Αφηρημένο

Ιστορικό

Ο καρκίνος του παγκρέατος βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) αντιπροσωπεύουν ένα μικρό υποπληθυσμό παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα που έχουν την ικανότητα να κινήσει και να διαδώσει το σχηματισμό όγκων. Πάντως, οι μηχανισμοί με τους οποίους διατηρούνται παγκρεατική ΚΕΠ δεν είναι καλά κατανοητοί ή χαρακτηρισθούν.

Μέθοδοι

Η έκφραση των υποδοχέων Notch, συνδέτες, και Notch γονίδια στόχους σηματοδότησης ποσοτικοποιήθηκε στο CSC και μη CSC πληθυσμών από 8 πρωτογενή ανθρώπινα παγκρεατικά ξενομοσχευμάτων. Ένας αναστολέας γάμμα εκκριτάσης (GSI) που αναστέλλει την οδό Notch και ένα shRNA στόχευση του γονιδίου στόχου Notch Hes1 χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση του ρόλου του μονοπατιού Notch σε συντήρηση του πληθυσμού CSC και ανάπτυξη παγκρεατικού όγκου.

Αποτελέσματα

συστατικά Notch μονοπατιού βρέθηκαν να ρυθμίζεται προς τα πάνω σε παγκρεατικά ΚΕΠ. Η αναστολή του μονοπατιού Notch χρησιμοποιώντας είτε έναν αναστολέα της γ-εκκριτάσης ή Hes1 shRNA σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα μείωσε το ποσοστό των ΚΕΠ και tumorsphere σχηματισμού. Αντιστρόφως, η ενεργοποίηση του μονοπατιού Notch με ένα εξωγενές πεπτίδιο Notch συνδέτη αύξησε το ποσοστό των ΚΕΠ καθώς tumorsphere σχηματισμού. In vivo θεραπεία των παγκρεατικών ορθοτοπική όγκων σε ποντίκια NOD /SCID με GSI μπλοκάρει την ανάπτυξη όγκου και μείωσε τον πληθυσμό CSC.

Συμπέρασμα

Το μονοπάτι σηματοδότησης Notch είναι σημαντική για τη διατήρηση της παγκρεατικής πληθυσμός CSC και είναι ένας πιθανός θεραπευτικός στόχος για τον καρκίνο του παγκρέατος

Παράθεση:. Abel EV, Kim EJ, Wu J, Hynes Μ, Bednar F, Proctor E, et al. (2014) η οδός Notch είναι σημαντικά στη διατήρηση της καρκινικά βλαστικά πληθυσμό κυττάρων σε καρκίνο του παγκρέατος. PLoS ONE 9 (3): e91983. doi: 10.1371 /journal.pone.0091983

Εκδότης: Martin Fernandez-Zapico, Schulze Κέντρο Μυθιστόρημα Therapeutics, Mayo Clinic, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 6 Ιαν, 2014? Αποδεκτές: 15 Φεβρουαρίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 19 Μαρτίου, 2014

Copyright: © 2014 Abel et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από το Pausch Οικογένεια AACR-PANCAN Βραβείο Καινοτομίας Randy (DMS). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του παγκρέατος είναι η τέταρτη πιο κοινή αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με το θάνατο στις Ηνωμένες Πολιτείες παρά το γεγονός ότι το 10

ου πιο κοινή διάγνωση του καρκίνου [1]. Το υψηλό ποσοστό θνησιμότητας οφείλεται εν μέρει στο γεγονός ότι η συντριπτική πλειοψηφία των καρκίνων του παγκρέατος διαγιγνώσκονται σε προχωρημένο στάδιο. Αλλά τουλάχιστον εξίσου σημαντικό είναι ότι καρκίνων του παγκρέατος είναι γενικά μόνο ελάχιστα ανταποκρίνεται στη χημειοθεραπεία και την ακτινοθεραπεία. Υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις ότι αυτή η αντίσταση στην θεραπεία είναι τουλάχιστον εν μέρει λόγω της εγγενούς αντοχής ενός υποπληθυσμού των καρκινικών κυττάρων που είναι ογκογόνα και μοιράζονται πολλές ιδιότητες με βλαστικά κύτταρα και έχουν έτσι επισημασμένα καρκινικά βλαστικά κύτταρα (CSC). Καρκίνος βλαστικά κύτταρα απομονώθηκαν πρώτα σε μυελοειδή λευχαιμία [2] και έχουν δείξει να μοιράζονται ιδιότητες βλαστικών κυττάρων όπως δυναμικό για αυτο-ανανέωση και την ικανότητα να διαφοροποιούνται και να πολλαπλασιάζονται. Στη συνέχεια, ΚΕΠ έχουν επίσης ταυτοποιηθεί σε ένα ευρύ φάσμα συμπαγών όγκων συμπεριλαμβανομένου του μαστού, του εγκεφάλου, του ήπατος, του παχέος εντέρου, του προστάτη, μελάνωμα, και του παγκρέατος [3] – [10] _ENREF_3. Παγκρεατικά καρκινικά βλαστικά κύτταρα (CSC) για πρώτη φορά απομονώθηκαν από ανθρώπινους καρκίνους του παγκρέατος με τη χρήση του ΕΣΟΛ προφίλ δείκτη

+ /CD44

+ /CD24

+ [10]. Αυτές οι θετικές δείκτη ΚΕΠ ήταν σε θέση να σχηματίζουν όγκους σε ποντίκια NOD /SCID που εμφανίστηκε ιστολογικά παρόμοια με τον πρωτογενή όγκο, υποδηλώνοντας multi-δραστικότητα με την ανασύσταση των διαφόρων τύπων κυττάρων όγκου. In vitro στοιχεία για μια φαινότυπο βλαστικών κυττάρων, όπως η αυτο-ανανέωση αποδείχθηκε από την ικανότητα να σχηματίζουν σφαίρες όγκου

in vitro

σε αντίθεση με την ESA

– /CD44

– /CD24

– κύτταρα που δεν μπορούσαν.

