Αφηρημένο

Ιστορικό

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι μία από τις άμεσες αιτίες θανάτου από καρκίνο σχετίζονται. Υψηλό επίπεδο χημειοαντίσταση είναι ένα από τα σημαντικότερα εμπόδια της κλινικής θεραπείας. Τα τελευταία χρόνια, ο καρκίνος βλαστικά κύτταρα έχουν ευρέως ταυτοποιηθεί και αναφέρεται ως η προέλευση του χημειοαντίσταση πολλαπλών τύπων συμπαγών όγκων. Αύξηση ενδείξεις δείχνουν ότι τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα βρίσκονται στα κύτταρα ικανά να σχηματίζουν holoclones συνεχώς. Ωστόσο, σε καρκίνο του παγκρέατος, τα κύτταρα που σχηματίζουν holoclone δεν έχουν χαρακτηριζόμενη ακόμα. Ως εκ τούτου, ο στόχος της παρούσας μελέτης μας ήταν να εντοπίζεται τις holoclone που σχηματίζουν τον καρκίνο του παγκρέατος βλαστικά κύτταρα και να αναπτύξει ένα in vitro σύστημα συνεχούς σχηματισμού αποικιών, η οποία θα διευκολύνει σε μεγάλο βαθμό τη μελέτη του καρκίνου του παγκρέατος βλαστικών κυττάρων.

Μεθοδολογία /Principal ευρήματα

ο καρκίνος του παγκρέατος κυτταρική σειρά BxPC3 υποβλήθηκε σε μονοκλωνικά καλλιέργεια για τη δημιουργία αποικιών. Με βάση τις μορφολογίες, οι αποικίες είχαν ταξινομηθεί και αναλύθηκαν για τις ικανότητές τους σχηματισμού δευτερογενών αποικίας, η μακροπρόθεσμη επιβίωση i

n vitro

, σχηματισμό όγκων

in vivo

, και της αντίστασης στα φάρμακα. Κυτταρομετρία ροής και ποσοτική RT-PCR διεξήχθησαν για να ανιχνεύσει το επίπεδο έκφρασης των καρκινικών βλαστικών κυττάρων που συνδέονται δείκτες κυτταρικής επιφάνειας, ρυθμιστικά γονίδια και microRNAs σε διαφορετικούς τύπους αποικιών. ταυτοποιήθηκαν και αποκαλείται ως holo-, mero-, και paraclones, στην οποία μόνο holoclones παράγεται απόγονος αποικίες όλων των τριών ειδών στη περαιτέρω περάσματα τρεις τύπους αποικιών με διακριτές μορφολογίες. Σε σύγκριση με mero- και paraclones, holoclones κατείχαν υψηλές χωρητικότητες της μακροχρόνιας επιβίωσης, την έναρξη του όγκου, και χημειοαντίσταση. Η προνομιακή έκφραση των καρκινικών βλαστικών κυττάρων που σχετίζονται με δείκτη (CXCR4), ρυθμιστικά γονίδια (BMI1, GLI1, και GLI2) και microRNAs (miR-214, miR-21, miR-221, miR-222 και miR-155) σε holoclones ήταν επίσης υπογράμμισε.

Συμπεράσματα /Σημασία

τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι τα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα-κίνηση με υψηλό επίπεδο χημειοαντίσταση εμπλουτίστηκαν σε holoclones που προέρχεται από την κυτταρική σειρά BxPC3. Γενιά holoclones μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα νέο μοντέλο για τη μελέτη καρκινικά βλαστικά κύτταρα, και αποδίδουν στην ανάπτυξη νέων αντικαρκινικών φαρμάκων

Παράθεση:. Tan L, Sui Χ, Ντενγκ Η, Ding Μ (2011) Holoclone κυττάρων που σχηματίζουν από καρκίνο του παγκρέατος κύτταρα Εμπλουτίστε Tumor Cells Έναρξη και αντιπροσωπεύουν ένα νέο μοντέλο για τη μελέτη του καρκίνου βλαστικών κυττάρων. PLoS ONE 6 (8): e23383. doi: 10.1371 /journal.pone.0023383

