Αφηρημένο

Αξιολογήσαμε τις δυνατότητες ενός δοκιμαζόμενου παράγοντα αναστροφής της ιστόνης μεθυλίωση, 3-deazaneplanocin Α (DZNep), στη βελτίωση της χημειοευαισθησία του καρκίνου του παγκρέατος σε νουκλεοσιδικά ανάλογα (δηλαδή, γεμσιταβίνη). DZNep έφερε καθυστερημένη αλλά επιλεκτική κυτταροτοξικότητα σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα χωρίς να επηρεάζει τα φυσιολογικά κύτταρα ανθρώπινου παγκρεατικού πόρου επιθηλιακά (HPDE). Co-έκθεση των DZNep και προκαλείται από γκεμσιταμπίνης κυτταροτοξικά προσθετικότητα ή συνέργεια στις δύο καλά και άσχημα-διαφοροποιημένο παγκρέατος κυτταρικές σειρές από αυξημένη απόπτωση. Σε αντίθεση, DZNep ασκείται ανταγωνισμός με γεμσιταβίνη έναντι HPDE κυττάρων με σημαντική μείωση της κυτταροτοξικότητας σε σύγκριση με την αγωγή gemcitabine-μόνο. DZNep οριακά εξαρτάται από νουκλεοσιδικά μεταφορείς πουρινών για κυτταροτοξικότητα του, αλλά η εξάρτηση των μεταφορών καταστρατηγήθηκε με ακυλο παραγώγων. Μελέτες έκθεση στο φάρμακο αποκάλυψε ότι μια σύντομη εκκίνηση με DZNep ακολουθούμενη από επεξεργασία γεμκιταβίνης και όχι συν-θεραπεία και των δύο παραγόντων για να παράγει μία μέγιστη απόκριση χημειοευαισθητοποίηση στα δύο παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα γεμσιταβίνης ευαίσθητα και ανθεκτικά gemcitabine. DZNep μειώθηκαν γρήγορα και αναστρέψιμα trimethylation ιστόνης Η3 λυσίνης 27, αλλά αυξημένη trimethylation λυσίνης 9 σε μια EZH2- και JMJD1A /2C-εξαρτώμενο τρόπο, αντίστοιχα. Ωστόσο, DZNep δυναμικοποίηση ανάλογο νουκλεοζίτη χημειοευαισθητοποίηση βρέθηκε να συζευχθεί χρονικά να trimethylation αλλαγές στη λυσίνη 27 και όχι λυσίνη 9. Πολυμερείς νανοσωματίδια κατασκευάζονται για να απελευθερώνουν χρονολογικά DZNep ακολουθούμενη από gemcitabine παράγονται προφέρεται χημειοευαισθητοποίηση και επιδράσεις δόσης-χαμήλωμα. Μαζί, τα αποτελέσματα μας προσδιορίσει ότι ένα βελτιστοποιημένο έκθεση DZNep μπορεί presensitize παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα σε αντικαρκινικά νουκλεοσιδικά ανάλογα με την αντιστροφή της ιστόνης μεθυλίωσης, τονίζοντας τις πολλά υποσχόμενες κλινικές επιχειρήσεις κοινής ωφελείας των επιγενετικών παραγόντων αναστροφής στο μέλλον οι θεραπείες του παγκρέατος συνδυασμό καρκίνου

Αιτιολογική αναφορά.: Hung ΝΔ, Mody Η Marrache S, Bhutia YD, Davis F, Cho JH, et al. (2013) Φαρμακολογική Αντιστροφή της ιστόνης μεθυλίωση Presensitizes παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα σε νουκλεοσιδικά Ναρκωτικά:

In Vitro

Βελτιστοποίηση και Νέα νανοσωματιδίων Παράδοση Σπουδών. PLoS ONE 8 (8): e71196. doi: 10.1371 /journal.pone.0071196

Επιμέλεια: Irina V. Λεμπέντεβα, Enzo Life Sciences, Inc., Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 13 Φλεβάρη, 2013? Αποδεκτές: 27, Ιουνίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 6 Αυγ, 2013

Copyright: © 2013 Hung et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας [Grant P30GM092378] (SD), το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου [Grant 1R03CA161832-01] (RG), ο Συνασπισμός της Γεωργίας Καρκίνου (RG), και OVPR του Πανεπιστημίου της Γεωργίας (SD). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Polycomb πρωτεΐνες ομάδα (PCGS) να αναδιαμορφώσει χρωματίνης επηρεάζοντας το βαθμό συμπίεσης, που οδηγεί σε επιγενετικές γονιδιακή αποσιώπηση. Polycomb Κατασταλτικά Complex 2 (PRC2), μία από τις δύο κατηγορίες PCGS, επάγει δραστικότητα μεθυλοτρανσφεράσης ιστόνης κυρίως από trimethylating ιστόνης Η3 στη λυσίνη 27 (H3K27me3), μεσολαβώντας αποσιώπηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων. Η καταλυτική υπομονάδα της PRC2 είναι Enhancer of Zeste ομόλογο 2 (ΕΖΗ2), στην οποία η επικράτεια SET αποτελεί το ενεργό κέντρο για ιστόνης H3K27 μεθυλίωση [1]. Μελέτες υποστηρίζουν ΕΖΗ2 ως βασικός παράγοντας για την ανάπτυξη και την εξέλιξη των όγκων λόγω της ικανότητάς του να αλλάξει γονιδιακή έκφραση συμπεριλαμβανομένων εκείνων που εμπλέκονται στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου, κυτταρική μετανάστευση, και επιδιόρθωση του DNA [2]. ΕΖΗ2 είναι ζωτικής σημασίας για τον έλεγχο της χρωματίνης των γενετικών επαναπρογραμματισμό του καρκίνου του βλαστικού κυττάρου αυτο-ανανέωσης και της διαφοροποίησης που έχουν ενοχοποιηθεί σε χημειοαντίσταση [3] – [6]

Ως δείκτης των προηγμένων και μεταστατικής νόσου σε πολλές στερεό. όγκων, ΕΖΗ2 υπερέκφραση έχει αναφερθεί σε καρκίνους του παγκρέατος, ιδιαίτερα εκείνοι που είναι κακώς διαφοροποιούνται [6], [7]. ΕΖΗ2 βρέθηκε να ρυθμίζεται προς τα πάνω με ογκογόνο RAS μέσω σηματοδότησης ΜΕΚ-ΕΚΚ, που οδηγεί στην αρνητική ρύθμιση του καταστολείς όγκου όπως RUNX3 και ρ27 (Kip1) [6], [8], [9]. εξάντληση ΕΖΗ2 οδήγησε στη διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην G1 /S μετάβαση, γεγονός που υποδηλώνει την πρωτεΐνη μπορεί να καταστέλλουν την καταστολής όγκων ρ27 γονίδιο [10]. Ομοίως, knockdown του ΕΖΗ2 οδήγησε σε σημαντική μείωση στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και διεισδυτικότητα [6], [7], [11] και ευαισθητοποιημένα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα στη δοξορουβικίνη και gemcitabine, αποκαλύπτοντας τις δυνατότητες ενός θεραπείας συνδυασμού αναστολέα-χημειοθεραπευτικών ΕΖΗ2 [6] .

