Αφηρημένο

Η /β-κατενίνης σηματοδοτικό μονοπάτι Wnt είναι σημαντική για την έναρξη και την εξέλιξη του όγκου. Η χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεϊνης υποδοχέα πρωτεΐνη που σχετίζεται με-6 (LRP6) είναι ένα απαραίτητο Wnt συν-υποδοχέας για σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης και αντιπροσωπεύει μια πολλά υποσχόμενη αντικαρκινική στόχο. Πρόσφατα, η antihelminthic φάρμακο, νικλοζαμίδιο βρέθηκε να αναστέλλει σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης, αν και ο μηχανισμός δεν ήταν καλά καθορισμένη. Βρήκαμε ότι νικλοζαμίδιο ήταν σε θέση να καταστείλει την έκφραση LRP6 και φωσφορυλίωση, μπλοκάρουν συσσώρευση β-κατενίνης Wnt3A επαγόμενη, και αναστέλλουν σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης σε κύτταρα ΗΕΚ293. Επιπλέον, οι ανασταλτικές επιδράσεις του νικλοζαμίδιο επί LRP6 έκφρασης /φωσφορυλίωσης και σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης ήταν σύμφωνη σε ανθρώπινο προστάτη PC-3 και DU145 και του μαστού MDA-MB-231 και T-47D καρκινικά κύτταρα. Επιπλέον, δείξαμε ότι ο μηχανισμός με τον οποίο το νικλοζαμίδιο κατασταλεί LRP6 προέκυψε από την αυξημένη αποδόμηση όπως είναι εμφανές από ένα βραχύτερο χρόνο ημίσειας ζωής. Τέλος, αποδείξαμε ότι το νικλοζαμίδιο ήταν σε θέση να προκαλέσουν καρκίνο κυττάρου απόπτωση, και εμφανίζεται εξαιρετική αντικαρκινική δράση με IC

50 τιμές μικρότερες από 1 μΜ για του προστάτη PC-3 και DU145 και του μαστού MDA-MB-231 και T-47D καρκινικών κυττάρων . Τα IC

50 τιμές είναι συγκρίσιμες με αυτές που δείχνονται για την καταστολή των δραστηριοτήτων των σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης στον προστάτη και κύτταρα καρκίνου του μαστού. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι είναι νικλοζαμίδιο ένα μοναδικό μικρό μόριο αναστολέα σηματοδότησης Wnt /β-κατενίνης στοχεύουν στην LRP6 συν-υποδοχέα Wnt στην κυτταρική επιφάνεια, και ότι νικλοζαμίδιο έχει δυνατότητα να αναπτυχθεί ένα νέο χημειοπροληπτική ή θεραπευτικού παράγοντα για την ανθρώπινη προστάτη και του καρκίνου του μαστού .

Παράθεση: Lu W, Lin C, Roberts MJ, Waud WR, Piazza GA, Li Υ (2011) Niclosamide Καταστέλλει Καρκίνος ανάπτυξη των κυττάρων επάγοντας Wnt συν-υποδοχέα LRP6 Υποβάθμιση και αναστέλλοντας την Wnt /β-κατενίνης Μονοπάτι. PLoS ONE 6 (12): e29290. doi: 10.1371 /journal.pone.0029290

Επιμέλεια: Λιν Μέι, Ιατρικό Κολέγιο της Τζόρτζια, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 1 Σεπτεμβρίου 2011? Αποδεκτές: 24 του Νοεμβρίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 16 Δεκεμβρίου 2011

Copyright: © 2011 Lu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (RO1CA124531? να YL). Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης διαδραματίζει ένα σημαντικό ρόλο στην εμβρυϊκή ανάπτυξη και μπορεί να οδηγήσει σε σχηματισμό όγκου όταν ενεργοποιούνται ανωμάλως. Ένα χαρακτηριστικό της ενεργοποίησης /β-κατενίνης σηματοδοτήσεως Wnt είναι η σταθεροποίηση του κυτοσολίου β-κατενίνης, η οποία εισέρχεται στον πυρήνα για την ενεργοποίηση γονιδίων στόχων Wnt μέσω δέσμευσης μεταγραφικών παραγόντων του ενισχυτικού παράγοντα Τ-κυττάρων /λεμφοειδών παράγοντας (TCF /LEF) οικογένεια [ ,,,0],1], [2]. Εν απουσία συνδετήρων Wnt, τα επίπεδα β-κατενίνης αποτελεσματικά ρυθμίζεται από ένα σύμπλοκο που περιέχει υπερμοριακές αδενωματώδη πολυποδίαση coli (APC), αξίνη, και 3β συνθετάση γλυκογόνου κινάση (ΟδΚ3β). Αυτό το συγκρότημα προωθεί φωσφορυλίωση β-κατενίνης με κινάση καζεΐνης 1 (Ck1) και ΟδΚ3β. Φωσφορυλιωμένη β-κατενίνης γίνεται multi-ουβικουιτινωμένης (Ub) και υποβαθμίζεται από την πρωτεασώματος 26S. Η δράση αυτού του συμπλόκου αναστέλλεται με την πρόσδεση του Wnt με τους υποδοχείς του στην επιφάνεια του κυττάρου [1], [2]. έχουν ταυτοποιηθεί μία ποικιλία γονιδίων στόχων Wnt /β-κατενίνης, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που ρυθμίζουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την απόπτωση, μεσολαβώντας έτσι την έναρξη και την πρόοδο του καρκίνου [3] – [5]. Αδιάσειστα στοιχεία έδειξε ότι υπάρχει μια ανώμαλη αυξητική ρύθμιση αυτής της οδού σε ογκογένεση πολλών τύπων καρκίνου, και ότι η διάσπαση του σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης αποτελεί μια μεγάλη ευκαιρία για την ανάπτυξη νέων φαρμάκων για τη χημειοπρόληψη και τη θεραπεία του καρκίνου [6] – [8].