παραμένει ατελώς κατανοητό πώς παγκρέατος τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα διατηρούνται σε ένα ετερογενές όγκου. Μια πιθανή συμβολή στην συντήρηση CSC είναι το σηματοδοτικό μονοπάτι Notch. Στις κανονικές αναπτυσσόμενες πάγκρεας, το μονοπάτι σηματοδότησης Notch έχει δειχθεί ότι είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής της ισορροπίας μεταξύ αυτο-ανανέωσης και της διαφοροποίησης [11] – [13]. Υπάρχουν 4 μέλη της οικογένειας των θηλαστικών υποδοχέα Notch (NOTCH 1-4) τα οποία ομοίως επεξεργασία και ενεργοποιείται μέσω μιας σειράς γεγονότων διάσπασης. Το ώριμο υποδοχέα Notch αποτελείται από δύο υπομονάδες που παράγονται ως αποτέλεσμα μιας αρχικής εκδήλωσης διάσπαση με φουρίνη όπως κονβερτάσης [14]. ενεργοποίηση Notch μονοπατιού σηματοδότησης συμβαίνει όταν ένας υποδοχέας Notch δεσμεύεται με έναν από τους πέντε γνωστούς συνδέτες Notch [Jagged1 (JAG1), jagged2 (JAG2), δέλτα-σαν 1 (DLL1), δέλτα-σαν 3 (DLL3), και δέλτα-όπως 4 (DLL4)]. πρόσδεσης προσδέματος προκαλεί μια διαμορφωτική αλλαγή στον υποδοχέα Notch που επιτρέπει μια δεύτερη διάσπαση με παράγοντα νέκρωσης όγκων-άλφα μετατρεπτικού ενζύμου (TACE) [15]. Ένα τρίτο συμβάν διάσπαση διεξάγεται με γάμμα εκκριτάσης (πρεσενιλίνη), η οποία απελευθερώνει την ενδοκυτταρική περιοχή του Notch του επιτρέπει να μετατοπίζονται στον πυρήνα για την ενεργοποίηση της έκφρασης των γονιδίων στόχων [16].

Η αναστολή της σηματοδότησης Notch μονοπάτι οδηγεί σε εξάντληση του πολυ-ισχυρά παγκρεατικά προγονικών κυττάρων [11], [13]. Αντιστρόφως, επαγόμενη ενεργοποίηση Notch αποτρέπει διαφοροποίησης παγκρεατικού επιθηλιακών και οδηγεί σε αυξημένη συντήρηση των αδιαφοροποίητων παγκρεατικών προγονικών κυττάρων [12]. Βασισμένο σε παρόμοια χαρακτηριστικά φαινοτυπικά παρουσιάζονται από ΚΕΠ, το μονοπάτι σηματοδότησης Notch έχει αξιολογηθεί για το ρόλο της στην CSC αυτο-ανανέωση. Και οι δύο CSCs μαστού και του εγκεφάλου έχουν δειχθεί ότι έχουν αυξημένη ενεργοποίηση του Notch μονοπατιού [17], [18]. In vitro αναστολή της οδού σηματοδότησης Notch σε αυτούς τους δύο τύπους όγκων αποτέλεσμα μειωμένη αυτο-ανανέωση, που δείχνεται με μείωση της tumorsphere σχηματισμού. Υποθέσαμε ότι η οδός σηματοδότηση Notch είναι περαιτέρω ρυθμισμένη προς τα πάνω σε παγκρεατικά CSC και συμβάλλει στην λειτουργία του παγκρέατος και του παγκρέατος CSC ογκογένεση του καρκίνου.

Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε το ρόλο του μονοπατιού Notch στη διατήρηση του πληθυσμού CSC και τα αποτελέσματά της της αναστολής της αύξησης παγκρεατικού όγκου. Έχουμε εντοπίσει προς τα πάνω ρύθμιση των διαφόρων συστατικών Notch μονοπατιού σε παγκρεατικά ΚΕΠ και να αποδείξει ότι η αναστολή από έναν αναστολέα της γ-εκκριτάσης ή shRNA να Hes1, ένα βασικό γονίδιο στόχο Notch, μειώνει παγκρέατος CSC αυτο-ανανέωση και ογκογονικότητα. In vivo θεραπεία της εγκατεστημένης ορθοτοπική παγκρεατικών όγκων με αναστολέα γ-εκκριτάσης μειώνει την ανάπτυξη του όγκου και συνδυασμό με κυτταροτοξική χημειοθεραπεία περαιτέρω αυξάνει την απόκριση κατά του όγκου. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η σηματοδότηση Notch είναι κρίσιμη για παγκρέατος συντήρησης CSC και ότι η στόχευση του μονοπατιού σηματοδότησης Notch σε καρκίνο του παγκρέατος έχει πολλά υποσχόμενες θεραπευτικές δυνατότητες.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

δείγματα παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα ιστού ελήφθησαν από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε χειρουργικές επεμβάσεις εντός του Πανεπιστημίου του Michigan συστήματος Υγείας. Γραπτή συγκατάθεση από όλα τα ερευνητικά θέματα που αποκτήθηκε πριν από τη συλλογή των ιστών, καθώς και όλα τα πρωτόκολλα που αφορούν δείγματα ασθενών εξετάστηκαν και εγκρίθηκαν από τις Institutional Review Boards του Πανεπιστημίου του Michigan Ιατρική Σχολή (IRBMED). Πρωτότυπο, είναι έντυπη όλων των γραπτών ενημέρωσε έντυπα συγκατάθεσης διατηρείται μέσα σε ένα ασφαλές αρχείο στο Πανεπιστήμιο του Michigan. Οι Institutional Review Boards του Πανεπιστημίου του Michigan Ιατρική Σχολή (IRBMED) καθορίζεται ότι η μελέτη αυτή είναι σύμφωνη με τις ισχύουσες κατευθυντήριες γραμμές, πολιτειακούς και ομοσπονδιακούς κανονισμούς, και το Πανεπιστήμιο της Federalwide Διασφάλισης του Μίτσιγκαν (FWA), με το Υπουργείο Υγείας και Ανθρωπίνων Υπηρεσιών (HHS). Η IRBMED ενέκρινε επίσης όλα τα γραπτά έγγραφα συναίνεσης, καθώς και τις διαδικασίες συναίνεσης, για την παρούσα μελέτη. Ο αριθμός του Πανεπιστημίου του Michigan Federalwide αξιοπιστίας για αυτή τη μελέτη είναι FWA00004969, και ο αριθμός αναγνώρισης μελέτη του Πανεπιστημίου του Michigan μελέτη είναι HUM00025339.