In vivo

, καταστέλλοντας ΕΖΗ2 μειωμένη ογκογονικότητα και ανέστειλε παγκρέατος μετάσταση του καρκίνου [7]. Κλινικά, οι θετικές συσχετίσεις παρατηρήθηκαν μεταξύ της έκφρασης ΕΖΗ2 και προχωρημένο στάδιο καρκίνου του παγκρέατος και του βαθμού σε ασθενείς [11]. Σε πολλές περιπτώσεις, τα υψηλά επίπεδα του ΕΖΗ2 στον καρκίνο ήταν επίσης σημαντικά σχετίζεται με μειωμένη έκφραση Ε-καδερίνης και εξαιρετικά επιθετική ασθένεια. Σε ασθενείς που έλαβαν γεμσιταβίνη, σημαντικά μεγαλύτερη επιβίωση παρατηρήθηκε σε ασθενείς με χαμηλό παρά την υψηλή έκφραση ΕΖΗ2 [12]. Κατά συνέπεια, ΕΖΗ2 μπορεί να είναι μια σημαντική προγνωστική αξία για τη συνολική επιβίωση σε ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος [13].

Πρόσφατα, έχει δειχθεί ότι ένας ισχυρός χημικός αναστολέας της S-αδενοσυλομοκυστεΐνης υδρολάση, 3-deazaneplanocin Α (DZNep) , ρυθμίζει χρωματίνη μέσω έμμεσων (δηλαδή, μειώνοντας διαθεσιμότητα ομάδα μεθυλίου) αναστολή της μεθυλτρανσφερασών ιστόνης συμπεριλαμβανομένης ΕΖΗ2 [14], [15]. DZNep, ένα καρβοκυκλικό ανάλογο της αδενοσίνης, μειώνει κυτταρικά επίπεδα των συστατικών PRC2 ενώ αναστέλλει την συνδεδεμένων H3K27me3 [16]. Ενώ οι μηχανισμοί και τα αποτελέσματα της DZNep μελετηθεί σε πολυάριθμες συμπαγών όγκων και λευχαιμίας [2], [3], [14], [15], [17] – [21], λιγότερα είναι γνωστά σχετικά με τις δυνατότητες αυτής της ένωσης για του παγκρέατος θεραπεία του καρκίνου. Παρ ‘όλα αυτά, η τρέχουσα το δυναμικό της για τη μείωση των επιπέδων ΕΖΗ2, επιστρέφοντας επιθηλιακά-to-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ), και την πρόληψη της εξέλιξης του όγκου, αυτό μια ιδιαίτερα υποσχόμενη αντιμεταστατική παράγοντα καθιστά [5]. Το θεραπευτικό δυναμικό των DZNep σε συνδυασμό με άλλους παράγοντες, όπως οι πολυφαινόλες και οι αναστολείς δεακετυλάσης ιστόνης, έχει αρχίσει να αναδύεται με ενθαρρυντικά αποτελέσματα [14], [15]. Δεδομένου ότι όλο και περισσότερα στοιχεία δείχνουν ότι οι μελλοντικές θεραπείες του καρκίνου θα επωφεληθούν από τα συνεργιστικά αποτελέσματα επιτεύχθηκαν από διαφορετικούς συνδυασμούς των επιγενετικών αντιστροφή και συμβατικών αντικαρκινικών παραγόντων [22], ερευνήσαμε το δυναμικό της DZNep-γεμσιταβίνη συνδυασμός για τη βελτίωση αντικαρκινική δράση στον καρκίνο του παγκρέατος. Τα αποτελέσματά μας διαπίστωσε ότι αντιστροφή της ιστόνης μεθυλίωση από DZNep presensitizes παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα να gemcitabine. Βελτιστοποίηση του συνδυασμού των φαρμάκων μέσω των μεθόδων της δοσολογίας και την παράδοση διεξήχθη περαιτέρω.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

Ραδιοσημασμένη (

3Η) γεμσιταβίνη, αδενοσίνη, θυμιδίνη, και γουανοσίνη ελήφθησαν από Moravek Biochemicals και Radiochemicals (Brea, CA), ενώ το κρύο gemcitabine ήταν από ChemieTek (Indianapolis, ΙΝ). Η αδενοσίνη και γουανοσίνη παρεσχέθησαν ευγενώς από το Δρ Chung Κ Chu (Πανεπιστήμιο της Γεωργίας). Θυμιδίνη, ουριδίνη, νιτροβενζυλ μερκαπτοπουρίνη ριβοζίδιο (NBMPR), και 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ) λήφθηκαν από Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ). Διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) αγοράστηκε από Macron Chemicals (Κέντρο Valley, ΡΑ), και το οξύ (BCA) αντιδραστήριο δοκιμασίας πρωτεΐνης δικιγχονινικού ήταν από Thermo Scientific Pierce (Rockford, IL). Πλαστικά είδη για καλλιέργεια κυττάρων ελήφθησαν από την Corning (Corning, Νέα Υόρκη).

