Αφηρημένο

Ιστορικό

Η συσχέτιση του ιού που σχετίζονται με ιούς της λευχαιμίας των ποντικών ξενοτροπικά (XMRV) με καρκίνο του προστάτη συνεχίζει να λαμβάνει αυξημένη προσοχή καθώς μελέτες αναφέρουν αντιφατικά επιπολασμούς XMRV κυμαίνονται από μηδέν έως 23%. Δεν είναι σαφές εάν οι διαφορές στη διαγνωστική δοκιμή, τη σοβαρότητα της νόσου, τη γεωγραφία, ή άλλους παράγοντες ευθύνονται για τα αντικρουόμενα αποτελέσματα. Αναφέρουμε εδώ την επικράτηση της XMRV σε έναν πληθυσμό με σαφώς καθορισμένες καρκίνοι του προστάτη και RNase L πολυμορφισμό. Χρησιμοποιήσαμε ευρέως αντιδραστικό αναλύσεις PCR και κηλίδας Western (WB) για την ανίχνευση μόλυνσης με XMRV και συναφείς ιούς λευχαιμίας ποντικού (MLV).

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

μελετήσαμε δείγματα από 162 ασθενείς ΗΠΑ διαγιγνώσκονται με καρκίνο του προστάτη με ένα ενδιάμεσο για να προχωρημένο στάδιο (Gleason Παρτιτούρες 5-10? μέτρια (46%) φτωχά διαφοροποιημένα καρκινώματα (54%)). Προστάτη ιστός DNA ελέγχθηκε με προσδιορισμούς PCR που ανιχνεύουν τις παραλλαγές XMRV και MLV. Για να αποκλειστεί η μόλυνση με DNA ποντικού, έχουμε επίσης σχεδιαστεί και να χρησιμοποιηθεί μια δοκιμή DNA PCR ειδικά για ποντικό. Λεπτομερής φυλογενετική ανάλυση χρησιμοποιήθηκε για να συναχθεί εξελικτικές σχέσεις. RNase L πληκτρολόγηση έδειξε ότι το 9,3% ήταν ομοζυγώτες (QQ) για το L μετάλλαξη R462Q RNase, ενώ το 45,6% και το 45,1% ήταν ομόζυγα ή ετερόζυγα, αντίστοιχα. Οι ορολογικές δοκιμές πραγματοποιήθηκαν με μία δοκιμή WB. Τρεις από 162 (1,9%) του DNA προστατικό ιστό ήταν PCR θετικά για XMRV και είχαν μη ανιχνεύσιμα DNA ποντικού. Κανένας ήταν ομόζυγος για τη μετάλλαξη QQ. Πλάσμα από τα τρία πρόσωπα ήταν αρνητική για ιϊκό RNA με RT-PCR. Όλα τα 162 ασθενείς ήταν WB αρνητικά. Φυλογενετική ανάλυση προκύπτει μια ξεχωριστή XMRV.

Συμπεράσματα και η σημασία τους

Βρήκαμε ένα πολύ χαμηλό επιπολασμό της XMRV σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη. Η μόλυνση επιβεβαιώθηκε με φυλογενετική ανάλυση και την απουσία μολυσματικών DNA ποντικού. Το εύρημα της μη ανιχνεύσιμα αντισώματα και ιαιμία σε όλους τους τρεις ασθενείς μπορεί να αντανακλά λανθάνουσα μόλυνση. Τα αποτελέσματά μας δεν υποστηρίζουν τη σύνδεση της XMRV ή MLV παραλλαγές με καρκίνο του προστάτη

Παράθεση:. Switzer WM, Jia Η, Zheng Η, Tang S, Heneine W (2011) αριθ Σύλλογος Xenotropic Λευχαιμίας Ποντικού που σχετίζονται με ιούς Οι ιοί με καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 6 (5): e19065. doi: 10.1371 /journal.pone.0019065

Επιμέλεια: Παύλος Dent, Βιρτζίνια Πανεπιστήμιο της Κοινοπολιτείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 3 Φεβ 2011? Αποδεκτές: 15, Μαρτίου, 2011? Δημοσιεύθηκε: 4 Μαΐου 2011

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση:. Η χρηματοδότηση για τη μελέτη που παρέχεται από τα Κέντρα Ελέγχου και Πρόληψης ανά ετήσιες πιστώσεις της κυβέρνησης των Ηνωμένων Πολιτειών Νόσων. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του προστάτη είναι μια από τις πιο συχνές, αργή ανάπτυξη, noncutaneous κακοήθειες των ανδρών στον αναπτυσσόμενο κόσμο [1]. Για παράδειγμα, υπολογίζεται ότι πάνω από 192.000 άνδρες στις ΗΠΑ, κυρίως της Αφρικής και της Αμερικής καθόδου, θα διαγνωστούν με καρκίνο του προστάτη το τρέχον έτος [2], [3]. Αν και η φυσική ιστορία του καρκίνου του προστάτη είναι σήμερα άγνωστη, έχουν πολλαπλές αιτιολογίες διατυπωθεί η υπόθεση, συμπεριλαμβανομένων των γενετικών ελαττωμάτων [4], [5], [6]. Το 2006, με τη χρήση μικροσυστοιχιών και ανάλυση ξενοτροπικοί ιού λευχαιμίας ποντικού RT-PCR (MLV)-σχετικές ιός (XMRV) εντοπίστηκε για πρώτη φορά σε περίπου 40% των ασθενών οικογενή καρκίνο του προστάτη που περιέχει τη μετάλλαξη R462Q στο γονίδιο RNase L, ένα συστατικό του αντιικού έμφυτη ανοσία [7]. MLVs είναι ενδογενείς gammaretroviruses που έχουν ενσωματωθεί στο γονιδίωμα του ποντικού και μπορεί να προκαλέσει καρκίνο, νευρολογικές παθήσεις, και διαταραχές ανοσοανεπάρκειας σε ποντίκια και ταξινομούνται σε τρεις ομάδες ανάλογα με τροπισμό ξενιστή τους [8]. Ξενοτροπικά MLV (XMLV) αναπαράγουν μόνο σε κύτταρα μη-ποντίκι. Σε αντίθεση, οικοτροπικό MLV (EMLV) αντιγράφονται μόνο σε ποντίκια, ενώ πολυτροπικά MLV (pMLV) έχουν μία ευρύτερη τροπισμό και μπορεί να αντιγραφεί σε ξενιστές του ποντικιού και μη-ποντικού [8]. XMRV μερίδια περίπου 93% και 89% ταυτότητα νουκλεοτιδίων με XMLV και pMLV απέναντι στο γονιδίωμα [7]. Ταυτοποίηση πιθανή ιική αιτία του καρκίνου του προστάτη είναι ιδιαίτερα σημαντική επειδή θα μπορούσε να διευκολύνει την θεραπεία και την πρόληψη αυτής της εξουθενωτική ασθένεια.

