Αφηρημένο

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται με όλο τον κόσμο. Η πρόσφατη πρόοδος στη διάγνωση και θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα έχει επιτευχθεί λόγω της καλύτερης κατανόησης των μοριακών μηχανισμών της νόσου και την ταυτοποίηση βιοδεικτών που επιτρέπουν πιο ειδικές θεραπείες για τον καρκίνο. Ένα από τα καλύτερα γνωστά παραδείγματα της εξατομικευμένης θεραπείας είναι η χρήση των αναστολέων της κινάσης τυροσίνης, όπως gefitinib και erlotinib, για την επιτυχή θεραπεία των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα μη-μικρού κυττάρου που επιλέγονται με βάση τη συγκεκριμένη

EGFR

μεταλλάξεις. Ως εκ τούτου, η αξιόπιστη ανίχνευση των μεταλλάξεων είναι κρίσιμη για την εφαρμογή της κατάλληλης θεραπείας. Σε αυτή τη μελέτη, εξετάσαμε δύο επιπέδων στρατηγική ανίχνευση μετάλλαξης χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς PCR πραγματικού χρόνου ως μια καλά επικυρωμένη μέθοδο υψηλής ευαισθησίας και multiplex απολίνωση-εξαρτώμενη ενίσχυση καθετήρα (MLPA) -με βάση EGFRmut + δοκιμασία ως δεύτερης βαθμίδας πρότυπο ευαισθησίας μέθοδος. Ένα επιπλέον πλεονέκτημα της εφαρμοζόμενης μεθόδου MLPA είναι ότι επιτρέπει την ταυτόχρονη ανίχνευση των μεταλλάξεων του EGFR και αντίγραφο-αριθμός αλλαγές (δηλαδή, ενισχύσεις) στο

EGFR, ΚΟΑ

και

ΕΚΒΒ2

. Η ανάλυσή μας έδειξε υψηλή αντιστοιχία μεταξύ αυτών των δύο μεθόδων. Με τη χρήση αυτής της στρατηγικής των δύο βαθμίδων, έχουμε αξιόπιστα καθορίζεται η συχνότητα των

EGFR

μεταλλάξεις και

EGFR, ΚΟΑ

και

ΕΚΒΒ2

ενισχύσεις σε πάνω από 200 δείγματα καρκίνου του πνεύμονα. Επιπλέον, αξιοποιώντας ταυτόχρονα τον αριθμό αντιγράφων και μικρές μετάλλαξη αναλύσεις, δείξαμε μια πολύ ισχυρή συσχέτιση μεταξύ μεταλλάξεων του EGFR και ενισχύσεις EGFR και αμοιβαία αποκλειστικότητα των μεταλλάξεων του EGFR /ενισχύσεις με ΚΟΑ και ενισχύσεις ErbB2. Τα αποτελέσματά μας απέδειξαν την αξιοπιστία και τη χρησιμότητα των δύο επιπέδων στρατηγική δοκιμών EGFR

Παράθεση:. Lewandowska MA, Czubak Κ, Klonowska K, Jozwicki W, Kowalewski J, Kozlowski P (2015) η χρήση μιας Δύο- κλιμακωτή στρατηγική δοκιμών για την ανίχνευση Ταυτόχρονη Μικρών

EGFR

Μεταλλάξεις και

EGFR

ενίσχυση στον καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 10 (2): e0117983. doi: 10.1371 /journal.pone.0117983

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Rafael Rosell, καταλανικά Ινστιτούτο Ογκολογίας, Ισπανία

Ελήφθη: May 16, 2014? Αποδεκτές: 5 Ιανουαρίου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 26 Φεβρουαρίου, 2015

Copyright: © 2015 Lewandowska et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από την έρευνα επιχορήγηση 2011/01 /Β /NZ5 /02773 από το Εθνικό Κέντρο Επιστημών (https://www.ncn.gov.pl /). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται με όλο τον κόσμο. Η θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα είναι παραδοσιακά βασίζεται σε μια ιστοπαθολογική αξιολόγηση που διακρίνει δύο κύριοι τύποι καρκίνου του πνεύμονα: μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (SCLC) και καρκίνο του πνεύμονα μη-μικρού κυττάρου (NSCLC), το τελευταίο των οποίων μπορεί να υποδιαιρεθεί σε πλακώδες καρκίνωμα, καρκίνωμα μεγάλου κυττάρου, αδενοκαρκίνωμα και καρκίνους με μικτή ιστολογία. Ουσιαστική πρόσφατη πρόοδο στη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα (ιδιαίτερα τα αδενοκαρκινώματα) έχει επιτευχθεί από τις προόδους στην κατανόηση της παθολογίας του? οι τρέχουσες επιλογές θεραπείας περιλαμβάνουν εξειδικευμένους παράγοντες με βάση την παρουσία ή απουσία συγκεκριμένων γενετικών βιοδείκτες ( «εξατομικευμένη θεραπεία»), όπως μεταλλάξεις στον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (

EGFR

) [1], ή να αποκτήσουν του κύκλου μετατοπίσεις λειτουργία ή αναστροφές που αφορούν την αναπλαστικού λεμφώματος τυροσινικής κινάσης του υποδοχέα (

ALK

) [2].

έχει αποδειχθεί ότι ορισμένες σωματικές μεταλλάξεις εντός της περιοχής της κινάσης του

EGFR

ευαισθητοποιήσει καρκίνοι στη θεραπεία με

EGFR

-ειδικά αναστολείς της τυροσινικής κινάσης (TKIs), όπως erlotinib ή gefitinib (αναθεωρηθούν [3]). Μεταξύ των πιο κοινή ευαισθητοποίηση

EGFR

μεταλλάξεις είναι L858R στο εξόνιο 21 και σε πλαίσιο διαγραφές στο εξόνιο 19, που από κοινού αντιπροσωπεύουν πάνω από το 80-85% του συνόλου

EGFR

μεταλλάξεις. Ωστόσο, η εμφάνιση του δευτερεύοντος μετάλλαξης Τ790Μ στο εξώνιο 20 προκαλεί επίκτητη ανθεκτικότητα σε ΤΚΙδ και προκαλεί την εξέλιξη των καρκίνων σε επεξεργασία με TKIs [4,5]. Ως εκ τούτου, η αξιόπιστη ανίχνευση του

EGFR

μεταλλάξεις είναι ένας σημαντικός παράγοντας που επιτρέπει την εξατομικευμένη θεραπεία των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα.

