Abstract

Εισαγωγή

ανθρώπινο αντιγόνο R (HuR) ρυθμίζει τη σταθερότητα του mRNA και σχετίζεται με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, αγγειογένεση, και λεμφαγγειογένεση. Ωστόσο, η κλινική σημασία και παθολογικό ρόλο των HuR στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης παραμένει ασαφής. Ο κύριος στόχος αυτής της έρευνας ήταν να διευκρινίσει τις σχέσεις μεταξύ της έκφρασης HuR και η κλινική σημασία και τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, την αγγειογένεση, τη λεμφαγγειογένεση και εκφράσεις της κυκλοοξυγενάσης (COX) -2 και του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) -Α, -C, και -D.

Μέθοδοι

Όλα εκφράσεις εξετάστηκαν με ανοσοϊστοχημικές τεχνικές σε 122 μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη δείγματα ασθενών με καρκίνο της ουροδόχου κύστης. έκφραση HuR αξιολογήθηκε ξεχωριστά με κυτταροπλασματική και πυρηνική χρώση. Ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, αγγειογένεση και λεμφαγγειογένεση μετρήθηκαν ως το ποσοστό των Ki-67-θετικών κυττάρων (δείκτης πολλαπλασιασμού, ΡΙ), CD34-βάφονται σκάφη (πυκνότητα μικροαγγείων, MVD), και D2-40-βάφτηκαν σκάφη (πυκνότητα σκάφος λέμφος, LVD) . Οι σχέσεις ανάμεσα σε κάθε έκφραση HuR και κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά, πρόγνωση, και τις εκφράσεις της COX-2 και VEGFs αναλύθηκαν με αναλύσεις πολλαπλών περιγραφικές. έκφραση HuR ερευνήθηκε επίσης σε 10 ποντίκια της Ν-βουτυλο-Ν- [4-hydroxybutil] νιτροζαμίνη (ΒΒΝ) που προκαλείται από το μοντέλο καρκίνου της ουροδόχου κύστης.

Αποτελέσματα

σε ανθρώπινους ιστούς, η υψηλή κυτοπλασμική έκφραση ήταν φαίνεται στο 5% και το 25,4% των φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων, αντίστοιχα. Πυρηνική HuR έκφραση δεν είχε καμία σημαντική σχέση με τυχόν παθολογικά χαρακτηριστικά. Ωστόσο, κυτταροπλασματική έκφραση HuR εμφανίστηκε θετική συσχέτιση με το στάδιο Πορτογαλία και βαθμού (

P

& lt? 0.001). Στους ιστούς του ποντικιού, παρόμοιες τάσεις επιβεβαιώθηκαν. Η κυτταροπλασματική έκφραση συσχετίζεται με ΡΙ, MVD, και LVD, καθώς και την έκφραση του VEGF-Α και -C, αλλά όχι VEGF-D. Υψηλή κυτταροπλασματική έκφραση HuR ήταν σημαντικός προγνωστικός δείκτης της μετάστασης και να προκαλέσει ειδικά την επιβίωση, και αναγνωρίστηκε ως προγνωστικός παράγοντας για την συνακόλουθη μετάσταση (αναλογία κινδύνου 4,75? P = 0,028). Σε ένα πολυπαραγοντικό μοντέλο ανάλυσης που περιλαμβάνεται παθολογικά χαρακτηριστικά

Συμπεράσματα

Κυτταροπλασματικά HuR φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την εξέλιξη και την επιβίωση των ασθενών με καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Η έκφρασή του σχετίζεται με την αγγειογένεση, τη λεμφαγγειογένεση και τις εκφράσεις του VEGF-Α και -C

Παράθεση:. Miyata Υ, Watanabe S-i, Sagara Υ, Mitsunari Κ, Matsuo, Τ, Ohba Κ, et al. (2013) υψηλή έκφραση του HuR στο κυτταρόπλασμα, αλλά όχι πυρήνες, συνδέεται με Κακοήθη Επιθετικότητα και πρόγνωση στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. PLoS ONE 8 (3): e59095. doi: 10.1371 /journal.pone.0059095

Επιμέλεια: Kaustubh Ντάτα του Πανεπιστημίου της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 11, Ιουλ, 2012? Αποδεκτές: 11 Φεβρουαρίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 13 Μαρτίου 2013

Copyright: © 2013 Miyata et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε εν μέρει από μια Grant-in-Aid από την Ιαπωνία Εταιρείας για την Προώθηση της Επιστήμης (Νο 22591771). Ωστόσο, οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση ελήφθη για τη μελέτη αυτή

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Κανονισμός της αποσύνθεσης mRNA είναι ένα ουσιαστικό μηχανισμό. για τον έλεγχο της γονιδιακής έκφρασης. Ο έλεγχος της σταθερότητας mRNA εξαρτάται από αλληλουχίες στην ίδια τη μεταγραφή και επί πρωτεϊνών δέσμευσης RNA που προσδένονται σε δυναμικά αυτές τις αλληλουχίες. Ανθρώπινο αντιγόνο R (HuR) είναι ένα μέλος του εμβρυϊκού φονικού, διαταραχές όρασης (elav) -όπως πρωτεΐνη οικογένεια πρωτεϊνών RNA δέσμευσης, και φέρεται να είναι ένα πολυλειτουργικό πρωτεΐνη που έχει εμπλακεί στη ρύθμιση των διαφόρων πτυχών της RNA μεταβολισμός. Δηλαδή, HuR εμπλέκεται σε μετα-μεταγραφική ρύθμιση του κύκλου εργασιών και της σταθερότητας του RNA [1].