Πολιτισμός τηλέφωνα

Οι παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές (AsPC-1, BxPC-3, Capan-1, ΜΙΑ PaCa- 2, και PANC-1) και MCF-10A κύτταρα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC? Manassas, VA) τράπεζας κυττάρων. Αυτές οι κυτταρικές σειρές πολλαπλασιάστηκαν, επεκτάθηκαν και καταψύχονται αμέσως μετά την άφιξη. Τα κύτταρα αναβίωσε από το κατεψυγμένο απόθεμα χρησιμοποιήθηκαν μέσα σε 10-20 περάσματα, δεν υπερβαίνει μια περίοδο 2-3 μηνών. Η ATCC χρησιμοποιεί μορφολογικά, κυτταρογενετική ανάλυση και προφίλ DNA για τον χαρακτηρισμό των κυτταρικών σειρών. Ανθρώπινα κύτταρα παγκρεατικού πόρου επιθηλιακά (HPDE) [23] ευγενικά ελήφθησαν από τον Dr. Ming Tsao του Ινστιτούτου Καρκίνου του Οντάριο (Toronto, Canada). Η κυτταρική σειρά L3.6pl [24] είχε την καλοσύνη να λάβει από τον Δρ Isiah Δ Fidler στο Πανεπιστήμιο του Τέξας MD Anderson Κέντρο Καρκίνου (Houston, TX). Οι κυτταρικές γραμμές HPDE και L3.6pl υπέστησαν χειρισμό και άλλες κυτταρικές γραμμές και ο γονότυπος με αποτύπωμα DNA (PowerPlex 16, Promega, Inc.) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η κυτταρική σειρά 293Τ είχε την καλοσύνη να λάβει από τον Δρ J. Michael Thomson από το Πανεπιστήμιο της Γεωργίας (Αθήνα, GA). Οι συνθήκες ανάπτυξης των κυτταρικών σειρών πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25].

ΜΤΤ δοκιμασία κυτταροτοξικότητας

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 3 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο σε 96 -Καλά πλάκα μικροτίτλου και αναπτύχθηκαν σε 90-95% συρροή. Μετά τη θεραπεία, 50 μΙ διαλύματος ΜΤΤ (5 mg /ml σε PBS) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο, και οι πλάκες επωάστηκαν για 2 ώρες. ΜΤΤ κρύσταλλοι φορμαζάνης διαλύθηκαν σε 100 μΙ /φρεάτιο DMSO με ανακίνηση των πλακών σε μια κουνιστή πλατφόρμα. Ένας σαρωτής 96-φρεατίων χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί η φασματοφωτομετρική απορρόφηση στα 490 nm. Η απορρόφηση στα 650 nm χρησιμοποιήθηκε για την αφαίρεση του υποβάθρου. Η 50% ανασταλτική συγκέντρωση (IC

50) προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας GraphPad Prism 5.0 λογισμικό.

κασπάσης 3 Δοκιμασία

Η απόπτωση μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη φθορισμομετρική κασπάσης 3 Assay Kit από τη Sigma-Aldrich ( Cat. Νο CASP3F) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 10

4 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκα 96-φρεατίων υποβλήθηκαν σε αγωγή με DZNep ή /και γεμσιταβίνη για 72 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια λύθηκαν και επωάστηκαν σε πάγο για 15-20 λεπτά. Μετά την προσθήκη ρυθμιστικού δοκιμασίας που περιέχει το υπόστρωμα Ac-DEVD-AMC, δείγματα μεταφέρθηκαν σε μια μαύρη πλάκα 96-φρεατίων, και ο φθορισμός διαβάστηκε κάθε 10 λεπτά για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου (360 nm διέγερση, 460 nm εκπομπή). Το κατάλληλο κενό (μείγμα της αντίδρασης), θετικό έλεγχο (κασπάσης 3), και αρνητικό μάρτυρα (κασπάσης 3+ κασπάσης 3 αναστολέα) διεξήχθησαν επίσης.

.

Αλληλεπιδράσεις Φαρμάκων Σπουδών

Τα οικόπεδα δείκτης συνδυασμού για DZNep και γεμσιταμπίνη εκτιμήθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο που αναπτύχθηκε από τους Chou και Talalay και το λογισμικό CalcuSyn [26].

Νουκλεοσιδικοί πρόσληψη σε κύτταρα και

Xenopus

ωοκύτταρα

Αυτές οι διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27], [28].

Δημιουργία

Xenopus

Έκφραση ωαρίων Κατασκευάζει

Οι πλήρους μήκους cDNA IMAGE κλώνους οι μεταφορείς (hENT1: κλώνος ID 3010092, την ένταξη BC008954? hENT2: κλώνος ID 9051840, την ένταξη BC143335? hCNT1: κλώνος ID 8991920, ένταξη π.Χ. 126.204? hCNT3: κλώνος ID 7939668, ένταξη BC093823) ελήφθησαν από την Ανοικτή Biosystems (Huntsville, AL) . Υποκλώνωση των γονιδίων σε το

φορέα έκφρασης ωοκυττάρων Xenopus

, ευλογιά, ολοκληρώθηκε με τη χρήση των συνόλων εκκινητών που ορίζονται στον πίνακα 1.

Η

Δυτική Blotting

κηλίδωση Western ήταν διεξάγεται όπως περιγράφεται προηγουμένως [25]. Το πολυκλωνικό κουνελιού αντι-ιστόνης H3K4TM, H3K9MM, H3K9DM, H3K27MM, H3K27DM, H4K20DM και H4K20TM ήταν από την Millipore (Billerica, ΜΑ), καθώς και το αντίσωμα αντι-EED πολυκλωνικό κουνελιού. Επίσης ελήφθη από την Millipore ήταν οι αντι-ιστόνης αντισώματα H3K9TM, H3K27TM, και H4K20MM μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, καθώς επίσης και το μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-ΕΖΗ2 (κλώνος BD43) και αντισώματα αντι-SUZ12 (κλώνος 3C1.2). Οι αντι-JMJD1A και αντι-JMJD2C πολυκλωνικά αντισώματα κουνελιού αποκτήθηκαν από τη Sigma-Aldrich. Το μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-β-ακτίνης αντίσωμα αγοράστηκε επίσης από την Sigma-Alrich, και οι συζευγμένο με HRP δεύτερα αντισώματα ήταν από Bethyl Laboratories (Montgomery, ΤΧ).