Πρόσθετες αποδείξεις για μόλυνση XMRV των ατόμων με καρκίνο του προστάτη έχει αναφερθεί σε μια μελέτη μας δείχνει μια υψηλότερη επικράτηση της ανίχνευσης XMRV DNA με PCR (6%) και ιικές πρωτεΐνες με ανοσοϊστοχημεία (IHC) (23%) σε ιστούς του προστάτη από ασθενείς με καρκίνο 334 προστάτη σε σύγκριση με 101 καλοήθη ελέγχους (1,9% με PCR και 3,9% κατά IHC) [9] . Η μελέτη αυτή ανέφερε, επίσης, να βρουν XMRV πιο συχνά σε ασθενείς με υψηλότερο βαθμό όγκου του προστάτη που υποδηλώνει την ύπαρξη αιτιώδους συνδέσμου μεταξύ του ιού και της ασθένειας. Μια παρόμοια τάση αναφέρθηκε σε μια άλλη μελέτη που ανέφεραν ποσοστό επιπολασμού XMRV 22% σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη από το Τέξας, αλλά βρέθηκαν ιού στα δύο ιστούς όγκων και μη καρκινικών [9], [10]. XMRV εξουδετερωτικά αντισώματα ταυτοποιήθηκαν πρόσφατα σε 11 από 40 (27,5%) ασθενείς ΗΠΑ καρκίνο του προστάτη και οι αλληλουχίες επιβεβαιώθηκαν XMRV σε πέντε από αυτά τα 11 άτομα, χρησιμοποιώντας φωλιασμένη DNA PCR και φθορισμό in situ υβριδισμού (FISH) [11].

σε αντίθεση, οι μελέτες στην Ευρώπη και δύο από τις ΗΠΑ ανέφεραν μικρή ή καθόλου μόλυνση XMRV [12], [13], [14], [15], [16]. Μια μελέτη των ασθενών με καρκίνο του προστάτη γερμανική και μία στην Ολλανδία βρήκε ένα πολύ χαμηλότερο επιπολασμό XMRV (1/87, 1.2% και 3/74 = 4%, αντίστοιχα) με τη χρήση μόνο RT-PCR και XMRV-ειδικών εκκινητών [12]. Μια δεύτερη μεγαλύτερη μελέτη στη Γερμανία χρησιμοποιώντας ένα συνδυασμό του DNA και του RNA PCR δεν βρήκε κανένα στοιχείο της λοίμωξης XMRV σε 589 ασθενείς [14]. Επιπλέον, οροί από επιπλέον 146 ασθενείς με καρκίνο του προστάτη ήταν όλα αρνητικά με τη δοκιμή με μία ELISA που ενσωματώνουν ανασυνδυασμένου φακέλλου XMRV (ENV) και Gag πρωτεΐνες και με έμμεσο δοκιμασίες ανοσοφθορισμού εκφράζουν XMRV [14]. XMRV επίσης δεν βρέθηκε σε DNA από ιστούς από 161 και 200 ​​ασθενείς με καρκίνο του προστάτη από δύο πληθυσμούς U.S., αντίστοιχα [13], [15]. Η μελέτη από Aloia

et al.

Επίσης δεν ανιχνεύει πρωτεΐνες XMRV σε ιστούς από 596 προστάτη αδενοκαρκινώματα και 452 δείγματα καλοήθη ιστό του προστάτη χρησιμοποιώντας IHC [13].

Οι λόγοι για τους ασύμφωνες αποτελέσματα XMRV δεν είναι γνωστά, αλλά μπορεί να σχετίζεται με τεχνικές διαφορές στις δοκιμές XMRV ή σε παράγοντες που σχετίζονται με τους πληθυσμούς ασθενών, συμπεριλαμβανομένων στάδιο της νόσου, οι γενετικοί παράγοντες, ή τη γεωγραφική ομαδοποίηση. Παρόμοια ασύμφωνα αποτελέσματα έχουν επίσης αναφερθεί πρόσφατα για XMRV σε άτομα με σύνδρομο χρόνιας κόπωσης (CFS) [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23], συμπεριλαμβανομένου ενός μελέτη από Lo

et. al

αναφορά pMLV-όπως ακολουθίες μεταξύ των ασθενών των ΗΠΑ με CFS [24]. Η πλειονότητα των μελετών καρκίνου του προστάτη χρησιμοποιείται PCR με XMRV-ειδικούς εκκινητές που μπορεί να μην είναι ιδιαίτερα ευαίσθητη για άλλα MLV-σαν παραλλαγές [7], [9], [10], [11], [12], [15], [16]. Επιπλέον, οι περισσότερες μελέτες δεν εκτελούν ορολογικό έλεγχο για αντισώματα που είναι χαρακτηριστικά των μολύνσεων από ρετροϊούς και μπορεί, ως εκ τούτου, παρέχει πρόσθετες ενδείξεις μόλυνσης που δεν είναι ιστο-ειδική.

Αναφέρουμε εδώ τις δοκιμές XMRV ενός καλά που χαρακτηρίζεται ομάδα 162 ασθενών με καρκίνο του προστάτη από τις ΗΠΑ, χρησιμοποιώντας ένα συνδυασμό των ορολογικών και PCR δοκιμασίες ικανή να ανιχνεύει XMRV και pMLV. Μετρήσαμε επίσης τη διανομή του RNase L QQ μετάλλαξη για να αξιολογηθεί η σύνδεση των XMRV με αυτό το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο [7]. Έχουμε, επίσης, έχουν χρησιμοποιήσει ένα ευαίσθητο τεστ PCR για την ανίχνευση μόλυνσης με DNA ποντικού και αποκλείουν ψευδώς θετικά αποτελέσματα PCR. Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι XMRV είναι σπάνιο σε αυτόν τον πληθυσμό ασθενών και δεν υποστηρίζουν τη σύνδεση αυτού του ιού με τον καρκίνο του προστάτη.