HuR αναφέρεται επίσης για τη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και της φλεγμονής που σχετίζονται με όγκους [2], [3]. Επιπλέον, HuR έχει βρεθεί ότι εμπλέκεται στην ρύθμιση της αγγειογένεσης από την αλληλεπίδραση με τις μεταγραφές του πολλούς παράγοντες αγγειογένεση προώθηση, και είναι επίσης γνωστό ότι συσχετίζεται με λεμφαγγειογένεση σε μια ποικιλία παθολογικών καταστάσεων, περιλαμβανομένου του καρκίνου [3], [4 ]. Με βάση αυτά τα δεδομένα, έχει προταθεί ότι HuR παίζει σημαντικούς ρόλους στην καρκινογένεση, ανάπτυξη όγκου, μετάσταση, και την πρόγνωση σε κακοήθειες. Στην πραγματικότητα, αρκετές αναφορές έχουν περιγράψει την έκφραση HuR δείχνουν θετικές συσχετίσεις με κακοήθη επιθετικότητα και χρησιμεύει ως προγνωστικός παράγοντας για την κακή κλινική έκβαση σε διάφορους καρκίνους [5] – [7]. Από την άλλη πλευρά, έχουν σημαντικά διαφορετικές ευρήματα έχουν αναφερθεί σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού [8]. Οι παθολογικές ρόλους και προγνωστική αξία της έκφρασης HuR σε ασθενείς με καρκίνο έτσι παραμένουν αμφιλεγόμενα, και η κλινική σημασία και η προγνωστική αξία για την πρόγνωση σε ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης δεν έχει ακόμη διευκρινιστεί.

Καθώς οι μηχανισμοί για αυτές τις παθολογικές δραστηριοτήτων, αγγειακή ενδοθηλιακών αυξητικών παραγόντων (VEGFs) και κυκλοοξυγενάσης (COX) -2 είναι τα πιο γνωστά HuR-σχετιζόμενους παράγοντες [5], [7], [9] – [11]. Αυτές οι πρωτεΐνες έχουν επίσης αναφερθεί ότι συνδέονται με κακοήθεις επιθετικότητα και την πρόγνωση σε ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης [12], [13]. Ωστόσο, λίγες πληροφορίες έχουν συσσωρευτεί όσον αφορά τη σχέση μεταξύ της έκφρασης HuR, VEGF-A, -C, και -D, και COX-2 σε ανθρώπινους ιστούς καρκίνου της ουροδόχου κύστης.

Η ενδοκυτταρική τοποθεσία του HuR έχει αναφερθεί ότι είναι κατά κύριο λόγο πυρηνική σε πολλούς τύπους καρκινικών κυττάρων [14], [15]. Ωστόσο, HuR λεωφορεία από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα σε απόκριση σε διάφορα ερεθίσματα, παρατείνοντας mRNA ημίσειας ζωής και διευκολύνοντας την αποτελεσματική μετάφραση των πρωτεϊνών [15]. Με αυτά τα δεδομένα, η έρευνα ως προς τις κλινικές, παθολογικές και προγνωστικές ρόλους των πυρηνικών και κυτταροπλασματικών έκφραση HuR είναι δικαιολογημένη.

Ο κύριος σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να διευκρινιστεί η παθολογική σημασία και προγνωστική αξία των πυρηνικών και κυτταροπλασματικών έκφραση HuR σε ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Για να επιβεβαιώσετε την παθολογική σημασία HuR κάτω από ένα δεδομένο μικροπεριβάλλον των ιστών, χημικά που προκαλείται μοντέλο ποντικού καρκίνου της ουροδόχου κύστης χρησιμοποιήθηκε για επιπλέον πειράματα. Επιπλέον, οι σχέσεις μεταξύ αυτών των εκφράσεων HuR, αγγειογένεση και λεμφαγγειογένεση, και VEGF-A, -C, -D, και COX-2 εκφράσεις εξετάστηκαν επίσης σε ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Έγκριση

Η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με τη δήλωση του Ελσίνκι ΙΙ και εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας αναθεώρηση του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου του Ναγκασάκι, Ναγκασάκι, Ιαπωνία.

γραπτή συγκατάθεση ήταν που λαμβάνονται από τους ασθενείς που συμμετέχουν στη μελέτη μας, πριν την εγγραφή τους. Τα ζώα σε αυτή τη μελέτη αντιμετωπίζονται σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές για τα πειράματα σε ζώα στο Πανεπιστήμιο του Ναγκασάκι, και των Κανονισμών της φροντίδας των ζώων και την Επιτροπή Χρήση ενέκρινε το πρωτόκολλο της μελέτης.