Σύνθεση Nucleosides γονέα και Παραγώγων

Troxacitabine και λιπόφιλων προφαρμάκου της, όπως περιγράφηκε προηγουμένως (ένωση 2K [29]? ένωση 6h [30]? C

24Η

41N

3Ο

5), ελήφθησαν από τον Dr. Chung Κ . Chu (Πανεπιστήμιο της Γεωργίας). Η σύνθεση ενός αναλόγου DZNep άρχισε από D-ριβόζη. D-ριβόζη υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 2,2-διμεθοξυπροπάνιο σε παρουσία μίας καταλυτικής ποσότητας

σ

τολουολοσουλφονικό οξύ για να δώσει ένα παράγωγο ισοπροπυλιδενο, ακολουθούμενη από την προστασία της πρωτοταγούς αλκοόλης με χλωριούχο τριφαινυλομεθύλιο. Το προστατευμένο λακτόλη στη συνέχεια αντέδρασε με βρωμιούχο βινυλμαγνήσιο για να δώσει ένα ενιαίο diastereomericdiol, η οποία στη συνέχεια προστατεύεται με TBDMS μόνο στο αλλυλικό υδροξύλιο θέση να δώσει silyldienol. Για να ενσωματωθεί ένα άλλο διπλό δεσμό για την αντίδραση μετάθεσης κλεισίματος δακτυλίου, η προστατευμένη δευτεροταγής αλκοόλη οξειδώνεται προς μία κετόνη με οξείδωση Swern, ακολουθούμενη από μία αντίδραση Wittig με βρωμιούχου μεθυλοτριφαινυλοφωσφονίου και καν.-BuLi να παράσχει την διενίου. Η σιλυλομάδα από το διένιο απομακρύνθηκε με TBAF για να δώσει μια λιγότερο απαιτητική από στερεοχημική άποψη διενόλης, το οποίο στη συνέχεια μετατρέπεται σε κυκλοπεντενόλη με δεύτερης γενιάς καταλύτης Grubbs σε καλή απόδοση. Προκειμένου να διεξαχθεί η σύζευξη Mitsunobu, δις-Βοο-3-δεαζα-αδενίνη παρασκευάστηκε. σύζευξη Mitsunobu παρέσχε την επιθυμητή Ν-9 ισομερούς ως κύριο προϊόν. Η απομάκρυνση των ομάδων προστασίας με τη χρήση ΗΟΙ 2Ν σε μεθανόλη που παράγεται DZNep. Τρεις ομάδες αλκοόλης DZNep προστατεύθηκαν με TBS που υποκαταστάθηκε στα δύο αμίδιο προφάρμακα (αλυσίδες άνθρακα C6 έως C8) με ακυλίωση του Ν

6-NH

2 ομάδα. Η ένωση τελικά πλήρως αποπροστατεύθηκε με TBAF για να δώσει το προφάρμακο DZNep 1 (C

20Η

29ClN

4O

4) και DZNep προφάρμακο 2 (C

18Η

24N

4O

4). Οι διαδικασίες συνθέσεις και φυσικοχημική χαρακτηρισμούς των ενώσεων θα δημοσιευθεί αλλού.

νανοσωματιδίων Σκεύασμα

Όλα τα χημικά αγοράστηκαν από την Sigma Aldrich και χρησιμοποιήθηκαν χωρίς περαιτέρω καθαρισμό εκτός εάν σημειώνεται διαφορετικά. PLGA-COOH με ένα ενδογενές ιξώδες 0.18 dL /g αγοράστηκε από Lactel. Η (5-καρβοξυπεντυλο) τριφαινυλοφωσφονίου (ΤΡΡ) κατιόν συνετέθη σύμφωνα με τις μεθόδους της βιβλιογραφίας [31]. ΗΟ-ΡΕΟ-ΟΗ με ΜΒ 3350 g /mol αγοράστηκε από την Sigma Aldrich. DSPE-PEG-COOH με ΜΒ 2000 g /mol αγοράστηκε από την Avanti Polar Lipids. Πολυβινυλική αλκοόλη (PVA) με μέσο μοριακό βάρος από 10,000-26,000 αγοράστηκε από την Alfa Aesar. Αποσταγμένο νερό καθαρίζεται με διέλευση μέσα από ένα σύστημα καθαρισμού νερού Millipore Milli-Q BioCel (18,2 ΜΩ) με ένα φίλτρο 0,22 μm. HPLC αναλύσεις διεξήχθησαν με τη χρήση ενός οργάνου σειρά Agilent 1200. Μέγεθος και ζήτα δυναμικό μετρήσεις διεξήχθησαν σε ένα όργανο Malvern Zetasizer Nanoseries. χρωματογραφία διείσδυσης πηκτής (GPC) συγκεντρώθηκαν σε ένα Shimadzu LC20-AD υγρό Τονίζονται χρωματογράφο. Όλα τα φάσματα NMR καταγράφηκαν σε Varian MHz NMR 400. TEM εικόνες ελήφθησαν σε Tecnai 20 FEM μικροσκόπιο. Υπερήχους διεξήχθη σε ένα υγρό επεξεργαστή Misonix S-4000 υπερήχων.

Σύνθεση PLGA-

β

-PEG-OH

Σύνθεση PLGA-PEG-

β

-ΟΗ διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [32].

Σύνθεση PLGA-

b

-PEG-TPP

Σύνθεση PLGA-PEG-

β

-TPP διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32].

Σύνθεση γεμσιταβίνη Encapsulated νανοσωματίδια (Gem-PLGA-

β

-PEG-OH-ΣΔ)

Η γεμσιταβίνη (10 mg /mL σε nanopure H

2O) γαλακτωματοποιήθηκε με PLGA-

b

-PEG-OH (5 mg σε CH

2Cl

2) χρησιμοποιώντας διερευνητή υπερήχων για μία λεπτών (Amplitude: 40% των 600 W ισχύ, Pulse: 1 δευτερόλεπτο μετά, 1 δευτερόλεπτο εκτός). Το πρωτεύον γαλάκτωμα γαλακτωματοποιήθηκε πάλι με την προσθήκη του γαλακτώματος νερό-σε-λάδι σε 2 mL νανοκαθαρό νερό που περιέχει 0.5% polyby 8 mL νανοκαθαρό νερό που περιείχε 0,05% PVA και υπερηχήθηκε χρησιμοποιώντας τις συνθήκες που αναφέρθηκαν παραπάνω. Ο οργανικός διαλύτης απομακρύνθηκε με πλύση τρεις φορές χρησιμοποιώντας μεμβράνη διήθησης Amicon με 100 kDa cut-off. Τα NPs επαναιωρήθηκαν σε νανοκαθαρό νερό και αποθηκεύθηκε στους 4 ° C μέχρι την περαιτέρω χρήση. Δυναμική σκέδαση φωτός (DLS) μετρήσεις έγιναν για να καθοριστεί το μέγεθος, ο δείκτης πολυδιασποράς (PDI), και ζήτα δυναμικό των εθνικών κοινοβουλίων. NPs χαρακτηρίστηκαν χρησιμοποιώντας ΤΕΜ σε τάση επιτάχυνσης 200 kV. Τα δείγματα ΤΕΜ παρασκευάστηκαν με την εναπόθεση 8 μL των ΝΡ (5 mg /mL) σε μία 200-mesh χάλκινο πλέγμα καλυμμένο με άνθρακα. Τα δείγματα κηλιδώθηκαν μακριά μετά από 15 λεπτά και πλέγματα χρωματίσθηκαν αρνητικά με αποστειρωμένο 2% (w /v) οξικού ουρανυλίου υδατικό διάλυμα για 15 λεπτά.

