Αφηρημένο

Η πρόγνωση του καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC) σταδίου ΙΙ και ΙΙΙ ασθενείς παραμένει μια πρόκληση λόγω οι δυσκολίες εξεύρεσης ισχυρή βιοδεικτών κατάλληλο για τη δοκιμή κλινικά δείγματα. Η πλειοψηφία των δημοσιευμένων υπογραφές γονιδίου της CRC έχουν δημιουργηθεί για κατεψυγμένα παχέος ιστούς. Επειδή συλλογή των κατεψυγμένων ιστών δεν είναι πρακτική για τη συνήθη χειρουργική πρακτική παθολογία, μια κλινική δοκιμή που βελτιώνει την προγνωστική δυνατότητες πέρα ​​από την τυπική παθολογικές σταδιοποίηση του καρκίνου του παχέος εντέρου θα πρέπει να είναι σχεδιασμένα για φορμόλη-σταθερής εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) ιστούς. Η NanoString nCounter

® πλατφόρμα είναι ένα εργαλείο ανάλυσης γονιδιακής έκφρασης που αναπτύχθηκε για χρήση με FFPE που προέρχονται από τα δείγματα. Σχεδιάσαμε μια προσαρμοσμένη nCounter

® codeset βασίζεται σε στοιχεία από πολλαπλές δημοσιευθεί φρέσκα προγνωστική υπογραφές γονίδιο κατεψυγμένο ιστό μικροσυστοιχιών που βασίζεται για τον καρκίνο του παχέος εντέρου, και χρησιμοποιήσαμε αυτή την πλατφόρμα για να συγκρίνετε συστηματικά δεδομένα γονιδιακής έκφρασης από FFPE με προσαρμοσμένα δεδομένα σειρά μικροσυστοιχιών από κατεψυγμένα ιστούς . Τα αποτελέσματά μας δείχνουν μέτρια συσχέτιση της έκφρασης των γονιδίων μεταξύ δύο πλατφόρμες και η ανακάλυψη του ένα μικρό υποσύνολο των γονιδίων ως υποψήφιος βιοδείκτες για την πρόγνωση του καρκίνου του παχέος εντέρου που είναι ανιχνεύσιμη και ποσοτικά σε τομές ιστού FFPE

Παράθεση:. Chen X, Deane NG, Lewis KB, Li J, Zhu J, Ουάσιγκτον ΜΚ, et al. (2016) Σύγκριση των Nanostring nCounter

® Δεδομένα σχετικά με δείγματα του καρκίνου του παχέος εντέρου FFPE και Affymetrix μικροσυστοιχιών Στοιχεία για Συμφωνήθηκε Κατεψυγμένα ιστούς. PLoS ONE 11 (5): e0153784. doi: 10.1371 /journal.pone.0153784

Επιμέλεια: Xiaofeng Wang, Cleveland Clinic Lerner Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 12 Φλεβάρη, 2016? Αποδεκτές: 4 Απριλίου, 2016? Δημοσιεύθηκε: May 13, 2016

Copyright: © 2016 Chen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Τα στοιχεία είναι διαθέσιμο σε Gene Expression omnibus (GEO) βάση δεδομένων (GSE62932)

Χρηματοδότηση:. η έρευνα αυτή χρηματοδοτήθηκε από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας CA158472 επιχορήγησης και CA095103 να XC, NGD, KBL, JZ, MKW και RDB. JL έλαβαν στήριξη με τη μορφή ενός μισθού από Affymetrix. Ο ειδικός ρόλος του συγγραφέα αρθρώνεται στο τμήμα Συγγραφέας Συνεισφορές. Αυτές οι χρηματοδότες δεν έπαιξε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η ταυτοποίηση καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC) ασθενείς οι οποίοι είτε περισσότερο ή λιγότερο πιθανό να επωφεληθούν από την επικουρική συστηματική χημειοθεραπεία μετά τη χειρουργική εκτομή αποτελεί μια σημαντική ανικανοποίητη ανάγκη για την παροχή ασφαλών και αποτελεσματική φροντίδα. Η τρέχουσα πρακτική μπορεί να οδηγήσει σε υπο-θεραπεία ορισμένων ασθενών υψηλού κινδύνου σταδίου II, και το δυναμικό πάνω-θεραπεία των ασθενών χαμηλού κινδύνου σταδίου II και το στάδιο ΙΙΙ [1]. Ο πυρήνας εμπόδιο είναι η έλλειψη οριστικών διαγνωστικών βιοδεικτών για τον εντοπισμό καρκίνων με υψηλή πιθανότητα μετάστασης και αντίστοιχα κακή κλινική έκβαση που είναι πιο πιθανό να επωφεληθούν από συστηματική χημειοθεραπεία? και αντιστρόφως, να εντοπίσει εκείνους τους ασθενείς με πολύ χαμηλό κίνδυνο (& lt? 10%), οι οποίοι είναι πιθανό να αποκομίσουν σημαντικό όφελος από τη χημειοθεραπεία [2-6]. Μετάφραση του προφίλ βάσει μικροδιάταξης σε κλινική διαγνωστική ως βιοδείκτες περιπλέκεται από το γεγονός ότι η απαιτούμενη για την αναπαραγωγή τους τεχνολογία έχει προηγουμένως απαιτούμενη δείγματα φρέσκο ​​αόριστης ιστού, και υπάρχει ένα κενό μεταξύ ενός αναδυόμενου σώματος των γονιδιωματικών πληροφοριών και διαγνωστική εφαρμογή. Η ικανότητα των υπογραφών γονιδιακής έκφρασης για την πρόβλεψη υποτροπής και του κλινικού αποτελέσματος υποστηρίζει σθεναρά ότι υψηλού και χαμηλού κινδύνου φαινότυποι έχουν μοριακά κωδικοποιημένα σε πρωτογενείς όγκους [7-9]. Παρ ‘όλα αυτά, σε ένα ισχυρό προγνωστικό υπογραφή που εφαρμόζεται στο κλινικό περιβάλλον δεν έχει ακόμη αναπτυχθεί για ορθοκολικό καρκίνο οφείλονται στη διακύμανση σε μεθόδους και διαδικασίες για τη διατήρηση των χειρουργικά δείγματα, μεταβολή στην ποσότητα και την ποιότητα του καθαρισμένου RNA διαθέσιμα για ανάλυση, τα θέματα ετερογένεια των όγκων και η αναπαραγωγιμότητα και ευρωστία της πλατφόρμας δοκιμασίας. Λόγω συλλογή του φρέσκου κατεψυγμένου ιστοί δεν είναι ρουτίνα, μια κλινική δοκιμή για τη βελτίωση της στάσης του καρκίνου του παχέος εντέρου θα πρέπει να είναι σχεδιασμένα για σταθεροποιημένο με φορμαλίνη εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) ιστών, ώστε να είναι ευρέως εφαρμόσιμη.