Ασθενείς

Όλες οι διαφάνειες του καρκίνου της ουροδόχου κύστης 122 δείγματα που λαμβάνονται από διουρηθρική εκτομή (TUR) στο νοσοκομείο μας μεταξύ 1993 και 2004, εξετάστηκαν. Όλοι οι ασθενείς είχαν κλινικά διαγνωστεί με μη μυϊκή διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης (NMIBC) χωρίς μετάσταση. Αποκλείσαμε τους ασθενείς που είχαν λάβει εισαγωγική θεραπεία. Επιπλέον, δείγματα ότι ο αριθμός των καρκινικών κυττάρων ήταν κάτω από 500 επίσης εξαιρούνται από αυτή τη μελέτη. Από την άλλη πλευρά, μεταξύ των 122 ασθενών, επικουρική θεραπεία συμπεριλαμβανομένης της συστηματικής χημειοθεραπείας, ενδοκυστική χημειοθεραπεία, και ενδοκυστική βάκιλο-Calmette-Guérin διεξήχθησαν σε 14 (11,5%), 67 (54,9%), και 19 ασθενείς (15,6%), αντίστοιχα . Όλοι οι ασθενείς αξιολογήθηκαν με ακτινογραφία θώρακα, υπερηχογράφημα, και αξονική τομογραφία (CT) της ουροδόχου κύστης και της κοιλίας, και κυστεοσκόπηση. Επιπλέον, CT ​​του πνεύμονα ή του εγκεφάλου, η μαγνητική τομογραφία (MRI), πυελογραφία στάγδην έγχυση, και σπινθηρογραφήματα οστών διεξήχθησαν όπως κρίνεται απαραίτητο. Οι όγκοι οργανώθηκαν σύμφωνα με την αμερικανική μεικτής επιτροπής για τον Καρκίνο και βαθμολογούνται σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας και την Διεθνή Εταιρεία για το σύστημα ταξινόμησης Ουρολογική Παθολογία. Στην παρούσα μελέτη, οι όγκοι ομαδοποιήθηκαν για στατιστική ανάλυση στις ακόλουθες ομάδες: χαμηλής (ΡΤΑ + 1) και υψηλής βαθμίδος (≥T2)? ή την χαμηλή (βαθμοί 1 και 2) και υψηλού βαθμού (βαθμός 3). Εξετάσαμε επίσης 20 δείγματα ιστού κανονικών ουροδόχου κύστης ελήφθησαν από φαινομενικά φυσιολογικές περιοχές της κύστης των ασθενών με καρκίνωμα από μεταβατικό επιθήλιο του ανώτερου ουροποιητικού. Όλοι οι ασθενείς ελέγχου έδειξε G1 και μη μυών διεισδυτική νόσο, και έδειξαν υποτροπή εντός περιόδου παρακολούθησης των 10-17 ετών. Η μέση διάρκεια της παρακολούθησης ήταν 51 μήνες (εύρος, 2-182 μήνες).

Animal

έκφραση HuR εξετάστηκε σε 10 δείγματα φυσιολογικών ουροθηλιακά κύτταρα (χωρίς BBN), 5 NMIBC (διάλυμα ΒΒΝ για 14 εβδομάδες), και 5 της μυϊκής διηθητικού καρκίνου της ουροδόχου κύστης (MIBC) (για 24 εβδομάδες) της επαγόμενης χημικών κύστη μοντέλο ποντικού καρκίνου. Το μοντέλο αυτό χρησιμοποιείται σε προηγούμενη έκθεση [16].

