμό των CD8 + CD25 + Foxp3 + Τ κύτταρα ήταν χαμηλή (& lt? 5%). Επιπλέον, αυτά τα κύτταρα ήταν απούσα στα περισσότερα δείγματα φυσιολογικού ιστού αλλά στις περισσότερες CRC δείγματα? Ωστόσο κλινική σημασία τους παραμένει άγνωστη [29]. Αρκετές ομάδες παρατηρήθηκε έκφραση Foxp3 από διάφορους τύπους καρκίνου και το δυναμικό ρόλο της στη ανοσολογική παρακολούθηση από την παραγωγή ανοσοκατασταλτικών κυτοκινών όπως IL-10 και ΤΟΡ-β [30].

Τέλος, αναλύσαμε τη συνολική επιβίωση των ασθενών με χαμηλή ή υψηλή διείσδυση Foxp3 + Treg στον όγκο σε σύγκριση με την επιβίωση των ασθενών με χαμηλή ή υψηλή έκφραση Foxp3 των καρκινικών κυττάρων τους. Εκείνοι οι ασθενείς με προφίλ έκφρασης σε καρκινικά κύτταρα υψηλής Foxp3 + συσχετίστηκαν με χειρότερη πρόγνωση από τους ασθενείς με χαμηλό προφίλ έκφρασης Foxp3 + σε καρκινικά κύτταρα τους. Αυτή η συσχέτιση των υψηλών Foxp3 μοτίβο έκφρασης με κακή πρόγνωση δεν παρατηρήθηκε για διεισδύοντας Treg στον όγκο. Τα καρκινικά κύτταρα έκφραση του Foxp3 ακολουθούμενη από έκκριση των ανοσοκατασταλτικών κυτοκινών στο μικροπεριβάλλον του ιστού του όγκου μπορεί να δώσει στον όγκο ένα ισχυρό εργαλείο για την παράκαμψη ανοσολογική καταστροφή. Είναι ενδιαφέρον ότι, μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ του αριθμού των Foxp3 + Treg και το επίπεδο των Foxp3 + καρκινικών κυττάρων παρατηρήθηκε σε ασθενείς μας με CRC προτείνοντας μία αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του ΤΟΡ-β επί Treg.

Εν κατακλείδι, παρά το γεγονός ότι το μέγεθος του δείγματος σε αυτήν την ομάδα είναι μικρή για να εξαχθούν οριστικά συμπεράσματα, η μελέτη μας δείχνει για την πρώτη φορά που υψηλή Foxp3 έκφραση σε καρκινικά κύτταρα συνδέεται με μια μελαγχολική πρόγνωση CRC. ανάλυση παλινδρόμησης Η πολυπαραγοντική Cox αποδειχθεί λεμφαδένες μετάσταση στους λεμφαδένες (Ν κατηγορία) και η έκφραση Foxp3 στα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου ως σημαντικές προγνωστικές παραμέτρους επιβίωσης στην ανθρώπινη CRC.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Ηθικές έγκριση για την έρευνα αυτή λήφθηκε από την Επιτροπή Ερευνών του Ανθρώπου Ηθικής του Πανεπιστημίου του Βίρτσμπουργκ. Όλοι οι ασθενείς που παρέχει ιστό του όγκου, καθώς και δείγματα φυσιολογικού ιστού του παχέος εντέρου υπογράψει ένα έντυπο συγκατάθεσης πριν από τη χειρουργική αφαίρεση του καρκίνου του εντέρου να καταστεί δυνατή η έρευνα αυτή που πρέπει να αναληφθούν.

Οι ασθενείς και οι έλεγχοι

εξήντα πέντε ασθενείς με ιστολογικά επιβεβαιωμένο καρκίνο που υποβάλλονται σε θεραπευτική CRC χειρουργική εκτομή στο τμήμα μας μεταξύ 01/2001 και 06/2004 συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη. Η ιστολογική στάδιο του όγκου προσδιορίστηκε σύμφωνα με το σύστημα -TNM σταδιοποίησης Ένωση Internationale Contre le Cancer (UICC) [31]. Οι όγκοι αξιολογήθηκαν για την τοποθεσία, το στάδιο, και το βαθμό διαφοροποίησης. Τα δεδομένα που αφορούν την ηλικία, το φύλο, το επίπεδο διείσδυσης τοίχου, και μετάσταση λεμφαδένα συλλέχτηκαν σε μια βάση δεδομένων. Τακτικές ιατρικές επισκέψεις των ασθενών μετά θεραπευτική αγωγή διεξήχθησαν κατά διαστήματα, σύμφωνα με τις κυβερνητικές οδηγίες για ασθενείς με όγκο. Οι ασθενείς, οι οποίοι υποβλήθηκαν σε καμία εισαγωγική θεραπεία ή R1 εκτομή αποκλείστηκαν από την ανάλυση. δείγματα όγκου ιστών, καθώς και τα δείγματα φυσιολογικού ιστού κόλον από τους ασθενείς καταψύχθηκαν αμέσως σε υγρό άζωτο και φυλάχθηκαν στους -80 ° C μέχρι να αναλυθούν. Φυσιολογικούς ιστούς κόλου από υγιή άτομα χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες (n = 10). Ανοσοϊστοχημική ανάλυση επιβεβαίωσε ότι δεν ανέλυσε όγκου από την ομάδα των ασθενών που εκφράζεται hMLH1 και hMSH2 ενδεικτικές για αστάθεια μικροδορυφόρου (θετική επισκευή ασυμφωνία [MMR] κατάστασης). Το βλεννώδες φαινότυπος της CRC θα μπορούσε να σχετίζεται με ψευδώς θετικά υποκυτταρική αντιδράσεις από ανοσοϊστοχημεία και ως εκ τούτου, εξαιρούνται από τη μελέτη μας. Τα κλινικά χαρακτηριστικά του πληθυσμού της μελέτης συνοψίζονται στο