Κατά τα τελευταία 10 χρόνια, έχουν χρησιμοποιηθεί πολλές μέθοδοι με διαφορετικές ευαισθησίες και εξειδικεύσεις για την ανίχνευση

EGFR

μεταλλάξεις σε δείγματα καρκίνου. Αυτές οι μέθοδοι περιλαμβάνουν προσδιορισμό της αλληλουχίας του Sanger, μονού κλώνου διαμόρφωσης πολυμορφισμού (SSCP) [6], η συν-ενίσχυση σε χαμηλότερη θερμοκρασία μετουσίωσης-PCR (COLD PCR) [7], ανοσοϊστοχημεία με

EGFR

-mutation ειδικά αντισώματα [8] , πεπτιδικά νουκλεϊκά οξέα κλειδωμένο νουκλεϊκό οξύ (ΡΝΑ-LNA) δοκιμασίες σφιγκτήρα PCR, πραγματικού χρόνου PCR (RT-PCR) μεθόδους [9] και αλληλούχιση επόμενης γενιάς [10]. Ωστόσο, καμία από τις μεθόδους που έχουν χρησιμοποιηθεί μέχρι τώρα είναι ιδανικό, και κάθε μία από αυτές τις μεθόδους έχει περιορισμούς που σχετίζονται κυρίως με τα ακόλουθα χαρακτηριστικά των δειγμάτων καρκίνου: (i) σε διάφορους τύπους δειγμάτων όγκων που διατίθενται για ανάλυση (χειρουργική, βιοψία), (ii) η μόλυνση με τα φυσιολογικά κύτταρα, (iii) η γενετική ετερογένεια των όγκων, (v) συχνά χαμηλής συχνότητας των αναλυθέντων μεταλλάξεων, (iv) αποδόμηση του DNA, και (v) βλάβη ή τροποποίηση του DNA [των δύο τελευταίων παράγοντες ισχύουν και για φορμόλη σταθερό, έχει εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) δείγματα, τα οποία είναι τα πιο συχνά διαθέσιμα δείγματα]. Τα πιο σοβαρά προβλήματα που προκύπτουν από τους περιορισμούς της ανάλυσης δειγμάτων όγκου είναι ψευδώς αρνητικά και ψευδώς θετικά σφάλματα που μπορεί να οδηγήσει στην ταξινόμησης και ανεπαρκή θεραπεία του καρκίνου. Ως εκ τούτου, για να μειωθεί το κλάσμα που ταξινομούνται λανθασμένα δείγματα, που προτάθηκε πρόσφατα στην τεκμηριωμένη κατευθυντήρια γραμμή των τριών επαγγελματικών κοινωνιών (College of American Παθολόγοι, Διεθνών Οργανισμών για τη μελέτη του καρκίνου του πνεύμονα, και Σύνδεσης Μοριακής Παθολογίας) ότι, αν είναι δυνατόν,

EGFR

δοκιμές μετάλλαξης θα πρέπει να πραγματοποιείται με δύο μεθόδους (α δύο επιπέδων στρατηγική δοκιμών). Αυτή η κατευθυντήρια γραμμή αντιπροσωπεύει μοριακές δοκιμές καρκίνου του πνεύμονα state-of-the-art και από κοινού δημοσιεύθηκε σε τρία περιοδικά [11-13]. Για λόγους απλότητας, θα αναφερθούμε στη συνέχεια μόνο στο [11]. Αυτή η μέθοδος δύο βαθμίδων θα πρέπει να βασίζονται σε διαφορετικές αρχές ανίχνευση μετάλλαξης και θα πρέπει να καλύπτουν διαφορετικές περιοχές της ευαισθησίας, που αποτελείται από πρότυπες μεθόδους ευαισθησίας και υψηλής ευαισθησίας.

Σε αυτή τη μελέτη, θα δοκιμαστεί πάνω από 200 δείγματα NSCLC με το χρήση των δύο συμπληρωματικών μεθόδων, μια ρουτίνα που χρησιμοποιείται εμπορική δοκιμασία RT-PCR (μέθοδος υψηλής ευαισθησίας) [9] και ένα νέο multiplex απολίνωση εξαρτώμενη ενίσχυση ανιχνευτή (MLPA) -με βάση EGFRmut + δοκιμασίας (ένα πρότυπο-ευαισθησία, μέθοδος δεύτερης κατηγορίας ) [14]. Η ανάλυσή μας έδειξε μια υψηλή αντιστοιχία μεταξύ αυτών των δύο μεθόδων και έτσι απέδειξε την αξιοπιστία και τη χρησιμότητα του EGFRmut + δοκιμασία ως μέθοδο δεύτερης βαθμίδας για

EGFR

δοκιμή μετάλλαξης. Με τη χρήση αυτών των μεθόδων, χαρακτηρίσαμε και εκτιμηθεί η συχνότητα των σωματικών

EGFR

μεταλλάξεις σε ένα σύνολο δειγμάτων καρκίνου του πνεύμονα από την κεντρική Πολωνία. Ένα πρόσθετο πλεονέκτημα του προσδιορισμού EGFRmut + είναι ότι επιτρέπει μια ανάλυση μετάλλαξης και προσδιορισμός αριθμός σχετική αντιγράφων (δηλ ανίχνευση ενίσχυσης) παράλληλα. Χρησιμοποιήσαμε αυτή την προσέγγιση για να βρείτε μια πολύ ισχυρή συσχέτιση μεταξύ

EGFR

ενίσχυση και η εμφάνιση του

EGFR

μεταλλάξεις και να καθορίσει το τραχύ συχνότητα των μεταλλαγμένων αλληλομόρφων στα δείγματα που αναλύθηκαν μας.