Η ανοσοϊστοχημεία

Η ανοσοϊστοχημική εξετάσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση φορμόλης-σταθερό, παραφίνη-ενσωματωμένες ενότητες. Χρησιμοποιήσαμε αντι-HuR αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ως το πρωτογενές αντίσωμα (πολυκλωνικό κουνελιού, αντιδραστική και για τους δυο ανθρώπου και ποντικού HuR). Πέντε-μικρόμετρο-τομές πάχους αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο και επανυδατώθηκαν σε διαβαθμισμένη διαλύματα αιθανόλης. Το αντιγόνο ανάκτηση διεξήχθη στους 100 ° C για 15 λεπτά. σε 0.01 ρυθμιστικό κιτρικού νατρίου (ρΗ 6.0). Όλες οι τομές κατόπιν βυθίζονται σε υπεροξείδιο του υδρογόνου 3% επί 30 λεπτά για να εμποδίσει την ενδογενή δραστηριότητα υπεροξειδάσης. Οι τομές επωάστηκαν για μία νύχτα με το πρωτογενές αντίσωμα στους 4 ° C, κατόπιν πλύθηκαν σε 0.05% Tween 20 σε αλατούχο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS). Στη συνέχεια, οι τομές επωάστηκαν με υπεροξειδάση χρησιμοποιώντας το σημασμένο μέθοδο πολυμερές με Dako EnVision + ™ Peroxidase, (Dako, Carpinteria, CA) για 60 λεπτά. Η αντίδραση υπεροξειδάσης έγινε ορατή με το υγρό τετραϋδροχλωρική 3,3′-διαμινοβενζιδίνη (DAB) κιτ υποστρώματος (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Οι τομές επιχρωματίστηκαν με τη χρήση αιματοξυλίνης. Άλλες μέθοδοι διεξήχθησαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [13], [17], [18]. Εν συντομία, αξιολογήσαμε επίσης VEGF-A, -C, και -D και COX-2 εκφράσεις σε παρόμοιες δείγματα χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημικές τεχνικές. Επιπλέον, μικροαγγειακή πυκνότητα (MVD) και του λεμφικού σκάφος πυκνότητας (LVD) εκτιμήθηκαν χρησιμοποιώντας CD34-θετικά αυλούς και D2-40-θετική αυλούς, αντίστοιχα. Λεπτομέρειες σχετικά με τις μεθόδους για τον προσδιορισμό MVD και LVD ήταν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13]. Πραγματοποιήσαμε όλες αξιολόγησης εκ νέου για τη μελέτη αυτή. Μια ποικιλία από δείγματα καρκίνου που είχαν επιβεβαιωθεί σε προκαταρκτικές μελέτες, όπως ανοσοδραστικά για τους μελετήθηκαν αντιγόνα χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί μάρτυρες για HuR (ήπαρ), VEGFs (καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων), COX-2 (κόλον), D2-40 (αμυγδαλές), και CD34 (νεφρών). Οι ιδιαιτερότητες αυτών των δειγμάτων ως θετικοί μάρτυρες επιβεβαιώθηκαν και σε προηγούμενες εκθέσεις μας [13], [17], [18]. Μια συνεχόμενη τμήμα από κάθε δείγμα σε επεξεργασία χωρίς το πρωτογενές αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Θετικοί και αρνητικοί μάρτυρες στήθηκαν για κάθε παρτίδα των πειραμάτων. Επιπλέον, για να επιβεβαιωθεί η ειδικότητα HuR ανοσοαντιδραστικότητας, εκτελέσαμε παρόμοια έρευνα, χρησιμοποιώντας γίδινο πολυκλωνικό αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) σε δείγματα ανθρώπινων (n = 40) και τους ιστούς ποντικού (n = 20), και επωάστηκαν επίσης με κλείδωμα πεπτίδιο για αυτό το αντι-HuR αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).

Αξιολόγηση

έκφραση HuR αξιολογήθηκε με ανοσοαντιδραστικές βαθμολογία όπως έχει ήδη αναφερθεί [19]. Εν συντομία, κυτταροπλασματικά και πυρηνικά χρώσης βαθμολογήθηκαν χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες κλίμακες: 0, καθόλου χρώση? 1, αδύναμα και /ή εστιακές χρώση (& lt? 10% των κυττάρων)? 2, μέτρια ή έντονη χρώση (10-50% των κυττάρων)? και 3, μέτρια ή έντονη χρώση (& gt? 50% των κυττάρων). Οι βαθμολογίες 0 και 1 κρίθηκαν ως χαμηλή έκφραση, και τα σκορ 2 και 3 κρίθηκαν ως υψηλή έκφραση. Αυτή η μέθοδος αξιολόγησης χρησιμοποιήθηκε για τους ιστούς ποντικού. Όσον αφορά τις άλλες εκφράσεις, τα αποτελέσματα θεωρήθηκαν θετικά αν ένταση χρώσης ήταν ισχυρή, και το ποσοστό θετικά χρωματισμένων κυττάρων καρκίνου προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μια συνεχή κλίμακα σύμφωνα με προηγούμενες αναφορές [13], [17]. Εν συντομία, τα επίπεδα έκφρασης αξιολογήθηκαν ημι-ποσοτικά από το ποσοστό των κυττάρων που εκφράζουν καρκινώματος (από ≥500 κύτταρα καρκινώματος). Αυτά τα κύτταρα εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας ένα E-400 μικροσκόπιο (Nikon, Τόκιο, Ιαπωνία) και ψηφιακές εικόνες συλλήφθηκαν (DU100? Nikon). Επιπλέον, χρησιμοποιήσαμε ένα σύστημα ανάλυσης εικόνας με τη βοήθεια υπολογιστή (Win ΣΤΕΓΗ έκδοση 5.0? Mitani, Fukui, Ιαπωνία) για τον υπολογισμό των στατιστικών μεταβλητών. Δύο ερευνητές (S.W. και Υ.Μ.), τυφλωμένοι με κλινικά χαρακτηριστικά και τα στοιχεία επιβίωσης, ανεξάρτητα πραγματοποιείται ημι-ποσοτικές αναλύσεις και ανοσοχρώση ερμηνείες. Το ποσοστό διαφωνίας στην ανάλυση μεταξύ αυτών των δύο ερευνητές ήταν & lt?. 10% και η μέση πυκνότητα χρησιμοποιήθηκε για στατιστικές αναλύσεις

Στατιστική Ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσο (τυπική απόκλιση [SD] ). t-test του Student χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση των συνεχών μεταβλητών. Το τεστ chi-square και ακριβής δοκιμασία Fisher χρησιμοποιήθηκαν για συγκρίσεις των κατηγορικά δεδομένα. συντελεστής συσχέτισης Spearman χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των ενώσεων μεταξύ δύο συνεχείς μεταβλητές. Αργού και προσαρμόζονται αποτελέσματα εκτιμήθηκαν με ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης και περιγράφονται ως αναλογίες πιθανοτήτων (OR) με διαστήματα εμπιστοσύνης 95% (95% ΠΙ), μαζί με το