Επιμέλεια: Hana Algul, Τεχνικό Πανεπιστήμιο του Μονάχου, Γερμανία

Ελήφθη: 20 Μαρτίου 2011? Αποδεκτές: 15 του Ιουλίου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 3 Αυγούστου 2011

Copyright: © 2011 Tan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από ένα Υπουργείο Παιδείας επιχορήγησης (705.001) (https://www.moe.edu.cn/), Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας για Creative Ερευνητικών ομάδων (30.421.004) (https://www.nsfc.gov. cn), και 111 Project για να HD. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του παγκρέατος είναι σήμερα η τέταρτη κύρια αιτία θνησιμότητας σχετίζονται με τον καρκίνο. Λιγότερο από 5% των ασθενών επιβιώνουν για 5 χρόνια μετά τη διάγνωση με τη μέση περίοδο επιβίωσης των 4 έως 6 μήνες [1], [2]. Αν και η χειρουργική εκτομή θεωρείται ως η πιο αποτελεσματική μέθοδος θεραπείας, σκοπιμότητας της παραμένει χαμηλή λόγω των τοπικών πρόοδο και στις αρχές μετάσταση [3]. Επιπλέον, η χημειοθεραπεία θεωρείται ως σημαντική επιλογή στην κλινική θεραπεία, αλλά συνήθως παράγει κακή επιδράσεις [4], [5] .Ως εκ τούτου, είναι αναγκαίο να αποκρυπτογραφήσει τους μηχανισμούς που διέπουν το χημειοαντίσταση υψηλό επίπεδο καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος.

τα τελευταία χρόνια, ο καρκίνος βλαστικά κύτταρα (ή όπως ονομάζεται καρκινικά κύτταρα κίνηση) έχουν ταυτοποιηθεί ως αναπόσπαστο τμήμα πολλαπλών τύπων συμπαγών όγκων [6] – [11]. Καρκινικά βλαστικά κύτταρα όχι μόνο να οδηγήσει σε έναρξη και την ανάπτυξη του όγκου, αλλά και να λειτουργήσει ως την προέλευση της μετάστασης του καρκίνου, η υποτροπή και την αντίσταση ενάντια χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία [12] – [14]. Ως εκ τούτου, περαιτέρω εργασίες για τον εντοπισμό και την εξάλειψη των παγκρεατικών καρκινικά βλαστικά κύτταρα είναι ακόμη επιθυμητό να κατακτήσει με επιτυχία τα εμπόδια στην κλινική θεραπεία.

Πρόσφατες μελέτες σε ενήλικες και βλαστικά κύτταρα καρκίνου έχουν συσχετίσει ιδιότητες των βλαστικών κυττάρων με τη μορφολογία των αποικιών που δημιουργούνται από μονά κύτταρα [15] – [20]. Σύμφωνα με τα κριτήρια του μεγέθους της αποικίας και οριακά ορίζεται από πρωτοποριακά έργα σε κυτταρικές σειρές κερατινοκυττάρων, οι αποικίες είχαν ταξινομηθεί και χαρακτηριστεί ως holoclones, meroclones και paraclones [21]. Παρόμοια με τα βλαστικά κύτταρα στους θύλακες των τριχών [15], οφθαλμικής [16], και επιδερμικά [17], ο καρκίνος βλαστικά κύτταρα του προστάτη [19] και του γλοιώματος [20] καταδείχθηκαν να διαμένουν σε holoclones. Holoclones που προέρχεται από καρκίνο του προστάτη κυτταρική γραμμή PC3 ξεκίνησε σχηματισμό όγκων σε ποντίκια NOD /SCID αποκλειστικά και πολλαπλασιάστηκαν in vitro εύρωστα [19]. Κύτταρα σε holoclones που προέρχονται από κυτταρική σειρά γλοιώματος U251 ήταν σε θέση να παράγουν σφαίρες όγκων σε κατάσταση ελεύθερης ορού και διαφοροποιούνται σε γενεές των νευρώνων, αστροκυττάρων και ολιγοδενδροκυττάρων [20]. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα βλαστικά γονίδια που σχετίζονται κυττάρων εντόνως εκφρασμένο σε holoclones προέρχονται τόσο από τον καρκίνο του προστάτη και κυτταρικές σειρές γλοιώματος [19], [20]. Αυτά τα στοιχεία πρότειναν ότι διάδοση του holoclones από καρκινικές κυτταρικές γραμμές θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως μια εναλλακτική στρατηγική για τον εμπλουτισμό των καρκινικών βλαστικών κυττάρων [20]. Ωστόσο, στον καρκίνο του παγκρέατος, holoclones δεν έχουν εντοπιστεί και συσχέτιση με τις ιδιότητες των καρκινικών βλαστικών κυττάρων δεν έχει προσδιοριστεί ακόμα.