Υλικά και Μέθοδοι

Επιλογή και επεξεργασία των δειγμάτων NSCLC για μοριακή ανάλυση

Εξετάσαμε αναδρομικά μια κοόρτη 239 ασθενών με ιστοπαθολογικά επιβεβαίωσε NSCLC διαγιγνώσκονται 2011-2012 στο Franciszek Lukaszczyk Ογκολογικό Κέντρο στο Μπιντγκός (κεντρική Πολωνία). Η ηλικία των ασθενών κυμαινόταν από 35 έως 81. Ένα σύνολο 239 δειγμάτων που πέρασαν τα βήματα ελέγχου ποιότητας (μικροσκοπική ανάλυση και όγκου προσόντα περιεχόμενο, καθώς και την ποιοτική και ποσοτική ανάλυση DNA) ελήφθησαν μετά από 143 χειρουργικές επεμβάσεις, 91 λεπτή βελόνη ( FNA) διαδικασίες, και 5 ενδοβρογχική υπερήχων με γνώμονα διαβρογχική παρακέντηση () διαδικασίες EBUS-TBNA ή πλευριτικού υγρού δειγματοληψίες. Τα δείγματα χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη για την ποιοτική και ποσοτική ανάλυση των καρκινικών κυττάρων στο αναλύθηκε υλικό (συμπεριλαμβανομένων macrodissection σε βαθμολογείται δείγματα). Ο χαρακτηρισμός του βιολογικού υλικού για μοριακή ανάλυση βασίστηκε στα περιγράφηκε προηγουμένως ποιοτικές και ποσοτικές κλίμακες για κυτταρολογική [9] και ιστολογική [15] υλικό. Ενημέρωσε γραπτή συγκατάθεση για γενετικό έλεγχο, που εγκρίθηκε από την F. Lukaszczyk Ογκολογικό Κέντρο στο Bydgoszcz λήφθηκε από όλους τους ασθενείς και η μελέτη εγκρίθηκε από την τοπική επιτροπή δεοντολογίας μας, Επιτροπή Βιοηθικής του Ludwig Rydygier Collegium Medicum στο Bydgoszcz, Πανεπιστήμιο Nicolaus Copernicus στο Torun . Τα δεδομένα αναλύθηκαν ανώνυμα.

DNA απομόνωση

απομόνωση DNA πραγματοποιήθηκε μετά την macrodissection μιας περιοχής που υποδεικνύεται από το pathomorphologist. Γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε από FFPE αδενοκαρκίνωμα ιστό ή κυτταρολογικά επιχρίσματα χρησιμοποιώντας μια QIAamp FFPE Mini Kit (QIAGEN) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή με τις ακόλουθες τροποποιήσεις. Εμείς επαναιωρήθηκε το ίζημα σε 180 μl του ρυθμιστικού διαλύματος λύσης ιστού με 20 μΐ πρωτεϊνάσης Κ, και στη συνέχεια στροβιλίζεται και συνεχώς τίναξε το κυτταρικό ίζημα σε σύντομα χρονικά διαστήματα κατά τη διάρκεια μιας από ολονύκτια επώαση στους 56 ° C. Η ποσότητα και η ποιότητα του DNA αξιολογήθηκαν με ανάλυση NanoDrop απορρόφησης και ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης.

Η ανάλυση της μεταλλαγής με πραγματικού χρόνου PCR

Η μέθοδος RT-PCR χρησιμοποιεί μετάλλαξη ειδικούς ανιχνευτές για την αξιολόγηση 29 σημειακές μεταλλάξεις , συμπεριλαμβανομένης της μετάλλαξης Τ790Μ (EGFR-RT52? Entrogen, Inc., Tarzana, CA). Μία ποσότητα DNA από 200 έως 650 ng ήταν επαρκής για την ανίχνευση μεταλλάξεων σε 29 δείγματα του ενδιαφέροντος? Ο εσωτερικός έλεγχος VIC ανιχνευτές φθορισμού και

EGFR

φθορισμού ανιχνευτές FAM χρωστική-επισημασμένο. Οι καμπύλες ενίσχυσης αξιολογήθηκαν σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή.

Μετάλλαξη και ανάλυση ενίσχυση από MLPA

ανάλυση

MLPA διεξήχθη με τη χρήση ενός ειδικά σχεδιασμένα EGFRmut + δοκιμασία, η οποία έχει προηγουμένως περιγράφεται με μεγαλύτερη λεπτομέρεια [14]. Αυτή η δοκιμασία επιτρέπει ταυτόχρονα την ανίχνευση των ογκογόνων

EGFR

μεταλλάξεις και μια ανάλυση του αριθμού αντιγράφων (ανίχνευση ενίσχυση) του

EGFR

,

MET

, και

ΕΚΒΒ2

. Όλα τα αντιδραστήρια εκτός από το μείγμα ιχνηλατών EGFRmut + αγοράστηκαν μορφή MRC-Ολλανδία Άμστερνταμ, Ολλανδία (www.mlpa.com). Οι αντιδράσεις MLPA διεξήχθησαν σύμφωνα με τις γενικές συστάσεις του κατασκευαστή (MRC-Holland), όπως περιγράφεται παραπάνω σε [16,17]. Εν συντομία, 5 μΐ γονιδιωματικού DNA (σε συγκέντρωση περίπου 20 ng /NL) επωάστηκε στους 98 ° C για 5 λεπτά, ψύχθηκε σε θερμοκρασία δωματίου και αναμίχθηκαν με 1,5 μΙ EGFRmut μείγματος + ανιχνευτών και 1,5 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος υβριδοποίησης SALSA. Η αντίδραση στη συνέχεια μετουσιώθηκαν στους 95 ° C για 2 λεπτά και υβριδοποιήθηκε στους 60 ° C για 16 ώρες. Οι ανιχνευτές υβριδοποιήθηκαν συνδέθηκαν στους 54 ° C για 15 λεπτά με την προσθήκη 32 μΐ μίγματος απολίνωσης. Μετά την αδρανοποίηση θερμότητας, η αντίδραση απολίνωσης ψύχεται σε θερμοκρασία δωματίου, αναμιγνύεται με 10 μΙ μίγματος PCR (πολυμεράση, dNTPs, και καθολική εκκινητές, ένας εκ των οποίων σημάνθηκε με φλουορεσκεΐνη) και υποβλήθηκε σε ενίσχυση PCR για 35 κύκλους. Τα προϊόντα MLPA στη συνέχεια αραιώθηκαν 20χ σε HiDi φορμαμιδίου που περιέχει GS Liz600, το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο μεγέθους DNA, και διαχωρίστηκαν μέσω ηλεκτροφόρησης τριχοειδούς (πολυμερές POP7) σε μία συσκευή ΑΒΙ Prism 3130XL (Applied Biosystems). Τα ληφθέντα ηλεκτροφορήματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό v1.91 GeneMarker (2.4.0). Οι εντάσεις σήματος (τα ύψη των κορυφών) ανακτήθηκαν και μεταφέρθηκαν σε έτοιμα φύλλα Excel (διαθέσιμο κατόπιν αιτήματος). Για κάθε επιμέρους δείγμα, η ένταση σήματος κάθε ανιχνευτή διαιρέθηκε με την μέση ένταση σήματος των ανιχνευτών ελέγχου για την κανονικοποίηση των λαμβανόμενων τιμών και για την εξίσωση των run-to-τρέξει παραλλαγή, και η κανονικοποιημένη τιμή για κάθε κορυφή διαχωρίζεται κατόπιν από ένα αντίστοιχο αξία στα δείγματα αναφοράς και πολλαπλασιασμένο επί 2. το τελικό αποτέλεσμα MLPA κάθε δείγματος παρουσιάζεται στη γραμμή-πλοκή, στην οποία οι ράβδοι δείχνουν τον σχετικό αριθμό αντιγράφων αξία των επακόλουθων ανιχνευτών.