Αντισώματα και αντιδραστήρια

Η Merck γάμμα αναστολέα σεκρετάσης (MK-0752) ήταν από τον Dr. Max Wicha (University of Michigan) και χρησιμοποιήθηκε για το

in vitro

και

ex vivo

μελέτες. Gamma αναστολέας σεκρετάσης RO4929097 ευγενική παραχώρηση από τη Roche (Indianapolis, IN) και χρησιμοποιήθηκε για τις

in vivo

μελέτες. ΡΕ-συζευγμένα ποντικού αντι-ανθρώπινο CD44 και FITC-συζευγμένα αντισώματα ποντικού αντι-ανθρώπινο CD24 αγοράστηκαν από B.D. (Franklin Lakes, NJ). APC συζευγμένο αντίσωμα ποντικού αντι-ανθρώπου ESA αγοράστηκε από Miltenyi Biotech και αντι-ποντικού Η2Κ βιοτινυλιωμένο ποντικού αγοράστηκε από τη Southern Biotech. Hes1 αντίσωμα που χρησιμοποιείται για Western Blot ελήφθη από τον Dr. Xing Fan (University of Michigan) ή αγοράστηκαν από MBL International (Woburn, ΜΑ). Notch 1 και Notch 1 διασπάται αντισώματα αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ) και αντίσωμα β-ακτίνης αγοράστηκε από την Sigma (St. Louis, ΜΟ). Matrigel αγοράστηκε από B.D. (Franklin Lakes, NJ). Hes1 shRNA κλώνος V2LHS 249.784 αγοράστηκε από την Open Biosystems (Huntsville, AL). Ο /Serrate /Lag-2 πεπτιδίου δέλτα (DSL) (ακολουθία CDDYYYGFGCNKFCRPR) συντέθηκε από πρωτεϊνική δομή διευκόλυνση του Πανεπιστημίου του Michigan.

έγκριση πρωτοκόλλου

πρωτόκολλα των ζώων εγκρίθηκαν από την Επιτροπή του Πανεπιστημίου για την Χρήση και φροντίδα των ζώων (UCUCA) στο Πανεπιστήμιο του Μίσιγκαν και λεντοϊού πρωτόκολλα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Θεσμικών Βιοασφάλεια (IBC) στο Πανεπιστήμιο του Μίσιγκαν.

Προετοιμασία του απλού κυττάρου εναιωρήματα καρκινικών κυττάρων

Single κυτταρικό εναιώρημα των κυττάρων του όγκου παρασκευάστηκε όπως περιγράφεται [10] με τις ακόλουθες τροποποιήσεις. Πρωτογενή ανθρώπινα παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα ξενομοσχεύματος ιστός τεμαχίστηκε τελείως και στη συνέχεια εναιωρήθηκε σε 200 μονάδες /ml υπερκαθαρό κολλαγενάση IV (Worthington Biochemicals, Freehold, NJ) στο Media 199 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Μετά την πέψη του ενζύμου στους 37 ° C για 45 έως 60 λεπτά και μηχανική διάσπαση με σιφωνισμό κάθε 15 λεπτά με μία mL πιπέτα 10, η πέψη και διαχωριζόμενα κύτταρα διηθήθηκαν μέσω 40 μm περιοριστή κύτταρο νάιλον πλέγματος (BD Franklin Lakes, NJ) και πλένεται με HBSS (Invitrogen, Carlsbad, CA) δύο φορές. Τα κύτταρα κατόπιν επαναιωρήθηκαν σε 2% FBS σε HBSS για τα πειράματα.

Η κυτταρομετρία ροής

Η κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [10]. Διαχωρισμένα κύτταρα μετρήθηκαν και μεταφέρθηκαν σε σωλήνες των 5 mL, πλένεται με HBSS /2% FBS δύο φορές και επαναιωρήθηκαν σε HBSS /2% FBS σε συγκέντρωση 1 εκατομμυρίου κυττάρων ανά 100 μL. Sandoglobin (1 mg /mL) προστέθηκε στο δείγμα σε αραίωση 1:50 και το δείγμα επωάστηκε επί πάγου για 20 λεπτά, στη συνέχεια πλένονται δύο φορές με HBSS /2% FBS. Αντισώματα ΡΕ-συζευγμένα ποντικού αντι-ανθρώπινο CD44, συζευγμένο με FITC αντι-ανθρώπινο CD24 ποντικού, συζευγμένο APC ποντικού αντι- ανθρώπινο ESA και αντι-ποντικού Η2Κ βιοτινυλιωμένο ποντικού προστέθηκαν σε αραίωση σύμφωνα με τις οδηγίες, και το δείγμα επωάστηκε για 45 λεπτά σε πάγου και στη συνέχεια πλένονται δύο φορές με HBSS /2% FBS. Στρεπταβιδίνη συζευγμένη με ΑΡΟ-Cy7 προστέθηκε στην αραίωση του 1:200 και το δείγμα επωάζεται επί πάγου επί 15 λεπτά. Μετά από πλύση δύο φορές με HBSS /2% FBS, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε HBSS /2% FBS που περιέχει 3 μΜ 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Η κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός FACSAria (B.D., Franklin Lakes, NJ). Πλευρά διασποράς και προς τα εμπρός προφίλ διασποράς χρησιμοποιήθηκαν για την εξάλειψη των διπλών κυττάρων

Ποσοτική PCR

Αστάρια για τα συστατικά μονοπατιού Notch επιλέχθηκαν από μια τράπεζα αστάρι. (Wang & amp? Seed, 2003) και συντίθεται από Invitrogen (Carlsbad, CA). Ολικό RNA εξήχθη από ταξινομημένα καρκινικά βλαστικά κύτταρα και αρχέγονα κύτταρα μη-καρκίνου χρησιμοποιώντας ένα κιτ RNeasy Micro (Qiagen, Valencia, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες. Αντίστροφη μεταγραφή του cDNA διεξήχθη χρησιμοποιώντας υψηλής χωρητικότητας cDNA Reverse Transcription Kits (Applied Biosystems, Foster City, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες. qPCR διεξήχθη επί Rotorgene 6000 (Qiagen, Valencia, CA) χρησιμοποιώντας ένα υδραυλικό SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystem, Foster City, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, με όλες τις αντιδράσεις ομαλοποιήθηκε για GAPDH. Οι συνθήκες που χρησιμοποιήθηκαν για qPCR ήταν 95 ° C κράτημα για 10 λεπτά, 40 κύκλοι των 95 ° C για 10 δευτερόλεπτα, 60 ° C για 15 δευτερόλεπτα, και 72 ° C για 20 δευτερόλεπτα.