Πειράματα που διεξάγονται στη Drosophila [9], Xenopus [10] και ποντίκια [11] έδειξε ότι η πρωτεΐνη υποδοχέα που σχετίζονται με χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνης 5 (LRP5) /LRP6 (ονομάζεται βέλος στη Drosophila) δρα ως συν-υποδοχέας για συνδετήρες Wnt, οι οποίες αλληλεπιδρούν τόσο με τον υποδοχέα επτά διαμεμβράνης της οικογένειας Frizzled (Fz) και LRP5 /6 για την ενεργοποίηση του κανονικού μονοπατιού σηματοδότησης Wnt. Οι κυτταροπλασματικές ουρές των LRP5 /6, κατά την ενεργοποίηση του υποδοχέα με συνδέτη Wnt, είναι φωσφορυλιωμένα, και να προσλάβει την κυτοσολική πρωτεΐνη ικρίωμα αξίνη στη μεμβράνη. LRP6 εκφράζεται σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές γραμμές και πάνω ρυθμισμένα σε ανθρώπινους κακοήθεις ιστούς [12] – [16]. Μελέτες κατά τα τελευταία χρόνια έχουν αποδείξει ότι LRP6 είναι μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική στόχο για την ανάπτυξη νέων αντικαρκινικών φαρμάκων [6] -. [8], [15], [17], [18]

Niclosamide (εμπόριο όνομα Niclocide) είναι ένα teniacide στην antihelmintic οικογένεια η οποία είναι ιδιαίτερα αποτελεσματικά έναντι κεστωδών, ο οποίος μολύνει ανθρώπους. Niclosamide έχει εγκριθεί από την FDA για τέτοιες ενδείξεις και έχει χρησιμοποιηθεί σε ανθρώπους για σχεδόν 50 χρόνια [19] – [21]. Πιστεύεται ότι το νικλοζαμίδιο αναστέλλει την οξειδωτική φωσφορυλίωση σε μιτοχόνδρια των κεστώδη? ένα αερόβιο μεταβολισμό, την οποία πολλοί κεστώδη εξαρτώνται. Πρόσφατα, έχει καταδειχθεί ότι το νικλοζαμίδιο μπορεί μειορυθμίζει κυτοσολική έκφραση β-κατενίνης για να αναστείλει Wnt /β-κατενίνης σηματοδότηση [22], [23], και την καταστολή του παχέος την ανάπτυξη του καρκίνου και μετάσταση [23], [24]. Δεδομένου ότι ο μηχανισμός δεν ήταν καλά καθορισμένη, μελετήσαμε περαιτέρω αυτό. Δείξαμε για πρώτη φορά ότι μπορούν να αναστείλουν νικλοζαμίδιο σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης με την επαγωγή αποικοδόμησης LRP6, και ότι αυτή η δραστηριότητα είναι στενά συνδεδεμένο με δραστηριότητα επαγωγής απόπτωσης αντιπολλαπλασιαστική και της.

Αποτελέσματα

Niclosamide σηματοδότηση Wnt μπλοκ /β-κατενίνης που επάγεται από Wnt3A και LRP6 καταστέλλοντας την έκφραση LRP6 σε κύτταρα ΗΕΚ293