Αποτελέσματα

Σπάνια ακολουθίες XMRV σε καρκινικούς ιστούς από ασθενείς με καρκίνο του προστάτη

β-ακτίνης ακολουθίες ανιχνεύθηκαν με PCR στο DNA εκχυλίσματα από όλους τους ιστούς του προστάτη επιβεβαιώνοντας την ακεραιότητά τους για δοκιμή PCR. DNA από μόνο δύο (5956 και 6203) του 162 ασθενείς (1,23%) ήταν θετικοί για αλληλουχίες XMRV στην αρχική διαλογή (Σχ. 1, Πίνακας 1). Από τα 77 δείγματα DNA που επιπρόσθετα δοκιμάστηκε εις τριπλούν από το

pol

PCR δοκιμασία, μόνο ένας ασθενής (5935) (1,3%) βρέθηκε θετικό. Αυτό το δείγμα ήταν θετικό σε μόνο μία από τις τρεις επαναλήψεις. Έτσι, ο συνολικός επιπολασμός της PCR ήταν 3/162 ή 1,85%. Ασθενής 5956 ήταν θετική για

gag

και

pol

ακολουθίες σε 3/5 και 4/6 επαναλαμβανόμενες δοκιμές, αντίστοιχα, και

env

αλληλουχίες ανιχνεύτηκαν επίσης σε 1/3 επανάληψη τεστ (Πίνακας 2). Δείγμα 5956 ήταν επίσης θετικό και στις τρεις πανομοιότυπες

δοκιμές pol

PCR. Μόνο XMRV

pol

και

env

αλληλουχίες ανιχνεύτηκαν στο DNA ιστού 6203 προστάτη ασθενή σε 1/4 και 1/1 επαναλαμβανομένων δοκιμών, αντίστοιχα. Πρόσθετες δοκιμές του DNA που εξάγεται από ένα άλλο τμήμα του ιστού του προστάτη του 6203 ήταν κατ ‘επανάληψη αρνητική, πιθανόν αντανακλώντας μια άνιση κατανομή της χαμηλής XMRV αντιγράφου σε αυτόν τον ιστό. DNA από όλους τους τρεις ασθενείς επανειλημμένα δοκιμαστεί αρνητικό για μυϊκό mtDNA καταδεικνύει την απουσία μολυσματικών ΟΝΑ του ποντικιού. Για να δοκιμαστεί η ιαιμία αναλύσαμε εκχυλίσματα RNA από δείγματα πλάσματος και από τους τρεις ασθενείς. Όλα τα δείγματα είχαν ανιχνεύσιμα ακολουθίες από τις δοκιμές qRT-PCR και nRT-PCR.

Εκπρόσωπος φωλιασμένη

pol

αποτελέσματα PCR χρησιμοποιώντας DNA των όγκων του προστάτη. Λωρίδες 1-24, ασθενείς με καρκίνο του προστάτη, συμπεριλαμβανομένων ασθενών 5956 (λωρίδα 8) και 6203 (λωρίδα 19)? λωρίδα 25, αρνητικό ανθρώπινο έλεγχο DNA PBMC? λωρίδες 26 και 27, το νερό ελέγχει μόνο για την πρωτοβάθμια και ένθετα δοκιμές PCR, αντίστοιχα? λωρίδες 28 και 29, οι έλεγχοι ευαισθησία της ανάλυσης που αποτελείται από 10 και 10

3 αντίγραφα XMRV VP62 πλασμιδιακού DNA διαλυμένο σε ένα φόντο από 1 μα ανθρώπινου PBMC DNA, αντίστοιχα.

Η

Η

Αναγνώριση της διαφορετικότητας XMRV σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη

p> ανάλυση

pol

αλληλουχίες από όλους τους τρεις ασθενείς έδειξαν 90,5 έως 100% νουκλεοτιδίου ταυτότητα μεταξύ τους, 94-100% σε XMRV, 91,7 έως 98,8% για XMLV, 94-100% σε pMLV, και 91 -100% σε οικοτροπικά MLV (EMLV) σε αυτό το σύντομο περιοχή. 164-bp

env

αλληλουχίες από πρόσωπα 5956 και 6203 ήταν ταυτόσημα μεταξύ τους και μοιράζονται την υψηλότερη ταυτότητα νουκλεοτιδίων (94,9 – 100%) για να XMRV και άλλα στελέχη ξενοτροπικοί MLV, αντίστοιχα, [25]. Η

env

αλληλουχίες από τα δύο πρόσωπα που ήταν εξαιρετικά αποκλίνουσες από EMLVs μοιράζονται μόνο περίπου 46% ταυτότητα νουκλεοτιδίων. 413-bp

gag

αλληλουχίες ενισχύθηκαν μόνο από το DNA προστατικό ιστό του ατόμου 5956 και είχε περίπου 98% ταυτότητα νουκλεοτιδίων να XMRV αλλά ήταν πανομοιότυπο με ένα ξενοτροπικών Merv βρέθηκε στο χρωμόσωμα ποντικού 8 (GenBank # AC127575).

η φυλογενετική ανάλυση του

env

αλληλουχίες συνάγονται τρεις διακριτές συστάδες με ισχυρή υποστήριξη εκκίνησης με βάση ιικό τροπισμό όπως αναμενόταν, αφού αυτή η περιοχή περιλαμβάνει ένα τμήμα της μεμβράνης ιικής επιφάνειας που εμπλέκονται στην κυτταρική τροπισμός (Σχ . 2α). Η

env

αλληλουχίες από δύο ασθενείς σε σύμπλεγμα με ακολουθίες XMLV αλλά ήταν διαφορετικό από προηγουμένως αναφερθεί XMRV και πρωτότυπη pMLV (Σχ. 2α). Σε αντίθεση, οι συναχθεί φυλογενετικές σχέσεις των

pol

αλληλουχίες από όλες τις ομάδες MLV έδειξε ότι αυτή η περιοχή δεν ομαδοποιούνται με εύρος ξενιστών (Σχ. 2β). Οι τρεις

pol

αλληλουχίες από τις ασθενείς με καρκίνο του προστάτη που σχηματίζεται ένα καλά υποστηριζόμενο γενεαλογία που περιέχει ένα neuropathogenic ανασυνδυασμένου Moloney MLV (στέλεχος ts-1-92b, GenBank με # AF462057) (Σχ. 2β). XMRV

pol

αλληλουχίες από ασθενείς που είχαν προηγουμένως αναφερθεί με καρκίνο του προστάτη (κωδικοποιημένες με VP), εκτός από δύο (VP29 και VP184, παραχωρήθηκε ευγενικά από τον Joe DeRisi), συγκεντρωμένα με εκείνα από τα άτομα με CFS (κωδικοποιημένες με WPI) με σημαντική εκκίνησης υποστήριξη. VP29 και VP184

pol

αλληλουχίες ήταν ταυτόσημες με το άλλο, αλλά 1,2% αποκλίνουσες από άλλες XMRV και σχημάτισε μια ασθενώς υποστηρίζεται σύμπλεγμα που περιέχει ένα μίγμα EMLV και pMLV (Σχ. 2β). Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν μια ευρύτερη ποικιλία των XMRV στην περιοχή αυτή από ό, τι δει προηγουμένως, αλλά είναι σύμφωνες με ανασυνδυασμό με Moloney MLV όπως αναφέρθηκε πρόσφατα [7], [25]. VP29, VP79, VP86, VP88, VP90, και VP184 είναι ασθενείς με καρκίνο του προστάτη που αναφέρονται στην Urismann

et al.