Η NanoString nCounter

® σύστημα έχει εφαρμοστεί για την ποσοτικοποίηση του γονιδίου έκφραση διαφόρων γονιδίων υπογραφών για πολλαπλούς τύπους ιστών συμπεριλαμβανομένων των δειγμάτων FFPE [10-13]. Έχουμε σχεδιάσει ένα προσαρμοσμένο nCounter codeset για την ποσοτική εκτίμηση της έκφρασης των 414 στοιχείων γονιδίου. Αυτή η δοκιμασία αποτελείται από πολλαπλές δημοσιευθεί υπογραφές γονίδιο για την πρόγνωση του καρκίνου του παχέος εντέρου καθώς και διάφορες στοιχεία υποψήφιο γονίδιο που προέρχεται από συνεχιζόμενες μελέτες σε εντερική βιολογία των βλαστικών κυττάρων και των επιθηλιακών-to-μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT). Για να προσδιορίσετε ποια στοιχεία των προγνωστικών υπογραφών μπορεί να μεταφραστεί από φρέσκο ​​κατεψυγμένο ιστό με αρχειακό FFPE που προέρχονται RNA δείγματα ασθενών, εμείς συστηματικά σε σύγκριση με τα αποτελέσματα της έκφρασης για τα 414 γονίδια από την πλατφόρμα nCounter χρησιμοποιώντας FFPE που προέρχονται από ιστούς και από μια πλατφόρμα σειρά μικροσυστοιχιών χρησιμοποιώντας συμφωνημένα κατεψυγμένα ιστούς.

Υλικά και Μέθοδοι

σχεδιασμός πειράματος και το δείγμα περιγραφή

Ανθρώπινοι ιστοί που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση μικροσυστοιχιών συλλέχθηκαν και σχολιασμένο σύμφωνα με καθιερωμένα πρωτόκολλα και έχουν εγκριθεί από τις αρμόδιες Συμβούλια Institutional Review (IRB) στο Πανεπιστήμιο Vanderbilt (VUMC). Όλοι οι ιστοί συλλέχθηκαν κατά τη χρονική περίοδο 1999 με 2011. το στάδιο του όγκου εκτιμήθηκε από την αμερικανική κοινή Επιτροπής για τις κατευθυντήριες γραμμές του καρκίνου. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς πριν να συμπεριληφθούν στις μελέτες. slides Ποιοτική αξιολόγηση ελήφθησαν για την επαλήθευση της διάγνωσης και της ποσότητας του κυτταρικού υλικού για κάθε δείγμα. Αποχαρακτηριστούν ανθρώπινους ιστούς όγκου για ανοσοϊστοχημεία ελήφθησαν με την έγκριση VUMC IRB. Για τις μελέτες μικροσυστοιχίας, αντιπροσωπευτικά τμήματα του νωπά δείγματα ιστού καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο εντός 20 λεπτών από την εκτομή και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C μέχρι το στάδιο της απομόνωσης του RNA. Η διάμεση (ελάχιστη-μέγιστη) χρόνος αποθήκευσης κατεψυγμένων ιστών από την ημερομηνία της εκτομής με εκχύλιση RNA είναι 455 (35 έως 2858) ημερών. RNA καθαρίστηκε από τομές ιστών που περιέχουν & gt? 80% ιστού επιθηλιακά όγκου χρησιμοποιώντας RNeasy (Qiagen, Valencia, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα δείγματα υβριδίστηκαν με συστοιχίες Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 GeneChip Arrays Έκφραση, Santa Clara, CA), η οποία περιελάμβανε περίπου 39.000 ανθρώπινα γονίδια. Τα δείγματα που περιλαμβάνονται τέσσερις ιστούς υγιή έλεγχο του ασθενούς, 12 σταδίου Ι, 17 σταδίου ΙΙ, 20 σταδίου ΙΙΙ και 15 σταδίου IV CRC ιστούς του ασθενούς. Οι λεπτομερείς πληροφορίες δείγμα συμπεριλαμβανομένων suvival δεδομένα μπορούν να βρεθούν στο S1 πίνακα.