P

-τιμές. ανάλυση επιβίωσης αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση Kaplan-Meier και τη δοκιμασία log-rank, και μεταβλητές που επιτεύχθηκε στατιστική σημαντικότητα (

P

& lt? 0.050) σε μονοδιάστατες αναλύσεις στη συνέχεια τέθηκε σε μια πολυπαραγοντική ανάλυση με τη χρήση Cox ανάλυση αναλογικών κινδύνων ( περιγράφεται ως αναλογία κινδύνου [HR] με 95% CI, μαζί με το

P

-τιμές) (Υπόδειγμα Α). Επιπλέον, για να εξετάσει την προγνωστική αξία της έκφρασης HuR με μεγαλύτερη λεπτομέρεια, η ανάλυση περιλάμβανε ένα πολυπαραγοντικό μοντέλο, συμπεριλαμβανομένων όλων των παραγόντων κινδύνου (Υπόδειγμα Β). Όλες οι στατιστικές δοκιμασίες ήταν δύο όψεων και η σημασία ορίστηκε ως

P

& lt? 0.050. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε προσωπικό υπολογιστή με StatView για Windows έκδοση λογισμικού 5.0 (Abacus Concepts, Berkeley, CA).

Αποτελέσματα

Εντοπισμός και Έκφραση HuR

κανονική ουροθηλιακό κύτταρα, αδύναμη έως μέτρια έκφραση πυρηνικών HuR ανιχνεύθηκε, μαζί με απόντα σε ασθενή κυτοπλασμική έκφραση (Εικ. 1Α). Τέλος, το 90% (18/20) κρίθηκε ότι δείχνουν υψηλή πυρηνική έκφραση σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα ουροδόχου κύστης. Σε αντίθεση, η υψηλή κυτοπλασμική έκφραση παρατηρήθηκε σε μόνο το 5% (1/20) των φυσιολογικών ιστών. Όσον αφορά την έκφραση πυρηνικών HuR σε καρκινικά κύτταρα, η έκφραση ήταν υψηλή σε 88 δείγματα (72,1%? Στείλει 2, n = 64? Βαθμολογία 3, n = 24) και χαμηλή σε 34 (27,9%? Στείλει 0, n = 1? Σκορ 1, n = 33). Από την άλλη πλευρά, όσον αφορά την κυτταροπλασματική έκφραση σε καρκινικά κύτταρα, η έκφραση ήταν υψηλή σε 31 δείγματα (25,4%? Στείλει 2, n = 24? Βαθμολογία 3, n = 7) και χαμηλή περιεκτικότητα σε 91 (74,6%? Στείλει 0, η = 37? σκοράρει 1, n = 54). Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα χαμηλής και υψηλής έκφρασης HuR σε καρκινικό ιστό που φαίνεται στο Σχήμα 1 Β και C, αντίστοιχα.

HuR ανιχνεύθηκε κυρίως σε πυρήνες των κανονικών και καρκινικών κυττάρων σε ιστούς της ουροδόχου κύστης. Μέτρια ή ισχυρά κυτταροπλασματική έκφραση ήταν εμφανής σε καρκινικά κύτταρα (C), αλλά ήταν σπάνιο σε φυσιολογικά urothelial κύτταρα (Α). Ορισμένα καρκινικά κύτταρα επίσης έδειξαν ασθενή κυτταροπλασματική έκφραση μολονότι πυρηνική έκφραση ανιχνεύθηκε (Β). Επιπλέον, δείξαμε αντιπροσωπευτικά στοιχεία της έκφρασης HuR (C) και παράγοντες που σχετίζονται με αυτά? (D) της κυκλοοξυγενάσης-2, (Ε) αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα-Α, (F) αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα-C στην ίδια περιοχή. (Όλα μεγέθυνση, χ400).

Η

Σε πειράματα σε ζώα, η υψηλή πυρηνική έκφραση βρέθηκε σε 80% (8/10) και 70% (7/10) των κανονικών ουροθηλιακά και καρκινικά κύτταρα, αντίστοιχα. Από την άλλη πλευρά, η υψηλή κυτοπλασμική έκφραση σε φυσιολογικά κύτταρα ανιχνεύθηκε σε 10% (1/10). Στα καρκινικά κύτταρα, υψηλή έκφραση σε NMIBC και MIBC ανιχνεύθηκε σε 40% (2/5) και 80% (4/5), αντίστοιχα. Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα έκφρασης HuR σε ιστούς ποντικών έδειξαν στο Σχήμα 2Α και Β Σημαντικά, παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα άλλο αντίσωμα αντι-HuR και χρώση του μειώθηκε από τον ανταγωνισμό με το κλείδωμα πεπτίδιο.

(μεγέθυνση, χ400) . Χρώση μοτίβο ήταν κοντά στους ανθρώπινους ιστούς.