Πίνακας 3

. Όλοι οι ασθενείς συμπληρώσει τουλάχιστον 60 μήνες παρακολούθησης μετά την εκτομή.

Κυτταρική καλλιέργεια

Τα καρκίνου του παχέος εντέρου ανθρώπινες κυτταρικές σειρές SW620, SW480, και HCT-116 λήφθηκαν από την ATCC (Manassas, VA ) και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2 χρησιμοποιώντας μέσο RPMI 1640 (Life Technologies, GIBCO, Carlsbad, CA) συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) εμβρυϊκό βόειο ορό (Life Technologies, GIBCO, Carlsbad , CA), 1% (ν /ν) L-γλουταμίνη (Biochrom AG, Βερολίνο, Γερμανία) και 1% (ν /ν) πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Biochrom AG, Βερολίνο, Γερμανία).

Η κυτταρομετρία ροής ανάλυση (FACS)

καρκινικά κύτταρα από το κυτταρικές σειρές καρκίνου ανθρώπινου κόλον SW620, SW480, και HCT-116 συλλέχθηκαν σε φάση εκθετικής ανάπτυξης με τη χρήση του ενζύμου ελεύθερο διάλυμα διαστάσεως κυττάρων (Merck Millipore, Billerica, ΜΑ) και αναλύθηκαν για την έκφραση Foxp3. Μετά από πλύση με DPBS (Life Technologies, GIBCO, Carlsbad, CA) δύο φορές, 5 × 10

5 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Foxp3 ρυθμιστικό χρώσης κιτ (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Γερμανία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και επωάστηκαν με ΡΕ- συζευγμένο αντίσωμα Foxp3 ή IgG1 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Γερμανία) για 30 λεπτά στους 4 ° C στο σκοτάδι. Ο φθορισμός του Foxp3 μετρήθηκε και αναλύθηκε με μια ροή FACS κυτταρόμετρο (Coulter EPICS XL, Beckman Coulter, Brea, USA).

Η ανοσοϊστοχημική χρώση ανοσοφθορισμού και

CD4 και CD25 αντισώματα παρέχονται από Dako (Αμβούργο, Γερμανία). Δύο διαφορετικοί κλώνοι Foxp3 αντίσωμα (ab22510 ποντικού μονοκλωνικό και ab2481 κατσίκα πολυκλωνικά) αγοράστηκαν από την Abcam (Cambridge, UK), αντίσωμα ΤΟΡ-β παρεσχέθη από Serotec (Duesseldorf, Γερμανία), και IL-10 αντίσωμα από το R & amp? D Systems (Wiesbaden -Nordenstadt, Germany). αντισώματα ελέγχου ισοτύπου αγοράστηκαν από eBioscience (San Diego, USA). Δευτερογενής αντισώματα που χρησιμοποιούνται για ανοσοφθορισμό διπλή χρώση και ανοσοϊστοχημεία παρασχέθηκαν από Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. (Suffolk, England). Δευτερογενής EpCAM και αντισώματα CD4 ήταν συζευγμένο με FITC AffiniPure γαϊδάρου αντι-κατσίκας IgG και δευτερεύον αντίσωμα του Foxp3, IL-10, και ΤΟΡ-β ήταν Cy3-συζευγμένο γαϊδάρου αντι AffiniPure IgG ποντικού σε αραίωση 1:200 (Jackson ImmunoResearch).