Σύνθεση DZNep Encapsulated νανοσωματιδίων (DZNep-PLGA-

b

-PEG-OH-ΣΔ)

DZNep (10 mg /mL σε νανοκαθαρμένο H

2O) γαλακτωματοποιήθηκε με PLGA-

β

-PEG-OH (5 mg σε CH

2Cl

2) με κατεργασία υπερήχων για ένα λεπτό (Amplitude το 40% των 600 W ισχύ, Pulse: 1 δευτερόλεπτο μετά, 1 δευτερόλεπτο εκτός). Το πρωτεύον γαλάκτωμα γαλακτωματοποιήθηκε πάλι με την προσθήκη του ανωτέρω σχηματίζεται γαλάκτωμα νερού-σε-έλαιο σε 2 κ.εκ. νανοκαθαρό νερό που περιέχει 0.5% PVA και υπερηχήθηκε χρησιμοποιώντας παρόμοιες συνθήκες. Τέλος, το γαλάκτωμα αυτό ανα-γαλακτωματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας 8 κ.εκ. νανοκαθαρό νερό που περιείχε 0,05% PVA κάτω από επεξεργασία με υπερήχους χρησιμοποιώντας τις παρόμοιες συνθήκες όπως προηγουμένως. Ο οργανικός διαλύτης απομακρύνθηκε με πλύση τρεις φορές χρησιμοποιώντας μεμβράνη διήθησης Amicon με 100 kDa cut-off. Τα NPs επαναιωρήθηκαν σε νανοκαθαρό νερό και αποθηκεύθηκε στους 4 ° C μέχρι την περαιτέρω χρήση. μετρήσεις DLS έγιναν για να καθοριστεί το μέγεθος, ο δείκτης πολυδιασποράς (PDI), και ζήτα δυναμικό των εθνικών κοινοβουλίων. ΣΔ χαρακτηρίστηκαν χρησιμοποιώντας TEM όπως αναφέρθηκε παραπάνω.

Σύνθεση γεμσιταβίνη και DZNep Encapsulated ΣΔ (Gem-DZNep-PLGA-

β

-PEG-OH-ΣΔ)

Η γεμσιταβίνη και DZNep συν-ενθυλακωμένα PLGA-b-PEG-ΟΗ ​​NPs ακολουθούσαν την ακριβή διαδικασία που αναφέρθηκαν παραπάνω, εκτός από το πρώτο βήμα όπου DZNep (10 mg /mL σε nanopure H

2O) και γεμσιταβίνη (10 mg /mL σε νανοκαθαρμένο H

2O) γαλακτωματοποιήθηκε με PLGA-PEG-ΟΗ ​​(5 mg σε CH

2Cl

2). Ο οργανικός διαλύτης απομακρύνθηκε με πλύση τρεις φορές χρησιμοποιώντας μεμβράνη διήθησης Amicon με 100 kDa cut-off. Τα NPs επαναιωρήθηκαν σε νανοκαθαρό νερό και αποθηκεύθηκε στους 4 ° C μέχρι την περαιτέρω χρήση. μετρήσεις DLS έγιναν για να καθοριστεί το μέγεθος, ο δείκτης πολυδιασποράς (PDI), και ζήτα δυναμικό των εθνικών κοινοβουλίων. ΣΔ χαρακτηρίστηκαν χρησιμοποιώντας TEM όπως αναφέρθηκε παραπάνω.

Σύνθεση Controlled Release Gem-DZNep-PLGA-

β

-PEG-TPP-ΣΔ

Η γεμσιταμπίνη (10 mg /mL σε νανοκαθαρμένο H

2O) γαλακτωματοποιήθηκε με PLGA-

β

-PEG-TPP (5 mg σε CH

2Cl

2) με κατεργασία υπερήχων για ένα λεπτό (Amplitude: 40% των 600 W ισχύ, Pulse: 1 δευτερόλεπτο μετά, 1 δευτερόλεπτο εκτός). Το πρωτεύον γαλάκτωμα γαλακτωματοποιήθηκε πάλι με την προσθήκη του γαλακτώματος νερό-σε-λάδι σε 2 mL νανοκαθαρό νερό που περιέχει 0.5% PVA και υπερηχήθηκε χρησιμοποιώντας παρόμοιες συνθήκες. Τέλος αυτό το γαλάκτωμα γαλακτωματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας 8 κ.εκ. νανοκαθαρό νερό που περιείχε 0,05% PVA και DZNep (10 mg /mL σε nanopure H

2O) υπό κατεργασία με υπερήχους χρησιμοποιώντας συνθήκες όπως αναφέρθηκε παραπάνω. Ο οργανικός διαλύτης απομακρύνθηκε με πλύση τρεις φορές χρησιμοποιώντας μεμβράνη διήθησης Amicon με 100 kDa cut-off. Τα NPs επαναιωρήθηκαν σε νανοκαθαρό νερό και αποθηκεύθηκε στους 4 ° C μέχρι την περαιτέρω χρήση. μετρήσεις DLS έγιναν για να καθοριστεί το μέγεθος, ο δείκτης πολυδιασποράς (PDI), και ζήτα δυναμικό των εθνικών κοινοβουλίων. ΣΔ χαρακτηρίστηκαν χρησιμοποιώντας TEM όπως αναφέρθηκε παραπάνω.