Η

Κλινική και παθολογική σημασία της HuR Έκφραση

Οι σχέσεις μεταξύ παθολογικά χαρακτηριστικά και την έκφραση HuR στον πυρήνα και στο κυτταρόπλασμα παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Τα πυρηνικά HuR έκφραση δεν έδειξε σημαντική σχέση με το στάδιο ρΤ ή βαθμού (

P

= 0.471 και

P

= 0,773, αντίστοιχα). Αντίθετα, κυτταροπλασματική έκφραση HuR συσχετιζόταν θετικά με το στάδιο Pt (

P

& lt? 0.001) και του βαθμού (

P

& lt? 0.001).

Η

Όπως φαίνεται στο Πίνακας 2, κυτταροπλασματική έκφραση HuR συσχετιζόταν θετικά με εκφράσεις της COX-2 (

P

= 0,011), VEGF-A (

P

= 0,021) και VEGF-C (

P

= 0.004), αλλά όχι με την έκφραση του VEGF-D (

P

= 0,134). Επιπλέον, κυτταροπλασματική έκφραση HuR εμφανίζονται επίσης θετικές συσχετίσεις με MVD (

P

= 0,010) και LVD (

P

= 0,023). Από την άλλη πλευρά, η πυρηνική έκφραση της HuR δεν έδειξε σημαντική συσχέτιση με οποιαδήποτε από αυτές τις εκφράσεις ή μεταβλητές (Πίνακας 2). Έτσι, τα αντιπροσωπευτικά παραδείγματα για αυτά τα σημαντικά μόρια φαίνεται στην υψηλή δείγμα έκφρασης HuR (Σχήμα 1D-F).

Η

Σχέσεις μεταξύ HuR που σχετίζονται με Μόρια και αγγειογένεση ή λεμφαγγειογένεση

Σε μας τον πληθυσμό της μελέτης, MVD συνδέθηκε στενά με τον VEGF-A (r = 0.40,

P

& lt? 0.001), VEGF-C (r = 0.41,

P

& lt? 0.001), και COX -2 έκφρασης (r = 0,31,

P

& lt? 0.001), αλλά όχι με VEGF-D (r = 0,17, Ρ = 0,652). Ομοίως, LVD συσχετίστηκε επίσης με VEGF-A (r = 0,39,

P

& lt? 0.001), VEGF-C (r = 0,58,

P

& lt? 0.001), και VEGF- D (r = 0,53, Ρ & lt? 0.001), αλλά όχι με την έκφραση της COX-2 (r = 0,15,

P

= 0,103). Το σχήμα αυτών των συσχετίσεων ήταν showen στο Σχήμα 3.

MVD, μικροαγγειακή πυκνότητα? LVD, πυκνότητα lymphvessel? VEGF, αγγειακός ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα? COX, κυκλοοξυγενάσης.

Η

Για να διευκρινιστεί η σημασία των εκφράσεων του VEGF-A, VEGF-C, και COX-2 για MVD και LVD με μεγαλύτερη λεπτομέρεια, πολυπαραγοντική ανάλυση διεξήχθη με μοντέλα, συμπεριλαμβανομένων αυτών των παραγόντων, στάδιο pt, και την τάξη. Όσον αφορά την MVD, αν και ο VEGF-C και COX-2 συσχετίστηκαν με MVD (OR = 1.05, 95% CI = 1.2 έως 1.8,

P

= 0,002 και OR = 1.05, 95% CI = 1.00- 1.11,

P

= 0,043, αντίστοιχα), VEGF-A έκφρασης έδειξε την ισχυρότερη συσχέτιση (OR = 1,05, 95% CI = 01.03 με 01.11,

P

& lt? 0.001). Παρόμοια ανάλυση έδειξε ότι ο VEGF-C που σχετίζονται πιο στενά με LVD (OR = 1.05, 95% CI = 1.1 έως 1.8,

P

= 0,001), ενώ VEGF-A έκφραση συσχετίστηκε επίσης (OR = 1.05, 95% CI = 1.1 έως 1.8,

P

= 0,011).

Survival αναλύσεις

έκφραση Πυρηνική HuR δεν ήταν αναγνωριστεί ως σημαντικός παράγοντας πρόβλεψης της υποτροπής στο ουροποιητικό, μετάσταση, ή να προκαλέσει ειδικά την επιβίωση (log-rank

P

= 0.156,

P

= 0.058 και

P

= 0,940, αντίστοιχα). Αντιστρόφως, υψηλή κυτοπλασμική έκφραση HuR ήταν σημαντικός προγνωστικός για κάθε μία από αυτές τις παραμέτρους (Εικ. 4 Α-C). Για να εμφανίσετε περισσότερες αναλυτικές τιμές προγνωστικοί παράγοντες, παρόμοιες αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν επίσης για παθολογικά χαρακτηριστικά και επικουρική θεραπεία. Επιπλέον, δείξαμε πολυμεταβλητή ανάλυση μοντέλων συμπεριλαμβανομένων όλων αυτών των παραγόντων (Model Α) και κυτταροπλασματική έκφραση HuR και παθολογικά χαρακτηριστικά (Model Β) έδειξε στον Πίνακα 3. Και στα δύο μοντέλα, η έκφραση HuR αναγνωρίστηκε ως προγνωστικός παράγοντας για τη μετάσταση, αλλά όχι για υποτροπή στο ουροποιητικό σύστημα (HR = 2,00, 95% CI = 0,98 – 4,11,

P

= 0.057 στο Μοντέλο Α ​​και HR = 1,82, 95% CI = 0,90 – 3,72,

P

= 0.094 στο Model B) και να προκαλέσει ειδικά επιβίωση (HR = 5,42, 95% CI = 0,29 – 6,71,

P

= 0.688 στο Μοντέλο Α ​​και HR = 1,26, 95% CI = 0,42 – 3,75,

P

= 0,683 στο μοντέλο Β).

Η

Συζήτηση

Η παρούσα μελέτη έδειξε ότι η κυτταροπλασματική έκφραση HuR ήταν στενά συνδεδεμένη με κακοήθη δυναμικό, την εξέλιξη του όγκου , και την έκβαση για ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Αντίθετα, καμία τέτοια σημασία βρέθηκε για την πυρηνική έκφραση της HuR. Προηγούμενες μελέτες έχουν ανιχνεύσει κυτταροπλασματική συσσώρευση σε αρκετούς καρκίνους, δείχνοντας ότι πυρηνοκυτταροπλασματικής μετατόπιση HuR ήταν απαραίτητη για τη σταθερότητα του RNA [20], [21]. Τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν ένα παρόμοιο ρόλο σε ανθρώπινους ιστούς καρκίνου της ουροδόχου κύστης.

Αυτή είναι η πρώτη έκθεση σχετικά με τις σχέσεις μεταξύ της έκφρασης HuR και παθολογικά χαρακτηριστικά, την επανάληψη, και την επιβίωση σε ασθενείς με καρκίνωμα ουροφόρων του ουροποιητικού καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Όσον αφορά την παθολογική σημασία και προγνωστικές ρόλους των HuR, αρκετές προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ότι η υπερέκφραση συνδέεται με υψηλού βαθμού κακοήθειας, προχωρημένο στάδιο, και κακή επιβίωση σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου [6], του καρκίνου του μαστού [5], και καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων [7]. Ωστόσο, η έκφραση HuR δεν φαίνεται να σχετίζεται με παθολογική κατάσταση σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού, με υψηλή έκφραση του HuR πρόβλεψη καλύτερη πρόγνωση [8]. Τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν προηγούμενη κατάσταση σε ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Ως μηχανισμός υποκείμενες τέτοια παθολογική δραστηριότητες HuR, ρύθμιση της αγγειογένεσης έχει προταθεί σε διάφορους καρκίνους [3], [4]. Ιδιαίτερη προσοχή δόθηκε στις σχέσεις μεταξύ της έκφρασης HuR, κακοήθους δυναμικού και παθολογικά χαρακτηριστικά επειδή η διέγερση της αγγειογένεσης έχει συνδεθεί με την ανάπτυξη και την εξέλιξη του όγκου σε ασθενείς με διάφορες κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου της ουροδόχου κύστης [13], [22]. Τέλος, τα αποτελέσματα μας έδειξαν την πιθανότητα ότι κυτταροπλασματική έκφραση του HuR θετικά σχετίζεται με κακοήθη συμπεριφορά και την έκβαση σε ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Επιπλέον, υπάρχει μια πιθανότητα ότι η εν λόγω κακοήθης επιθετικότητα σχετίζεται με HuR σχετίζονται αγγειογένεση.

Ένα από τα πιο ενδιαφέροντα ευρήματα αυτής της μελέτης ήταν ότι η κυτταροπλασματική έκφραση HuR συσχετίζεται θετικά με λεμφαγγειογένεση σε ιστούς καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Για το καλύτερο της γνώσης μας, αυτή η μελέτη είναι η πρώτη που αναφέρει μια σχέση μεταξύ της έκφρασης HuR και λεμφαγγειογένεση σε ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης, αν και έχουν παρόμοια ευρήματα έχουν εντοπιστεί σε καρκίνο του πνεύμονα και σε προηγούμενες εκθέσεις [4]. Επιπλέον, έχει ενδιαφέρον, τόσο που αναφέρει και η παρούσα μελέτη έδειξε ότι η κυτταροπλασματική έκφραση HuR συσχετίζεται τόσο με την αγγειογένεση και λεμφαγγειογένεση. Λαμβάνοντας υπόψη αυτά τα αποτελέσματα, υποθέσαμε ότι συν-παράγοντες που μπορούν να επηρεάσουν τόσο την αγγειογένεση και λεμφαγγειογένεση μπορεί να συνδεθεί με τέτοιο εύρημα σε καρκινικούς ιστούς.

Λεπτομερής ρυθμιστικών μηχανισμών της αγγειογένεσης και λεμφαγγειογένεσης από HuR σε ανθρώπινους καρκινικούς ιστούς δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητή . Αρκετά μόρια έχουν αναφερθεί ότι HuR σχετίζονται, όπως ο VEGF-A [10], VEGF-C, και COX-2 [7], [9]. Αυτοί οι παράγοντες είναι γνωστό ότι σχετίζονται με MVD και LVD στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Ωστόσο, οι σχέσεις μεταξύ της έκφρασης HuR και αυτές την αγγειογένεση και την λεμφαγγειογένεση που σχετίζονται με τα μόρια σε ανθρώπινους ιστούς καρκίνου της ουροδόχου κύστης είναι ακόμα ασαφής. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η κυτταροπλασματική έκφραση HuR συσχετίζεται θετικά με εκφράσεις του VEGF-Α και -C, αλλά όχι VEGF-D. Έχουμε αναφέρει προηγουμένως ότι ο VEGF-Α και -C συσχετίζονταν σημαντικά με MVD και LVD σε ανθρώπινους ιστούς καρκίνου της ουροδόχου κύστης [13]. Επιπλέον, τέτοιες σημαντικές σχέσεις δεν ανιχνεύθηκαν ως προς την έκφραση της πυρηνικής HuR. Λαμβάνοντας υπόψη αυτά τα ευρήματα, εμείς εικάζουν ότι η μετατόπιση από τον πυρήνα προς κυτταρόπλασμα είναι μια σημαντική διαδικασία για την τόνωση της αγγειογένεσης και λεμφαγγειογένεσης. Επιπλέον, προς τα πάνω ρύθμιση του VEGF-Α και -C εκφράσεις μπορεί να σχετίζεται με αυτό το φαινόμενο σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης.

Ένα επιπλέον σημαντικό αποτέλεσμα στην παρούσα μελέτη ήταν το γεγονός ότι η κυτταροπλασματική έκφραση HuR ήταν ένα χρήσιμο προγνωστικό της πρόγνωσης σε ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης που υποβλήθηκαν σε TUR. Ειδικότερα, η έκφραση συνδέθηκε στενά με την μετεγχειρητική μετάσταση. Πολλοί ερευνητές εντοπίστηκαν αυξήθηκαν MVD και LVD τόσο ισχυρή πρόβλεψης της έκβασης σε ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης [13], [23], [24]. Με βάση αυτά τα ευρήματα, σκεφτήκαμε ότι μια τέτοια προγνωστικό ρόλο της MVD και LVD ήταν λογικό. Από την άλλη πλευρά, κυτταροπλασματική έκφραση του HuR ταυτοποιήθηκε ως ένα σημαντικό προγνωστικό παράγοντα της αιτίας ειδικών επιβίωση σε μονοπαραγοντική ανάλυση, αλλά όχι ως ανεξάρτητος προγνωστικός σε πολυπαραγοντική ανάλυση. Δεν είμαστε σίγουροι γιατί προέκυψαν αυτές οι διαφορές σε αυτή τη μελέτη. Ωστόσο, μετεγχειρητική επιβίωση επηρεάζεται από πολλούς παράγοντες. Έτσι σκέφτηκαν ότι κυτταροπλασματική HuR μπορεί να παίξει διάφορους ρόλους στην επιβίωση των ασθενών, ενώ διάφοροι άλλοι παράγοντες και τα μόρια μπορούν να έχουν ισχυρότερες επιπτώσεις για τον προσδιορισμό των αποτελεσμάτων για τους ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης.

Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι κυτταροπλασματική εκφράσεις HuR στην καρκίνο της ουροδόχου κύστης κύτταρα ήταν υψηλότερες από εκείνες σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα. Οι Βιολογικές λειτουργίες HuR σε ανθρώπου και ποντικού έχει αναφερθεί ότι είναι παρόμοια σε προηγούμενη έκθεση [25]. Ωστόσο, η επικύρωση της εξειδίκευσης των στόχων HuR δεν είναι ακόμα απολύτως σαφής. Επιπλέον, πρόσφατα και λεπτομερής παθολογική λειτουργία του HuR σε καρκινικά κύτταρα γίνονται όλο και πιο καθαρά κατά τα τελευταία έτη [26]. Έτσι, περαιτέρω μελέτες σχετικά με τα πειράματα μοριακού μηχανισμού και κυτταρικής βιολογίας είναι αναγκαίο να κατανοήσουμε πιο λεπτομερείς παθολογικές ρόλους των HuR στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης.

Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η κυτταροπλασματική έκφραση HuR ήταν σημαντικά σχετίζεται με κακοήθη επιθετικότητα και τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης έκβαση των ασθενών, ενώ η έκφραση των πυρηνικών HUR δεν ήταν. Επιπλέον, κυτταροπλασματική έκφραση HuR σχετίζεται με την αγγειογένεση, τη λεμφαγγειογένεση και αυτές που σχετίζονται με μόρια που περιλαμβάνουν VEGF-A, VEGF-C, και COX-2. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η κυτταροπλασματική έκφραση HuR ήταν χρήσιμη ως προγνωστικό δείκτη για μετάσταση μετά TUR σε ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Για να αποκτήσετε περαιτέρω μηχανιστική αντίληψη, περαιτέρω

in vivo

και

in vitro

μελέτες για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης είναι αναγκαία.

Ευχαριστίες

Είμαστε ευγνώμονες στον κ Takumi Shimogama και η κα Μίχο Μ Kuninaka για την εξαιρετική υποστήριξή τους.