Για κύτταρα καρκινώματος παρασκευάσματα cytospin ορθοκολικό από τους ασθενείς με CRC καλλιεργήθηκαν σε βραχυπρόθεσμες πρωτογενείς καλλιέργειες και καθιερωμένες κυτταρικές σειρές καρκίνου ανθρώπινου κόλου συλλέχθηκαν σε φάση εκθετικής ανάπτυξης με τη χρήση διαλύματος ενζύμου ελεύθερου κυττάρου διαστάσεως (Merck Millipore, Billerica , ΜΑ). Μετά από πλύση με DPBS (Life Technologies, GIBCO, Carlsbad, CA) δύο φορές, τα κύτταρα ρυθμίστηκαν σε μία συγκέντρωση 2 × 10

5 κύτταρα /ml. Κυτταροσπίν έγιναν με 50 μΙ κυτταρικού εναιωρήματος σε 550 rpm για 1 λεπτό σε ένα Cytospin4 κυτταροφυγοκέντρηση (Thermo Fisher Scientific, Waltham, ΜΑ).

Η χρώση των CD4, CD25, Foxp3, ΤΟΡ-β, και IL- 10 πραγματοποιήθηκε σε σειριακές τομές κρυοστάτη των 65 snap-κατεψυγμένα δείγματα CRC σε όγκους πρώιμου σταδίου (UICC I /II) και όγκους προχωρημένου σταδίου (UICC III /IV) με τις γειτονικές φυσιολογικό ιστό του παχέος εντέρου και 10 φυσιολογικά δείγματα του παχέος εντέρου. Όλες οι όγκοι χρωματίστηκαν θετικά για κυτοκερατίνη-20 (CK-20) (Dako, Αμβούργο, Γερμανία) και αρνητικό για κυτοκερατίνη-7 (CK-7) (Dako), ένα χαρακτηριστικό μοτίβο για αδενοκαρκινώματος παχέως εντέρου [32]. Πρώτα αξιολογείται Η.Ε. τμήματα από κάθε ιστό του όγκου για τη διαφοροποίηση μεταξύ των περιοχών των κυττάρων του καρκίνου, των στρωματικών περιοχές και διηθητικά κύτταρα του ανοσοποιητικού. Στη συνέχεια χρωματίστηκαν για CD4, CD25, Foxp3, ΤΟΡ-β, και IL-10 στην ακόλουθη σειριακές τομές. Για Foxp3 κυτταροπλασματική έκφραση, περιπυρηνικά κυτταροπλασματικής και πυρηνικής χρώσης ήταν διαφορετικά προσδιορίζεται [30]. διαδοχικές τομές κρυοστάτη (5 μm) επωάστηκαν με το πρωτογενές αντίσωμα ή αντίσωμα ελέγχου και το παράγωγο FITC-συζευγμένο (φθορεσκεϊνισοθειοκυανικό) αντίσωμα. Στη συνέχεια, οι πλάκες στη συνέχεια επωάστηκαν με το δεύτερο πρωτεύον αντίσωμα που ακολουθείται από επώαση με δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με Cy3. Τα πλακίδια επιχρωματίστηκαν με DAPI (4 ‘, 6-διαμιδινο-2-phenylindoldihydrochlorid) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Γερμανία) και καλύπτονται με Πολυβινυλική αλκοόλη στερέωσης μέσο (DABCO, Sigma-Aldrich) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μία μηχανή Zeiss (Oberkochen, Γερμανία).

για ανοσοϊστοχημεία, η προ-επεξεργασία (στερέωση) των διαφανειών ήταν η ίδια όπως περιγράφεται για ανοσοφθορισμό. Μετά την επώαση με το πρωτογενές αντίσωμα, χρησιμοποιήσαμε μια υπεροξειδάση (HRP) AffiniPure Donkey αντι-ποντικού ή Donkey IgG αντι-κατσίκας (Jackson ImmunoResearch). Τα πλακίδια στη συνέχεια επωάστηκαν σε DAB (3,3′-διαμινοβενζιδίνη) (Biogenex, San Ramon, USA), αντίθετα με Haemalaun και τοποθετείται με Glycergel (Dako, Αμβούργο, Γερμανία). Η ποσοτικοποίηση του κάθε ανοσοενζυματική χρώση των καρκινικών κυττάρων από τα 65 επιμέρους ιστών του όγκου σε έξι επιμέρους μεγεθυσμένη πεδία (× 400 μεγέθυνση) για κάθε δείγμα χρώση Ο κυτταρική καταμέτρηση που εκτελούνται από δύο ανεξάρτητους ερευνητές τυφλωθεί για την υποκείμενη νόσο. Οι μεγεθύνεται πεδία ήταν αντιπροσωπευτικά για ολόκληρο το τμήμα του όγκου. Το αποτέλεσμα της χρώσης εκφράστηκε σε ποσοστά (%) θετικότητα. Όλες οι τιμές εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD.