μη-συμπλεγμένα κυτοσολικό β-κατενίνης (ελεύθερη β-κατενίνη) είναι η δραστική μορφή της β-κατενίνης που μετατοπίζεται προς το κύτταρο πυρήνας να ενεργοποιεί παράγοντες μεταγραφής της οικογένειας TCF /LEF, που οδηγεί στην μεταγραφή των γονιδίων στόχων Wnt. Για να προσδιοριστεί εάν νικλοζαμίδιο μπορεί να αναστέλλουν σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης, κύτταρα ΗΕΚ293 υποβλήθηκαν σε θεραπεία για με Wnt3A ρυθμισμένο μέσο (CM) σε παρουσία νικλοζαμίδιο ή οχήματος (DMSO). Τα επίπεδα του κυτοσολίου ελεύθερης β-κατενίνης και της συνολικής κυτταρικής β-κατενίνης στη συνέχεια εξετάστηκαν με κηλίδωση Western. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, νικλοζαμίδιο ήταν σε θέση να εμποδίσει Wnt3A επαγόμενη κυτοσολικό ελεύθερο β-κατενίνης και συνολική συσσώρευση κυτταρικής β-κατενίνης σε κύτταρα ΗΕΚ293 σε συγκεντρώσεις τόσο χαμηλές όσο 0.6 μΜ (Σχήμα 1Α).

(Α) ΗΕΚ293 κύτταρα σε πλάκες 6 φρεατίων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Wnt3A CM (20%) και νικλοζαμίδιο σε υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 24 ώρες. Εξετάστηκαν τα επίπεδα του κυτοσολίου ελεύθερης β-κατενίνης, ολικό κυτταρικό β-κατενίνης, LRP6 και φωσφο-LRP6 (ρ-LRP6). Όλα τα δείγματα επίσης ανιχνεύθηκαν με αντίσωμα αντι-ακτίνης για την επαλήθευση ίση φόρτωση. (Β) ΗΕΚ293 κύτταρα σε πλάκες 24 φρεατίων επιμολύνθηκαν παροδικά με LRP6 πλασμίδιο ή το αντίστοιχο φορέα ελέγχου, μαζί με TOPFlash κατασκευάσει και β-γαλακτοσιδάσης εκφράζουν φορέα σε κάθε φρεάτιο. Αφού επωάστηκαν για 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με νικλοζαμίδιο ή νικλοζαμίδιο συν Wnt3A CM σε υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 24 ώρες. Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε στη συνέχεια 24 ώρες αργότερα με κανονικοποίηση προς την δραστικότητα του β-γαλακτοσιδάσης. Οι τιμές είναι μέσοι όροι των τριών προσδιορισμών με τις τυπικές αποκλίσεις που υποδεικνύεται από ράβδους σφάλματος. ** Ρ & lt? 0,01 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου χωρίς θεραπεία νικλοζαμίδιο

Η

LRP6 αποτελεί ουσιώδες Wnt συν-υποδοχέας για το μονοπάτι σηματοδότησης Wnt /β-κατενίνης και φωσφορυλίωση LRP6 είναι κρίσιμη για Wnt /β. κατενίνης ενεργοποίηση που προκαλείται από Wnt πρωτεΐνες σηματοδότησης [25] – [28]. Για να εξερευνήσετε το μοριακό μηχανισμό που διέπουν την αναστολή της σηματοδότησης Wnt /β-κατενίνης από νικλοζαμίδιο, εξετάσαμε την έκφραση LRP6 και φωσφορυλίωση μετά νικλοζαμίδιο θεραπεία. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, η αγωγή των Wnt3A CM αισθητά επαγόμενη φωσφορυλίωση ενδογενούς LRP6 σε ΗΕΚ293 κύτταρα, τα οποία καταργήθηκε με νικλοζαμίδιο θεραπεία. Είναι σημαντικό, βρήκαμε επίσης ότι το συνολικό κυτταρικό επίπεδο της ενδογενούς LRP6 ήταν σημαντικά μειωμένη μετά νικλοζαμίδιο θεραπεία σε κύτταρα ΗΕΚ293 (Σχήμα 1Α).

Για να επιβεβαιώσετε την ανασταλτική επίδραση της νικλοζαμίδιο στην έκφραση LRP6 και φωσφορυλίωση, πραγματοποιήσαμε μια Wnt /β-κατενίνης σηματοδοτήσεως δοκιμασίας ρεπόρτερ για να ελεγχθεί αν το νικλοζαμίδιο είναι σε θέση να αναστέλλουν την ενεργοποίηση του σήματος Wnt /β-κατενίνης με LRP6 και Wnt3A. ΗΕΚ293 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με LRP6 μαζί με Wnt /β-κατενίνης TOPFlash ρεπόρτερ σηματοδότηση, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με Wnt3A CM και νικλοζαμίδιο. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1 Β, η έκφραση LRP6 αύξησε την δραστικότητα TOPFlash σε κύτταρα ΗΕΚ293, η οποία ενισχύθηκε περαιτέρω όταν τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με LRP6 και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με Wnt3A CM (Σχήμα 1Β). Επιπλέον, η αυξημένη δραστηριότητα TOPFlash επάγεται από LRP6 ή LRP6 συν Wnt3A CM μπλοκαρίστηκε από νικλοζαμίδιο (Εικόνα 1Β).