Για τις μελέτες nCounter, αρχειοθετημένα δείγματα FFPE όγκου ταιριάζει με κατεψυγμένων ιστών που περιγράφονται ανωτέρω εντοπίστηκαν και επεξεργασία από την Vanderbilt Μεταγραφική Παθολογίας και Imaging Core εγκατάσταση. Οι ιστοί μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη, ενσωματωμένο σε παραφίνη και αποθηκεύτηκε σε θερμοκρασία δωματίου μέχρι την εκχύλιση του RNA. Η διάμεση (ελάχιστη-μέγιστη) FFPE ιστού χρόνος αποθήκευσης από την ημερομηνία της εκτομής με εκχύλιση RNA είναι 1021 (364 – 3.483) ημέρες. Η πρώτη 20μm του ιστού απορρίφθηκε πριν από την κοπή τμήματα για την εκχύλιση RNA. Τομές ιστού στερεώθηκαν σε μη φορτισμένες γυάλινες πλάκες και μία από τις διαφάνειες τμήματος ιστού χρωματίστηκαν με Η &? Ε για τον έλεγχο της ποιότητας από κάθε μπλοκ ιστού. RNA καθαρίστηκε από 5μm τομές πάχους ιστού που περιέχουν περισσότερο από 80% του όγκου χρησιμοποιώντας υψηλής καθαρότητας Κιτ FFPE RNA Micro (Roche) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. απαιτήθηκαν τουλάχιστον 4 τομές ανά δείγμα. Η υβριδοποίηση mRNA, ανίχνευσης και σάρωσης ακολούθησε το πρωτόκολλο και εκτελούνται από NanoString Technologies.

nCounter ανάπτυξη codeset

Σχεδιάσαμε μια προσαρμοσμένη nCounter

® δοκιμασία (NanoString Technologies, Seattle, WA) για την ποσοτική εκτίμηση της έκφρασης του 414 στοιχεία γονιδίου. Αυτό πολυπλεκτικές δοκιμασία μπορεί να ανιχνεύσει την έκφραση έως 800 μεταγραφές σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις mRNA (0.1fM /1 αντίγραφο ανά κύτταρο) [14], ακόμη και σε δείγματα RNA που αποδομούνται σημαντικά, όσο περισσότερο από το 20% του δείγματος έχει θραύσματα RNA μεγαλύτερη από 300 ζεύγη βάσεων [13]. Στον Πίνακα 1 παρατίθενται όλες οι υπογραφές γονίδιο που εμπλέκεται στην nCounter codeset. Συμπεριλάβαμε γονίδιο στοιχεία από 34-γονίδιο υπογραφή μας [9], καθώς και στοιχεία από δημοσιευμένες υπογραφές [7, 8, 15-24], στη δοκιμασία nCounter, επιλέγοντας εκείνες που αντιπροσωπεύτηκαν σε ≥2 υπογραφές. Πενήντα επιπλέον υποψήφια γονίδια ενδιαφέροντος που σχετίζονται με ΕΜΤ και τη μελέτη της μεταστατικής συμπεριφοράς των καρκινικών κυττάρων (π.χ., E-cadherin, Smad4, Zeb1, σαλιγκάρι, Slug, Twist, βήτα-κατενίνης, κ.λπ.) προστέθηκαν επίσης στη δοκιμασία. Ο πλήρης κατάλογος με τα σύμβολα γονιδίων και τις πηγές των 414-γονίδια μπορούν να βρεθούν στο S2 και S3 πίνακες.

Η

Βιοπληροφορική και τη στατιστική ανάλυση των δεδομένων

δεδομένα μικροσυστοιχιών Affymetrix ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το στιβαρή MultiChip μέσου όρου (RMA) αλγόριθμο όπως εφαρμόζεται στο πακέτο Bioconductor

Affy

[25]. Τα αποτελέσματα παρτίδα προσαρμόστηκαν προσέγγιση κατά την καταπολέμηση διαθέσιμη στο πακέτο Bioconductor

SVA

[26]. NanoString nCounter έλεγχος ποιότητας των δεδομένων και την ομαλοποίηση διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το πακέτο R

NanoStringNorm

[27]. Για συγκρίσεις ομάδα, t-test στο

Limma

συσκευασία Bioconductor χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση διαφορικά εκφρασμένων σετ καθετήρα μεταξύ του όγκου και των φυσιολογικών ιστών στα δύο Affymetrix και nCounter πλατφόρμες [28]. Για την ανάλυση επιβίωσης, η Cox αναλογικών κινδύνων εφαρμόστηκε για να ελέγξετε τη σύνδεση με τη συνολική έκβαση επιβίωσης για κάθε υποψήφιο γονίδιο χρησιμοποιώντας το πακέτο R

επιβίωση

.

Σε αυτή τη μελέτη, προκειμένου να γίνει άμεση σύγκριση μεταξύ των Affymetrix HGU133plus 2 και τα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης nCounter, βρήκαμε για πρώτη φορά τα καλύτερα ταιριαστό Affymetrix μικροσυστοιχιών ανιχνευτές για να NanoString nCounter ανιχνευτές. Προς το σκοπό αυτό, θα χρησιμοποιείται το σύμβολο γονίδιο ή μεταγραφή ID για να συνδεθούν NanoString nCounter αναγνωριστικά και Affymetrix Probe αναγνωριστικά. Αν το γονίδιο είχε μόνο ένα μοναδικό ανιχνευτή, τότε θα χρησιμοποιηθεί Probe ότι ID ως αγώνα για NanoString. Διαφορετικά, εάν το γονίδιο είχε πολλαπλούς ανιχνευτές, τότε θα πάρει το ένα με τη μεγαλύτερη βαθμολογία ευθυγράμμιση Smith-Waterman, η οποία υπολογίστηκε από τον αλγόριθμο Smith-Waterman για τον εντοπισμό ομόλογες περιοχές μεταξύ αλληλουχιών με την έρευνα για τη βέλτιστη τοπική ευθυγραμμίσεις, μεταξύ NanoString nCounter και Affymetrix Probe ακολουθίες ως αγώνα για nCounter [29]. Και τα δύο δεδομένα μικροσυστοιχιών και nCounter είναι διαθέσιμα στη γονιδιακή έκφραση omnibus (GEO) βάση δεδομένων (GSE62932).

Αποτελέσματα

Ποιότητα εξάγεται RNA

Αριθμοί RNA Ακεραιότητα τιμές (RIN) ήταν λήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα όργανο Agilent Bioanalyzer τόσο για κατεψυγμένα και FFPE δείγματα που προέρχονται RNA. Το λογισμικό εργαλείο παράγει μια βαθμολογία RIN βασίζεται σε ολόκληρο ηλεκτροφόρημα της. τιμές RIN κυμαίνονται από 1-10, με το 1 να είναι εντελώς υποβαθμισμένη RNA και το 10 να είναι υψηλής ποιότητας (άθικτο) RNA. Για τις μελέτες των μικροσυστοιχιών, αποκοπής του RIN = 7,0 χρησιμοποιήθηκε. τιμές RIN κυμαίνονταν 7-10, με διάμεση τιμή των 8,5 και μέση τιμή 8.4. Για τις μελέτες nCounter, οι τιμές κυμαίνονταν RIN 0-8, με ένα μέσο όρο 2.4 και μέση τιμή 2,5. Επιπλέον, για να είναι αποδεκτή για ανάλυση για nCounter, ≥20% του δείγματος RNA έπρεπε να περιέχουν θραύσματα τουλάχιστον 300 ζεύγη βάσεων σε μήκος. Οι λεπτομέρειες των αποτελεσμάτων συμπεριλήφθηκαν στον πίνακα S4.

Η ποιότητα των δεδομένων του nCounter και μικροσυστοιχιών

Μετά την προ-επεξεργασία και τυποποίηση, log2 μετασχηματισμένα δεδομένα από 414 γονίδια των δύο μικροσυστοιχιών και nCounter συγκρίθηκαν. Οι κατανομές των εντάσεων σήματος για όλα τα δείγματα που εμφανίζονται με Boxplots στο S1 Εικ. Για να σχεδιάσετε τη διανομή γονιδιακής έκφρασης, κάθε ένα από τα 414 γονίδια που εκπροσωπήθηκε από τη μέση τιμή για 68 δείγματα. Σχήμα 1 συγκρίνει διανομές γονιδιακής έκφρασης με βάση nCounter και μικροσυστοιχίες. δεδομένων nCounter έδειξε ένα δυαδικό διανομής που είναι πιθανό να οφείλεται στην υποβάθμιση του RNA σε δείγματα FFPE. Με περισσότερες λεπτομέρειες, βρήκαμε ότι ~ 70% των γονιδίων είχαν μέσες τιμές ομαλοποιημένη έκφραση στην αυθαίρετη σειρά μονάδα 5-10 και στις δύο πλατφόρμες. Σε αντίθεση, το 15% περίπου των γονιδίων έδειξαν πολύ χαμηλές τιμές κανονικοποιημένες έκφραση (≤ 5 αυθαίρετες μονάδες) πάνω στην πλατφόρμα nCounter ενώ μόνο το 8% των γονιδίων πραγματοποιήθηκε ως ανεπαρκώς στην πλατφόρμα μικροσυστοιχίας. εύρωστη διάμεσες τιμές Αντίθετα, μόνο το 14% των γονιδίων έδειξαν έκφραση έκφραση (& gt? 10 αυθαίρετες μονάδες) πάνω στην πλατφόρμα nCounter ενώ πιο κοντά στο 23% των γονιδίων έδωσε ισχυρή σήματα στην πλατφόρμα μικροσυστοιχίας. Συνοπτικά, η ποσότητα των αξιοποιήσιμων δεδομένων επιτυγχάνεται χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα nCounter ήταν χαμηλή σε σχέση με εκείνη που επιτυγχάνεται στην πλατφόρμα μικροσυστοιχίας.