Tumorsphere καλλιέργειες

Ιδρύθηκε παγκρεατικό tumorspheres καρκίνο [10] διατηρήθηκαν σε μέσα σφαίρα όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19], [20] με τροποποιήσεις [50% NeuralBasal (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1% Ν2 συμπλήρωμα (Invitrogen, Carlsbad, CA), 2% συμπλήρωμα Β27 (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1% αντιβιοτικό-αντιμυκητικό (Invitrogen, Carlsbad, CA), 10 ng /mL ΒΜΡ4 (Sigma), 10 ng /mL LIF (Sigma), 20 ng /mL ανθρώπινης από bFGF 2 (Invitrogen, Carlsbad, CA), όλα σε 1:01 DMEM /F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA)]. Tumorspheres ανακαλλιεργήθηκαν κάθε 6 ημέρες. Για ανακαλλιέργεια, tumorspheres διαχωρίστηκαν με 0,05% θρυψίνη για 2-5 λεπτά και στη συνέχεια αμέσως πλένεται δύο φορές με 40 mL PBS. Τα κύτταρα στη συνέχεια διέρχεται μέσα από ένα σουρωτήρι κύτταρο πλέγματος νάιλον 40 μm, μετρήθηκαν και επιστρώθηκαν σε φρέσκο ​​μέσο σφαίρα σε Costar εξαιρετικά χαμηλό προσάρτησης 6 φρεατίων (Corning, Lowell, ΜΑ).

θεραπεία GSI του tumorsphere σε κύτταρα,

Tumorspheres διαχωρίστηκαν σε απλά κύτταρα και επαναιωρήθηκαν σε μέσο που περιέχει σφαίρα GSI στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για τις σημειώνεται χρονικές περιόδους. Τα κύτταρα στη συνέχεια παρατηρήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο ή συλλέχθηκαν για ανάλυση.

κηλίδωση Western

Κύτταρα κατεργασμένα με ή χωρίς GSI σε διάφορες δόσεις λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (20 mM Tris ρΗ 7.5 /150 mM NaCl /12 mM EDTA /10% γλυκερόλη /1% Triton Χ-100) που περιέχει ένα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche Applied Science, Indianapolis, ΙΝ) και PhosphoStop (Roche Applied Science, Indianapolis, ΙΝ). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε με τη χρήση Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA). Πενήντα μα πρωτείνης αναμίχθηκε με ένα ίσο όγκο 2χ δϋδ ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης (Invitrogen, Carlsbad, CA) και έβρασαν για 5 λεπτά πριν από την εφαρμογή του δείγματος σε SDS-PAGE. Μετά την SDS-PAGE, η πρωτεΐνη πήκτωμα στυπώθηκε σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης Hybond C επιπλέον (Amersham Biosciences, Pittsburgh, ΡΑ) χρησιμοποιώντας Bio-Rad κηλίδωση συσκευή (BioRad, Hercules, CA) επί μία ώρα. Το στύπωμα αποκλείστηκε με 5% ξηρό γάλα σε TBST για μία ώρα, πλύθηκαν δύο φορές σε TBST, και ακολούθως επωάζονται με αντισώματα (1:1000) σε 5% BSA εις 4 ° C όλη τη νύκτα. Το στύπωμα πλύθηκε τρεις φορές σε TBST και μετά επωάζονται με δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση (Jackson ImmunoResearch, West Grove, ΡΑ) σε 5% ξηρό γάλα σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Μετά από πλύση τρεις φορές σε TBST, το στύπωμα επωάστηκε για 5 λεπτά με SuperSignal West Pico χημειοφωταύγειας υπόστρωμα (Pierce, Rockford, IL) και φιλμ ακτίνων Χ (Denville Scientific, Metuchen, NJ) στη συνέχεια αναπτύχθηκε.

shRNA transductioin

Lentivirus κατασκευάζει φορέα pGIPZ περιέχει Hes1 shRNA ή ελέγχου shRNA έγιναν στον πυρήνα Vector στο Πανεπιστήμιο του Μίσιγκαν. Η μεταγωγή εκτελέσθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ ViraDuctin Lentivirus Μεταγωγή (Cell Biolabs, Inc. San Diego, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες.

Προσδιορισμός απόπτωσης

Tumorsphere κύτταρα μεταδιεγείρονται με τον έλεγχο ή Hes1 shRNA καλλιεργήθηκαν σε μέσα σφαίρα που περιέχουν 4 μg /mL πουρομυκίνη για 4 ημέρες ακολουθούμενη από θρυψινοποίηση και PBS πλύση. Τα κύτταρα διηθήθηκαν μέσω ενός νάιλον πλέγματος 40 μm για να ληφθεί εναιωρήματα μονών κυττάρων. Τα προκύπτοντα μεμονωμένα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με παγωμένη αιθανόλη 50% σε PBS όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με ΡΙ και ΡΙΤΟ-αννεξίνης V χρησιμοποιώντας ένα αννεξίνης V:. FITC απόπτωση Detection Kit II αγοράστηκε από την BD Biosciences (San Jose, California)

θεραπεία DSL του tumorspheres

σφαίρες διαχωρίστηκαν σε απλά κύτταρα και επαναιωρήθηκαν σε μέσο σφαίρα που περιέχει το πεπτίδιο DSL στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για τους υποδεικνυόμενους χρόνους. Επεξεργασμένα κύτταρα παρατηρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο ή που συλλέγονται για ανάλυση.