πραγματικού χρόνου ποσοτική ανάστροφης μεταγραφής-ΡΟΡ ανάλυση

Για να αναλυθεί έκφραση γονιδίων των CD4, CD25, Foxp3, ΤΟΡ-β, και IL-10 από RT-qPCR, εξάγαμε ολικό κυτταρικό RNA χρησιμοποιώντας το RNeasy MINIKIT από Qiagen (Hilden, Germany). Τομείς ενδιαφέροντος (μόνο επιθηλιακά περιοχές) για κάθε τμήμα ιστού με το χέρι μικροτομή χρησιμοποιώντας ένα νυστέρι. Ίσες ποσότητες των περιοχών ιστού αξιολογήθηκαν (2 × 1,5 εκατοστά

2 επιφάνειας ανά τμήμα, πάχους 10 μm). εκχύλιση RNA από δείγματα ασθενών και καθιερωμένες κυτταρικές σειρές ανθρώπινου κόλον (για Foxp3) πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Primer σύνολα ελήφθησαν από Qiagen, ζεύγη εκκινητών 18S RNA (προς τα εμπρός: TCA AGA ACG ΑΑΑ GTC GGA GGT ΤΕΕ, αντίστροφη: ΤΤΑ TTG CTC ΑΑΤ CTC GGG ΤΟΟ CTG) σχεδιάστηκαν από Biomers (Ulm, Γερμανία). Συμφωνήθηκε cDNA ανθρώπινου κόλον αγοράστηκε από Pharmingen (Χαϊδελβέργη, Γερμανία) ως έλεγχος και τυποποιήθηκε με την αρχική τιμή. Η αφυδρογονάση γονίδια housekeeping αφυδρογονάση 3-φωσφορικής (GAPDH), β-ακτίνη, και 18S RNA [33] χρησιμοποιήθηκαν για σχετική ποσοτικοποίηση και cDNA ελέγχου της ποιότητας. Όλες οι PCR αντιδράσεις διεξήχθησαν με ένα Opticon 2 Σύστημα DNA κινητήρα (MJ Research, Biozym, Oldendorf, Γερμανία). Η σχετική αξία ποσοτικοποίηση, πλάσια διαφορά, εκφράστηκε ως 2

-ΔΔCt. Για την ανάλυση σε καρκίνο του παχέος εντέρου έκφραση κυτταρικών γραμμών ενδείκνυται σε μέση τιμή, ΔCt και σχετική έκφραση (γονίδια Foxp3 /καθαριότητας).

Στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση SAS 9.2. Συνολική επιβίωση ορίστηκε ως το χρονικό διάστημα μεταξύ της τυχαιοποίησης και του θανάτου οποιασδήποτε αιτιολογίας. Οι ασθενείς, οι οποίοι χάθηκαν κατά την παρακολούθηση περικόπηκαν την ημερομηνία της τελευταίας επαφής. Η συνολική επιβίωση αξιολογήθηκε μέσω PROC PHREG (Cox μοντέλο αναλογικού κινδύνου). Οι παράμετροι προγνωστικής δυναμικό, προσδιορίζονται σε μια σταδιακή διαδικασία, έχουν ακόμη διερευνηθεί με τη μέθοδο Kaplan-Meier (PROC LIFETEST). Για μονοπαραγοντική ανάλυση μέση τιμή αποκοπής είτε υψηλή ή χαμηλή έκφραση ορίστηκε στο 12% για Foxp3 στο διηθούν όγκο Treg και 16% για Foxp3 στα καρκινικά κύτταρα. Μονοπαραγοντική ανάλυση της σημασίας για Foxp3 έκφραση που διηθούν όγκο Treg και τις διαφορές έκφρασης των καρκινικών κυττάρων στις καμπύλες επιβίωσης εκτιμήθηκαν με δοκιμασία log-rank. Με τον ίδιο τρόπο καμπύλες επιβίωσης συγκρίθηκαν για Ν και Τ κατηγορίες, καθώς και πρωτογενούς όγκου.

Δύο ανεξάρτητοι ομάδες ασθενών αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας t-τεστ του Student (Satterthwaite). Περισσότερες από δύο ομάδες αναλύθηκαν εφαρμογή GLM PROC (ανάλυση της διακύμανσης) με έλεγχο post-hoc (Tukey). κατανομές συχνότητας συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας πίνακες kxm (Chi-τετραγώνων). συντελεστής συσχέτισης του Pearson χρησιμοποιήθηκε για να περιγράψει και να δοκιμάσουν διμεταβλητή συσχετισμούς. Μια ρ-τιμή μικρότερη του 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς ευχαριστήσω τον κ Dipl.-Μαθηματικά. Mathias Brosz για στατιστικούς συμβουλές και κα Sabine Müller-Morath, κα Mariola Ντράγκαν, κα Nadine Gutermuth, και η κα Ingrid Strauss για την τεχνική υποστήριξή τους.