Niclosamide καταστέλλει LRP6 Έκφραση και φωσφορυλίωση και Blocks Wnt /β-κατενίνης σηματοδότηση στα κύτταρα του προστάτη και του καρκίνου του μαστού

Για να προσδιοριστεί εάν νικλοζαμίδιο μπορεί να μπλοκάρει σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης στα καρκινικά κύτταρα, εξετάσαμε το επίπεδο του κυτταροπλάσματος ελεύθερης β-κατενίνης μετά νικλοζαμίδιο θεραπεία. Βρήκαμε ότι κυτοσολικό ελεύθερο επίπεδα β-κατενίνης σε ανθρώπινο προστάτη PC-3 και του μαστού MDA-MB-231 κύτταρα καρκίνου ήταν σημαντικά μειωμένες μετά νικλοζαμίδιο αγωγή (Σχήμα 2Α). Περαιτέρω, όταν το PC-3 και ΜϋΑ-ΜΒ-231 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με το /β-κατενίνης TOPFlash ρεπόρτερ σηματοδότηση Wnt, βρήκαμε ότι η θεραπεία νικλοζαμίδιο μειώνεται σημαντικά η δραστηριότητα TOPFlash σε PC-3 και ΜϋΑ-ΜΒ-231 κύτταρα ( Σχήμα. 2Β).

(Α) Ο καρκίνος του προστάτη PC-3 και κύτταρα καρκίνου του μαστού MDA-MB-231 σε πλάκες των 6-φρεατίων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με νικλοζαμίδιο στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 24 ώρες. Τα επίπεδα του κυτοσολίου ελεύθερης β-κατενίνης στη συνέχεια εξετάστηκαν με δοκιμασία σύνδεσης GST-Ε-καδερίνης. (Β) Ο καρκίνος του προστάτη PC-3 και του καρκίνου του μαστού MDA-MB-231 κύτταρα σε πλάκες 24 φρεατίων επιμολύνθηκαν παροδικά με το κατασκεύασμα λουσιφεράσης TOPFlash και β-γαλακτοσιδάσης εκφράζουν φορέα σε κάθε φρεάτιο. Μετά από 24 ώρες επώασης, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 2,4 μΜ νικλοζαμίδιο. Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε στη συνέχεια 24 ώρες αργότερα με κανονικοποίηση προς την δραστικότητα του β-γαλακτοσιδάσης. Οι τιμές είναι ο μέσος όρος της τριπλής προσδιορισμών με το Τ.Α. που υποδεικνύεται από μπάρες σφάλματος. ** Ρ & lt?. 0.01 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου

Η

Είναι γνωστό ότι axin2 είναι ένα ειδικό μεταγραφικό στόχο του /β-κατενίνης οδό σηματοδότησης Wnt, και ότι το επίπεδο έκφρασης του axin2 είναι η υπογραφή της ενεργοποίησης του Wnt /β-κατενίνης σηματοδότηση [29] – [32]. Η κυκλίνη D1 είναι ένας μεταγραφικός στόχος της σηματοδότησης Wnt /β-κατενίνης, και είναι κρίσιμη για τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων [33], [34]. Για τον προσδιορισμό των ανασταλτικά αποτελέσματα της νικλοζαμίδιο επί Wnt /β-κατενίνης σηματοδότηση σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα, εξετάσαμε την έκφραση axin2 και κυκλίνης D1 σε ανθρώπινο προστάτη PC-3 και DU145 και του μαστού MDA-MB-231 και T-47D καρκινικά κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, το νικλοζαμίδιο κατέστειλε σημαντικά axin2 και έκφραση κυκλίνης D1 σε όλες τις κυτταρικές σειρές καρκίνου του τέσσερα.

(Α) και DU145 κύτταρα καρκίνου προστάτη PC3 και MDA-MB-231 και T-47D κύτταρα καρκίνου του μαστού σε πλάκες 6-φρεατίων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με νικλοζαμίδιο σε υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 24 ώρες. Τα συνολικά κυτταρικά επίπεδα LRP6, π-LRP6, Dvl2, Axin2 και κυκλίνης D1were στη συνέχεια εξετάζονται. Όλα τα δείγματα επίσης ανιχνεύθηκαν με αντίσωμα αντι-ακτίνης για την επαλήθευση ίση φόρτωση. (Β) PC-3 και DU145 κύτταρα καρκίνου προστάτη και MDA-MB-231 και T-47D κύτταρα καρκίνου του μαστού σε πλάκες 6 φρεατίων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με νικλοζαμίδιο στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 24 ώρες. Τα κυτοσολικά επίπεδα Dvl2 εξετάστηκαν στη συνέχεια. Όλα τα δείγματα επίσης διερευνήθηκαν με αντι-ακτίνης αντίσωμα για την επαλήθευση ίση φόρτωση.