Ex vivo θεραπεία GSI των tumorspheres και η εμφύτευση σε NOD /SCID ποντίκια

Ενιαία κύτταρα διαχωρίζονται από tumorspheres καλλιεργήθηκαν σε μέσο σφαίρα που περιέχει DMSO ή 8 μΜ GSI για 48 ώρες πριν να διαχωριστεί με θρυψίνη και χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ και ένα αντίσωμα προς Η2Κ. Τα κύτταρα ταξινομήθηκαν με FACS και DAPI αρνητικών και Η2Κ αρνητικά κύτταρα συλλέχθηκαν για να ληφθεί ένα καθαρό ζωντανό, πληθυσμός ανθρώπινων παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων. Μετά από πλύση με HBSS, ταξινομημένα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε μέσο σφαίρα. Η βιωσιμότητα των κυττάρων ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας Trypan Blue (Invitrogen, Carlsbad, CA). Σαράντα χιλιάδες κύτταρα σε 50 μικρόλιτρα μέσου αναμίχθηκαν με ίσο όγκο Matrigel και εγχύθηκαν υποδορίως στην περιοχή του midflank NOD ποντίκια /SCID χρησιμοποιώντας μια βελόνα 23 gauge. Πέντε ποντίκια ενέθηκαν για κάθε ομάδα θεραπείας. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε σε εβδομαδιαία βάση. Οι όγκοι δεν είχαν τη δυνατότητα να υπερβαίνει τα 2 cm σε διάμετρο πριν την ευθανασία. Επιπλέον, τα ζώα παρακολουθούνται καθημερινά από το Πανεπιστήμιο του Michigan το κτηνιατρικό προσωπικό και θυσιάζονται σε οποιοδήποτε σημάδι δυσφορίας ή απώλεια βάρους. Στο τέλος της μελέτης τα ζώα υποβλήθηκαν σε ευθανασία με ασφυξία με διοξείδιο του άνθρακα ακολουθούμενη από αυχενική εξάρθρωση για να εξασφαλιστεί το θάνατο.

ορθοτοπική εμφύτευση κυττάρων όγκου παγκρέατος σε NOD /SCID ποντίκια και GSI Θεραπεία

παγκρεατικά κύτταρα όγκου επωάστηκαν με φακοϊό λουσιφεράσης που εκφράζουν τη διάρκεια της νύχτας πλύθηκαν με ορό ελεύθερο HBSS και εναιωρήθηκαν σε ένα μίγμα PBS /Matrigel (1:01 σε όγκο) σε συγκέντρωση 10 εκατομμυρίων κυττάρων /mL για εμφύτευση. Οι ποντικοί αναισθητοποιούνται με ενδοπεριτοναϊκή ένεση 100 mg /kg κεταμίνης και 5 mg /kg ξυλαζίνης, και ένα μικρό αριστερό υποπλεύρια τομή εκτελέστηκε. 500000 χύδην όγκου κύτταρα σε έναν όγκο 50 μΐ ενέθηκαν στην ουρά του παγκρέατος χρησιμοποιώντας μια βελόνα 30-gauge. Η βουπρενορφίνη χορηγήθηκε κάθε 6 ώρες για τις πρώτες 24 ώρες μετά τη χειρουργική επέμβαση για να ανακουφίσει τον πόνο. Η θεραπεία με χημειοθεραπεία ξεκίνησε 2 εβδομάδες μετά την όγκοι ήταν ανιχνεύσιμα. Τρεις επιμέρους χαμηλής διαβιβάσεως ανθρώπινων παγκρεατικών ξενομοσχεύματος όγκων συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυση. Υπήρχαν 4 ομάδες ποντικών: έλεγχος, RO4929097 (GSI), γεμσιταβίνη, και GSI συν gemcitabine, με 5 ποντίκια ανά ομάδα. Τα ζώα αξιολογήθηκαν από bioluminescent ανάπτυξη απεικόνισης και του όγκου αξιολογήθηκε εβδομαδιαίως. GSI (30 mg /kg) χορηγήθηκε από του στόματος καθετηριασμό κατά τη συχνότητα του 5 ημέρες σε 2 ημέρες μακριά. Αυτό το πρόγραμμα χρησιμοποιήθηκε για να ελαχιστοποιηθεί η GSI προκαλούμενη διάρροια δευτερεύουσα σε υπερπλασία των καλυκοειδών κυττάρων [21]. Η γεμσιταβίνη (50 mg /kg) χορηγήθηκε εβδομαδιαία με ενδοπεριτοναϊκή ένεση όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22]. Η θεραπεία δόθηκε για 4 εβδομάδες στο οποίο σημείο τα ζώα υποβλήθηκαν σε ευθανασία με ασφυξία με διοξείδιο του άνθρακα ακολουθούμενη από αυχενική εξάρθρωση για να εξασφαλιστεί το θάνατο. Πριν από τη θυσία, τα ζώα παρακολουθούνται καθημερινά από το Πανεπιστήμιο του Michigan το κτηνιατρικό προσωπικό και θυσιάζονται σε οποιοδήποτε σημάδι δυσφορίας ή απώλεια βάρους. Νεκροψία διεξήχθη και οι όγκοι αποκόπηκαν για ανάλυση.

απεικόνιση βιοφωταύγειας

απεικόνιση βιοφωταύγειας των εμφυτευμένων ορθοτοπική όγκων σε ποντικούς διεξήχθη χρησιμοποιώντας Xenogen IVIS 200 Σύστημα Απεικόνισης (Xenogen Biosciences, Cranbury, NJ) ως περιγράφηκε προηγουμένως [23].

Ανοσοϊστοχημεία

τα δείγματα ιστού σταθεροποιήθηκαν σε 10% φορμαλίνη ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού και ενσωματωμένα σε παραφίνη. Φορμαλίνη σταθερό, ενσωματωμένες σε παραφίνη τομές κόπηκαν πάχους 4-μm, τοποθετήθηκαν σε πλακίδια με πολυ-L-λυσίνη (Sigma), και ξηραίνεται όλη τη νύχτα στους 37 ° C. Οι τομές στη συνέχεια αποκηρωμένα σε ξυλόλιο, επανυδατώθηκαν σύμφωνα με τυποποιημένες διαδικασίες ιστοπαθολογικές, και χρωματίστηκαν με Η &? Ε. Ανοσοανίχνευση έγινε χρησιμοποιώντας την DakoCytomation LSAB + Kit σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Dako, Denmark). Οι πλάκες στη συνέχεια με αιματοξυλίνη και καλύφθηκαν με VectaMount Τοποθέτηση Media (Vector Labs, Burlingame, CA). Κάθε χρωματισμένο τμήμα στη συνέχεια αξιολογήθηκε με μικροσκοπία.