Η συχνότητα του γονιδίου ανιχνευτές (414 στοιχεία συνολικά) απεικονίζεται γραφικά ενάντια διάμεση κανονικοποιημένες τιμές έκφραση σε όλη την x -άξονα.

η

για να εξεταστεί η επαναληψιμότητα της πλατφόρμας nCounter, επιλέχθηκαν έξι δείγματα FFPE να δημιουργήσει δύο πιο τεχνικά επαναλήψεις για κάθε δείγμα. S2 σχήμα δείχνει τα scatterplots των log2 μετασχηματισμένη μετρήσεις μεταξύ όλων των ζευγών των επαναλήψεων. Ο μέσος συντελεστής συσχέτισης είναι 0,983, γεγονός που δείχνει ότι η πλατφόρμα nCounter είναι επαναλήψιμη.

Δείγμα και γονίδιο συσχετίσεις μεταξύ nCounter και μικροσυστοιχιών

Για κάθε ζεύγος δείγματος FFPE ποσοτικά με nCounter και φρέσκο ​​κατεψυγμένο δείγμα ποσοτικά με μικροσυστοιχίας, ο συσχετισμός Pearson υπολογίστηκε με βάση την κανονικοποιημένη, log2 μετασχηματισμένα τιμές γονιδιακής έκφρασης των 414 γονιδίων. Η μέση συσχέτιση ήταν 0.501 με 95% διάστημα εμπιστοσύνης εκκίνησης (0,412, 0,589), και η ελάχιστη και η μέγιστη συσχέτιση ήταν 0.337 και 0.591 αντίστοιχα. Ο θερμικός χάρτης στο Σχήμα 2 εμφανίζει όλα τα ζεύγη συσχετισμούς μεταξύ FFPE και κατεψυγμένα δείγματα. Η ανάλυση βασίζεται σε Spearman συσχέτιση έδειξε παρόμοια αποτελέσματα, τα οποία πρότεινε το πρότυπο συσχέτισης μεταξύ των δειγμάτων δεν επηρεάζεται από διάφορες διαδικασίες κανονικοποίησης αφού οι μέθοδοι κανονικοποίησης δεν αλλάζουν την κατάταξη του γονιδίου σε κάθε δείγμα.

Χ-άξονας αντιπροσωπεύει το κατεψυγμένα δείγματα και y-άξονας αντιπροσωπεύει αντίστοιχα δείγματα FFPE.

η

Για καθένα από τα 414 γονίδια, η συσχέτιση Pearson υπολογίστηκε επίσης ανάμεσα σε δύο τύπους ιστών. Εμείς καταγράφεται το ιστόγραμμα του γονιδίου-σοφός συντελεστές συσχέτισης στο Σχήμα 3. Η μέση συσχέτιση των 414 γονίδια ήταν 0.315 με 95% διάστημα εμπιστοσύνης εκκίνησης (0.248, 0.385), και η ελάχιστη και η μέγιστη συσχέτιση ήταν -0,250 και 0,784 αντίστοιχα. Gene-σοφός συσχέτιση αντιπροσωπεύει την αντιστοιχία των τιμών γονιδιακής έκφρασης από δύο πλατφόρμες έκφρασης ανάμεσα σε δύο ταιριάζουν τύπο ιστού. Λόγω του ενιαίου σχεδιασμού καθετήρα nCounter του, μερικά γονίδια δεν ταιριάζουν καλά μεταξύ δύο πλατφόρμες, οι οποίες μπορεί να έχουν συμβάλει στις αδύναμες ή αρνητικές συσχετίσεις. Είναι λογικό να παρατηρήσουμε αυτό το μέτριο επίπεδο της αντιστοιχίας, διότι οι μεταβολές στη γονιδιακή έκφραση ήταν από δύο διαφορετικές πλατφόρμες και τύπους ιστών. Το μέσο επίπεδο της αντιστοιχίας μεταξύ των γονιδίων οδήγησε επίσης στην ασαφή μοτίβο μεταξύ κατεψυγμένα και FFPE δείγματα εμφανίζονται στο σχήμα 2.

Χ-άξονας αντιπροσωπεύει Pearson συσχέτιση του καθενός από 414 γονίδια μεταξύ κατεψυγμένα δείγματα και δείγματα FFPE και y -άξονα αντιπροσωπεύει τη συχνότητα.