αριθμού αντιγράφων EGFR ανάλυση με ποσοτική PCR (qPCR) και σταγονιδίου ψηφιακή PCR (ddPCR)

Η ανάλυση qPCR διεξήχθη με τη χρήση της MESA GREEN qPCR βασικού μείγματος Plus για Δοκιμασία SYBR (Eurogentec, Seraing, Βέλγιο), σύμφωνα με τις γενικές συστάσεις του κατασκευαστή. ddPCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του συστήματος QX200 και EvaGreen Supermix (Bio-Rad, CA, USA) σύμφωνα με τις γενικές συστάσεις του κατασκευαστή, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18,19]. Η ανάλυση ddPCR διεξήχθη σε ένα multiplex μορφή με την συν-ενίσχυση του ελέγχου-amplicon και ένας από τους δοκιμαστικούς αμπλικόνια σε μία αντίδραση. Για να επιτευχθεί κατάλληλο διαχωρισμό των τύπων των σταγονιδίων, η ένταση του σήματος δοκιμής και ελέγχου διαφοροποιείται από το «μήκος και αστάρια» αμπλικόνια συγκεντρώσεις. Και για τις δύο μεθόδους χρησιμοποιήθηκε η ίδια σετ εκκινητών PCR: (i) δοκιμή-amplicon για το

EGFR

εξόνιο 2: προς τα εμπρός GCAGTTGGGCACTTTTGAAG εκκινητή, αντίστροφο εκκινητή TTCCAAATTCCCAAGGACCA (συγκέντρωση σε qPCR-300 ηΜ, η συγκέντρωση σε ddPCR-100 ηΜ , μήκους αμπλικόνιο 83 bp)? (Ii) δοκιμή-amplicon για εξόνιο EGFR 18: προς τα εμπρός TTGTGGAGCCTCTTACACCC εκκινητή, αντίστροφο εκκινητή CCTTCAAGATCCTCAAGAGAGC (συγκέντρωση στην qPCR-300 nM, συγκέντρωση σε ddPCR-100 nM, μήκους αμπλικόνιο 64 bp)? (Iii) έλεγχος-αμπλικόνιο: προς τα εμπρός GCTGACCTGTTGGCTGAAAA εκκινητή, αντίστροφο εκκινητή GAATCGCTGTGGCCTTGATG (συγκέντρωση στην qPCR-300 nM, συγκέντρωση στο ddPCR-200 nM? Μήκους αμπλικόνιο 113 bp). Τα αμπλικόνια είτε επικαλύπτονται ή στενά βρίσκονται στους ακόλουθους ανιχνευτές MLPA: EGFR_e2, EGFR_e18 και ctrl_1, αντίστοιχα. Η βελτιστοποιημένη θερμοκρασία ανόπτησης ορίστηκε σε 59 ° C και 58 ° C, σε qPCR και ddPCR, αντίστοιχα

Αποτελέσματα

Όλα τα 239 δείγματα που αναλύθηκαν ως τυφλά δείγματα με δύο μεθόδους:. (I) μια εμπορική δοκιμασία RT-PCR (EGFR-RT52? Entrogen Inc.) που καλύπτει 29 από τις πιο κοινές ογκογόνων μεταλλάξεων στα εξόνια 18, 19, 20 και 21 του

EGFR

(για λεπτομέρειες, δείτε την ιστοσελίδα τους κατασκευαστές? https://www.entrogen.com/web2/egfr-mutation-analysis-kit) και (ii) ένα ειδικά σχεδιασμένο δοκιμασία MLPA (EGFRmut +) που επιτρέπει ταυτόχρονα την ανίχνευση ενισχύσεις και μικρές μεταλλάξεις σε

EGFR

(για λεπτομέρειες βλέπε [14]) (Εικ. 1). Εν συντομία, εκτός από τις συνήθεις (DS) ανιχνευτές δοσολογία ευαίσθητη, η δοκιμασία EGFRmut + αποτελείται επίσης από δύο τύπους μετάλλαξης ευαίσθητα ανιχνευτές. Μετάλλαξη ευαίσθητα (MS-) ανιχνευτές είναι τύποι DS ανιχνευτές που είναι ειδικά για την αλληλουχία άγριου τύπου, αλλά συμπίπτουν με τις θέσεις των παρακάτω μεταλλάξεις: G719A /S /C (G719X) στο εξόνιο 18 (ανιχνευτής Ε18), εσωτερικά διαγραφές πλαίσιο στο εξόνιο 19 (ανιχνευτής Ε19), S768I και παρεμβολές σε πλαίσιο στο εξόνιο 20 (ανιχνευτής e20-1), Τ790Μ στο εξόνιο 20 (καθετήρα e20-2) και L858R στο εξόνιο 21 (ανιχνευτής Ε21). Η εμφάνιση μιας από αυτές τις μεταλλάξεις σε αναλυθέντος δείγματος προκαλεί μια μείωση στο σήμα της αντίστοιχης MS-ανιχνευτή. Η δοκιμασία EGFRmut + περιέχει επίσης τρία (MS +) ανιχνευτές μετάλλαξης ευαίσθητα που είναι ειδικά για μεταλλαγμένες αλληλουχίες. Τα σήματα από αυτούς τους ανιχνευτές γίνεται μόνον αν η αντίστοιχη μετάλλαξη είναι παρούσα. Δύο από αυτούς τους ανιχνευτές αναγνωρίζουν τις αλληλουχίες από τις πιο κοινές

EGFR

μεταλλάξεις (η πιο κοινή διαγραφή εντός πλαισίου στο εξόνιο 19, c.2235_2249del15 (ανιχνευτής E19 +) και L858R (ανιχνευτής Ε21 +)), και η τρίτη αναγνωρίζει η μετάλλαξη Τ790Μ, η οποία σχετίζεται με την αντίσταση ΤΚΙ (ανιχνευτής e20-2 +). Επιπλέον, EGFRmut + περιέχει μερικά DS ανιχνευτές που είναι ειδικά είτε για

MET

ή

ΕΚΒΒ2

που επιτρέπουν ενισχύσεις από αυτά τα γονίδια που πρόκειται να ανιχνευθεί.