Σύνθεση Controlled Release Gem-DZNep-DSPE-PEG-ΟΗ-ΣΔ

Η γεμσιταμπίνη (10 mg /mL σε νανοκαθαρμένο H

2O) γαλακτωματοποιήθηκε με PLGA-b-PEG-ΟΗ ​​(5 mg σε CH

2Cl

2) με κατεργασία υπερήχων για ένα λεπτό (Amplitude: 40% των 600 W ισχύ, Pulse: 1 δευτερόλεπτο μετά, 1 δευτερόλεπτο εκτός) . Το πρωτεύον γαλάκτωμα γαλακτωματοποιήθηκε πάλι με την προσθήκη του γαλακτώματος νερό-σε-λάδι σε 2 mL νανοκαθαρό νερό που περιέχει 0.5% PVA και υπερηχήθηκε χρησιμοποιώντας τις συνθήκες που αναφέρθηκαν παραπάνω. Αυτό το γαλάκτωμα περαιτέρω γαλακτωματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας 8 κ.εκ. νανοκαθαρό νερό που περιείχε 0,05% PVA, 0,1% DSPE-PEG-COOH, και DZNep (10 mg /mL σε nanopure H

2O) υπό κατεργασία με υπερήχους χρησιμοποιώντας τις ίδιες συνθήκες όπως αναφέρθηκε παραπάνω. Ο οργανικός διαλύτης απομακρύνθηκε με πλύση τρεις φορές χρησιμοποιώντας μεμβράνη διήθησης Amicon με 100 kDa cut-off. Τα NPs επαναιωρήθηκαν σε νανοκαθαρό νερό και αποθηκεύθηκε στους 4 ° C μέχρι την περαιτέρω χρήση. μετρήσεις DLS έγιναν για να καθοριστεί το μέγεθος, ο δείκτης πολυδιασποράς (PDI), και ζήτα δυναμικό των εθνικών κοινοβουλίων. NPs χαρακτηρίστηκαν χρησιμοποιώντας ΤΕΜ όπως αναφέρθηκε παραπάνω.

Φόρτωση και Encapsulation Αποτελεσματικότητα των γεμσιταβίνη και DZNep σε NPs

γεμσιταβίνη και DZNep φόρτωσης και ενθυλάκωση απόδοσης (EE) προσδιορίστηκαν με τη διάλυση της πολυμερικής πυρήνα σε 0,1 Μ ΝαΟΗ και ποσοτικοποίηση της ποσότητας του θεραπευτικού στα ΕΠ χρησιμοποιώντας HPLC (κινητή φάση: ακετονιτρίλιο με 20% η

2O και 0,1% τριφθοροξικό οξύ, μήκος κύματος που χρησιμοποιείται:. 270 nm

Release Κινητικές μελέτες DZNep /Η γεμσιταβίνη NPs

NPs τοποθετήθηκαν σε μονάδες αιμοκάθαρσης Slide-Α-Lyzer® MINI με αποκοπή ΜΒ 10.000 g /mol. τα δείγματα υποβλήθηκαν σε διαπίδυση έναντι 1 χ PBS (6,0 L) σε μια σταθερή θερμοκρασία αναδευτήρα στους 37 ° . C και 35 rpm στους διάφορους προκαθορισμένο χρόνο σημεία, τα δείγματα απομακρύνθηκαν και το περιεχόμενο /DZNep γεμσιταβίνη προσδιορίστηκε με διάλυση του πολυμερικού πυρήνα σε 0,1 mmol ΝαΟΗ και ποσοτικοποίηση με ανάλυση HPLC (κινητή φάση: ακετονιτρίλιο με 20% η

2O και 0,1% τριφθοροξικό οξύ, μήκος κύματος που χρησιμοποιείται: 270 nm)

Στατιστικές αναλύσεις

για τις περιπτώσεις όπου συγκρίθηκαν μόνο δύο προϋποθέσεις, t test του Student χρησιμοποιήθηκε για τον εντοπισμό σημαντικών διαφορών.. Σε περιπτώσεις όπου συγκρίθηκαν τρεις ή περισσότερες συνθήκες, μονόδρομη ANOVA διεξήχθη ακολουθήθηκε από εξέταση πολλαπλού Σύγκριση κατά Tukey. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές. Εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά,

σ

& lt? 0,05 και

σ

& lt?. 0.01 σε σύγκριση με συνθήκες ελέγχου αντιπροσωπεύονται από ένα και δύο αστερίσκους, αντίστοιχα

Αποτελέσματα

DZNep Επιλεκτικά Αυξάνει γεμσιταβίνη κυτταροτοξικότητα σε καρκινικά, αλλά δεν είναι φυσιολογικό παγκρεατικά κύτταρα

Ξεκινήσαμε μελετώντας την κυτταροτοξικότητα της DZNep για φυσιολογικού και καρκινικού παγκρέατος κυτταρικές σειρές. Η θεραπεία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις DZNep (0,1 ηΜ-100 μΜ) έδειξαν σημαντική μείωση στην κυτταρική βιωσιμότητα σε όλες τις έξι παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν (δηλαδή, BxPC-3, Capan-1, L3.6pl, AsPC-1, MIA PaCa- 2, PANC-1) (Σχ. 1Α). Η κυτταροτοξικότητα παρατηρήθηκε ξεκινώντας περίπου 0,5-1 μΜ DZNep, ανάλογα με την κυτταρική γραμμή, και αυξάνεται σταδιακά με υψηλότερες συγκεντρώσεις αργότερα. Η κυτταροτοξικότητα δεν άρχισε μέχρι -48 h θεραπείας (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η μέγιστη μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων (~ 50% μείωση με 10 μΜ DZNep για 72 ώρες) παρατηρήθηκε σε φτωχά διαχωριζόμενες ΜΙΑ PaCa-2, το οποίο είναι μόνο οριακά γεμσιταβίνη ευαίσθητα (Εικ. 1Α). Σε υποσυμβάλλουσες κύτταρα, η επίδραση των DZNep επί ΜΙΑ PaCa-2 ήταν σχεδόν παρόμοια με εκείνη του γεμσιταβίνης (Εικ. 1 C). DZNep έδειξε πολύ χαμηλότερο κυτταροτοξικότητα σε καλά διαφοροποιημένο, γεμσιταβίνη ευαίσθητη παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές (δηλαδή, BxPC-3, Capan-1, L3.6pl) όταν συγκρίνεται με γεμσιταβίνη (Εικ. 1 C). Αξίζει να σημειωθεί ότι δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές μεταβολές στον πολλαπλασιασμό και την κυτταρική βιωσιμότητα των φυσιολογικών ανθρώπινων παγκρεατικών επιθηλιακών πόρου κύτταρα (HPDE) (μέχρι 10 μΜ DZNep για 72 ώρες), τα οποία είναι εξαιρετικά γεμσιταβίνη ευαίσθητα, καθώς επίσης και δύο άλλες φυσιολογικές κυτταρικές σειρές ( 293Τ (ανθρώπινα εμβρυονικά νεφρικά) και MCF-10Α (ανθρώπινα επιθηλιακά μαστού)) (Σχ. 1Α-Β, S1). Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι DZNep προσδίδει επιλεκτικά κυτταροτοξικά αποτελέσματα σε (ανεπαρκώς διαφοροποιημένο) παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα χωρίς σημαντική βλάβη του πολλαπλασιασμού σε φυσιολογική παγκρεατικά επιθηλιακά κύτταρα.

A. Όλες οι καρκινικές κυτταρικές σειρές εκτός από την κανονική HPDE είναι DZNep-απόκρισης και μειωμένη κυτταρική βιωσιμότητα. Β DZNep και γεμσιταμπίνη εμφανίζονται ανταγωνιστικά αποτελέσματα σε HPDE. C. DZNep και gemcitabine εμφανίζονται προσθετικά ή συνεργικά αποτελέσματα σε πολλές από τις καρκινικές κυτταρικές γραμμές παγκρεατικού. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά από 3 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων πλάκα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με είτε DZNep, gemcitabine, ή ένας συνδυασμός και των δύο σε μία ισομοριακή αναλογία για 72 ώρες. Cellular βιωσιμότητα μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία ΜΤΤ. Κυτταροτοξική IC

Οι 50 τιμές που υποδεικνύονται. Έννοιες μεταξύ γεμσιταμπίνη και DZNep καθώς DZNep + Γεμσιταβίνη και DZNep ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από post-hoc δοκιμασία του Tukey. δείκτης συνδυασμού (CI) οικόπεδα (ένθετα) δείχνουν τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των δύο φαρμάκων. CI & gt? 1, ο ανταγωνισμός? CI = 1, προσθετικότητα? CI & lt? 1, συνέργεια. Ιστογράμματα προς τα δεξιά δείχνουν την σχετική δραστικότητα της κασπάσης-3 (RCA) κάθε θεραπείας όπως μετράται με ένταση φθορισμού. Οι τιμές ήταν αφαιρεθεί το υπόβαθρο και παρουσιάζονται ως πτυσσόμενο αλλαγή από τον έλεγχο. Σημασία μεταξύ ενός μόνο φαρμάκου έναντι του συνδυασμού φαρμάκων ταυτοποιήθηκε μέσω μονόδρομης ANOVA που ακολουθείται από post-hoc ανάλυση κατά Tukey. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1 μΜ DZNep, 100 ηΜ γεμκιταβίνης, ή και τα δύο.

Bars

, SD.

n

= 3. *

σ

& lt? 0,05, **

σ

& lt?. 0.01

Η

Ενθαρρυμένος από την πιθανή ικανότητα DZNep να αντισταθμίσει ανάλογο νουκλεοζίτη ανθεκτικότητα σε καρκίνο του παγκρέατος, έχουμε συν-κατεργασμένα κύτταρα με DZNep και gemcitabine σε ισομοριακές αναλογίες και σύγκριση των κυτταρικών βιωσιμότητες με εκείνα που λαμβάνονται όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με είτε DZNep ή γεμκιταβίνη μόνο. Είναι ενδιαφέρον ότι η συν-θεραπεία έδειξε σημαντικά υψηλότερες μειώσεις στην κυτταρική βιωσιμότητες των περισσότερων από τις γεμσιταβίνης ευαίσθητα και -insensitive καρκινικών κυττάρων από ό, τι όταν οι ενώσεις χρησιμοποιήθηκαν ως αυτόνομα παράγοντες (Εικ. 1 C). Αντιστρόφως, ο συν-θεραπεία ελαττωμένη κυτταροτοξικότητα (& gt? 2-φορές στα 100 ηΜ συγκέντρωση) σε HPDE (Σχήμα 1 Β.), Προτείνοντας ένα κυτταροπροστατευτικό ρόλος του DZNep μόνο στα φυσιολογικά κύτταρα

εκτιμάται το δείκτη συνδυασμού (. CI) οικόπεδα [26], για να προσδιορίσει το είδος της αλληλεπίδρασης μεταξύ DZNep και γεμσιταβίνη. Οι εκτιμήσεις αυτές προσδιορίζονται μια συνεργιστική ή προσθετική αλληλεπίδραση μεταξύ DZNep και gemcitabine (100 ηΜ-10 μΜ) σε όλες τις παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές με μόνη εξαίρεση AsPC-1, καθώς και μια έντονη ανταγωνιστική αλληλεπίδραση σε φυσιολογικά HPDE (Εικ. 1 C). Συν-θεραπεία του DZNep (1 ηΜ-10 μΜ) με διαφορετικές συγκεντρώσεις γεμσιταβίνη (1-100 ηΜ) έδειξε ότι DZNep ενισχύει την κυτταροτοξικότητα σε γεμσιταβίνη δοσοεξαρτώμενο τρόπο σε οριακά γεμσιταβίνης ευαίσθητη ΜΙΑ PaCa-2, ενώ μια τέτοια ενίσχυση εμφανίστηκαν σε σε μεγάλο βαθμό gemcitabine ανεξάρτητο από τη δόση τρόπο σε κύτταρα υψηλής γεμσιταβίνη ευαίσθητα Capan-1 (Εικ. S2). HPDE παρέμεινε κυτταροτοξική σε γεμσιταβίνη, επιβεβαιώνοντας ανταγωνισμός μεταξύ των δύο ενώσεων (Εικ. S2). Περαιτέρω ανάλυση της αλληλεπίδρασης με διάφορες αναλογίες γεμσιταβίνη: DZNep (1:01, 1:04, 4:01, 1:10, 10:01) προσδιόρισε μέγιστη συνεργική και κυτταροτοξική αντίδραση σε ΜΙΑ PaCa-2 χρησιμοποιώντας την αναλογία 1:10 ( Εικ. S3). Τέλος, προκειμένου να κατανοήσουμε το μηχανισμό της μείωσης της κυτταρικής βιωσιμότητας, πραγματοποιήσαμε κασπάσης-3 προσδιορισμούς απόπτωσης βασίζεται. Αυτά τα αποτελέσματα (σχ. 1C) προσδιόρισε μια σημαντική επαγωγή της απόπτωσης ως ένα σημαντικό μηχανισμό που συμβάλλουν για DZNep προκαλούμενη αύξηση της γεμσιταβίνης κυτταροτοξικότητα (Εικ. 1 C).