Η

Για να καθοριστεί εάν η ανασταλτική δράση του νικλοζαμίδιο επί σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης συσχετίζεται με την έκφραση LRP6, εξετάσαμε την έκφραση LRP6 και φωσφορυλίωση μετά νικλοζαμίδιο θεραπεία. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, νικλοζαμίδιο ήταν σε θέση να καταστείλει την έκφραση LRP6 και φωσφορυλίωση σε όλες τις τέσσερις κυτταρικές σειρές καρκίνου, υποδεικνύοντας ότι το νικλοζαμίδιο μπορεί καταστείλει σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης σε κύτταρα του μαστού και του καρκίνου του προστάτη με καταστολή της έκφρασης LRP6.

Niclosamide Προκαλεί LRP6 Αποδόμηση

για να ορίσετε τον μοριακό μηχανισμό που διέπουν τη δράση της νικλοζαμίδιο σε επίπεδο πρωτεΐνης LRP6, μελετήσαμε τον κύκλο εργασιών LRP6. κύτταρα PC-3 υποβλήθηκαν σε αγωγή με νικλοζαμίδιο σε 1,2 μΜ για 0, 3, 6, 10 και 24 ώρες με την παρουσία κυκλοεξιμίδιο, ένας αναστολέας της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, με την απουσία του νικλοζαμίδιο θεραπεία, LRP6 αποικοδομήθηκε με μία ημίσεια ζωή περίπου 6,9 h. Η θεραπεία με νικλοζαμίδιο ενισχυθεί σημαντικά ο κύκλος εργασιών LRP6 με μία ημίσεια ζωή περίπου 2,3 h (Σχήμα 4Α). Αυτή η συντόμευση του LRP6 ημίσειας ζωής δείχνει ότι νικλοζαμίδιο μπορεί να τονώσει την υποβάθμιση LRP6. Για να ελεγχθεί αν νικλοζαμίδιο ρυθμίζει την έκφραση LRP6 στο επίπεδο της μεταγραφής πάρα πολύ, εξετάσαμε τα επίπεδα mRNA LRP6 με πραγματικού χρόνου RT-PCR. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4Β, τα επίπεδα mRNA LRP6 δεν μεταβλήθηκαν σημαντικά μετά νικλοζαμίδιο θεραπεία σε PC-3 και ΜϋΑ-ΜΒ-231 κύτταρα. Ως εκ τούτου, νικλοζαμίδιο επαγόμενη καταστολή LRP6 οφείλεται κυρίως στην αυξημένη αποικοδόμηση LRP6.

(Α) PC-3 κύτταρα επωάστηκαν με 10 μg /ml κυκλοεξιμιδίου παρουσία Niclosamide (1,2 μΜ) ή όχημα για 0, 3, 6, 10 ή 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν, και το επίπεδο της ενδογενούς LRP6 εξετάστηκε με κηλίδωση Western. Τα δείγματα επίσης ανιχνεύθηκαν με αντίσωμα αντι-ακτίνης για την επαλήθευση ίση φόρτωση. Τα εικονοστοιχεία για κάθε ζώνη μετρήθηκαν, ομαλοποιημένη και απεικονίζονται. Τα δεδομένα είναι μέσες τιμές τριών ανεξάρτητων πειραμάτων με τις τιμές SD υποδεικνύονται με μπάρες σφάλματος. * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01 έναντι αντίστοιχης τιμής ελέγχου. (Β) PC-3 και ΜϋΑ-ΜΒ-231 κύτταρα σε πλάκες 6 φρεατίων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με νικλοζαμίδιο για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν και τα επίπεδα mRNA LRP6 προσδιορίστηκαν με πραγματικού χρόνου RT-PCR και ομαλοποιήθηκε ως προς τα επίπεδα μήνυμα του GAPDH mRNA. Όλες οι τιμές είναι ο μέσος όρος της τριπλής προσδιορισμών με το Τ.Α. που υποδεικνύεται από ράβδους σφάλματος.

Η

Niclosamide δεν έχει καμία επίδραση (Dvl2) Έκφραση-2 Dishevelled στον προστάτη και κύτταρα καρκίνου του μαστού

Έχει αναφερθεί ότι νικλοζαμίδιο ρυθμίζει προς τα κάτω συστατικά της οδού Wnt , ειδικά κυτοσολική έκφραση Dvl2, με αποτέλεσμα μειωμένη κατάντη σηματοδότησης Wnt /β-κατενίνης σε ορθοκολικούς καρκίνους [23]. Για να ελεγχθεί αν Dvl2 εμπλέκεται επίσης στην νικλοζαμίδιο επαγόμενη Wnt /β-κατενίνης αναστολή σηματοδότησης στον προστάτη και κύτταρα καρκίνου του μαστού, εξετάσαμε τόσο ολική κυτταρική και κυτοσολικές επίπεδα έκφρασης Dvl2. Απροσδόκητα, βρήκαμε ότι το νικλοζαμίδιο δεν είχε καμία επίδραση τόσο στη συνολική έκφραση κυτταρικών και κυτοσολικά Dvl2 σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου προστάτη PC-3 και DU145 και του μαστού MDA-MB-231 και T-47D (Σχήμα 3), ενώ η έκφραση LRP6 ήταν σε μεγάλο βαθμό καταστέλλεται σε η ίδια θεραπεία (Σχήμα 3Α). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι LRP6 προς τα κάτω ρύθμιση είναι το κλειδί μηχανισμός στηρίζεται νικλοζαμίδιο επαγόμενη Wnt /β-κατενίνης αναστολή σε ανθρώπινο προστάτη PC-3 και DU145 και του μαστού MDA-MB-231 και T-47D καρκινικών κυττάρων σηματοδότησης.