Χαρτί, αλλά για τα οποία ο XMRV

pol

ακολουθίες δεν είναι ακόμα διαθέσιμα στο GenBank [ ,,,0],7]. Πρόσφατα αναφέρθηκε

gag

και

pol

αλληλουχίες που βρίσκονται στην ανθρώπινη κυτταρική σειρά όγκου του DNA που βρίσκεται εκτός των περιοχών που χρησιμοποιούνται στη μελέτη μας και ως εκ τούτου δεν συμπεριλήφθηκαν στις αναλύσεις [25].

Ένα. φάκελο (

env

), Β πολυμεράσης (

pol

), και Γ

gag

. Σταθερότητα της τοπολογίας δέντρου ελέγχθηκε με τη χρήση 1000 bootstrap αντιγράφεται σε ενώνει τόσο γείτονα (NJ) και οι μέθοδοι μέγιστης πιθανότητας (ML). Bootstrap τιμές & gt? Οι 60 εμφανίζονται σε μεγάλα κόμβους (NJ /ML). Οι νέες αλληλουχίες από την παρούσα μελέτη εγκιβωτισμένα. αριθμοί πρόσβασης για πρωτοτυπία ακολουθίες MLV διαθέσιμο σε GenBank είναι XMRV VP35 = DQ241301, XMRV VP62 = DQ399707, XMRV VP42 = DQ241302, XMRV WPI-1106 = GQ497344, XMRV WPI-1178 = GC497343, XMRV PCA1-PCA17 = GU812341-GU812357, MLV ΓΔ -75 = AF221065, MLV MTCR = NC_001702, MLV ÅKV = J01998, MLV BM5eco = AY252102.1, Moloney MLV = J02255, Moloney neuropthogenic MLV παραλλαγή ts1-92b = AF462057, Rauscher MLV = NC_001819, φίλο MLV = X02794, Merv Χρ 7 = AC167978, Merv Χρ 7 = AC127565, Merv Χρ 8 = AC127575, Merv Χρ 12 = AC153658, Merv Χρ 9 = AC121813, Merv Χρ 4 = AL627077, Merv Χρ 1 = AC083892), XMLV Α2780 = FR670594, XMLV BHY = FR670595, XMLV Daudi = FR670596, XMLV EKVX = FR670597, XMLV IMR-5 = FR670598, XMLV Mutz-1 = FR670599, XMLV S-117 = FR670600, XMLV κινάσες-nu = FR670601. Ακολουθίες συμβολίζεται RAW είναι από την πολυτροπικά MLV απομονωθεί σε κύτταρα HeLa που χρησιμοποιούνται για την ανάπτυξη της δοκιμής WB in-house. Αλληλουχίες κωδικοποιούνται ως XMRV VP και PCA και WPI είναι από καρκίνο του προστάτη και των ασθενών CFS, αντίστοιχα. Πρόσθετες καρκίνο του προστάτη ασθενή VP

gag

και

pol

αλληλουχίες ευγενικά από τους Drs. Robert Silverman και Joe DeRisi. Τροπισμό του ιού, όπως προσδιορίζεται από την ανάλυση των

env

ακολουθίες, υποδεικνύεται από το μπλε (ξενοτροπικά), μοβ (πολυτροπικά) και κίτρινο (οικοτροπικά) σφαίρες.

Η

Το

gag

αλληλουχία από 5956 ασθενείς σε σύμπλεγμα με αλληλουχίες XMRV από έναν ασθενή με καρκίνο του προστάτη (VP88), ένα ξενοτροπικών Merv βρέθηκε στο χρωμόσωμα ποντικού 8, και μία αλληλουχία pMLV προσδιορίζονται στο δότη αίματος (BD-28) με Lo

et al.

(Εικ. 2γ) [24]. Αυτή η καταγωγή ήταν μεταξύ κλάδων που περιέχουν XMRV από καρκίνο του προστάτη και ασθενείς CFS και οι περισσότεροι PMLVs και τα υπόλοιπα MLVs βρέθηκαν στο Lo

et al.

Μελέτη [24]. Ένας πρωτότυπος pMLV (MCF1233) σε σύμπλεγμα με όλες EMLVs και δύο XMRVs, γεγονός που υποδηλώνει ότι είναι ένα ανασυνδυασμένο σε αυτήν την περιοχή (Σχ. 2c).

Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν φυλογενετική επίσης τη βραχεία περιοχή του

env

στοχεύονται από νέα PCR δοκιμασία μας είναι χρήσιμη για τον προσδιορισμό τροπισμό του ιού για την πληκτρολόγηση των MLV που σχετίζονται με αλληλουχίες. Αυτή η πληροφορία μπορεί να είναι χρήσιμη στην κατανόηση της προέλευσης των αλληλουχιών που προσδιορίζονται στην PCR-θετικά ανθρώπους. Σε αντίθεση, η

gag

και

pol

περιοχές έδειξαν λιγότερο ομαδοποίηση από τροπισμό δείχνει ιογενή ανασυνδυασμού σε αυτές τις περιοχές. Για παράδειγμα, το

gag

ακολουθίες πρωτότυπη XMLVs (MTCR), EMLVs (ÅKV, BM5eco), και PMLVs (MCF1233) συγκεντρωμένα με ιδιαίτερα σημαντική την υποστήριξη εκκίνησης (Εικ. 2α).

Σχεδόν ταυτόσημα φυλογενετικό δένδρο τοπολογίες για κάθε περιοχή του γονιδίου λήφθηκαν με αμφότερες τις μεθόδους NJ και ML. Οι αλληλουχίες XMRV από τους δύο ασθενείς με καρκίνο του προστάτη ήταν επίσης διαφορετική από τις αλληλουχίες pMLV ενισχύονται από την κυτταρική σειρά ποντικού (RAW) που χρησιμοποιείται για την παρασκευή WB αντιγόνα αποδεικνύει περαιτέρω ότι αυτά δεν είναι εργαστηριακά μολυντές (Εικ. 2). Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώνουν την παρουσία του XMRV σε δύο ασθενείς και να αποδείξει ότι η ποικιλομορφία XMRV είναι μεγαλύτερη από ό, τι σήμερα εκτιμηθεί.