η

Σύγκριση της γονιδιακής έκφρασης μεταξύ nCounter και μικροσυστοιχιών

Μετά την προεπεξεργασία και την εξομάλυνση, για την ανίχνευση διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων μεταξύ 64 όγκων και 4 κανονικά δείγματα σε nCounter ή μικροσυστοιχιών πλατφόρμες ξεχωριστά, χρησιμοποιήσαμε τακτοποιηθεί t-test, όπως εφαρμόζεται στο

Bioconductor

πακέτο

LIMMA

. Χρησιμοποιώντας ονομαστική τιμή ρ 0,05 ως αποκοπής, 76 γονίδια ταυτοποιήθηκαν ως σημαντικά διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια σε δύο πλατφόρμες. Μεταξύ των 76 γονιδίων, 40 και 26 γονίδια υπερεκφράζονται και μειωτικά σε δείγματα καρκίνου. Υπήρχαν 30 και 60 σημαντικά γονίδια ανακαλύφθηκαν σε μία μόνο πλατφόρμα με nCounter και μικροσυστοιχιών αντίστοιχα, και 248 γονίδια δεν ήταν σημαντικές από οποιοδήποτε πλατφόρμα. Οι πλήρεις κατάλογοι δοκιμές γονιδιακής συμπεριλαμβανομένων συντελεστή, ονομαστική τιμή p και ψευδείς ρυθμό ανακάλυψη μπορεί να βρεθεί σε S5 και S6 Τραπέζια για nCounter και μικροσυστοιχιών, αντίστοιχα. Το σχήμα 4 δείχνει τη σύγκριση της αλλαγής φορές log2 σε όγκο σε κανονική ένταση σήματος μεταξύ nCounter και μικροσυστοιχιών για κάθε μία από 414 γονίδια που επιλέχθηκαν για την codeset nCounter. Τα κόκκινα, πράσινα και μπλε κουκκίδες αντιπροσωπεύουν 76, 90 και 248 γονίδια σημαντικά εκφράζονται διαφορικά σε δύο, είτε και ούτε πλατφόρμες αντίστοιχα. Αν χρησιμοποιήσουμε FDR 0,1 ως αποκοπής, υπήρχαν 48, 72 και 294 γονίδια σημαντικά εκφράζονται διαφορικά σε δύο, είτε και ούτε πλατφόρμες αντίστοιχα.

αλλαγή φορές Log2 στον όγκο σε κανονική ένταση σήματος για 414 γονίδια σύγκριση των αποτελεσμάτων από nCounter (χ-άξονας) και μικροσυστοιχιών (γ-άξονας). Τα κόκκινα, πράσινα και μπλε κουκκίδες αντιπροσωπεύουν αντίστοιχα 76, 90 και 248 γονίδια σημαντικά εκφράζονται διαφορικά σε δύο, είτε, ούτε και πλατφόρμες.

Η

Σύλλογος nCounter και γονιδιακή έκφραση μικροσυστοιχιών με αποτέλεσμα την επιβίωση

επίσης εξετάσαμε τη συσχέτιση της έκφρασης των γονιδίων με τη συνολική έκβαση της επιβίωσης των 64 ασθενών, χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο αναλογικών κινδύνων Cox. Χρησιμοποιώντας μια ονομαστική τιμή p 0,05 ως όριο, υπήρχαν 6 σχετίζεται σημαντικά γονίδια, συμπεριλαμβανομένων PPL, CCND1, EXT2, S100A11, USP9X και PHLDA1 και από τις δύο πλατφόρμες, 25 σημαντικά γονίδια από nCounter, και 24 σημαντικά γονίδια από μικροσυστοιχιών. PPL, CCND1, S100A11 και PHLDA1 σχετίστηκαν με υψηλότερα κινδύνου, και EXT2 και USP9X σχετίστηκαν με καλύτερη πρόγνωση. Η πλειοψηφία των γονιδίων (359 γονίδια) δεν συνδέθηκαν σημαντικά με τη συνολική επιβίωση αποτελέσματα είτε πλατφόρμα λόγω του σχετικά μικρού μεγέθους του δείγματος. Οι πλήρεις κατάλογοι δοκιμές γονιδιακής συμπεριλαμβανομένων συντελεστή, ονομαστική τιμή p και ψευδείς ρυθμό ανακάλυψης ή αυτή την ανάλυση των δεδομένων επιβίωσης είναι σε S7 και S8 Τραπέζια για nCounter και μικροσυστοιχιών, αντίστοιχα. Σχήμα 5 δείχνει τις αναλογίες κινδύνου καταγραφής για τη συνολική έκβαση επιβίωση των 414 γονιδίων σύγκριση μεταξύ nCounter και τα δεδομένα μικροσυστοιχιών, με το κόκκινο, πράσινο και μπλε κουκκίδες αναφέροντας τις 6, 49 και 359 γονίδια έχουν σημαντική συσχέτιση επιβίωση στα δύο, μιας και ούτε οι πλατφόρμες . Για τα έξι γονίδια που προσδιορίζονται από δύο πλατφόρμες, προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι CCND1 και S100A1can να χρησιμοποιηθούν ως βιοδείκτες για πρόγνωση καρκίνου του παχέος εντέρου [30, 31], και η αναστολή της USP9X μπορεί να αυξήσει την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων σε ορισμένους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες [32, 33] .

Συνδεθείτε αναλογία κινδύνου για όγκου σε κανονική ένταση σήματος για 414 γονίδια έναντι συνολικού αποτελέσματα επιβίωση συγκρίνοντας τα αποτελέσματα από nCounter (άξονας x) και μικροσυστοιχιών (άξονας y). Τα κόκκινα, πράσινα και μπλε κουκκίδες αντιπροσωπεύουν 6, 49 και 359 γονίδια που σχετίζονταν σημαντικά με τα αποτελέσματα επιβίωσης σε δύο, είτε και ούτε πλατφόρμες αντίστοιχα.

Η

Συζήτηση

Η ποιότητα του mRNA μεταγραφή ποσοτικό προσδιορισμό σε δείγματα FFPE είναι ζωτικής σημασίας για την έρευνα για τον καρκίνο μεταφραστική. Σε αυτή τη μελέτη, οι συγκρίσεις μας βασίστηκαν στις μετρήσεις της πλατφόρμας nCounter NanoString χρησιμοποιώντας FFPE που προέρχονται από δείγματα και Ανθρώπινου Γονιδιώματος U133 Plus 2.0 GeneChip Πίνακες Έκφραση Affymetrix για ασθενή συμφωνημένα φρέσκο ​​κατεψυγμένο ιστό. Στην ιδανική περίπτωση, το mRNA ποσοτικοποίηση χρησιμοποιώντας την ίδια πλατφόρμα για συμφωνημένα FFPE και κατεψυγμένων ιστών θα κάνει μια πιο άμεση σύγκριση. Ωστόσο, προκειμένου να προσδιοριστεί αν το γονίδιο υπογραφές αναπτυχθεί χρησιμοποιώντας κατεψυγμένα ιστούς ισχύουν για κλινικά δείγματα, οι συγκρίσεις μεταξύ των δύο πλατφόρμες χρησιμοποιώντας συμφωνημένα, αλλά διαφορικά αρχειοθετούνται ιστούς, απαιτείται.

Το προφίλ mRNA nCounter με βάση τη χρήση FFPE τεχνική επαναλήψεις έδειξε υψηλή επαναληψιμότητα της πλατφόρμας παρόμοια με την προηγούμενη μελέτη [10]. Ωστόσο, ο μέσος όρος των συντελεστών συσχέτισης ήταν 0.501 και 0.315 για ζεύγη FFPE /φρέσκο-κατεψυγμένα συσχετίσεις του δείγματος και συμφωνημένα συσχετίσεις γονιδίων αντίστοιχα. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν μέτρια συσχέτιση μεταξύ nCounter (FFPE) και μικροσυστοιχιών (νωπά-κατεψυγμένα) δεδομένα.

Για όγκου και φυσιολογική ομάδα συγκρίσεις, 166 από τα 414 γονίδια που ταυτοποιήθηκαν ως σημαντικά διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων είτε με την πλατφόρμα και ότι του αυτά τα 166 γονίδια, 76 γονίδια (46%) εκφράστηκαν να συμπίπτει μεταξύ των δύο πλατφορμών. Επίδειξη σύνδεσης με την επιβίωση αποτελεσμάτων είναι πιο δύσκολο, μόνο το 11% των γονιδίων (6 γονίδια) μεταξύ σχετίζονταν σημαντικά γονίδια (55 γονίδια) είτε από την πλατφόρμα ήταν συγκλίνουσες.

Πολλαπλοί παράγοντες μπορούν να επηρεάσουν αυτά τα πειραματικά αποτελέσματα. Η πλατφόρμα nCounter, ως εκ της φύσεώς της, αποτελεί μια προσαρμοσμένη κατασκευή των στοιχείων υποψήφιου γονιδίου ως βιοδείκτη, έτσι την επιλογή των γονιδίων σε ένα nCounter codeset εγγενώς όρια

in silico

συγκρίσεις με άλλες δημοσιευμένες μελέτες. Ο βαθμός της υποβάθμισης του RNA είναι ένα άλλο δύσκολο ζήτημα που αντιμετωπίζει στρατηγικές μεταγραφικό προφίλ χρησιμοποιώντας FFPE που προέρχονται από τα δείγματα. Για παράδειγμα, μια πρόσφατη μελέτη σχετικά με ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα έδειξαν ότι οι μετρήσεις μεταγραφή του mRNA επιτυγχάνεται με τη χρήση του συστήματος nCounter για αρχειοθετούνται χωρισμένο δείγματα FFPE σύγκριση κακώς με φρεσκοκομμένο ιστούς FFPE [11]. Το θέμα αυτό αφορά τόσο το πρόβλημα της μεταβολής στο πλαίσιο της προετοιμασίας του δείγματος και στο ζήτημα της εγγενούς ετερογένειας όγκου αντανακλάται σε μετρήσιμες μοριακές διαφορές μεταξύ γειτονικών τμημάτων ιστού. Σε αυτή τη μελέτη, NanoString Τεχνολογίες προϋπόθεση του ενιαίου σχεδιασμού καθετήρα με βάση τη συχνότητα μεταγραφή για πάνελ γονιδίων μας, αλλά με τη χρήση του σχεδιασμού πολλαπλών καθετήρα μπορεί να είναι μια στρατηγική για τη βελτίωση της ποιότητας των δεδομένων nCounter.

Αρχείο FFPE διατηρημένα ιστό του όγκου παραμένει η πλέον διαθέσιμη πηγή του δείγματος ιστού για την ανάπτυξη μεγάλης κλίμακας και την επικύρωση των προγνωστικών και πρόβλεψης υπογραφές γονίδιο για τον καρκίνο του παχέος εντέρου. Ταυτοποίηση των υποομάδων των αρχειακών καρκινικών ιστών που παράγουν υψηλότερα δείγματα της ποιότητας του RNA για τη σκιαγράφηση της έκφρασης είναι μία προσέγγιση για τη βελτίωση της ανάπτυξης των βιοδεικτών από αυτά τα δείγματα. Οι βελτιώσεις στην τεχνολογία, όπως η νέα FFPE πρωτοκόλλων εκχύλισης RNA, νέες μέθοδοι ενίσχυσης του RNA και την επισήμανση FFPE, και τροποποιήθηκε ροές εργασιών επεξεργασίας δεδομένων μπορεί επίσης να βοηθήσει στην πλευρά-βήμα ζητήματα της υποβάθμισης του RNA και τη βελτίωση της ποιότητας των δεδομένων μεταγραφικό από RNA-Seq ή μικροσυστοιχιών [34- 36]. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι η υπογραφή γονίδιο που αναπτύχθηκε σε δεδομένα γονιδιακής έκφρασης μικροσυστοιχιών χρησιμοποιώντας κατεψυγμένα δείγματα δεν μπορούν να εφαρμοστούν άμεσα στα δεδομένα nCounter βασίζονται σε δείγματα FFPE. Ωστόσο, αποδεικνύεται ότι ένα μικρό υποσύνολο των γονιδίων που είχαν σταθερή σχήματα έκφρασης και στις δύο πλατφόρμες nCounter και μικροσυστοιχιών, και ανεξάρτητα από το αν τα προϊόντα λύσης προερχόμενα από φρέσκο ​​κατεψυγμένο ή FFPE προερχόμενο δείγματα. Παρακολούθηση μελέτες για αυτά τα γονίδια μπορεί να βοηθήσει να οδηγήσει σε πιο κλινικά χρήσιμη βιοδείκτες για τον καρκίνο του παχέος εντέρου.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 Εικ. Οι κατανομές των εντάσεων σήματος των 68 δειγμάτων (οικόπεδα κουτί ατομική) από nCounter και μικροσυστοιχιών

doi:. 10.1371 /journal.pone.0153784.s001

(PDF)

S2 Εικ. Scatterplot των κανονικοποιημένων μετράει από 414 επιμέρους στοιχεία γονίδιο χρησιμοποιώντας ένα δείγμα διάσπαση από έξι FFPE διατηρημένο εκχυλίσεις όγκου (τυφλωμένοι τεχνικά αντίγραφα) στην πλατφόρμα nCounter

doi:. 10.1371 /journal.pone.0153784.s002

(PDF)

S1 πίνακα. Η κλινική ενημέρωση των 68 δειγμάτων

doi:. 10.1371 /journal.pone.0153784.s003

(CSV)

S2 πίνακα. Ο πλήρης κατάλογος με τα σύμβολα γονιδίων και τις πηγές των 414-γονίδια για nCounter codeset

doi:. 10.1371 /journal.pone.0153784.s004

(CSV)

S3 πίνακα. Ο κατάλογος των συμφωνημένα αναγνωριστικά καθετήρα Affymetrix των 414-γονίδια για nCounter codeset

doi:. 10.1371 /journal.pone.0153784.s005

(CSV)

S4 πίνακα. Η εκχύλιση RNA RIN τιμές

doi: 10.1371 /journal.pone.0153784.s006

(CSV)

S5 πίνακα. Τα διαφορικά εκφρασμένων αποτελέσματα δοκιμών γονίδιο για nCounter

doi:. 10.1371 /journal.pone.0153784.s007

(CSV)

S6 πίνακα. Τα διαφορικά εκφρασμένων αποτελέσματα δοκιμών γονίδιο μικροσυστοιχιών

doi:. 10.1371 /journal.pone.0153784.s008

(CSV)

S7 πίνακα. Τα αποτελέσματα των δοκιμών της σύνδεσης με τα αποτελέσματα επιβίωσης για nCounter

doi:. 10.1371 /journal.pone.0153784.s009

(CSV)

S8 πίνακα. Τα αποτελέσματα των δοκιμών της σύνδεσης με την επιβίωση αποτελέσματα για μικροσυστοιχιών

doi:. 10.1371 /journal.pone.0153784.s010

(CSV)