νουκλεοζίτου Μεταφορείς διευκολύνει την κυτταρική Έναρξη του DZNep

Δεδομένου ότι DZNep είναι ένα υδρόφιλο ανάλογο νουκλεοσιδίου με ένα log Ρ -1,38 [5], υποθέσαμε ότι η είσοδος της στα κύτταρα θα εξαρτηθεί από την έκφραση του νουκλεοζίτη μεταφορέων, και ως εκ τούτου, η έλλειψη επαρκούς έκφρασης φορέα θα περιορίζει την κυτταρική δραστηριότητα της. Για να εξεταστεί αυτό, πραγματοποιήθηκε μία ανίχνευση ανταγωνιστικής με την αξιολόγηση του επιπέδου της αναστολής στην κυτταρική μεταφορά νουκλεοσιδίων με DZNep. Επιλέξαμε το κυτταρικές γραμμές ΜΙΑ PaCa-2 PANC-1 και για αυτές τις μελέτες επειδή έχουν αναφερθεί ότι εκφράζουν πολλαπλές μεταφορείς νουκλεοσιδίου [33]. ανάλυση μεταφορών που προσδιορίζονται μια σημαντική αναστολή της

3Η-αδενοσίνη και

3Η-γουανοσίνη (πουρίνες) μεταφορές, αλλά όχι

3Η-θυμιδίνης (πυριμιδίνης) (Εικ. 2Α). μεταφορά Γεμσιταβίνη στους δύο τύπους κυττάρων ανεστάλη μόνο σε υψηλότερη συγκέντρωση (200 μΜ) (Σχ. 2Α). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι DZNep κυτταρική εισροή διευκολύνεται από πουρινών, αλλά δεν πυριμιδίνης, νουκλεοσιδίου μεταφορείς.

Α. DZNep παρεμπόδισαν την πρόσληψη του ραδιοσημασμένου πουρινών PANC-1 και ΜΙΑ PaCa-2. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά από 5 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο σπάρθηκαν σε 24 φρεατίων πλάκα, τα κύτταρα αφέθηκαν να πρόσληψη την υποδεικνυόμενη ραδιοεπισημασμένο νουκλεοζίτη σε παρουσία DZNep ή αντίστοιχων μη επισημασμένου νουκλεοζίτη του. B. Αναστολή της μεταφοράς αδενοσίνης σε

Xenopus

ωαρίων με DZNep. C. Η φαρμακολογική αναστολή της hENT1 και περίσσεια ουριδίνη μείωσε την κυτταροτοξικότητα του DZNep σε ΜΙΑ PaCa-2. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά από 3 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων πλάκα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις DZNep παρουσία DMSO (έλεγχος), 10 μΜ NBMPR, ή 200 μΜ ουριδίνης. Cellular βιωσιμότητα μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία ΜΤΤ. IC

Οι 50 τιμές που υποδεικνύονται. Σημαντικές διαφορές μεταξύ του ελέγχου και κάθε αγωγή προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία t του Student.

Bars

, SD.

n

= 3. *

σ

& lt? 0,05, **

σ

& lt?. 0.01

Η

Για να χαρακτηριστεί περαιτέρω η ταυτότητα του τα νουκλεοσιδικα μεταφορείς πουρινών διαμεσολάβηση εισροή DZNep, εξετάσαμε την ικανότητα των DZNep να αναστέλλει

3Η-αδενοσίνη μεταφορών

Xenopus

ωοκύτταρα που εκφράζουν επιμέρους μεταφορείς. Μια σημαντική αναστολή της hENT1- και hCNT3 μεσολάβηση

παρατηρήθηκε 3Η-αδενοσίνη μεταφοράς, ενώ μια σημαντική αναστολή της hCNT2 μεσολάβηση

3Η-αδενοσίνη μεταφορών παρατηρήθηκε μόνο στην υψηλότερη συγκέντρωση (200 μΜ) (Εικ. 2Β ). Δεν παρατηρήθηκε σημαντική μείωση των μεταφορών αδενοσίνης από DZNep παρατηρήθηκε σε ωοκύτταρα hENT2 εκφράζουν.

Στη συνέχεια, για να μελετήσει τις επιπτώσεις της hENT1 και hCNT3 για DZNep κυτταροτοξικότητα σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, εξετάσαμε τον πολλαπλασιασμό των MIA PaCa- 2 παρουσία ενός φαρμακολογικού αναστολέα της hENT1 (10 ηΜ NBMPR) ή περίσσεια ουριδίνης (200 μΜ) που αναστέλλει ανταγωνιστικά όλα ΩΡΛ και CNTs. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι και οι δύο συνθήκες μπορεί να μειώσει σημαντικά DZNep κυτταροτοξικότητα της ΜΙΑ PaCa-2, όπως κρίνεται από τις αυξήσεις στην κυτταροτοξική IC

50 εκτιμήσεων (2-8 φορές) (Σχ. 2C).

Ακύλιο Παραγωγοποίηση της DZNep Augments Ευαισθητοποίηση των παγκρεατικών κυττάρων σε γεμσιταβίνη

από DZNep τουλάχιστον χρησιμοποιεί εν μέρει μεταφορείς για την άσκηση έπακρο τις δυνατότητές του, είναι πιθανό ότι οι ασθενείς μεταφορέα ανεπάρκεια μπορεί να ανταποκριθεί καλά σε DZNep. Για να παρακαμφθεί αυτό το πρόβλημα, δημιουργήσαμε πολικό ακυλο παράγωγα DZNep (Εικ. 3Α) χρησιμοποιώντας μία συνθετική διαδικασία που περιγράφεται στο

Υλικά και Μέθοδοι

. Εμείς αντικατασταθεί DZNep στο Ν

6-NH

2 ομάδα με ακυλο πλευρικές αλυσίδες για να δημιουργήσει δύο λιπόφιλες προ-φάρμακα (προφάρμακο 1: C

20Η

29ClN

4O

4? Προφάρμακο 2 : C

18Η

24N

4O

4). Τα συντιθέμενα προφάρμακα αξιολογήθηκαν για αντι-πολλαπλασιαστική τους δραστηριότητες, και μεμονωμένα και σε συνδυασμό με γεμσιταβίνη, σε ένα φυσιολογικό (HPDE), γεμσιταβίνη-ευαίσθητα (Capan-1), και γεμσιταβίνη ανθεκτικά (ΜΙΑ PaCa-2) κυτταρικής γραμμής.