Οι ακολουθίες XMRV που παρουσιάζονται στην παρούσα εργασία είναι διαθέσιμα και στην GenBank με τους αριθμούς προσχώρησης HM003608-HM003612 και HQ116790. Αλληλουχίες από άλλες μελέτες με ασθενείς με καρκίνο του προστάτη XMRV-θετικό δεν ήταν διαθέσιμα κατά GenBank για συμπερίληψη στις αναλύσεις μας [9], [11], [12], [16].

Απουσία των αντισωμάτων στο πλάσμα από προστάτη ασθενείς με καρκίνο

Όλα καρκίνο του προστάτη 162 δείγματα πλάσματος ασθενών βρέθηκαν να είναι αρνητικά για αντισώματα έναντι XMRV /MLV στη δοκιμή WB, συμπεριλαμβανομένων πλάσματος από άτομα 5935, 5956, και 6203 (Σχ. 3). Στις περισσότερες πλάσμα δείγματα κάποιο επίπεδο μη ειδικής δραστικότητας παρατηρήθηκε στο μη μολυσμένο αντιγόνο αλλά χωρίς αποδεικτικά στοιχεία για ειδική αντιδραστικότητα προς Gag και /ή πρωτεΐνες Εην στο μολυσμένο κηλίδα αντιγόνου (Εικ. 3).

δείκτες μοριακού βάρους (kD ) παρέχονται στα αριστερά των Υ.Σ. στα άνω πάνελ. Αναμενόμενα μεγέθη των ιικών Gag (Ρ30, καψιδίου (CA)), PR65, και Φάκελος είναι (Εην, gp69 /71) πρωτεΐνες παρέχονται σε κάθε WB στα άνω πάνελ. Εκπρόσωπος WB αποτελέσματα για έντεκα ασθενείς με καρκίνο του προστάτη, συμπεριλαμβανομένων των ασθενών 5956 και 6203 (υποδεικνύεται με αστερίσκους). Προσδιορισμός ειδική αντιδραστικότητα MLV προσδιορίζεται με σύγκριση του οροαντιδραστικότητα να ξενοτροπικών MLV μολυσμένα HeLa αντιγόνα και μη μολυνθέντων HeLa αντιγόνων σε άνω και κάτω πάνελ, αντιστοίχως. Ra, Rauscher MLV κατσίκι ολόκληρο τον ιό πολυκλωνικοί αντιοροί? Fr, φίλο MLV Φάκελος (gp69 /71) κατσικίσιο πολυκλωνικοί αντιοροί? προ-ανοσοποιητικό, κατσικίσιο ορούς πριν την ανοσοποίηση.

Η

RNase L R462Q αλληλομόρφων κατανομή στον πληθυσμό της μελέτης και κλινικά χαρακτηριστικά των τριών XMRV μολυσμένα άτομα

15 από τα 162 άτομα ( 9,3%) προσδιορίστηκαν ότι είναι ομόζυγη (QQ) για το L μετάλλαξη R462Q RNase, 74 (45,6%) είχαν το ομόζυγο αλληλόμορφο RR, και 73 (45,1%) ήταν ετερόζυγοι (RQ) για τη μετάλλαξη (Πίνακας 1).

ο ασθενής 5935 είναι η ετερόζυγη RQ RNase L γονότυπο. Έχει ελάχιστα διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα με βαθμολογία ενός Gleason της 6ης, T2C παθολογική στάδιο, επίπεδο PSA 4,6 ng /mL. Ασθενής 5956 είναι η άγριου τύπου ομόζυγη RR RNase L γονότυπο. Είχε μια κακώς διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα με βαθμολογία ενός Gleason της 7ης, Τ3Α παθολογική στάδιο, ένα 12,4 ng /mL επίπεδο PSA. Ασθενής 6203 είναι η ετερόζυγη RQ RNase L γονότυπο, και είχε μια μέτρια διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα με βαθμολογία ενός Gleason της 6ης, T2C παθολογικό στάδιο, και 7.1 ng /mL επίπεδο PSA. Έτσι, δεν ήταν σε θέση να επιβεβαιώσει τη σύνδεση της μόλυνσης XMRV με την ομόζυγη αλληλόμορφο QQ RNase L. Δεδομένου του χαμηλού επιπολασμού XMRV, δεν είχαμε τη στατιστική ισχύ για να καθορίσει εάν υπάρχει μια ένωση XMRV με το βαθμό του όγκου.

Συζήτηση

Χρησιμοποιήσαμε PCR και ορολογικές δοκιμές για να μελετήσει τον επιπολασμό της XMRV σε 162 καλά χαρακτηρισμένο αμερικανική ασθενείς Βορρά με καρκίνο του προστάτη. Εμείς που ρωτήθηκαν καρκίνους με το ενδιάμεσο να προχωρημένα στάδια, και να χρησιμοποιηθούν πολλαπλές δοκιμασίες PCR, περιλαμβανομένων δοκιμών με συντηρημένους εκκινητές για να επιτρέψουν την ανίχνευση των διαφορετικών XMRV και MLV-σχετιζόμενες αλληλουχίες. Σχεδόν το ήμισυ τα δείγματα ελέγχθηκαν επίσης εις τριπλούν για να μεγιστοποιηθεί η ευαισθησία ανίχνευσης αλληλουχιών χαμηλό αριθμό αντιγράφων. Χρησιμοποιήσαμε ένα ευρέως αντιδραστικό δοκιμασία WB να δοκιμάσει όλους τους ασθενείς για αντισώματα. Τα ευρήματά μας τεκμηριώνουν ένα πολύ χαμηλό επιπολασμό (1,9%) των ακολουθιών XMRV στον προστάτη DNA ιστού και την απουσία θετικών αντισωμάτων σε όλα τα δείγματα. Σε συνδυασμό αυτά τα δεδομένα δεν υποστηρίζουν τη σύνδεση της XMRV ή σχετίζονται MLV με καρκίνο του προστάτη.

Τα κυρίως αρνητικά αποτελέσματα PCR παρατηρήθηκαν παρά τη χρήση 1 μg DNA η οποία είναι 4-10 × υψηλότερο από το DNA των εισροών που χρησιμοποιούνται σε προηγούμενες μελέτες που ανέφεραν ανίχνευσης XMRV [7], [9], [14], [16]. Ομοίως, η παρατηρούμενη χαμηλή επικράτηση της XMRV δεν μπορεί να εξηγηθεί από μια μειωμένη ευαισθησία PCR δοκιμασία από τότε που προβλήθηκε δείγματα με την ίδια δοκιμασία που χρησιμοποιήθηκε αρχικά από Urisman

et al.