TUNEL Δοκιμασία

ανάλυση TUNEL έγινε χρησιμοποιώντας το κιτ Promega TUNEL δοκιμασίας (Promega, San Luis Obispo, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. πυρήνες αποπτωτικός κυτταρικός απεικονίστηκαν ως ένα κίτρινο-πράσινο φθορίζον σήμα υπό μικροσκοπία φθορισμού. πυρήνες κυττάρων αντίθετα με DAPI (Vector Labs, Burlingame, CA).

Πρόσθετα αντιδραστήρια

RO4929097 για in vitro έργο αγοράστηκε από Σέλεκ Χημικών Προϊόντων (Houston, TX).

ολιγονουκλεοτίδια για qRT-PCR

χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθες αλληλουχίες: 5′-Hes1 GAGAGGCGGCTAAGGTGTTTG-3 ‘και 5′-CTGGTGTAGACGGGGATGAC-3′, 5’-GLI1 GGCTGGACCAGCTACATCAAC-3 ‘και 5’-TGGTACCGGTGTGGGACAA-3 ‘, 5′-GLI2 GCAAATGAAAGCCAGGGAAC-3′ και 5’-ATCTCAGGAAGGCGATGAAC-3 ‘, 5′-PTCH1 TATCCAGCACTTACTTTACGACCT-3′ και 5′-ATCCTGAAGTCCCTGAAGCC3 », και GAPDH 5’-TCACCAGGGCTGCTTTTAAC-3 ‘και 5’-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3 ».

η στατιστική ανάλυση

τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SE Στατιστικά σημαντικές διαφορές προσδιορίζονται με

t

test του Student και

Χ

2 αναλύσεις ή το Mann-Whitney U, όπου κρίνεται σκόπιμο, και ορίζονται ως

P

& lt? 0.05.

Αποτελέσματα

σηματοδοτικό μονοπάτι Notch ρυθμίζεται αυξητικά σε παγκρεατικά καρκινικά βλαστικά κύτταρα

Το μονοπάτι σηματοδότησης Notch έχει δειχθεί ότι ενεργοποιείται σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα [24]. Υποθέσαμε ότι τα συστατικά μονοπατιού σηματοδότησης Notch μπορεί να ρυθμίζεται αυξητικά περαιτέρω στον παγκρεατικό καρκίνο υποπληθυσμό βλαστοκυττάρων. Χρησιμοποιώντας πρωτογενή ανθρώπινα παγκρεατικά ξενομοσχεύματα καρκίνου από 8 διαφορετικούς όγκους ασθενούς αξιολογήσαμε τα επίπεδα έκφρασης των συστατικών μονοπατιού σηματοδότησης Notch σε βλαστικά κύτταρα του καρκίνου σε σύγκριση με χύμα κύτταρα όγκου. Οι όγκοι από ξενομοσχεύματα απομονώθηκαν και μεταποιούνται σε εναιωρήματα απλού κυττάρου που ταξινομούνται στη συνέχεια με βάση το προφίλ triple-δείκτη CD44 + /CD24 + /ESA + για την απόκτηση ΚΕΠ και ξεχωριστά μη-ΚΕΠ (Εικόνα 1Α). Διεξήχθη ποσοτική ανάλυση RT-PCR του RNA που ελήφθη από ΚΕΠ και μη ΚΕΠ για την έκφραση των συστατικών του μονοπατιού σηματοδότησης Notch. Τα αποτελέσματα υποδηλώνουν προς τα πάνω ρύθμιση συστατικών Notch μονοπατιού σε ΚΕΠ πάνω από εκείνη του μη-ΚΕΠ (Εικόνα 1Β). ΚΕΠ σε 6 από 8 όγκων εκφράζονται τουλάχιστον ενός υποδοχέα Notch σε επίπεδο & gt? 1,5 φορές έναντι των μη-CSC. Ομοίως, τουλάχιστον ένα συνδετήρα Notch ρυθμίζεται αυξητικά & gt? 1,5 φορές σε CSC επί μη CSC σε 6 από 8 όγκων. Αξίζει να σημειωθεί ότι δεν είχαμε ανιχνεύσει έκφραση είτε του υποδοχέα Notch4 συνδετήρα DLL3 είτε CSC ή μη CSC διαμερισμάτων σε οποιαδήποτε από τις πρωτογενείς ξενομοσχευμάτων που εξετάστηκαν (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Υπήρχε μια μέση 1,75 φορές μεγαλύτερη έκφραση του γονιδίου στόχου Notch μονοπάτι Hes1 στα ΚΕΠ σε σύγκριση με μη-ΚΕΠ. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ΚΕΠ διαφορικά εκφράζουν αυξημένα επίπεδα των συστατικών Notch μονοπατιού και ότι η οδός είναι αντίστοιχα ενεργοποιηθεί, όπως φαίνεται από την αυξημένη έκφραση του Hes1.

Α. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Σε διάσταση με χαμηλό πέρασμα ανθρώπινα παγκρεατικά κύτταρα καρκινικά κύτταρα βάφτηκαν με DAPI και αντισώματα για να Η2Κ, ESA, CD44 και CD24. ΫΑΡΙ θετικά τα νεκρά κύτταρα και τα κύτταρα Η2Κ θετικά ποντικού τόσο εξαλειφθεί από την ανάλυση. Ο πληθυσμός CSC (με την ESA δείκτη επιφανείας

+ /CD44

+ /CD24

+) ήταν περιφραγμένη από δύο P5 και Ρ7, και το μη-CSC πληθυσμού από P6. επίπεδα Β Αντίγραφο των συστατικών Notch μονοπατιού στο CSC σε σύγκριση με το μη-CSC λαμβάνεται με qPCR, κανονικοποιημένη σε GAPDH. Η μέση φορές αλλαγή μεταξύ όγκων αντιπροσωπεύεται από μια οριζόντια ράβδο.

Η

Notch αναστολή οδού

Με βάση την παρατήρηση ότι τα Notch σηματοδότηση συστατικά μονοπάτι είναι ρυθμισμένη προς τα πάνω σε καρκίνο του παγκρέατος και ειδικότερα παγκρεατικής CSC , μελετήσαμε περαιτέρω τη συμβολή της ενεργοποίησης Notch μονοπατιού σε παγκρεατική λειτουργία CSC. Γ-εκκριτάσης καταλύει το τρίτο στάδιο διάσπασης του υποδοχέα Notch που αποδεσμεύει το Notch ενδοκυττάρια περιοχή. Αυτό το στάδιο επιτρέπει τον υποδοχέα Notch τότε μετατοπίζονται στον πυρήνα και να ενεργοποιήσει σηματοδότηση Notch, με αποτέλεσμα την προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου-στόχου. Η αναστολή της γ-εκκριτάσης με έναν αναστολέα της γ-εκκριτάσης μπορεί έτσι μπλοκάρει την ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης Notch. Η επώαση του παγκρεατικού καρκίνου του tumorspheres με αυξανόμενες δόσεις του GSI μειωμένα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου-στόχου Notch Hes1 με δοσοεξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 2Α, Β) (ρ & lt? 0.001 έλεγχος vs.). Έχοντας επιβεβαιώσει ότι GSI μπορεί να αναστείλει Notch σηματοδότηση σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, αξιολογήσαμε την επόμενη την επίδραση της αναστολής Notch μονοπατιού ειδικά στο διαμέρισμα CSC. Παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με GSI έδειξαν σημαντική μείωση στο ΚΕΠ με το ΕΣΛ

+ /CD44

+ /CD24

προφίλ δείκτη + σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (2,76 ± 0,16% ελέγχου έναντι 1,43 ± 0,15% με GSI p = 0,013) (Σχήμα 2C, D). Το αποτέλεσμα αυτό υποδηλώνει κάποιο ρόλο για την ενεργοποίηση του Notch μονοπατιού στη συντήρηση CSC.

Α. Πρωτογενής tumorspheres παγκρεατικό καρκινικό κύτταρο (που προέρχεται από ασθενή 5) καλλιεργήθηκαν σε μέσο που περιείχε σφαίρα διαφορετική συγκέντρωση GSI όπως υποδεικνύεται για 48 ώρες πριν την ανάλυση στυπώματος Western με ένα αντίσωμα προς Hes1 ή β-ακτίνης. B. Η ποσοτικοποίηση των επιπέδων Hes1 mRNA μετά από αγωγή GSI για 48 ώρες (* p & lt? Έλεγχος .001 έναντι). Γ παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα σε μέσο σφαίρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα ελέγχου (DMSO) ή 8 μΜ GSI για 48 ώρες. FACS ανάλυση του ελέγχου των κυττάρων που έλαβαν DMSO (

πάνω πίνακα

) και GSI κατεργασμένων κυττάρων (

κάτω πίνακα

). CSC πληθυσμού με δείκτη επιφάνεια του ESA

+ /CD44

+ /CD24

αναγνωρίστηκε από αυτά τα κύτταρα και στις δύο πύλες P5 και P7 +. Δ Η ποσοτικοποίηση της ESA

+ /CD44

+ /CD24

+ πληθυσμού CSC παρακάτω DMSO και θεραπεία GSI (* p = 0,013 έναντι DMSO).

Η

Ένα από τα καθοριστικά χαρακτηριστικά του ΚΕΠ είναι αυτο-ανανέωση, που μπορεί να προσδιοριστεί in vitro με μέτρηση tumorsphere σχηματισμό μέσω πολλαπλών διόδων. Παγκρέατος ΚΕΠ ταυτίζεται με το προφίλ δείκτη ESA

+ /CD44

+ /CD24

+ έχουν την ικανότητα να σχηματίζουν σφαίρες σε μη προσκολλημένα συνθήκες που τους διαφοροποιεί από μη-καρκινικά βλαστικά κύτταρα, τα οποία δεν έχουν αυτή την ικανότητα [10]. Έχοντας παρατηρήθηκε δοσοεξαρτώμενη αναστολή της οδού Notch με αυξανόμενες δόσεις του GSI και μία προκύπτουσα μείωση στο ποσοστό των παγκρεατικών CSC, αξιολογήσαμε τη λειτουργική επίδραση επί της λειτουργίας CSC με εξέταση των επιπτώσεων της GSI σε tumorsphere δοκιμασίες. Συνεπής με ένα εξαρτώμενο αποτέλεσμα δόσης στην αναστολή Notch μονοπάτι, θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος κυττάρων με GSI προκάλεσε μία εξαρτώμενη από τη δόση μείωση στην πρωτοβάθμια συχνότητα σχηματισμού tumorsphere (Σχήμα 3Α, ρ & lt? 0,01 vs. ομάδα ελέγχου)

Α.. Ο καρκίνος του παγκρέατος κυττάρων tumorspheres καλλιεργήθηκαν για 5 ημέρες σε μέσο που περιείχε σφαίρα αναφερόμενες συγκεντρώσεις του GSI. Αντιπροσωπευτικές εικόνες του πρωτογενούς tumorspheres που αναπτύχθηκαν από το 1000 κύτταρα ανά φρεάτιο καλλιεργήθηκαν με αυξανόμενες συγκεντρώσεις GSI. Η ποσοτικοποίηση του αριθμού των πρωτογενών tumorspheres (μαύρες ράβδοι) που σχηματίζεται σε κάθε συγκέντρωση με 1000 κύτταρα σπάρθηκαν ανά φρεάτιο (* ρ & lt? 0,01 vs. μάρτυρα). σχηματισμός Δευτερογενής tumorsphere (γκρι ράβδοι) από tumorspheres αγωγή με GSI διαχωρίστηκαν σε μεμονωμένα κύτταρα, πλύθηκαν και καλλιεργήθηκαν για 5 ημέρες σε κανονικό μέσο σφαίρα χωρίς GSI (** ρ & lt? 0,01 vs. μάρτυρα). Β Tumorspheres κατεργάζεται με GSI σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις βάφονται με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) και ΡΙΤΟ-αννεξίνης V (ANV) και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής για να αξιολογηθεί η έκταση της απόπτωσης (* ρ & lt?. 0,05 8 μΜ έναντι του ελέγχου, ** p & lt? .01 16 μΜ έναντι του ελέγχου). C. Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου των παγκρεατικών tumorspheres αγωγή με έλεγχο DMSO ή GSI σε 0, 24, 48, και 72 ώρες. (* P & lt? .01 Ελέγχου έναντι). Δ παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν είτε με 8 μΜ GSI ή όχημα ελέγχου (DMSO) για 48 ώρες ενέθηκαν υποδορίως σε NOD ποντίκια /SCID. Αντιπροσωπευτικές εικόνες ποντικών εμφυτευμένων με κύτταρα από τα υποδεικνυόμενα ομάδες θεραπείας λαμβάνονται 21 ημέρες μετά την ένεση. Τα βέλη υποδεικνύουν τη θέση των όγκων. Serial όγκου μεγέθη μετρήσεις από ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με έλεγχο DMSO ή GSI σε υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία. Ν = 5 (* p & lt? .01 Ελέγχου έναντι).