Niclosamide προκαλεί καρκίνο του προστάτη και του μαστού απόπτωση των κυττάρων και αναστέλλει τον καρκίνο Πολλαπλασιασμός κυττάρων

Το μονοπάτι /β-κατενίνης Wnt είναι σημαντικό για τον καρκίνο κυτταρικής απόπτωσης [35], [36]. Μετά τη διαπίστωση ότι είναι νικλοζαμίδιο ένας ισχυρός αναστολέας της σηματοδότησης Wnt /β-κατενίνης στον προστάτη και του καρκίνου του μαστού κύτταρα, μπορούμε στη συνέχεια εξετάσαμε εάν νικλοζαμίδιο είναι ικανό να επάγει απόπτωση. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α, η έκθεση σε νικλοζαμίδιο σε 1.2 και 2.4 μΜ για 24 ώρες επάγεται σημαντικά αποπτωτική κατάτμηση του DNA σε προστάτη PC-3 και DU145 και του μαστού MDA-MB-231 και T-47D καρκινικών κυττάρων.

( Α) τα καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με νικλοζαμίδιο στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 24 ώρες. Πλωτή και προσκολλημένα κύτταρα συνενώθηκαν για ανίχνευση απόπτωσης από κυτταρικό θάνατο κιτ ELISA από την Roche Diagnostics Corporation για θραύσματα του DNA ιστόνης που σχετίζονται όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. κύτταρα (Β) Cancer σε πλάκες 96-φρεατίων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με νικλοζαμίδιο για 72 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με την Κυττάρου σύστημα Titer Glo Δοκιμασία. Όλες οι τιμές είναι ο μέσος όρος των τριπλών προσδιορισμών με την s.d. που υποδεικνύεται από μπάρες σφάλματος. ** Ρ & lt?. 0,01 έναντι αντίστοιχης τιμής ελέγχου

Η

Δεδομένου ότι νικλοζαμίδιο μπορεί να μπλοκάρει σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης σε καρκινικά κύτταρα και μπορούν να επάγουν απόπτωση, εξετάσαμε έπειτα την επίδραση της νικλοζαμίδιο επί του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Β, νικλοζαμίδιο ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων με IC

50 τιμές μικρότερες από 1 μΜ και για τις τέσσερις εξετασθείσες κυτταρικές γραμμές. Τα IC

50 τιμές είναι συγκρίσιμες με εκείνες που παρουσιάζονται για να καταστείλουν τις δραστηριότητες των σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης στον προστάτη και του καρκίνου του μαστού τα κύτταρα.

Συζήτηση

Αδιάσειστα στοιχεία δείχνουν ότι υπάρχει μια ανώμαλη αυξητική ρύθμιση του /β-κατενίνης μονοπάτι Wnt στην ογκογένεση πολλών τύπων καρκίνου. Ενώ γενετικές μεταλλάξεις ορισμένων συστατικών του μονοπατιού /β-κατενίνης Wnt, όπως

APC

και

CTNNB1

, είναι σημαντικοί παράγοντες που συμβάλλουν για παχέος εντέρου, δεν είναι συνήθως ο μηχανισμός κυριαρχούν συνδέονται με πολλούς άλλους τύπους καρκίνου, όπως καρκίνοι του μαστού και του προστάτη. Αντ ‘αυτού, φαίνεται ότι απορύθμιση της Wnt /β-κατενίνης σηματοδότηση στην κυτταρική επιφάνεια οδηγεί σε ανώμαλη ενεργοποίηση αυτού του μονοπατιού σε αυτούς τους τύπους καρκίνου [3] – [5], [37]. Ως εκ τούτου, στοχευμένη αναστολή της σηματοδότησης Wnt /β-κατενίνης στην επιφάνεια του κυττάρου είναι μια λογική και πολλά υποσχόμενη νέα προσέγγιση για την θεραπεία του καρκίνου.

σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του μαστικού αδένα και καρκινογένεση [ ,,,0],4]. Triple αρνητικό καρκίνο του μαστού (TNBC? ER, PR, και HER2-αρνητικό καρκίνο του μαστού) είναι μία από τις πιο δύσκολες υποτύπους του καρκίνου του μαστού για τη θεραπεία λόγω έλλειψης μιας στοχευμένης θεραπείας. Μελέτες έχουν δείξει ότι η ενεργοποίηση σηματοδότησης Wnt /β-κατενίνης κατά προτίμηση βρίσκονται σε TNBC και συνδέεται με κακή κλινική έκβαση [38]. καρκίνο του μαστού (BLBC) μετοχές της βασικής-όπως και πολλά επικαλυπτόμενα χαρακτηριστικά με BLBC. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι LRP6 είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε ανθρώπινα TNBC ή BLBC [14] – [16]. Σε ποντικούς, η ανάπτυξη του μαστικού αδένα και MMTV-Wnt1 επαγόμενη μαστικού ογκογένεση είχαν καθυστερήσει LRP6

+/- ποντίκια [14], ενώ MMTV-LRP6 διαγονιδιακά ποντίκια ανέπτυξαν υπερπλασία του μαστικούς αδένες τους λόγω LRP6 μεσολάβηση Wnt /β- κατενίνης σηματοδότηση [39]. Μεταγραφική knockdown του LRP6 σε TNBC MDA-MB-231 κυττάρων μειώθηκε σημαντικά Wnt /β-κατενίνης σηματοδότησης, του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, και την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

[15]. Επιπλέον, έχει αποδειχθεί ότι ειδικά αντισώματα LRP6 ήταν σε θέση να εμποδίσει MMTV-Wnt1 ή MMTV-Wnt3 ξενομοσχεύματα

in vivo

[17], [18], και ότι η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη Mesd, ένας ανταγωνιστής LRP6, αξιοσημείωτα κατέστειλε την ανάπτυξη του όγκου σε MMTV-Wnt1 μοντέλα ξενομοσχεύματος [15]. Επιπλέον, σαλινομυκίνη, καρκίνος μαστού βλαστικών κυττάρων φονέων [40], αποδείχθηκε πρόσφατα ότι είναι ένας αναστολέας του σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης με διέγερση αποικοδόμησης LRP6 [41]. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι το νικλοζαμίδιο κατασταλεί έκφραση LRP6 σε TNBC MDA-MB-231 κύτταρα και τα κύτταρα ER-θετικό καρκίνο του μαστού T-47D, και ανέστειλαν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου του μαστού με IC

50 τιμές μικρότερες από 1 μΜ. Τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν την ιδέα ότι LRP6 είναι μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτικός στόχος για τον καρκίνο του μαστού, συμπεριλαμβανομένων TNBC.

Συσσωρευμένες αποδείξεις έχει επιδείξει ένα σημαντικό ρόλο για Wnt /β-κατενίνης σηματοδότηση στην ανάπτυξη και την πρόοδο του ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη [3] . Αν και δεν είναι σαφές αν LRP6 είναι επάνω ρυθμισμένο στον καρκίνο του προστάτη, έχουμε καταδείξει πρόσφατα ότι ο ανταγωνιστής LRP6 Mesd ανέστειλαν αξιοσημείωτα σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη PC-3, και κατέστειλε PC-3 κυττάρου πολλαπλασιασμός

σε vitro

και ανάπτυξη του όγκου

in vivo

[42], [43]. Στην παρούσα μελέτη, βρήκαμε νικλοζαμίδιο ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του προστάτη PC-3 και DU145 με IC

50 τιμές μικρότερες από 1 μΜ, οι οποίες είναι συγκρίσιμες με αυτές που δείχνονται για την καταστολή της έκφρασης LRP6 και τις δραστηριότητες της Wnt /β- κατενίνης σηματοδότηση σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Μαζί, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι LRP6 είναι ένας πιθανός θεραπευτικός στόχος για τον καρκίνο του προστάτη.

Οι μεταλλάξεις στο

APC

και

CTNNB1

είναι δύο σημαντικοί παράγοντες για σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης ενεργοποίηση σε ορθοκολικούς καρκίνους, ωστόσο πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι τα επίπεδα του Wnt /β-κατενίνης σηματοδότηση σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα θα μπορούσαν να διαμορφώνονται επί της επιφανείας του κυττάρου [44] – [48]. Ειδικότερα, Ueno

et al.