[7]. Στα τρία δείγματα με ανιχνεύσιμες αλληλουχίες, παρατηρήσαμε ότι ο αριθμός αντιγράφων ήταν πολύ χαμηλή καθώς ένθετα PCR και αναπαράγουν τις δοκιμές ήταν συχνά απαραίτητη για ανίχνευση. Είναι σημαντικό ότι, σε όλα τα τρία δείγματα δεν ήταν δυνατή η ανίχνευση του ποντικιού mtDNA παρά τη χρήση ενός εξαιρετικά ευαίσθητη δοκιμασία, γεγονός που υποδηλώνει ότι η πηγή του XMRV είναι απίθανο το αποτέλεσμα της μόλυνσης με DNA ποντικού. Αυτά τα αποτελέσματα είναι σημαντικά επειδή η μόλυνση DNA ποντικού αναφέρθηκε για να είναι η πηγή του XMRV σε μια πρόσφατη μελέτη των ιστών καρκίνου του προστάτη [26]. Οι συγγραφείς της μελέτης αυτής χρησιμοποιήθηκαν μία δοκιμασία PCR για την εντός της εγκεφαλικής δεξαμενής ποντίκι ένα σωματίδιο (IAP) που αναφέρεται ότι είναι πιο ευαίσθητο από μια δοκιμασία D-loop mtDNA που βασίζεται ειδικά για ποντικό [26]. Παρά το γεγονός ότι τα δείγματα DNA δεν ήταν διαθέσιμα για έλεγχο κατά τη δοκιμή ΙΑΡ, έχουμε βρει ότι η δοκιμασία ΙΑΡ είναι εξίσου ευαίσθητος σε δοκιμασία mtDNA σε πραγματικό χρόνο μας COX2 (τα δεδομένα δεν φαίνονται), έτσι περαιτέρω αποκλείοντας μόλυνση DNA ποντικού ως πηγή για τη θετική μας PCR αποτελέσματα. Επιπλέον, τα δείγματα του DNA παρασκευάστηκαν σε FCCC όπου μόνο τα ανθρώπινα βιολογικά δείγματα, και όχι κυτταρικές γραμμές, γίνεται ο χειρισμός, μειώνοντας περαιτέρω την πιθανότητα μόλυνσης ποντικού.

Η ανάλυση της αλληλουχίας των PCR-θετικά δείγματα ήταν άκρως κατατοπιστική επειδή επιβεβαίωσε ότι και τα τρία δείγματα ήταν XMRV-σχετικές. Επίσης, η εύρεση ενός ιικό στέλεχος σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη που τρία είναι διαφορετικό από το XMRV παρατηρήθηκαν σε προηγούμενες μελέτες είναι σημαντική και δείχνει μια ευρύτερη ιικό ποικιλομορφία [7], [9], [14], [16]. Αυτό θα ήταν ένα αναμενόμενο αποτέλεσμα συνάδει με την εξέλιξη του ιού κατά τη διάρκεια της εξάπλωσης και επιμονή. Η απουσία των αντισωμάτων και ιαιμίας στο πλάσμα σε αυτούς τους τρεις ασθενείς είναι αξιοσημείωτη επειδή μπορεί να αντανακλά απομονωμένο ή λανθάνουσες μολύνσεις. Απώλεια αντισώματος κατά τη διάρκεια μιας λανθάνουσας μόλυνσης, ενώ τα άτυπα των περισσοτέρων ρετροϊικών μολύνσεων, έχει περιγραφεί προηγουμένως για φυσική μόλυνση των μακάκων με πιθήκου ρετροϊούς τύπου D (SRV) [27]. SRV στους μακάκους συνδέεται με κρούσματα σοβαρή ανοσολογική ανεπάρκεια σε πρωτεύον αποικίες και μόλυνση λανθάνουσα SRV σε αυτά τα αρνητικά ζώα αντισώματος επιβεβαιώνεται με μεγαλύτερη ευαισθησία, χρησιμοποιώντας PCR ανάλυση [27]. Τα αποτελέσματά μας είναι επίσης σύμφωνη με εκείνες που παρατηρήθηκαν πρόσφατα σε macaques πειραματικά μολυνθεί με XMRV στην οποία ιστούς κατά την νεκροψία είναι ΡΟΚ-θετικά αλλά ιαιμίας και ανίχνευση προϊού σε PBMCs εξαφανιστεί γρήγορα, ακολουθούμενη από απώλεια της ανίχνευσης αντισωμάτων [28], [29]. Παρά το γεγονός ότι μία μελέτη ανέφερε την ανίχνευση αντισώματος XMRV εξουδετέρωσης σε 11 ασθενείς με καρκίνο του προστάτη, τα στοιχεία αυτά δεν επιβεβαιώθηκαν από πιο ευαίσθητες μεθόδους όπως WB, ή με δοκιμές PCR σε όλες τις περιπτώσεις, και ως εκ τούτου μπορεί να αντιπροσωπεύει μη ειδική αντιδραστικότητα [11], [17 ]. Διαχρονικές μελέτες μπορεί να καθορίσει την καλύτερη αντιδράσεις του ξενιστή σε μόλυνση XMRV.

πληθυσμό της μελέτης μας περιλαμβάνονται 15 άτομα με το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο QQ RNase L. Ωστόσο, κανένα δεν ήταν XMRV-θετικά, πράγμα που έρχεται σε αντίθεση με τις αρχικές διαπιστώσεις από Urismann

et al.

[7]. Οι XMRV μολυσμένα άτομα στη μελέτη μας είχαν είτε το ομόζυγο άγριου-τύπου (RR) ή ετερόζυγα αλληλόμορφα (RQ) RNase L R462Q. Τα αποτελέσματά μας είναι συνεπείς με τις άλλες αμερικανικές και ευρωπαϊκές μελέτες, οι οποίες προσδιορίζονται επίσης υψηλότερες συχνότητες της ομόζυγο QQ μεταλλαγμένο αλληλόμορφο σε XMRV-αρνητικών ατόμων [9], [10], [16]. Σε συνδυασμό, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η μόλυνση XMRV δεν συνδέεται με αυτή τη μορφή των αλληλομόρφων RNase L.

Παρά το γεγονός ότι τα δεδομένα μας δεν υποστηρίζουν τη σύνδεση του καρκίνου του προστάτη με XMRV, είναι σημαντικό να καταλάβουμε αν XMRV έχει καμία αιτιώδη ρόλο στον καρκίνο του προστάτη όταν είναι σπάνια ανιχνεύεται. Σε γενικές γραμμές, gammaretroviruses σαν XMRV επάγει κακοήθη μετασχηματισμό με εισαγωγική μεταλλαξογένεση, έτσι ώστε τα κακοήθη κύτταρα σε έναν όγκο όλα κλωνικά μολυνθεί. Αυτός ο μηχανισμός της καρκινογένεσης έχει βρεθεί σε ζώα καθώς και σε παιδιά που εκτίθενται σε MLV-προερχόμενους φορείς σε δοκιμές γονιδιακής θεραπείας [30], [31]. Ως εκ τούτου, η χαμηλής συχνότητας του XMRV μολυσμένα κύτταρα που βρέθηκαν στους τρεις ασθενείς δεν συνάδουν με άμεσο ρόλο του XMRV στην καρκινογένεση προστάτη σε αυτούς τους ασθενείς. Προηγουμένως, μια ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου του προστάτη, 22Rv1, έχει αποδειχθεί ότι εκφράζουν υψηλά επίπεδα XMRV, ένα εύρημα που υποστηρίζει έναν ρόλο των XMRV στην ογκογένεση του καρκίνου του προστάτη [32]. Ωστόσο, αναφέρθηκε πρόσφατα ότι η XMRV εκφράζεται από 22Rv1 μπορεί να μην είναι ανθρώπινης προέλευσης, αλλά πιθανότατα προέκυψαν μέσω ανασυνδυασμού των δύο επικαλυπτόμενα XMRV-σαν γονιδιώματα κατά τη διέλευση του όγκου του προστάτη σε συγγενείς ποντικοί (Τ Paprotka

κ.ά. .

18

ου Συνέδριο για ρετροϊούς και ευκαιριακές λοιμώξεις). Επιπλέον, άλλοι έχουν δείξει ότι θέσεις ενσωμάτωσης XMRV κλωνοποιήθηκε από ιστούς του προστάτη των δύο από εννέα ασθενείς μπορεί να ήταν το αποτέλεσμα της μόλυνσης με DNA από πειραματικά μολυσμένα κύτταρα DU145 [33], ενώ άλλες περιοχές ολοκλήρωσης XMRV δεν είναι κοντά ογκοκατασταλτικά γονίδια ή πρωτόκολλα ογκογονίδια [34]. Σε συνδυασμό, τα αποτελέσματα αυτά εγείρουν ερωτήματα σχετικά με το ρόλο των XRMV στον καρκίνο του προστάτη. Παρ ‘όλα αυτά, χρειάζεται περισσότερη δουλειά για να κατανοήσουμε καλύτερα την επικράτηση της XMRV και MLVs στον άνθρωπο και το ρόλο τους στην ανθρώπινη ασθένεια.

Υλικά και Μέθοδοι

πληθυσμός Μελέτη

Ανώνυμος, αρχειοθετούνται πλάσματος και του προστάτη ιστού ήταν διαθέσιμα από 162 ασθενείς με καρκίνο του προστάτη ΗΠΑ που συλλέγονται από την Αντικαρκινικού Κέντρου Fox Chase (FCCC) βιολογικού δείγματος Repository Πυρήνας διευκόλυνσης μεταξύ του 1997 και του 2004. Ολόκληρο δείγματα αίματος συλλέχθηκαν κατά τη στιγμή της προ-χειρουργικές δοκιμή ή την ημέρα της χειρουργικής επέμβασης πριν από την αναισθησία από συναινούντων ασθενείς με καρκίνο ως μέρος μιας μελέτης που εγκρίθηκε από την FCCC Ανθρώπινα Θέματα Επιτροπή. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους συμμετέχοντες. Η FCCC Ανθρώπινα Θέματα επιτροπή δεοντολογίας ενέκρινε τη συλλογή, την αποθήκευση και τη μελλοντική δοκιμή των δειγμάτων που συλλέγονται από όλα τα συναινούντων συμμετέχοντες στη μελέτη. Ο προσδιορισμός μη έρευνας εγκρίθηκε για τον έλεγχο των ανώνυμων δειγμάτων σε CDC για XMRV και σχετίζονται με ιούς. Η ηλικία κατά τη διάγνωση των 162 συμμετεχόντων κυμάνθηκε 36 έως 71 ετών με μέση και διάμεση τιμή των 57 χρόνων. 86% Καυκάσιοι, 12% Αφρικανικός Αμερικανός, και 1% Ασιάτες, δεν καταγράφονται, ή άλλο. Ο μέσος όρος και διάμεσος του ειδικού προστατικού αντιγόνου του ορού (PSA) επίπεδα ήταν 7.22 ng /mL και 5,5 ng /mL, αντίστοιχα. Ο βαθμός του όγκου για 75 από 162 (46%) των συμμετεχόντων ήταν μετρίως διαφοροποιημένων, ενώ το 54% είχε χαμηλή διαφοροποίηση όγκων. Χρησιμοποιώντας το σύστημα Gleason, το 42% του πληθυσμού της μελέτης είχε βαθμού 5-6 καρκίνο, το 40% είχε βαθμό 7, και 18% είχαν αδενοκαρκίνωμα υψηλού βαθμού (σκορ Gleason του 8-10). Παθολογική στάσης ταξινομούνται τους όγκους του προστάτη, όπως T1C (0,6%), T2A (9,3%), T2B (3,1%), T2C (61,7%), Τ3Α (17,9%), T3B (5,6%), και Τ4 (1,8%).

προετοιμασία δειγμάτων

Plasma δειγματίστηκε και φυλάχθηκε στους -80 ° C εντός 4 ωρών από τη συλλογή του αίματος. Τα δείγματα πλάσματος κλασματοποιήθηκαν και πάλι στο CDC μετά την απόψυξη για ορολογικό έλεγχο? τα υπόλοιπα δείγματα καταψύχθηκαν στους -80 ° C. δείγματα DNA παρασκευάστηκαν με εκχύλιση φαινόλης-χλωροφορμίου ιστών του προστάτη σε FCCC τη χρήση τυποποιημένων διαδικασιών. Μόνο οι ανθρώπινοι ιστοί υποβάλλονται σε επεξεργασία σε FCCC. Για επιλεγμένα δείγματα η MINIKIT QIAamp DNA (Qiagen, Carlsbad, CA) χρησιμοποιήθηκε στο CDC. Για πλάσμα RT-PCR δοκιμασία όγκο 0,5-1,0 ml υπερφυγοκεντρήθηκε στις 45.000 rpm να συγκεντρωθεί ιού. 360 ul σε 860 μΙ επιπλέοντος υλικού πλάσμα απομακρύνθηκε προσεκτικά και το σφαιρίδιο επαναιωρήθηκε σε 140 μΐ σε φυγοκέντρηση πλάσματος παραμένουν στο σωλήνα και στη συνέχεια το RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας την MINIKIT QIAamp Viral RNA (Qiagen, Valencia, CA). Οι συγκεντρώσεις νουκλεϊκών οξέων προσδιορίστηκαν με φασματοφωτομετρία χρησιμοποιώντας το όργανο Nanodrop (Thermo Scientific, Wilmington, DE). Ακεραιότητα των δειγμάτων DNA και του RNA προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας β-ακτίνη ή GAPDH PCR, αντίστοιχα, όπως περιγράφεται [35], [36]. Όλα προετοιμασία του δείγματος, καλλιέργεια ιστών, και τη δοκιμή PCR έγινε σε φυσικά απομονωμένες αίθουσες για την πρόληψη της μόλυνσης.

Μοριακή ανίχνευση του XMRV

Για την ανίχνευση XMRV και άλλες παραλλαγές MLV θα χρησιμοποιηθούν ξεχωριστές αναλύσεις PCR με εκκινητές ειδικό για την ανίχνευση του XMRV, ή συντηρημένους εκκινητές για το γενόσημο ανίχνευση MLV και XMRV, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21]. δείγματα DNA υποβλήθηκαν σε διαλογή χρησιμοποιώντας δύο ένθετα δοκιμασίες PCR. Η πρώτη δοκιμασία χρησιμοποιεί την εκκινητών GAGOF PCR, GAGOR, GAGIF και GAGIR απασχολούνται από Urismann

et al.

Και από Lombardi

et al.

Για τον εντοπισμό 413-bp XMRV

gag

αλληλουχίες σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη και σε άτομα με CFS, αντίστοιχα [7], [18]. Η δεύτερη δοκιμασία PCR ανιχνεύει γενικά MLV και XMRV πολυμεράσης (

pol

) ακολουθίες περίπου 216-bp σε μήκος, χρησιμοποιώντας το XPOLOF εκκινητών, XPOLOR, XPOLIF και XPOLOR [21]. Τόσο το

gag

και

pol

δοκιμές PCR μπορεί να ανιχνεύσει 10 αντίγραφα του πλασμιδίου XMRV DNA διαλυμένο σε ένα φόντο από 1 ug ανθρώπινου DNA [21]. Δείγματα θετικός είτε για

gag

ή

pol

ακολουθίες επανελέγχονται με τα δύο δοκιμασίες και ελέγχθηκαν επίσης με μια τρίτη ένθετη δοκιμή PCR για φακέλου XMRV (

env

) αλληλουχίες που είναι επίσης γενικός για XMRV /MLV. Η εξωτερική XENVOF (5 ‘GGG GAT CTT GGT GAG GGC ΑΓΓ AGC 3’) και XENVOR (5 ‘CAG AGA GAA CAG GGT CAC CGG GTC 3’) και της εσωτερικής XENVIF εκκινητές (5 ‘ΑΓΓ GCT ACT ΟΤΟ GCA ΑΑΤ GGG GAT 3’ ) και XENVIR (5 ‘ΚΔ ΤΤΤ ACC CGC GTC AGT GAA TTC 3’) ενισχύουν ένα 215-bp

env

ακολουθία. Επιπλέον, ένα υποσύνολο των δειγμάτων (n = 77) για τις οποίες επαρκούν DNA ήταν διαθέσιμο δοκιμάστηκαν εις τριπλούν χρησιμοποιώντας το ένθετο

pol

PCR δοκιμασία για τη βελτίωση της ανίχνευσης χαμηλού αντιγράφου XMRV /MLV.

η PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας 1 μg DNA ιστού του προστάτη σε ένα όγκο αντίδρασης 100 μΐ χρησιμοποιώντας πρότυπες συνθήκες 94 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 50 ° C για 30 sec, και 72 ° C για 45 sec για 40 κύκλους σε έναν ΑΒΙ 9700 θερμικό ανακυκλωτή ( Foster City, CA). PCR προϊόντα έγιναν ορατά με ηλεκτροφόρηση σε ένα βαμμένου με βρωμιούχο αιθίδιο πηκτώματος αγαρόζης 1,8%. Για να αυξηθεί η ευαισθησία και η ειδικότητα των δοκιμασιών, ενισχυμένο

gag

,

pol

, και

env

αλληλουχίες επιβεβαιώθηκαν με ανάλυση κηλίδας Southern χρησιμοποιώντας τα βιοτινυλιωμένα ολιγο XGAGP2 (5 ‘ ACC TTG CAG CAC ΤΟΟ GGA GAT GTC 3 ‘), XPOLP (5’ TTG ΑΤΟ ΑΓΓ CAC TGC ACA GAG ACC 3 ‘), και XENVP (5’ TGG GCT CCG ΟΤΑ GCA TCC ΑΓΓ ΟΤΟ 3 ‘) και ανίχνευση χημειοφωταύγειας. Όπως και το XMRV

gag

και

pol

αναλύσεις PCR [21], η νέα XMRV

env

δοκιμή PCR ήταν επίσης ικανό να ανιχνεύσει 10 αντίγραφα του πλασμιδίου XMRV σε ένα φόντο 1 ug ανθρώπινο DNA (30/32, 93.8%). Εμείς δεν εντόπισε καμία XMRV /ακολουθίες MLV στο DNA PBMC από 41 αιμοδότες ΗΠΑ χρησιμοποιώντας καθένα από τα τρία ένθετα δοκιμές PCR [21].

Δείγματα

Ποσοτική XMRV RNA RT-PCR

Plasma από άτομα με θετικό XMRV PCR αποτελέσματα στο DNA του προστάτη ιστού ελέγχθηκαν περαιτέρω για ιική RNA χρησιμοποιώντας δύο δοκιμές RT-PCR. Η πρώτη δοκιμασία, που αναφέρεται ως Q

pro

χρησιμοποιεί MLV /XMRV γενικές πρωτεάσης (

pro

) Taqman εκκινητών Pro-UNV-F1 (5 ‘ΚΔ GAA CCC ΑΟΟ ΑΤΑ ACC CT 3’) και Pro-UNV-R1 (5 ‘ΟΤΟ GTC CAG CGA TAC ΚΕΔ Τ 3’) και ανιχνευτές Pro-UNV-P1C (FAM5 «AGA TAC ΤΟΟ GGC CCA ACA CTC CGT GCT GAC 3’BHQ1) και Pro-UNV-PR1 ( Τα ευρήματα και τα συμπεράσματα σε αυτή την έκθεση είναι αυτές των συγγραφέων και δεν αντιπροσωπεύουν απαραίτητα τις απόψεις των Κέντρων Ελέγχου και Πρόληψης Νοσημάτων.