Η

Για να καθοριστεί εάν η παρατηρούμενη αναστολή της tumorsphere σχηματισμού διασώθηκε μετά από παροδική έκθεση σε Notch αναστολή, αντιμετωπίζονται tumorspheres διαχωρίστηκαν σε απλά κύτταρα και την εκ νέου -cultured σε φυσιολογικά μέσα μαζικής ενημέρωσης σφαίρα χωρίς GSI. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η επίδραση στην tumorsphere σχηματισμό διατηρήθηκε ακόμα και μετά την απομάκρυνση του αναστολέα της γ-εκκριτάσης, όπως αποδεικνύεται από τη μειωμένη παραγωγή δευτερογενών tumorspheres (Σχήμα 3Α, σ & lt? 0,01 έναντι του ελέγχου).

Ένα αποτέλεσμα της GSI για απόπτωση θα μπορούσαν να εξηγήσουν αυτή την μείωση tumorsphere σχηματισμό. Πράγματι, παρατηρήσαμε αυξημένο ρυθμό απόπτωσης βασίζεται σε ΡΙ και Αηηβχίην χρώση των κυττάρων από σε tumorspheres κατεργάζεται με GSI σύγκριση με tumorspheres έλαβαν φορέα (Σχήμα 3Β, ρ & lt? 0,05 8 μΜ έναντι του ελέγχου, ρ & lt? 0,01 16 μΜ vs. έλεγχος). Αυτό το αποτέλεσμα υποδηλώνει ότι η απόπτωση συμβάλλει σε μειωμένη tumorsphere σχηματισμού ικανότητα των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με GSI. Πραγματοποιήσαμε επίσης ανάλυση κυτταρικού κύκλου σε απουσία και παρουσία του GSI που αποκάλυψε αυξημένη συσσώρευση κυττάρων σε G1 με GSI σύγκριση με τον έλεγχο (ρ & lt? 0,01). Διαταραγμένη εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου μπορεί συνεπώς να συμβάλει επίσης στη μείωση της tumorsphere σχηματισμό με αναστολή της οδού σηματοδότησης Notch με GSI (Σχήμα 3C).

Για την περαιτέρω επικύρωση αυτή παρατηρείται λειτουργικό αποτέλεσμα της in vitro αναστολή μονοπάτι Notch, μελετήσαμε αν προεπεξεργασία με GSI θα μπορούσε να αναστείλει το σχηματισμό όγκων in vivo. Σε αυτή τη δοκιμασία, μπορούμε προ-επεξεργασμένο παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα καθιερωθεί ως tumorspheres με GSI για 48 ώρες και στη συνέχεια εμφυτεύονται βιώσιμα, τα επεξεργασμένα κύτταρα υποδορίως σε ποντίκια NOD /SCID (5 ποντικοί ανά ομάδα). Τα κύτταρα που δεν υποβλήθηκαν σε αγωγή σχημάτισαν όγκους 5 ημέρες νωρίτερα από εκείνα προεπεξεργασία με GSI και μεγάλωσε σημαντικά μεγαλύτερη (ρ & lt? 0,01) από εκείνες που προέρχονται από κύτταρα προεπεξεργασμένα με GSI (Σχήμα 3D)

αναστολής Notch μονοπατιού χρησιμοποιώντας Hes1. shRNA

Όπως παρατηρείται στο Σχήμα 1Β, το επίπεδο του mRNA της Hes1, άμεσο στόχο /τελεστής του Notch-σηματοδότησης, ρυθμίζεται αυξητικά σε ΚΕΠ σε σύγκριση με μη-ΚΕΠ σε διάφορες πρωτογενείς ξενομοσχεύματα. Προς τα πάνω ρύθμιση Hes1 παρατηρήθηκε με συνέπεια σε όλη ξενομοσχεύματα, σε αντίθεση με άλλους στόχους Notch όπως Hey1 και HEYL (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Προκειμένου να εκτιμηθεί αν οι παρατηρούμενες επιδράσεις του GSI ήταν συγκεκριμένα το αποτέλεσμα της αναστολής του μονοπατιού σηματοδότησης Notch και όχι off-στόχο επιπτώσεις, χρησιμοποιήσαμε λεντοϊού κατασκευάσματα που εκφράζουν ελέγχου και Hes1 shRNA να στοχεύουν συγκεκριμένα Hes1. Νοκ ντάουν της Hes1 από shRNA επιβεβαιώθηκε τόσο στο mRNA (p & lt? .001 Ελέγχου εναντίον) και πρωτεΐνης (Εικόνα 4Α, Β) και δεν επηρέασε ανοδικά διάσπαση Notch 1 (Εικόνα 4Β). Προς τα κάτω ρύθμιση των Hes1 οδήγησε σε διαταραχή του σχηματισμού tumorsphere (Σχήμα 4C, D, p & lt? .001 Ελέγχου έναντι). Παρέχοντας περαιτέρω ενδείξεις ότι η ενεργοποίηση Notch μονοπατιού συμβάλλει στην παγκρεατική λειτουργία CSC

Α. Παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα σε μεταγωγή είτε με έλεγχο ή Hes1 shRNA συγκομίζονται μετά από καλλιέργεια για 4 ημέρες. επίπεδα Hes1 μεταγραφή ποσοτικοποιείται με qRT-PCR, κανονικοποιημένη στο GAPDH (* p & lt? .001 ελέγχου έναντι). B. κυτταρολύματα ήταν Western στυπώθηκαν για Hes1, Notch 1, σχισμένα Notch 1, ή β-ακτίνης.