Α) Χάρτης του

EGFR

γονίδιο με τις θέσεις των RT-PCR αμπλικόνια (EGFR-RT52) και ανιχνευτές MLPA (EGFRmut + προσδιορισμού) αναφέρεται (κάθετες γραμμές κάτω από τον χάρτη). Οι EGFRmut + ανιχνευτές μετάλλαξης ευαίσθητα υποδεικνύονται με κόκκινο χρώμα. Οι θέσεις των ογκογόνων

Οι EGFR

μεταλλάξεις που αναφέρεται πάνω στο χάρτη. Β) Τα αποτελέσματα RT-PCR που αντιπροσωπεύουν (από την κορυφή) (i) το δείγμα αναφοράς (ένα δείγμα χωρίς μεταλλάξεις ή ενίσχυση), (ii) ένα δείγμα με την πιο κοινή διαγραφή εντός πλαισίου στο εξόνιο 19 (c.2235_2249del15) , (iii) ένα δείγμα με τόσο L858R στο εξόνιο 21 και Τ790Μ στο εξόνιο 20, και (iv) ένα δείγμα με διαγραφή εντός πλαισίου στο εξόνιο 19 (c.2235_2249del15) και

EGFR

ενίσχυσης. Σε κάθε γράφημα, τα επικαλυπτόμενα αποτελέσματα των 8 RT-PCR αντιδράσεις που καλύπτουν 29

EGFR

μεταλλάξεις απεικονίζονται. Οι κόκκινες γραμμές δείχνουν τα θετικά ενίσχυση-καμπύλες των συγκεκριμένων

EGFR

μεταλλάξεις (επισήμανε στο γράφημα), και η πράσινη γραμμή βάσης αντιπροσωπεύει το μη ενισχυμένο σήμα λόγω της έλλειψης του αξιολογούμενου μετάλλαξη στο αναλυόμενο δείγμα. Γ) MLPA ηλεκτροφερογράμματα των δειγμάτων που αναλύθηκαν με RT-PCR (πίνακας Β). Τα αναγνωριστικά ανιχνευτή που αναφέρονται κάτω από τα ηλεκτροφορήματα. Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν τις ανιχνευτές ελέγχου? οι ροζ βέλη δείχνουν μειωμένη σήμα της MS-ανιχνευτών και αυξημένο σήμα των ανιχνευτών MS +, αντίστοιχα? και τα μαύρα βέλη δείχνουν ενισχυμένα σήματα του

EGFR

-ειδικών ανιχνευτών. οικόπεδα D) Bar που αντιστοιχούν στα ηλεκτροφερογράμματα φαίνονται στον πίνακα C και αντιπροσωπεύει την κανονικοποιημένη τιμή αριθμού αντιγράφων (άξονας γ) από κάθε ανιχνευτή (χ-άξονας). Τα ροζ βέλη δείχνουν μειωμένη τιμή αριθμό αντιγράφων των ανιχνευτών MS-και αυξημένη τιμή του αριθμού αντιγράφων των ΚΜ + ανιχνευτές, αντίστοιχα.

Η

Χαρακτηριστικά του ανιχνεύονται μεταλλάξεις

Στο σύνολο, ανιχνεύσαμε 30 μεταλλάξεις σε 29 από 239 δείγματα (12,1%). Τόσο L858R και Τ790Μ βρέθηκαν σε ένα δείγμα. Μεταξύ των ταυτοποιημένες μεταλλάξεις ήταν 16 εντός πλαισίου απαλείψεις στο εξόνιο 19 (53%), 9 υποκαταστάσεις L858R (30%), 2 υποκαταστάσεις L861Q (7%), μία υποκατάσταση G719X, ένας εντός πλαισίου παρεμβολή στο εξόνιο 20 και μία υποκατάσταση Τ790Μ (S1 Πίνακας? συνοψίζονται στον πίνακα 1). Οι μεταλλάξεις ήταν πολύ πιο συχνή στις γυναίκες 22/68 από ό, τι σε άνδρες 7/142 (24,4% έναντι 4,7%, αντίστοιχα? Ρ & lt? 0,0001). Ένα διαστρωμάτωση της συχνότητας μετάλλαξης από την ηλικία [& lt? 55 (13%), & gt? 55 (11,9%)] και τον τύπο του δείγματος [FFPE (11,9%), κυτταρολογικά δείγματα (12,5%)] δεν έδειξαν σημαντικές επιδράσεις αυτών των παραγόντων στην συχνότητα μετάλλαξης (Πίνακας 1). Επίσης, δεν παρατηρούμε μια μείωση στη συχνότητα μετάλλαξης σε δείγματα με ένα χαμηλότερο ποσοστό των κυττάρων όγκου (PTC). Σημειώστε, ωστόσο, ότι μόνο ένα μικρό κλάσμα (περίπου 5%) των δειγμάτων που αναλύθηκαν είχαν PTC≤30%.

Η

Σύγκριση των μεθόδων ανίχνευσης μετάλλαξης RT-PCR και MLPA

Υπάρχει δεν χρυσό πρότυπο μέθοδο για την ανίχνευση μεταλλάξεων σε δείγματα καρκίνου, όπου μια συγκεκριμένη μετάλλαξη μπορεί να ευθύνεται για ένα πολύ χαμηλό κλάσμα του ανέλυσε DNA. Ως εκ τούτου, για την αξιολόγηση της ποιότητας της ανάλυσης EGFRmut + MLPA-based, μπορούμε να σε σύγκριση με την ρουτίνα που χρησιμοποιείται και καλά επικυρωμένης μεθόδου RT-PCR. Μια άμεση σύγκριση των αποτελεσμάτων της RT-PCR και MLPA έδειξε μια πολύ υψηλή συμφωνία μεταξύ αυτών των δύο μεθόδων (98,7% σύμφωνα αποτελέσματα), καθώς και 100% ειδικότητα (χωρίς ψευδή θετικά) και 90% ευαισθησία (27 από 30 μεταλλάξεις που ανιχνεύονται) της δοκιμής EGFRmut +. Μεταξύ των 3 μεταλλάξεις που δεν ανιχνεύθηκαν με την δοκιμασία EGFRmut + ήταν δύο περιπτώσεις με την υποκατάσταση L861Q, η οποία δεν καλύπτεται από EGFRmut + ανιχνευτές (Εικ. 1Α), και μία μετάλλαξη G719X σε ένα δείγμα με ένα χαμηλό PTC (15%). Επιπλέον, μεταξύ των δειγμάτων που αναλύθηκαν από MLPA ήταν 4 διπλά τυφλά πειράματα με 3 διαφορετικές μεταλλάξεις. Σε όλες τις περιπτώσεις, τα αποτελέσματα των διπλών δειγμάτων συμφωνούσαν. Επιπλέον, πρέπει να σημειωθεί ότι η MS + ανιχνευτές (εμφάνιση σήματος) την ανίχνευση μεταλλάξεων πιο εύκολα και με μεγαλύτερη εμπιστοσύνη από ό, MS-ανιχνευτές (μείωση σήματος). Οι ανιχνευτές MS + επέτρεψε την αυτοπεποίθηση ανίχνευση μεταλλάξεων, ακόμη και όταν οι εν λόγω μεταλλάξεις αντιπροσωπεύουν ένα πολύ μικρό κλάσμα του DNA που αναλύθηκαν (~ 10%) σε δείγματα με PTC≤30%. Για παράδειγμα, η μετάλλαξη L858R, η οποία καλύπτεται από δύο ανιχνευτές MS + και MS-, σε τρία δείγματα, δεν θα μπορούσε να ανιχνευθεί από μία μείωση στο σήμα του ανιχνευτή MS-αλλά ανιχνεύονται εύκολα με την εμφάνιση ενός χαμηλού αλλά σαφές μήνυμα του ανιχνευτή MS +. Η χαμηλότερη ευαισθησία των ανιχνευτών MS-προκύπτει κυρίως από την σχετικά υψηλή διακύμανση του σήματος από τους ανιχνευτές DS σε δείγματα καρκίνου. Η μεγαλύτερη MLPA μεταβολή του σήματος σε δείγματα καρκίνου έχει παρατηρηθεί στο παρελθόν και τα αποτελέσματα ως επί το πλείστον από τη γενετική ετερογένεια των δειγμάτων καρκίνου [20] και την χαμηλότερη ποιότητα και τη συχνή υποβάθμιση των δειγμάτων DNA που απομονώθηκε από τους ιστούς FFPE [21-25].

ενίσχυση του EGFR, ΜΕΤ και ErbB2 και τη σχέση της με τη συχνότητα μετάλλαξης

το πρόσθετο πλεονέκτημα του προσδιορισμού MLPA είναι ότι εκτός από την ανίχνευση μεταλλάξεων, παρέχει επίσης πληροφορίες σχετικά με ένα σχετικό αριθμό αντίγραφο όλων αναλύθηκαν αλληλουχιών /ανιχνευτές . Επιτρέπει μια πρόχειρη εκτίμηση του κλάσματος των ανιχνεύθηκαν μεταλλάξεις σε δείγματα που αναλύθηκαν και επιτρέπει την ανίχνευση του αριθμού αντιγράφων αλλαγές (ενισχύσεις) στις ανάλυσης των γονιδίων:

EGFR

,

MET

και

ΕΚΒΒ2

. Καθορισμός σχετικού αριθμού αντιγράφων 3-4 ως «κέρδος» και ≥4 ως «ενίσχυση», εντοπίσαμε 12 (5%), 17 (7%) και, 2 (1%) δείγματα με κέρδη και 7 (3%) , 11 (5%) και 3 (1%) δείγματα με ενισχύσεις του

EGFR

,

ΚΟΑ

, και

ΕΚΒΒ2

, αντίστοιχα (S1 πίνακα και Σχ. 2 ). Η κατανομή του πλάτους αριθμού αντιγράφων ήταν παρόμοια και για τα 3 γονίδια, με τις μεγαλύτερες ενισχύσεις άνω των 10 αντιτύπων. Όπως και στην περίπτωση των μεταλλάξεων, παρατηρήσαμε μια πολύ υψηλότερη συχνότητα

EGFR

κέρδη /επιμηκύνσεις στις γυναίκες παρά στους άνδρες (18% έναντι 2%, αντίστοιχα? Ρ & lt? 0,0001). Μια παρόμοια τάση δεν παρατηρήθηκε για το

ΜΕΤ

(13% έναντι 11%, αντίστοιχα), και ένα αντιστραφεί αλλά όχι σημαντική τάση παρατηρήθηκε για

ERBB2

(1% έναντι 3%).

Α) Παραδείγματα

EGFR

(δείγματα V-VI),

MET

(δείγματα vii-viii) και

ΕΚΒΒ2

(δείγματα ix-x) ενίσχυση ανιχνεύονται από τη δοκιμασία EGFRmut +. Β) Χαρακτηριστικά δείγματα με

EGFR

,

ΚΟΑ

και

ΕΚΒΒ2

κέρδη /ενισχύσεις. Τα δείγματα που φαίνεται στο Σχ. 1D (ΙΙ-ΙΙΙ) και το Σχ. 2Α (vi-x) υποδεικνύονται στην πρώτη στήλη. Το φύλο και η

EGFR

κατάσταση μετάλλαξης του κάθε δείγματος που αναφέρεται στη δεύτερη και την τρίτη στήλη, αντίστοιχα. Στήλες 4-6 δείχνουν τον αριθμό αξίες αντίγραφο του

EGFR

,

ΚΟΑ

και

ΕΚΒΒ2

, αντίστοιχα. Τα σκούρα μπλε κύτταρα δείχνουν ενισχύσεις (αριθμός αντιγράφων ≥4), και τα γαλάζια κύτταρα δείχνουν κέρδη (αριθμός αντιγράφων 3-4). C) Συχνότητα

EGFR

μεταλλάξεις σε δείγματα με

EGFR

ενίσχυση,

EGFR

κέρδος και φυσιολογικό

EGFR

αριθμό αντιγράφων.

Η

Όπως φαίνεται στο Σχ. 2, τα κέρδη και οι ενισχύσεις του

EGFR

,

ΚΟΑ

και

ΕΚΒΒ2

ήταν αλληλοαναιρούνται. Ωστόσο, παρατηρήσαμε πολύ ισχυρή συσχέτιση μεταξύ της εμφάνισης

EGFR

μεταλλάξεις και

EGFR

ενίσχυσης (Chi-square τεστ για την τάση? P & lt? 0,0001). Όλα εκτός από ένα δείγμα του καρκίνου (90%) με

EGFR

ενίσχυση και 7 από τα 12 δείγματα (58%) με

EGFR

κέρδος είχε μια

EGFR

μετάλλαξη.

Μια προσεκτική εξέταση των αποτελεσμάτων MLPA με

EGFR

ενισχύσεις (βλέπε παραδείγματα στο Σχ. 1 και Σχ. 2) δείχνει ότι η μείωση του σήματος από τους ανιχνευτές MS-και η αύξηση του σήματος των ΚΜ + ανιχνευτές (κλάσμα του μεταλλαγμένου αντίγραφα) είναι περίπου η ίδια ή ακόμη και μεγαλύτερη από την αύξηση του

EGFR

αριθμό αντιγράφων. Το αποτέλεσμα αυτό υποδεικνύει ότι όλα τα ενισχυμένα αντίγραφα του

EGFR

στα μεταλλαγμένα δείγματα περιέχουν τη μετάλλαξη (δηλ, ότι μόνο το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο υφίσταται ενίσχυση) και ότι οι μεταλλάξεις συμβαίνουν ως μια πρώιμη γενεσιουργό γεγονός, καθιστώντας

EGFR

ενίσχυση ευεργετική για τον καρκίνο. Σημειώστε ότι όλα τα δείγματα περιέχουν κάποια ποσότητα του φυσιολογικού DNA, που μπορεί να ισιώσει ο παρατηρούμενος αριθμός αλλαγές αντίγραφο και να καλύψουν το αποτέλεσμα σε δείγματα με χαμηλότερο επίπεδο ενίσχυσης.

Αυτή η παρατήρηση μας ώθησε στην αλληλουχία εξώνια 18-21 (που κωδικοποιεί την περιοχή κινάσης τυροσίνης) σε δείγματα με

EGFR

κέρδη /επιμηκύνσεις, στις οποίες κανένα γνωστό

EGFR

μετάλλαξη βρέθηκε. Η ανάλυση αλληλουχίας δεν αποκάλυψε νέες παραλλαγές ακολουθίας που θα μπορούσε να είναι ογκογόνο μεταλλάξεις ή σκανδάλη

EGFR

ενίσχυσης.

Η αναπαραγωγή της ανάλυσης αριθμού αντιγράφων EGFR (ανίχνευση ενίσχυση) με τη χρήση των qPCR και ddPCR

Για την επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων του

EGFR

αντιγράψετε ανάλυση αριθμός που αναλύονται πάλι ένα πάνελ δειγμάτων καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων όλων των δειγμάτων με

EGFR

ενίσχυση, με τη χρήση των qPCR και ddPCR. Και οι δύο μέθοδοι βασίζονται σε εντελώς διαφορετικές αρχές από ό, τι MLPA. Το qPCR είναι μια μέθοδος που χρησιμοποιεί πραγματικό χρόνο ποσοτικοποίηση του προϊόντος PCR, που χρησιμοποιείται πιο συχνά για την επαλήθευση των παραλλαγών αριθμού αντιγράφων, τα οποία προσδιορίζονται τόσο σε φυσιολογικά (μη καρκινικά) και τα δείγματα καρκίνου (π.χ., [26,27]). Το ddPCR είναι μια νέα μέθοδος ποσοτικοποίησης, με βάση την απόλυτη μέτρηση δοκιμαστεί και αναφοράς DNA μόρια, κλωνικά ενισχυμένο σε χιλιάδες νερό-σε-λάδι-σταγονιδίων αντιδράσεις (γαλάκτωμα PCR). Η χρησιμότητα της ddPCR με τη χρωστική EvaGreen dsDNA-δεσμευτική για την ακριβή εκτίμηση του αριθμού αντιγράφων αποδείχθηκε πρόσφατα σε διάφορες μελέτες [18,19,28]. Με τη χρήση και των δύο qPCR και ddPCR, τα σήματα των δύο δοκιμών-αμπλικόνια, που βρίσκεται στο εξόνιο 2 και εξόνιο 18 του

EGFR

, αναλύθηκαν κατά το σήμα του ελέγχου-αμπλικονίου (που αντιστοιχεί σε MLPA ανιχνευτή ctrl_1). Η ανάλυση που πραγματοποιήθηκε έδειξε ότι τα αποτελέσματα των δύο qPCR και ddPCR συσχετίζονται πολύ καλά με τις σχετικές τιμές αριθμού αντιγράφων, προσδιορίζονται με τη χρήση του MLPA (συντελεστής συσχέτισης R = 0.941 και Ρ = 0.927, αντίστοιχα), και ότι τα σήματα των δειγμάτων με

EGFR

ενίσχυσης ήταν καλά διαχωρισμένα από τα σήματα των δειγμάτων χωρίς ενίσχυση (S1 Εικ.). Πρέπει να σημειωθεί, ωστόσο, ότι δεν μπορεί να αποκλειστεί ότι μερικά δείγματα με τιμές αριθμό οριακά αντίγραφο μπορεί να ταξινομηθεί εσφαλμένα. Μερικές διαφορές στα απόλυτες τιμές σήματος που καθορίζεται από MLPA, και οι μέθοδοι αναφοράς μπορούν να προκύψουν από διαφορετικά σύνολα περιοχών ελέγχου που χρησιμοποιείται για την εξομάλυνση και από το γεγονός ότι MLPA είναι μια multiplex μέθοδος και μετρά τον αριθμό αντιγράφων σε πολλαπλά σημεία σε ένα γονίδιο του ενδιαφέρον. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν για

ΚΟΑ

και

ΕΚΒΒ2

(τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Συζήτηση

Είναι γνωστό ότι η συχνότητα των

EGFR

μεταλλάξεις διαφέρει σημαντικά μεταξύ των ανθρώπινων πληθυσμών. Η συχνότητα μετάλλαξης είναι υψηλότερο σε Ασιάτες (45-52%)? χαμηλότερα σε Ευρωπαίους (24%), οι Αφροαμερικανοί (20%) και οι Ισπανοί (17%)? και το χαμηλότερο στη Λευκή Αυστραλοί (7%) ([11,29] και αναφορές εντός). Επίσης μεταξύ των Ευρωπαίων, διαφορετικές συχνότητες

EGFR

μεταλλάξεις έχουν αναφερθεί: π.χ. 17% στην Ισπανία [30] και το 10% στη νότια Γερμανία [31]. Σε αυτή τη μελέτη, η οποία βασίζεται σε μια ολοκληρωμένη ανάλυση ενός σημαντικού αριθμού δειγμάτων αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα, που χαρακτηρίζεται και προσδιορίζεται η συχνότητα των

EGFR

μεταλλάξεις στην πολωνική ασθενείς (12,1%). Η ανάλυσή μας έδειξε μια πολύ υψηλότερη (4.8x) συχνότητα

EGFR

μεταλλάξεις στις γυναίκες παρά στους άνδρες (24% έναντι 5%, αντίστοιχα). Παρατηρήσαμε μια παρόμοια τάση για

EGFR

κέρδη /ενισχύσεις, η οποία έδειξε ακόμη μεγαλύτερη υπερεκπροσώπηση (9x) στις γυναίκες παρά στους άνδρες (18% έναντι 2% αντίστοιχα). Αν και η υψηλότερη συχνότητα των

EGFR

μεταλλάξεις στις γυναίκες παρά στους άνδρες έχει παρατηρηθεί πολλές φορές στο παρελθόν, η υπερεκπροσώπηση των

EGFR

μεταλλάξεις σε γυναίκες που παρατηρήθηκε στη μελέτη μας, σύμφωνα με τις γνώσεις μας, ένα από τα υψηλότερα που έχουν αναφερθεί μέχρι στιγμής (εκτός από τις μελέτες με ένα πολύ μικρό αριθμό δειγμάτων /μεταλλάξεις) ([11,29] και οι αναφορές εντός). Οι πληροφορίες σχετικά με τον πληθυσμό-ειδικό χαρακτηριστικό και η συχνότητα των μεταλλάξεων είναι σημαντικοί παράγοντες επιδημιολογική που μπορούν να επηρεάσουν την εφαρμογή των κατάλληλων διαγνωστικών και θεραπευτικών διαδικασιών βέλτιστες για το συγκεκριμένο πληθυσμό.

Molecular διαγνώσεις καρκίνου του αντιμετώπιση διαφοροποιημένο ετερογενές υλικό όγκου σε καθημερινή βάση. Το DNA απομονώνεται από χειρουργικά όγκοι (νωπά ή FFPE) και από λεπτή βελόνα και διαβρογχοσκοπική υπερηχογράφημα διαβρογχική κύτταρα βελόνα αναρρόφηση. Κάθε ένα από αυτά ιστολογικών ή κυτταρολογικά δείγματα μπορούν να έχουν διαφορετικές και μερικές φορές πολύ χαμηλή PTC, και συχνά παρουσιάζουν ένα σημαντικό επίπεδο αποικοδόμησης DNA (ειδικά τα δείγματα FFPE). Επιπλέον, φορμόλη στερέωση μπορεί να βλάψουν το DNA και να οδηγήσει σε τροποποιήσεις ακολουθία. Όλοι αυτοί οι παράγοντες προκαλούν διάφορα είδη των αντικειμένων που μπορεί να οδηγήσει σε δύο ψευδώς θετικά και ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα.

Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε μια δοκιμασία EGFRmut + MLPA (μέθοδος πρότυπο ευαισθησίας) ως δεύτερης μέθοδο βαθμίδας και σύγκριση αποτελεσμάτων μας με αυτά ενός καλά επικυρωμένη εμπορική δοκιμασία RT-PCR (μέθοδος υψηλής ευαισθησίας). Αυτές οι δύο μέθοδοι βασίζονται σε εντελώς διαφορετικές αρχές. Σε RT-PCR, ανίχνευση μετάλλαξης βασίζεται στην υβριδοποίηση TaqMan μετάλλαξη ειδικούς ανιχνευτές, αλλά σε MLPA, ανίχνευση μετάλλαξης βασίζεται στη σύνδεση και επακόλουθη ενίσχυση του άγριου τύπου ή μετάλλαξη-ειδικούς ανιχνευτές. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι EGFRmut + είναι μια ισχυρή δοκιμασία που εμφανίζει υψηλή επαναληψιμότητα, την ειδικότητα και ευαισθησία. Ένας μικρός αριθμός απαρατήρητα μεταλλάξεις είτε δεν καλύπτονται από τους ανιχνευτές MLPA (n = 2), ή συνέβη σε ένα δείγμα με ένα χαμηλό PTC (n = 1). Η δοκιμασία EGFRmut + μας επέτρεψε την ανίχνευση μεταλλάξεων σε όλους τους τύπους των δειγμάτων (κυτταρολογική και ιστολογική? Φρέσκου κατεψυγμένου και FFPA) και μας επέτρεψε την ανίχνευση μεταλλάξεων σε δείγματα με διαφορετικές PTCs (20-90%). Ωστόσο, πρέπει να σημειωθεί ότι η MS + ανιχνευτές επιτρέπουν πιο ισχυρή ανίχνευση μετάλλαξης από ό, τι MS-ανιχνευτές και ότι η ποιότητα των αποτελεσμάτων MLPA είναι γενικά χαμηλότερη για τα δείγματα καρκίνου από ό, τι για τα δείγματα βλαστικής σειράς DNA. Η κατώτερη ποιότητα του καρκίνου αποτελεσμάτων MLPA οφείλεται στα προαναφερθέντα χαρακτηριστικά των δειγμάτων του καρκίνου και έχει αναφερθεί και συζητήθηκε προηγουμένως [23-25,32]. Πρόσθετοι παράγοντες που καθιστούν την ανάλυση MLPA ελκυστική ως δεύτερης βαθμίδας

EGFR

μέθοδος ανίχνευσης μετάλλαξης είναι η χαμηλή ποσότητα DNA (50-100 ng) που απαιτούνται για την ανάλυση (δεν απαιτείται επιπλέον την εξαγωγή του δείγματος ή το παρασκεύασμα, και η ίδιο δείγμα DNA μπορεί να χρησιμοποιηθεί τόσο για RT-PCR και ανάλυση MLPA), ένα σύντομο στροφή γύρω από το χρόνο (& lt? 2 ημέρες), και το χαμηλό κόστος (περίπου $ 5 συν το αρχικό κόστος της σύνθεσης ανιχνευτή, περίπου $ 3.000). Στην περίπτωση που χρησιμοποιείται σαν ρουτίνα δοκιμασίες, το κόστος της σύνθεσης ανιχνευτή μπορεί να αγνοηθεί διότι η ποσότητα των συντιθέμενων ανιχνευτών είναι επαρκής για εκατοντάδες χιλιάδες αναλύσεων.

Εκτός από

EGFR

ανίχνευση μετάλλαξης , η δοκιμασία EGFRmut + επιτρέπει επίσης την ανίχνευση

EGFR

,

ΚΟΑ

και

ΕΚΒΒ2

ενίσχυσης.