Απέδειξαν ότι κατσαρωμένα-7 Wnt υποδοχέα ενεργοποιεί την /β-κατενίνης μονοπάτι Wnt σε ορθοκολικό καρκίνο κύτταρα παρά την παρουσία του

APC

ή

CTNNB1

μετάλλαξη και ότι frizzled-7-siRNA μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως θεραπευτικό αντιδραστήριο για τον ορθοκολικό καρκίνο [48]. Shi

et al

. ανέφεραν ότι siRNA αποσιώπηση του Wnt-2, η οποία είναι γνωστή για την υπερέκφραση του σε καρκίνο του παχέος εντέρου, αναστέλλεται σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης και επαγόμενη απόπτωση σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου που περιέχουν κατάντη μεταλλάξεις [47]. Το εκκρινόμενο κατσαρωμένα σχετίζονται πρωτεΐνη (SFRP) οικογένεια και Wnt ανασταλτικό παράγοντα-1 (WIF-1) εκκρίνονται Wnt /β-κατενίνης ανταγωνιστές που συνδέονται προς συνδετήρες Wnt σηματοδότησης, και παρεμβαίνει με την αλληλεπίδραση Wnt-υποδοχέα. Έχει αναφερθεί ότι η απώλεια της έκφρασης της οικογένειας SFRP συσχετίστηκε με υπερμεθυλίωση υποκινητή σε καρκίνο του παχέος εντέρου [44], και ότι η αποκατάσταση της λειτουργίας SFRP σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα εξασθενίζει Wnt /β-κατενίνης σηματοδοτήσεως ακόμη και με την παρουσία του κατάντη μεταλλάξεων [45]. Ομοίως,

et al.

Ανέφεραν ότι η απώλεια του WIF-1 έκφραση συσχετίστηκε με υπερμεθυλίωση προαγωγού σε καρκίνο του παχέος εντέρου, και ότι η αποκατάσταση της WIF-1 λειτουργία, Wnt-1 siRNA, ή ένα μονοκλωνικό αντι-Wnt- 1 αντίσωμα επάγει σημαντική απόπτωση σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα τα οποία περιέχουν μεταλλάξεις κατάντη και εκφράζουν Wnt-1 [46]. Πολύ πρόσφατα, έχει αναφερθεί ότι το νικλοζαμίδιο ήταν σε θέση να αναστέλλουν σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης σε κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου, του παχέος ανέστειλε την ανάπτυξη του καρκίνου και S100A4 μεσολάβηση μεταστατικό ορθοκολικό καρκίνο [23], [24]. Το ασβέστιο πρωτεΐνη δέσμευσης S100A4 είναι ένα γονίδιο στόχος του μονοπάτι Wnt /β-κατενίνης [49]. Οι μελλοντικές μελέτες που απαιτούνται για την αντιμετώπιση της σημασία της LRP6 σε ορθοκολικό ανάπτυξη και την εξέλιξη του καρκίνου.

Η ανάπτυξη του FDA ενέκρινε φάρμακα που χρησιμοποιούνται για άλλες ενδείξεις είναι μια ελκυστική στρατηγική για την ανάπτυξη νέων φαρμάκων για τη χημειοπρόληψη ή θεραπεία του καρκίνου δίδεται τους αποδεδειγμένη ασφάλεια. Η διακοπή του σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης αποτελεί μια μεγάλη ευκαιρία για να καθορίσει εάν FDA ενέκρινε φάρμακα μπορεί να έχουν δυναμικό αντικαρκινική αποτελεσματικότητα [6] – [8]. Niclosamide είναι ένα παράγωγο salicyclamide και το φάρμακο επιλογής για τη θεραπεία της λοίμωξης πλέον ταινίας. Niclosamide εξασκεί αντιπαρασιτική δράση του στον εντερικό αυλό και απορροφάται ελάχιστα από το γαστρεντερικό σωλήνα [19] – [21]. Ωστόσο, σε ποντικούς εμφυτεύθηκαν με ανθρώπινο ορθοκολικό ξενομοσχεύματα καρκίνου, χορηγούνται από το στόμα νικλοζαμίδιο ήταν καλά ανεκτή, πέτυχε επίπεδα στο πλάσμα και στον όγκο που σχετίζεται με βιολογική δραστικότητα και οδήγησαν σε έλεγχο του όγκου [23]. Επιπλέον, νικλοζαμίδιο δεν έχει καμία σημαντική τοξικότητα κατά των μη καρκινικών κυττάρων

in vitro

και εμφανίζει κανένα προφανή παρενέργειες στα ποντίκια νικλοζαμίδιο αγωγή [23]. Έχουμε αποδείξει στο παρόν ότι είναι νικλοζαμίδιο ένας ισχυρός αναστολέας της σηματοδότησης Wnt /β-κατενίνης με επαγωγή αποικοδόμησης LRP6 σε καρκινικά κύτταρα, και εμφανίζει μια εξαιρετική αντικαρκινική δράση

in vitro

. Ως εκ τούτου, ως ένα FDA ενέκρινε antihelminthic φάρμακο, νικλοζαμίδιο θα είναι μια ενδιαφέρουσα comoound να βελτιστοποιηθεί για την αύξηση της βιοδιαθεσιμότητας του και να ελεγχθεί για

in vivo

καρκίνο προληπτικές και θεραπευτικές ρόλους της στο μέλλον.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά