Αφηρημένο

Σκοπός

Για να παρέχει πρόσθετες λειτουργικές πληροφορίες για τον χαρακτηρισμό του όγκου, μελετήσαμε τη χρήση διπλής ενέργειας αξονικής τομογραφίας για την απεικόνιση όγκων του πνεύμονα ποντικού. όγκου αίματος όγκου και της αγγειακής διαπερατότητας ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας χρυσό και ιώδιο νανοσωματίδια. Η προσέγγιση αυτή συγκρίνεται με ένα μόνο παράγοντα αντίθεσης /μέθοδος CT μονής ενέργειας.

Ex vivo

μελέτες επικύρωσης έγιναν για να αποδειχθεί η ακρίβεια των

in vivo

αντίθεση ποσοτικοποίηση παράγοντα από CT.

Μέθοδοι

Πρωτοβάθμια όγκων του πνεύμονα παρήχθησαν στην

LSL-Kras

G12D? p53

FL /FL

ποντίκια. Τα νανοσωματίδια χρυσού ενέθηκαν, ακολουθούμενα από ιώδιο νανοσωματίδια δύο ημέρες αργότερα. Το χρυσό συσσωρευμένη σε όγκους, ενώ το ιώδιο παρέχεται ενδοαγγειακή αντίθεση. Τρεις αξονικές τομογραφίες διπλής ενέργειας διεξήχθησαν δύο για τη μέθοδο του μονού παράγοντα αντίθεσης και μία για τη μέθοδο διπλού παράγοντα αντίθεσης. Οι συγκεντρώσεις Χρυσό και ιώδιο σε κάθε σάρωση υπολογίστηκαν με τη χρήση διπλής ενέργειας αποσύνθεσης. Για κάθε μέθοδο, ο όγκος όγκος κλασματική αίμα υπολογίστηκε με βάση τη συγκέντρωση ιωδίου, και την αγγειακή διαπερατότητα όγκου υπολογίστηκε με βάση την συσσωρευμένη συγκέντρωση χρυσού. Για την επικύρωση, ο CT-προέρχεται μετρήσεις συγκρίθηκαν με ιστολογία και οπτική φασματοσκοπία εκπομπής επαγωγικά συζευγμένου πλάσματος μετρήσεις των συγκεντρώσεων χρυσού στους ιστούς.

Αποτελέσματα

Διπλής ενέργειας CT ενεργοποιήσετε την

in vivo

διαχωρισμό του χρυσού και την αντίθεση ιώδιο παράγοντες και έδειξε πρόσληψη νανοσωματίδια χρυσού στο σπλήνα, το ήπαρ, και όγκους. Τα καρκινικά μετρήσεις όγκου κλασματική αίματος προσδιορίζονται από τις δύο μεθόδους απεικόνισης ήταν σε συμφωνία, και μία υψηλή συσχέτιση (R

2 = 0,81) βρέθηκε μεταξύ μετριέται κλασματικό όγκο του αίματος και ιστολογία που προέρχονται από την πυκνότητα μικροαγγειακή. Αγγειακές μετρήσεις διαπερατότητας λαμβάνονται από τις δύο μεθόδους απεικόνισης συμφώνησε επίσης με

ex vivo

μετρήσεις.

Συμπεράσματα

Διπλής ενέργειας CT χρησιμοποιώντας δύο τύπους των νανοσωματιδίων είναι ισοδύναμο με το ενιαίο νανοσωματιδίων μέθοδος, αλλά επιτρέπει τη μέτρηση των κλασματικών όγκου του αίματος και η διαπερατότητα με ένα μόνο σάρωση. Όπως επιβεβαιώνεται από

ex vivo

μεθόδους, CT-προέρχεται συγκεντρώσεις νανοσωματιδίων είναι ακριβείς. Αυτή η μέθοδος θα μπορούσε να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στο χαρακτηρισμό του πνεύμονα όγκου με CT

Παράθεση:. Ashton JR, Clark DP, moding EJ, Ghaghada Κ, ΓΔ Kirsch, Δυτική JL, et al. (2014) διπλής ενέργειας Micro-CT Λειτουργική Απεικόνιση του πρωτοπαθή καρκίνο του πνεύμονα σε ποντίκια χρησιμοποιώντας χρυσό και ιώδιο νανοσωματιδίων Contrast Agents: μια μελέτη επικύρωσης. PLoS ONE 9 (2): e88129. doi: 10.1371 /journal.pone.0088129

Επιμέλεια: Τάνια Β Kalin, Ιατρικό Κέντρο Νοσοκομείο Σινσινάτι των παιδιών, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 5 Σεπ 2013? Αποδεκτές: 6 Ιανουαρίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 10 Φεβρουαρίου 2014

Copyright: © 2014 Ashton et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τη χρηματοδότηση από ένα Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας /Εθνικό Κέντρο Έρευνας επιχορήγηση Πόρων Εθνικό Βιοϊατρικής Τεχνολογίας Resource Center (Ρ41 EB015897) (CTB), και από το National Cancer Institute U54 CA151668 (JLW). Άλλα υποστήριξη που παρέχεται από ΝΙΗ /NCI R21 CA175839 και ΝΙΗ /Εθνικό Ινστιτούτο Αλλεργιών και Λοιμωδών Νοσημάτων K02 AI093866 (DGK). JRA υποστηρίζεται από μια ιατρική Επιστήμονας Εκπαίδευση Εκπαιδευτικό Πρόγραμμα επιχορήγησης (Τ32 GM007171) και Δούκας Θεσμικών υποτροφία. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση ελήφθη για τη μελέτη αυτή. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. KG κατέχει δικαιώματα προαίρεσης αγοράς μετοχών στο Marval Βιοεπιστημών, μια νεοσύστατη εταιρεία που επιδιώκουν την ανάπτυξη της ένα λιποσωματικό ιωδιωμένο παράγοντα CT αντίθεσης. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

καρκίνου

πνεύμονα παραμένει η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο παγκοσμίως και ο αριθμός των θανάτων που αποδίδονται για καρκίνο του πνεύμονα αναμένεται να αυξηθεί κατά 50% έως το 2020 [1]. Η υπολογιστική τομογραφία (CT) είναι το πρότυπο τεστ απεικόνισης για την αξιολόγηση των ασθενών με υποψία καρκίνο του πνεύμονα. Δυστυχώς, κακοήθεις και καλοήθεις όζοι του πνεύμονα παρουσιάζουν συχνά παρόμοια ακτινολογικά χαρακτηριστικά στην αξονική τομογραφία [2], οπότε κακοήθεια δεν μπορεί πάντα να εντοπιστεί και αντιμετωπιστεί σωστά. Στο Εθνικό Καρκίνο του Πνεύμονα Δίκη Screening (NLCST), CT έλεγχο σε ασθενείς υψηλού κινδύνου μειωμένη πνευμονική ειδική θνησιμότητα λόγω καρκίνου [3], και η προληπτική Υπηρεσίες Task Force των Ηνωμένων Πολιτειών συνέστησε πρόσφατα ρουτίνας CT καρκίνο του πνεύμονα σε ασθενείς υψηλού κινδύνου? Ωστόσο, αυτή η διαλογή οδηγεί αναπόφευκτα στην ανίχνευση των μικρών πνευμονικών οζιδίων (& lt? 1 cm) που δεν είναι καλά χαρακτηρισμένα από σήμερα διαθέσιμα απεικονιστικές μεθόδους (PET, CT, ή MRI) [4]. Η NLCST αποδείξει ότι τα περισσότερα από αυτά τα οζίδια δεν είναι κλινικά σημαντική. Κατά συνέπεια, υπάρχει ανάγκη να επεκταθεί η πληροφορίες που παρέχονται από αξονική τομογραφία για οζίδιο χαρακτηρισμό-τόσο για τον χαρακτηρισμό των γνωστών όγκων και για τη διαφοροποίηση πρόσφατα ανιχνεύθηκε κακοήθων όγκων από καλοήθεις όζους.

Μια πιθανή μέθοδος για επιπλέον χαρακτηρισμό των όγκων είναι να μελέτη των πνευμόνων αγγείωση του όγκου. Η αγγειογένεση είναι ένας βασικός παράγοντας στην ανάπτυξη του καρκίνου και μετάσταση. Συγκεκριμένα, η αγγειογένεση προάγει την ανάπτυξη του όγκου με την παροχή όγκων με θρεπτικά συστατικά που απαιτούνται και παρέχει έναν αγωγό για μεταστατική εξάπλωση. Όγκου αγγειακό σύστημα που σχηματίζεται από την ταχεία αγγειογένεση τείνει να είναι λιγότερο καλά οργανωμένη και πιο διαπερατό από το φυσιολογικό αγγειακό σύστημα [5]. Η πυκνότητα του αγγειακού συστήματος του όγκου, η οποία συχνά σχετίζεται με την έκταση της αγγειογένεσης, σχετίζεται με την επιθετικότητα του όγκου και μπορεί να συσχετίζεται με την επιβίωση [6]. Υπάρχουν επίσης αποδείξεις ότι η έκταση της αγγειοβρίθειας και της αγγειακής διαπερατότητας διαφέρει μεταξύ καλοήθων και κακοήθων πνευμονικά οζίδια [7]? Ωστόσο, πιο αναλυτικές μελέτες, οι οποίες είναι προτιμότερο να γίνεται σε προκλινικό επίπεδο, είναι αναγκαία για τη διαλεύκανση της σημασίας αυτών των αγγειακών βιοδείκτες στον καρκίνο του πνεύμονα.

Χρησιμοποιώντας προκλινικές μελέτες σε ποντίκια, έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι νωχελικός και επιθετική πνεύμονα όγκοι μπορούν να διαφοροποιηθούν χρησιμοποιώντας απλούς ενέργεια μικρο-CT και μία λιποσωματική περιέχουν ιώδιο (Lip-I) παράγοντα αντίθεσης [8]. Αυξημένη συσσώρευση των νανοσωματιδίων (λόγω της αυξημένης αγγειακής διαπερατότητας) αποδείχθηκε σε περισσότερο επιθετικούς όγκους σε σύγκριση με αυτές που νωχελικός, ενώ αγγειακή πυκνότητα ήταν παρόμοια και στις δύο τύπους όγκου. Τα πειράματα παράγοντα ενιαίο αντίθεση απαιτούνται δύο αξονικές τομογραφίες που χωρίζονται από αρκετές ημέρες για να επιτρέψει την πλήρη κάθαρση του αίματος του παράγοντα αντίθεσης ώστε να ποσοτικοποιηθούν και να διαφοροποιηθούν αγγειακή σήμα από το σήμα συσσώρευση όγκου. δεν μπορεί να απαιτηθεί η καθυστέρηση μεταξύ της πρώιμης και απεικόνισης καθυστερημένη φάση αν υιοθετήσουμε μια πιο κομψή λύση που περιλαμβάνει δύο διαφορετικούς τύπους των νανοσωματιδίων και των μεθόδων απεικόνισης CT, όπως η φασματική ή διπλής ενέργειας (DE) CT.

DE απεικόνισης είναι μια προηγμένη τεχνική που έχει πρόσφατα αυξηθεί στο προσκήνιο της τεχνολογίας CT [9]. Απορρόφηση των ακτίνων Χ με παράγοντες αντίθεσης εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό και στις δύο ατομικό βάρος του παράγοντα αντίθεσης και την ενέργεια της προσπίπτουσας ακτίνων Χ. Έτσι, δύο υλικών διαφορετικής ατομικού βάρους μπορεί να διαφοροποιηθεί από το ένα το άλλο με βάση τις μοναδικές συντελεστές εξασθένησης τους σε δύο διαφορετικές ενέργειες ακτίνων Χ. DE-CT επιτρέπει την επιλεκτική απεικόνιση και την ποσοτικοποίηση των πολλαπλών παραγόντων αντίθεσης σε ένα ενιαίο σάρωση. DE-CT έχει σημειώσει σημαντική πρόοδο στην κλινική απεικόνιση του καρκίνου. Για όγκους του πνεύμονα, έχει δειχθεί ότι η ενίσχυση ιώδιο σε κλινικές DE-αξονική τομογραφία μπορεί να συσχετισθεί με το SUV

max της

18FDG- ΡΕΤ [10], [11], που δείχνουν ότι το DE-CT έχει τη δυνατότητα να παρατείνει CT απεικόνιση πέρα ​​από καθαρά ανατομική απεικόνιση σε λειτουργική και μοριακή απεικόνιση. Ενώ DE-CT δείχνει υψηλή υπόσχεση στην κλινική για την απεικόνιση του καρκίνου, δεν έχει υιοθετηθεί σε μεγάλο βαθμό στην προκλινική τομέα λόγω των προκλήσεων που συνδέονται με υψηλότερη χωρική ανάλυση, χρονική ανάλυση, και τα επίπεδα θορύβου σε μικρο-CT. Εμείς, ωστόσο, ήταν σε θέση διεύθυνση κάποιες από αυτές τις προκλήσεις και έχουν δείξει ότι DE μικρο-CT χρήση νανοσωματιδίων σαν παράγοντες αντίθεσης μπορούν να διαδραματίσουν σημαντικό ρόλο σε προκλινικές απεικόνισης για καρδιακή [12], του πνεύμονα [13], και οι εφαρμογές του καρκίνου [14] , [15].

παράγοντες αντίθεσης νανοσωματιδίων είναι απαραίτητα για προκλινικές μελέτες CT επειδή οι συνήθεις παράγοντες αντίθεσης εκκαθαριστεί από την κυκλοφορία του αίματος πολύ γρήγορα για την αποτελεσματική απεικόνιση. Τα περισσότερα προκλινικά μοντέλα ζώων, ειδικά τα ποντίκια, είναι σε θέση να νεφρική σαφής μοριακό βάρος κλινικών παραγόντων χαμηλής αντίθεσης από το αίμα τους μέσα σε δευτερόλεπτα (φυσιολογικό αίμα ημίσειας ζωής στον άνθρωπο είναι 2-3 ώρες [16]), λόγω της εξαιρετικά υψηλή καρδιακή παροχή τους. Νανοσωματίδια χρησιμοποιούνται ως παράγοντες αντίθεσης CT τυπικά έχουν ένα μακρύ (& gt? 2 ώρα) ημίσειας ζωής και επίσης τείνουν να συσσωρεύονται σε όγκους, λόγω της ενισχυμένης διαπερατότητας και κατακράτησης (EPR) αποτέλεσμα [17]. Η χρησιμότητα αυτών των παραγόντων σε προκλινικά απεικόνισης CT έχει εδραιωθεί [14], [18] – [24]

Έχουμε αναπτύξει πρόσφατα μια μέθοδο DE μικρο-CT για το διαχωρισμό του χρυσού και με βάση το ιώδιο νανοσωματιδίων για. αγγειακή απεικόνιση σε σαρκώματα μαλακών ιστών [14]. Στη μέθοδο αυτή, οι νανοσωματιδίων χρυσού εγχέονται και αφήνεται να συσσωρεύονται στον ιστό του όγκου για δύο ημέρες. Λιποσωμική ιώδιο στη συνέχεια με ένεση και ακολουθήθηκε αμέσως από ένα DE-CT scan, ενώ το ιώδιο παραμένει ενδοαγγειακή. Αγγειακής διαπερατότητας (ρυθμός πρόσληψης νανοσωματιδίων όγκου) υπολογίζονται με την μετρημένη συγκέντρωση του χρυσού στους ιστούς, ενώ ο όγκος του αίματος υπολογίζεται από τις συγκεντρώσεις ιωδίου ιστό. Η παρούσα εργασία έχει ως στόχο να εφαρμόσει τη μέθοδο micro-CT DE στο δύσκολο έργο των όγκων του πνεύμονα απεικόνισης για την ποσοτικοποίηση του όγκου του αίματος του όγκου και την αγγειακή διαπερατότητα. Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι η μέθοδος δύο παράγοντα αντίθεσης (δύο-υλικό), η οποία απαιτεί μόνο μία απλή αξονική τομογραφία, συγκρίνεται ευνοϊκά με τη μέθοδο μας προηγουμένως δημοσιευμένου ενιαίου παράγοντα αντίθεσης (single-υλικό), η οποία απαιτούσε δύο αξονικές τομογραφίες σε απόσταση αρκετών ημερών χώρια [8]. Είναι σημαντικό, έχουμε ως στόχο να επικυρώσει μας

in vivo

διπλής ενέργειας αποτελεσμάτων με

ex vivo

χρυσό πρότυπο μετρήσεων. Για το καλύτερο της γνώσης μας, δεν έχουν υπάρξει δημοσιευμένες κλινικές ή προκλινικές μελέτες DE-CT με αυστηρή επικύρωση υπολογίζεται

in vivo

συγκεντρώσεις υλικό. Οι μετρήσεις DE συνήθως διακριβώνεται χρησιμοποιώντας

in vitro

φαντάσματα, η οποία κατά προσέγγιση, αλλά δεν αντιπροσωπεύει πλήρως,

in vivo

συνθήκες. Ως εκ τούτου, υπάρχει η δυνατότητα για σημαντικό σφάλμα στις μετρήσεις DE όταν στηρίζεται μόνο σε in vitro βαθμονομήσεις φάντασμα. Σε αυτό το χειρόγραφο, αναλαμβάνουμε

in vivo

επικύρωσης, η οποία είναι ζωτικής σημασίας για την περαιτέρω ανάπτυξη DE-CT για προκλινικά μοντέλα.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Όλα τα ζώα εξετάζονται σύμφωνα με την ορθή πρακτική των ζώων, όπως ορίζεται από τις αρμόδιες εθνικές ή /και τοπικούς φορείς καλή διαβίωση των ζώων, καθώς και η εργασία των ζώων εγκρίθηκε από την Επιτροπή Θεσμικών Animal Care and Use (IACUC πρωτόκολλο A283-11-11) της University Medical Center Duke. Το πρόγραμμα διαχείρισης των ζώων του Πανεπιστημίου Duke Medical Center είναι πιστοποιημένο από την Αμερικανική Ένωση για την αξιολόγηση και διαπίστευση του Εργαστηρίου Φροντίδα Ζώων (AAALAC) και πληροί Εθνικά Ινστιτούτα πρότυπα υγείας, όπως ορίζεται στον «Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου» (DHHS δημοσίευση Νο (ΝΙΗ) 85-23, αναθεωρημένη 1985). Το ίδρυμα δέχεται επίσης ως υποχρεωτική την «Πολιτική για την ανθρώπινη φροντίδα και χρήση των πειραματόζωων από awardee Ιδρύματα» PHS και «ΝΙΗ Αρχές για την αξιοποίηση και τη φροντίδα των σπονδυλωτών ζώων που χρησιμοποιούνται στις δοκιμές, έρευνα και εκπαίδευση.».

Λιποσωμικά ιώδιο Κατασκευή

λιποσωμιακή ιώδιο παρήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Ένα μίγμα λιπιδίων (200 mmol /L) που αποτελείται από 1,2-διπαλμιτοϋλ-sn-γλυκερο-3-φωσφοχολίνη (DPPC), χοληστερόλη, και 1,2-διστεαροϋλο-sn-γλυκερο-3-φωσφοαιθανολαμίνη-Ν- [μεθοξυ ( πολυαιθυλενογλυκόλη) -2000] (DSPE-MPEG 2000) σε ένα 55:40: 5 μοριακή αναλογία διαλύθηκε σε αιθανόλη και ενυδατωμένο με ένα πυκνό διάλυμα iodixanol (550 mg I /ml). Το προκύπτον διάλυμα λιπιδίων διαδοχικά εξωθήθηκε σε εξωθητήρα Lipex Thermoline (Βόρεια Lipids, Vancouver, British Columbia, Canada) το μέγεθος των λιποσωμάτων να ~ 100 nm. Το διάλυμα λιποσωμάτων διαδιηθήθηκε χρησιμοποιείτε μονάδα MicroKros® (Spectrum Laboratories, Milpitas, CA) για την απομάκρυνση un-έγκλειστα iodixanol.

Λιποσωμικά Ιώδιο Χαρακτηρισμός

Η κατανομή μεγέθους των λιποσωμάτων στο τελικό σκεύασμα ήταν προσδιορίστηκε με δυναμική σκέδαση φωτός (DLS) χρησιμοποιώντας ένα Malvern Zetasizer Nanoseries (Malvern Instruments, Worcestershire, UK) στους 25 ° C. μετάδοσης ηλεκτρονίου μικροσκοπία (ΤΕΜ) πραγματοποιήθηκε για επιπλέον ανάλυση μεγέθους και χαρακτηρισμό παράγοντα αντίθεσης. Τα λιποσώματα ήταν spot-αποξηραμένα σε ένα πλέγμα ταινία του άνθρακα και απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα FEI Tecnai G

2 μονά TEM (FEI, Hillsboro, OR) σε τάση λειτουργίας των 120 mV. διάμετρος σωματιδίων μετρήθηκε για 200 λιποσωμάτων χρησιμοποιώντας ImageJ (https://rsbweb.nih.gov/ij/, ΝΙΗ). Η συγκέντρωση ιωδίου στο τελικό διάλυμα λιποσωματικού ποσοτικοποιήθηκε με μέτρηση της απορρόφησης UV στα 245 nm χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο Cary 50 (Varian Medical Systems, Palo Alto, CA).

In vitro

σταθερότητα των λιποσωμάτων επιβεβαιώθηκε με μέτρηση απελευθέρωσης iodixanol από τα λιποσώματα μετά από επώαση σε φωσφορικό ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα (PBS) στους 37 ° C για 72 ώρες. Η συγκέντρωση του iodixanol απελευθερώνεται μετά από επώαση προσδιορίστηκε με διαπίδυση έναντι των λιποσωμάτων 500 mL PBS και μετρώντας την απορρόφηση υν του προϊόντος διαπήδησης σε μια κυψελίδα χαλαζία.

νανοσωματίδια χρυσού Fabrication

Τα νανοσωματίδια χρυσού (AuNPs) παρήχθησαν χρησιμοποιώντας την μέθοδο Frens [26]. 500 mL ενός 1 mM διαλύματος HAuCl

4 σε υπερκαθαρό νερό θερμάνθηκε σε βρασμό. Ένα προθερμασμένο διάλυμα 540 mg κιτρικού νατρίου διαλύθηκαν σε 3 mL νερού εγχύεται ταχέως εντός του διαλύματος χρυσό και το προκύπτον μίγμα αναδεύτηκε έντονα. Το χρώμα άλλαξε από κίτρινο σε άχρωμο έως σκούρο κόκκινο κατά τη διάρκεια των 30 δευτερολέπτων. Η αντίδραση συνεχίστηκε σε βρασμό για 15 λεπτά, μετά την οποία το δοχείο αντίδρασης απομακρύνθηκε από την πηγή θερμότητας και αφέθηκε να ψυχθεί με συνεχή ανάδευση για 1 ώρα. Μετά την ψύξη, τα νανοσωματίδια διηθήθηκαν χρησιμοποιώντας φίλτρο πολυαιθεροσουλφόνης 0,45-μm. Την παθητικοποίηση της παράγονται νανοσωματίδια, μία μεγάλη περίσσεια 5 kDa θειόλη τερματίζεται πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG? Laysan Bio, Αραβικά, AL) προστέθηκε στα διηθείται νανοσωματίδια, τα οποία στη συνέχεια ανακινείται σε θερμοκρασία δωματίου για 4 ώρες. Χωρίς περιορισμούς PEG μόρια απομακρύνθηκαν και τα σωματίδια συμπυκνώθηκαν χρησιμοποιώντας έναν φυγοκεντρικό φίλτρο 100 kDa.

νανοσωματίδια χρυσού Χαρακτηρισμός

Η κατανομή μεγέθους και το επιφανειακό φορτίο των νανοσωματιδίων χρυσού χαρακτηρίζονταν από DLS και δυναμικό ζήτα χρησιμοποιώντας ένα Malvern Zetasizer Nanoseries στους 25 ° C. κατανομή μεγέθους DLS επιβεβαιώθηκε με ΤΕΜ χρησιμοποιώντας ένα FEI Tecnai G

2 μονά ΤΕΜ που λειτουργεί σε 200 mV. διάμετρο σωματιδίου και αναλογία μετρήθηκαν για 200 AuNPs χρήση ImageJ. Τα φάσματα απορρόφησης του AuNPs αιωρήθηκε σε υπερκαθαρό νερό συλλέχθηκαν από 400 ως 650 nm χρησιμοποιώντας ένα UV-Vis φασματοφωτόμετρο. Σταθερότητα των νανοσωματιδίων ΡΕΟυλιωμένης έναντι συσσωμάτωσης επιβεβαιώθηκε με παρακολούθηση της UV-Vis φάσματος για 6 ώρες μετά την προσθήκη του φυσιολογικά διαλύματα άλατος 0.9% NaCl ή Modified Eagle Medium (ϋΜΕΜ) μέσο καλλιέργειας Dulbecco με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) σε λύσεις γυμνών ή πεγκυλιωμένη AuNPs. Η τελική συγκέντρωση του χρυσού στο συμπυκνωμένο διάλυμα AUNP προσδιορίσθηκε με UV-Vis απορρόφησης χρησιμοποιώντας τη δημοσιευμένη συντελεστή απόσβεσης 12 nm AuNPs στα 450 nm [27] και στη συνέχεια συσχετίζεται με τις μετρήσεις από φασματοσκοπία οπτικής εκπομπής πλάσματος με επαγωγική σύζευξη (ICP-OES ), όπως περιγράφεται παρακάτω.

Ιη Vivo Απεικόνιση Ογκου

όγκων του πνεύμονα παρήχθησαν με ενδορινική ένεση του αδενοϊού που εκφράζουν Cre ανασυνδυάση (Gene Transfer Vector πυρήνα, Πανεπιστήμιο της Αϊόβα) στο

LSL-Kras

G12D? p53

FL /FL

ένωση μεταλλαγμένα ποντίκια όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28] – [30]. Τα ποντίκια με πρωτοπαθείς όγκους του πνεύμονα χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη απεικόνισης σε 12 εβδομάδες μετά τη μόλυνση αδενο-Cre, στο οποίο σημείο πολλαπλές επιθετικές αδενοκαρκινώματα πνεύμονα (~0.5-1.5 mm σε διάμετρο) ήταν παρόντα σε κάθε ποντίκι. Όλα τα ζώα απεικονίστηκαν σε 24-30 εβδομάδες ηλικίας. Συνολικά πέντε ζώα χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη απεικόνισης. Λόγω της διαμήκους φύση αυτής της μελέτης, κάθε ποντικός υπηρέτησε ως μάρτυρας του εαυτού του.

Διαμήκης DE μικρο-CT απεικόνισης εκτελέστηκε σε όλα τα ζώα, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1. Τρία DE μικρο-CT τομογραφίες διεξήχθησαν για κάθε ποντίκι για να συγκρίνουν τη μέθοδο του μονού υλικού (αξονική τομογραφία 1 και 2) με νέα μας μέθοδος δύο-υλικό (αξονική τομογραφία 3). Σημειώνουμε ότι, σε αντίθεση με προηγούμενη μελέτη μας [14], DE-μικρο-CT εκτελέστηκε ακόμη και όταν χρησιμοποιείται ένα μόνο παράγοντα αντίθεσης, η οποία μας επέτρεψε να μετρηθεί η συγκέντρωση χρυσού χωρίς την ανάγκη για μια σάρωση προ-αντίθεση σύγκριση. Την ημέρα 1, ο παράγοντας αντίθεσης AUNP εγχύθηκε ενδοφλεβίως από ουραία φλέβα σε μία δόση όγκου 0,32 ml /25 gm βάρους σώματος και σαρώνει μετά την ένεση (CT scan 1) αμέσως αποκτήθηκαν. Στη συνέχεια, περίμενε 48 ώρες για να δοθεί επαρκής χρόνος για τη συσσώρευση χρυσού να συμβεί στους όγκους. Μετά από αυτή την καθυστέρηση (ημέρα 3) μια δεύτερη αξονική τομογραφία διπλής ενέργειας (αξονική τομογραφία 2) ελήφθη. Αμέσως μετά τη δεύτερη σάρωση, ο παράγοντας αντίθεσης λιποσωμική ιώδιο εγχύθηκε από φλέβα της ουράς σε δόση όγκου των 0,3 ml /25 gm βάρους σώματος και μια τρίτη σάρωση CT διπλής ενέργειας (CT scan 3) διεξήχθη. Μετά την τρίτη σάρωση, οι ποντικοί υποβλήθηκαν σε ευθανασία και οι ιστοί συλλέχθηκαν για μελέτες επικύρωσης, όπως περιγράφεται παρακάτω.

AuNPs εγχύθηκαν την ημέρα 1, ακολουθούμενη από σάρωση CT 1. Δύο ημέρες αργότερα, CT σάρωση 2 έγινε , ακολουθούμενη αμέσως από ένεση Lip-Ι και αξονική τομογραφία 3. Όλες οι σαρώσεις ήταν διπλής ενέργειας μικρο-CT εξαγορές.

η

διπλής ενέργειας Micro-CT Σύστημα

Ένα έθιμο ενσωματωμένο διπλής πηγής σύστημα απεικόνισης micro-CT χρησιμοποιήθηκε για τη μελέτη [31]. Τα ζώα σαρώθηκαν, ενώ ελεύθερη αναπνοή υπό αναισθησία χρησιμοποιώντας 2-3% ισοφλουράνιο παραδίδονται από τη μύτη κώνου. Η θερμοκρασία του σώματος διατηρήθηκε με λάμπες θερμότητας, ενός ορθού καθετήρα, και έναν ελεγκτή ανατροφοδότησης (Digi-Sense®, Cole Parmer, Chicago, IL). Υποψήφιοι αναπνευστικού περίφραξη χρησιμοποιήθηκε για την ελαχιστοποίηση των επιπτώσεων των ζώων αναπνευστικής κίνησης κατά τη διάρκεια σαρώσεων [32]. Ένα πνευματικό μαξιλάρι τοποθετημένο επί του θώρακα του ζώου συνδέεται με έναν μετατροπέα πίεσης χρησιμοποιήθηκε για την παρακολούθηση της αναπνοής. Μια εφαρμογή του LabVIEW (National Instruments, Austin, TX) χρησιμοποιήθηκε για την παρακολούθηση της αναπνευστικής σήμα και να προκαλέσει τους σωλήνες ακτίνων Χ στο τέλος λήξης υπολογίζοντας ένα σταθερό χρόνο καθυστέρησης από την κορυφή του αναπνευστικού σήματος. Εξαγορές πραγματοποιήθηκαν για τις δύο αλυσίδες απεικόνισης σε κάθε γωνία περιστροφής με 10 msec καθυστέρηση μεταξύ των δύο ανοίγματα σωλήνα ακτίνων Χ για την ελαχιστοποίηση πολλαπλής σκέδασης. Δεδομένου ότι αυτό είναι ένα πολύ σύντομο χρόνο σε σχέση με το μήκος του επίπεδου άκρου φάση εκπνοής, δεν επηρεάζει την απόδοση της αναπνευστικής διόδου. Ένα σύνολο 360 προβολές αποκτήθηκαν για κάθε αλυσίδα απεικόνισης κατά τη διάρκεια της περιστροφής 360 °. Κάθε προοπτικά-gated σάρωσης πήρε περίπου 7 λεπτά για να ολοκληρωθεί. Οι παράμετροι σάρωσης για τις διπλής ενέργειας σαρώσεις ήταν: 80 kVp, 160 mA, 10 ms /έκθεσης για την πρώτη αλυσίδα απεικόνισης και 40 kVp, 250 mA, 16 ms /έκθεσης για τη δεύτερη αλυσίδα απεικόνισης. Η συνολική δόση ακτινοβολίας που συνδέεται με τις τρεις αξονικές τομογραφίες ήταν 0,39 Gy.

Μετα-επεξεργασία και διπλής ενέργειας αποσύνθεσης

επεξεργασία δεδομένων DE μικρο-CT ακολούθησε το διάγραμμα ροής στο Σχήμα 2. Οι πρώτες 40 kVp και 80 σύνολα δεδομένων kVp ανακατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο Feldkamp [33] σε μια μήτρα 512 × 512 × 512 στα 88-μm ισοτροπική μεγέθους voxel. Affine καταχώριση έγινε για να βελτιωθεί η καταχώριση των αντίστοιχων 40 και 80 kVp ανακατασκευάστηκε όγκους χρησιμοποιώντας τα μυρμήγκια, ένα open-source, ΙΤΚ-based εργαλείων εγγραφής (Advanced Κανονικοποίηση Εργαλεία, https://picsl.upenn.edu/ANTS/? Svn 1409? [ ,,,0],34], [35]). Για τη βελτίωση της αποσύνθεσης, κάθε σύνολο δεδομένων ήταν απαλλαγμένου από θόρυβο χρήση κοινών διμερών διήθησης (BF). Κοινή BF είναι μια φασματική επέκταση του καλώς χαρακτηρισμένου άκρη συντηρητικά εξομάλυνση φίλτρο που θεωρεί την διανομή των γειτονικών voxels προς το χώρο και την ένταση. Κοινή BF υλοποιήθηκε με χρήση MATLAB (MathWorks, Natick ΜΑ), και γενικά ολοκληρώνεται μέσα σε 15 έως 20 λεπτά ανά σύνολο των ενεργειών. Λεπτομέρειες σχετικά με την εφαρμογή των κοινών BF σε μυϊκή μικρο-CT δεδομένων [36] και μια ποσοτική αξιολόγηση της εφαρμογής του BF σε DE μικρο-CT [13] έχουν περιγραφεί προηγουμένως.

Πρώτες 40 kVp και 80 KVP σύνολα δεδομένων αποκτήθηκαν, και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε affine εγγραφής και κοινών διμερών διήθησης να παράγει φιλτραρισμένα σύνολα δεδομένων. Διπλής ενέργειας αποσύνθεσης διεξήχθη επί αυτών των φιλτραρισμένες εικόνες, η οποία οδήγησε σε δύο ανεξάρτητες εικόνες (χάρτες) που αντιπροσωπεύουν την ιώδιο και συγκέντρωση χρυσού σε κάθε voxel. Μετά την απόκτηση των δύο χάρτες, οι εικόνες επικαλύφθηκαν και τα οστά κατά διαστήματα έξω (λευκού χρώματος) για να σχηματίσει την τελική επικάλυψη συγκέντρωση χάρτη. Αυτές οι εικόνες λήφθηκαν από τη σάρωση CT 3, στην οποία τόσο το ιώδιο και το χρυσό ήταν παρόντες στην κυκλοφορία του αίματος. Η ράβδος κλίμακας αντιπροσωπεύει το 1 cm σε όλες τις εικόνες. Οι εικόνες 40 και 80 kVp με παράθυρα από -300 να 1200 HU, οι χάρτες ιώδιο με παράθυρα από 0,25 έως 15 mg /mL, και το χρυσό χάρτες παραθυρώνονται από 0,25 έως 6 mg /mL.

Η

DE αποσύνθεση του χρυσού και ιώδιο διεξήχθη μετά την εγγραφή και διήθηση, με τη χρήση αντίστοιχων 80 και 40 kVp-φιλτραρισμένα δεδομένα, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14], [37]. Για κάθε voxel, η αποσύνθεση που εμπλέκονται επίλυση ενός συστήματος δύο εξισώσεων με δύο αγνώστους, C

I και C

Au, τα οποία αντιπροσωπεύουν τις συγκεντρώσεις του ιωδίου και του χρυσού, αντίστοιχα, εντός του δεδομένου voxel. Η μετρούμενη τιμή εξασθένησης CT σε κάθε voxel αντιπροσωπεύει ένα γραμμικό συνδυασμό των άγνωστων συγκεντρώσεων χρυσού και ιώδιο σε mg /mL συντελεστές της μήτρας CT ευαισθησία, όπως φαίνεται στις παρακάτω εξισώσεις:

Εδώ, C

I και C

Au είναι οι άγνωστες συγκεντρώσεις του ιωδίου και του χρυσού, αντίστοιχα, σε ένα δεδομένο voxel, CT

40 και CT

80, οι μετρούμενες εξασθενήσεις στο voxel σε 40 και 80 kVp, και CT

I, 40, CT

I, 80, CT

Au, 40, και CT

Au, 80 είναι εμπειρικώς προσδιορισμένη συντελεστές της σταθερής μήτρας ευαισθησία για το ιώδιο και το χρυσό στα 40 και 80 kVp σε μετρούμενη εξασθένηση (μονάδες HU) ανά συγκέντρωση παράγοντα αντίθεσης (mg /mL). Οι άγνωστες συγκεντρώσεις του ιωδίου και του χρυσού σε κάθε voxel προσδιορίστηκαν με αναστροφή αυτής της μήτρας ευαισθησία και την εύρεση της ελαχίστων τετραγώνων λύση του ακόλουθο σύστημα εξισώσεων σε MATLAB:

ενέργειες Σάρωση για βέλτιστη χρυσό και ιώδιο αποσύνθεση επιλέχθηκαν ακολουθεί το αποτελέσματα των προηγούμενων προσομοιώσεων μας και

in vitro

μελέτες [37]. Αυτές οι μελέτες έδειξαν ότι η μέγιστη φασματική διαφορά μεταξύ του χρυσού και ιώδιο για πολυχρωματικών πηγών ακτίνων Χ εμφανίστηκε σε τάσεις λειτουργίας 40 και 80 kVp. Οι τιμές για τους συντελεστές της μήτρας ευαισθησίας σε κάθε ενέργεια (CT

I, 40, CT

I, 80, CT

Au, 40, και CT

Au, 80) έχουν καθοριστεί εμπειρικά χρησιμοποιώντας ένα φάντασμα βαθμονόμηση όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14]. Για τη βαθμονόμηση φάντασμα, το CT εξασθένηση των φιαλιδίων γνωστής συγκέντρωσης χρυσού και ιωδίου μετρήθηκαν στα 40 και 80 kVp, και οι συντελεστές για την μήτρα ευαισθησία προσδιορίστηκαν με υπαγωγή της γνωστής χρυσό και συγκεντρώσεις ιωδίου προς τη μετρούμενη CT εξασθένησης χρήση γραμμικής τουλάχιστον τετραγώνων σε κάθε επίπεδο ενέργειας. Οι προκύπτουσες τιμές για CT

I, 40, CT

I, 80, CT

Au, 40, και CT

Au, 80 που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη ήταν 28,7, 42,6, 88,5, και 58,8 HU /mg /mL, αντίστοιχα. Μετά την αποσύνθεση, voxels με αρνητικές συγκεντρώσεις και των δύο υλικών με μηδέν. Voxels με αρνητική συγκέντρωση από ένα υλικό και μια θετική συγκέντρωση του άλλου υλικού είχαν προβάλλεται πάνω στον υπόχωρο του θετική συγκέντρωση.

In vitro

επικύρωση αυτής της μεθόδου αποσύνθεσης χρησιμοποιώντας τόσο την ψηφιακή και φυσική φαντάσματα έχει αποδειχθεί σε προηγούμενη εργασία μας [14]. Αυτές οι μελέτες επικύρωσης απέδειξαν την ικανότητα αυτής της μεθόδου αποσύνθεσης για την ακριβή μέτρηση των συγκεντρώσεων χρυσού και ιωδίου τόσο όταν είναι ανεξάρτητες η μια από την άλλη και όταν είναι παρόντα στο ίδιο voxel.

Εικόνα Ανάλυση

CT εικόνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Avizo (FEI Οπτικοποίηση Sciences Group, Burlington, ΜΑ). Περιοχές που αντιστοιχούν στο αίμα (κοιλιακή κοιλότητα και τα μεγάλα αγγεία) και σπλήνα αυτόματα κατά τμήματα χρησιμοποιώντας το σετ 80 δεδομένα kVp, ενώ οι περιοχές που αντιστοιχούν στο συκώτι και τα νεφρά ήταν ημι-αυτόματα κατά διαστήματα χρησιμοποιώντας το ίδιο σύνολο δεδομένων. Κάθε κατάτμηση περιοχή περιλαμβάνεται το σύνολο του οργάνου, αλλά εξαιρούνται τα μεγάλα αιμοφόρα αγγεία μέσα στο όργανο. Όγκοι διαστήματα ημι-αυτόματα χρησιμοποιώντας το χρυσό χάρτη από το διπλής ενέργειας αποσύνθεσης. Rough περιοχές ήταν το χέρι που εκτός των συνόρων του όγκου, και αυτές οι περιοχές ήταν κατώφλι για να επιλέξετε μόνο εκείνα τα voxels που περιείχε μια συγκέντρωση χρυσού μεταξύ 0,25 mg /mL και 3 mg /mL. Αυτές οι τιμές κατωφλίου επιλέχθηκαν, ώστε να αποκλειστεί η κανονική πνευμονικό παρέγχυμα, μεγάλα αιμοφόρα αγγεία, και τα οστά από τα διαστήματα όγκους. Ένα σύνολο 27 όγκων του πνεύμονα στις 5 ποντίκια εντοπίστηκαν και κατά διαστήματα σε κάθε μια από τις 3 DE μικρο-αξονικές τομογραφίες.

Μετά από κατάτμηση, συγκεντρώσεις χρυσού και ιωδίου μετρήθηκαν σε κάθε διαστήματα περιοχής ενδιαφέροντος από τον υπολογισμό του μέσου όρου αξία του χρυσού και ιώδιο χάρτες για ολόκληρη την περιοχή ενδιαφέροντος. Επειδή και οι δύο νανοσωματίδια είναι μακρύς παράγοντες αντίθεσης ημίσειας ζωής, παραμένουν σχεδόν εξ ολοκλήρου εντός του αγγειακού συστήματος αμέσως μετά την ένεση. Η κλασματική όγκος αίματος (FBV) κάθε όργανο μπορεί, ως εκ τούτου, να εκτιμηθεί με τη μέτρηση της χρυσό ή συγκέντρωση ιωδίου μέσα στο όργανο αμέσως μετά την ένεση νανοσωματιδίων. Υπολογίσαμε FBV την ημέρα 1, χρησιμοποιώντας τα AuNPs και ξανά την ημέρα 3 χρησιμοποιώντας το Lip-I. FBV υπολογίστηκε με την ακόλουθη εξίσωση: όπου C

Au, day1 είναι η μέση συγκέντρωση χρυσού σε έναν ιστό αμέσως μετά την ένεση του χρυσού την ημέρα 1, C

Au, αίμα, day1 είναι η μέση συγκέντρωση χρυσού στο τμηματικό αίμα την ημέρα 1, C

I, day3 είναι η μέση συγκέντρωση ιωδίου σε έναν ιστό αμέσως μετά την ένεση Lip-I, και C

Ι, το αίμα, day3 είναι η μέση συγκέντρωση ιωδίου μετρήθηκε στο τμηματικό αίμα την ημέρα 3. FBV υπολογίστηκε για κάθε τμηματικής όγκου, σπλήνα, το ήπαρ, τα νεφρά και στα δύο χρονικά σημεία. Αυτή η υπολογισμένη FBV είναι μια εκτίμηση του αγγειακού πυκνότητα εντός του ιστού, και συσχετίστηκε με πυκνότητα μικροαγγειακή υπολογίζεται με ανάλυση εικόνων των τμημάτων ιστολογικών ιστού, όπως περιγράφεται παρακάτω.

Μετά τον προσδιορισμό της FBV σε κάθε ιστό, η συγκέντρωση του χρυσός συσσωρευμένη μέσα σε κάθε ιστό υπολογίστηκε. Λόγω της μακράς ημιπεριόδου ζωής αίματος του, πάνω από το ήμισυ του παράγοντα αντίθεσης εγχύθηκε παρέμειναν στην κυκλοφορία του αίματος κατά την ημέρα 3. Κατά συνέπεια, η συγκέντρωση του χρυσού ιστού μετράται σε χρυσό χάρτη της CT περιλαμβάνει τόσο χρυσού που εξαγγείωση μέσα στον ιστό και το χρυσό που παραμένει ενδοαγγειακή εντός του ιστού. Η FBV υπολογίστηκε παραπάνω μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να αφαιρέσουμε το ενδοαγγειακή συγκέντρωση χρυσού σύμφωνα με τις ακόλουθες εξισώσεις: όπου C

Au, accum είναι η συσσωρευμένη (εξωαγγειακή) συγκέντρωση χρυσού σε έναν ιστό, C

Au, tot είναι το συνολικό χρυσός συγκέντρωση σε έναν ιστό που υπολογίζεται από χρυσό χάρτη της CT την ημέρα 3, C

Au, iv είναι η συγκέντρωση του χρυσού εντός ενός ιστού που παραμένει ενδοαγγειακή, και C

Au, το αίμα είναι η συγκέντρωση του χρυσού στο χύδην αίμα υπολογίζεται από χρυσό χάρτη της CT την ημέρα 3. Αυτές οι εξισώσεις χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό το συσσωρευμένο χρυσό μέσα σε κάθε όγκου και όργανο. Για τη μέθοδο του μονού παράγοντα αντίθεσης, η FBV από την αξονική τομογραφία 1 και τα χρυσά συγκεντρώσεις από αξονική τομογραφία 2 χρησιμοποιήθηκαν σε αυτούς τους υπολογισμούς. Για τη μέθοδο παράγοντα δύο Αντίθετα, οι συγκεντρώσεις FBV και χρυσό ήταν και οι δύο από την αξονική τομογραφία 3. Για την επικύρωση, αυτές οι συσσωρευμένες συγκεντρώσεις χρυσού σε σχέση με τις συγκεντρώσεις του χρυσού σε κάθε οργάνου μετρήθηκε με ICP-OES.

Επικύρωση Σπουδών

επεξεργασία ιστών.

δείγματα του αίματος, όγκων του πνεύμονα, και σε άλλα όργανα (νεφρός, ήπαρ, σπλήνα) εκχυλίστηκαν από όλα τα ποντίκια για ανάλυση. Ελήφθη αίμα από τους ποντικούς μετά από την πρώτη αξονική τομογραφία από τη φλέβα του προσώπου. Ένα τερματικό κλήρωση του αίματος και των οργάνων της συγκομιδής πραγματοποιήθηκαν μετά την τρίτη αξονική τομογραφία. Κάθε ποντικός τέθηκε υπό βαθιά αναισθησία με ενδοπεριτοναϊκή ένεση πεντοβαρβιτάλης. Αναισθησία επαληθεύεται από τα δάχτυλα τσίμπημα. Η κοιλιακή κοιλότητα ανοίχθηκε και λήφθηκε αίμα αργά από το κάτω κοίλη φλέβα, ενώ η καρδιά εξακολουθεί να χτυπάει. 0,5-1,0 ml αίματος συλλέχθηκαν από κάθε ποντικό, μετά από το οποίο κόπηκαν τα κάτω κοίλη φλέβα και η αορτή και το υπόλοιπο αίμα αφέθηκε να στραγγίσει μέσα στην κοιλιακή κοιλότητα. Η τραχεία στη συνέχεια διασωληνώθηκε με μια βελόνα 20-gauge, μέσω της οποίας ένα μίγμα 1:01 μέσου (OCT) και 30% σακχαρόζη cryoembedding εγχύθηκαν στους πνεύμονες για να γεμίσει τα εναέριους χώρους για αργότερα τομής ιστού. Μετά φούσκωμα με μέσο εγκλεισμού, οι πνεύμονες αφαιρέθηκαν από το ποντίκι και είτε αμέσως τεμαχίζεται για όγκους του πνεύμονα ή ενσωματωμένα σε OCT και καταψύχθηκαν σε ξηρό πάγο. Lung όγκοι που εξάγονται από τα ανατομή πνεύμονες ήταν εμποτισμένο με PBS για 5 λεπτά για να ξεπλύνετε μακριά υπολειμματικό αίμα και στη συνέχεια καταψύχθηκαν στους -80 ° C για ανάλυση ICP-OES. Μετά την εκχύλιση του πνεύμονα, το ήπαρ, σπλήνα, νεφρά και κάθε ποντικού συλλέχθηκαν και κόβεται στο μισό. Το πρώτο μισό του κάθε οργάνου αμέσως ενσωματωμένα σε OCT σε ξηρό πάγο για την κοπή. Το δεύτερο μισό εμβαπτίστηκε σε PBS για 5 λεπτά και καταψύχονται στους -80 ° C για ανάλυση ICP-OES. Όλοι οι ιστοί διατηρήθηκαν κατεψυγμένα στους -80 ° C μέχρι να είναι έτοιμο για περαιτέρω επεξεργασία.

Ιστολογία.

8-μm κατεψυγμένες τομές όγκων ανοσοχρωματίστηκαν για την CD31 ενδοθηλιακού δείκτη κυττάρου. Πριν από την κηλίδωση, οι τομές σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεϋδη, ξεπλύθηκαν με PBS, και αποκλείστηκαν με 10% FBS σε PBS για μία ώρα. Οι τομές στη συνέχεια επωάστηκαν με το πρωτογενές αντίσωμα (αντι-ποντικού αρουραίου CD31, BD Pharmingen) αραιωμένο 1:250 σε ρυθμιστικό αποκλεισμού επί 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Τα πλακίδια εκπλύθηκαν τρεις φορές με PBS για 10 λεπτά για να απομακρυνθεί το μη συνδεδεμένο κύριο αντίσωμα, μετά το οποίο το δευτερεύον αντίσωμα (Alexa Fluor488-συζευγμένο IgG γαϊδάρου αντι-αρουραίου, Invitrogen) αραιωμένο 1:500 σε ρυθμιστικό αποκλεισμού προστέθηκε και επωάστηκε για 1 ώρα σε το σκοτάδι. Πυρήνες αντίθετα με DAPI. Μερικά τμήματα 8-μm χρησιμοποιήθηκαν επίσης για αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε) χρώση. Για Η &? Χρώση Ε, τα δείγματα βάφτηκαν με αιματοξυλίνη, ξεπλένεται με νερό και αιθανόλη, χρωματίστηκαν με ηωσίνη Υ, κατόπιν ξεπλύθηκε με αιθανόλη και ξυλόλιο και συναρμολογούνται για μικροσκοπία

ανοσοχρώση τμήματα απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα Zeiss Axiovert 135 ανεστραμμένη.