Στην παρούσα μελέτη, απηύθυνε την ετερογένεια σε καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές σειρές BxPC3 [22] και PC3 [23] με βάση την μορφολογία των αποικιών που προέρχονται από τα καρκινικά κύτταρα και μόνο και απέδειξαν ότι ιδιότητες καρκίνος βλαστοκυττάρων εμπλουτίστηκαν σε holoclones αποκλειστικά. Επιπλέον, το έργο μας έδειξε το holoclone σχηματίζοντας κύτταρα αποδίδουν χημειοαντίσταση, η οποία ανέφερε πιθανή αξία της για την ανάπτυξη χημειοθεραπευτικά φάρμακα.

Αποτελέσματα

Ο καρκίνος του παγκρέατος κύτταρα εμφανίζουν ετερογενή ικανότητα να παράγουν διαφορετικές μορφολογίες αποικία στην κλωνική πολιτισμό

ο πρώτος στόχος της μελέτης μας ήταν να διαπιστωθεί αν υπάρχει η ποικιλομορφία των κλωνική μορφολογίες στον πληθυσμό του παγκρέατος καρκινικών κυττάρων, έτσι ώστε το μονοκλωνικό καλλιέργεια διεξήχθη (Εικ. 1Α) με καρκίνο του παγκρέατος κυτταρική σειρά BxPC3. Αυτή η κυτταρική γραμμή προήλθε από την πρωτογενή τόπους του παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα και με χαρακτηριστική μορφολογία επιθήλιο. Μετά επιστρώθηκαν, ένα μέρος των κυττάρων πέθαναν, ενώ οι άλλοι κρατήθηκαν βιώσιμη και σχηματίζονται αποικίες μέσα σε 3 ημέρες μετά την επίστρωση και έδειξε ένα φάσμα διακριτό μορφολογιών μετά από 5-7 ημέρες. Με βάση τις διαφορές στη μορφολογία, οι αποικίες ορίστηκαν ως holoclones, meroclones και paraclones (Εικ. 1 Β, C, D) [21]. Holoclones ήταν συστάδες των ομογενών, των μικρών και σφικτά συσκευασμένα κύτταρα με την τακτική και ομαλή όρια αποικία (Εικ. 1Β). Paraclones αποτελούνταν των διάσπαρτων και μεγαλύτερων κυττάρων με κατακερματισμένο όρια (Εικ. 1D). Meroclones εμφάνισε ενδιάμεση μορφολογίες (Εικ. 1 C). Αυτά mophologies διατηρήθηκαν όταν το μέγεθος των αποικιών αυξήθηκε. Με παράλληλες δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν με PC3 κυτταρική γραμμή, ταυτοποιήθηκαν τρεις τύποι αποικιών (Σχ. S1A, B, C) με τα μορφολογίες παρόμοιες με εκείνες που προέρχονται από την κυτταρική σειρά BxPC3. Η σύνθεση αποικία ήταν παρόμοια στις δύο αυτές κυτταρικές σειρές: σχεδόν το ήμισυ των αποικιών ήταν meroclones, ενώ holoclones και paraclones αντιπροσώπευαν περίπου 20-30% από τις αποικίες που σχηματίζονται (Σχήμα 1Ε, Σχ S1D..). Ως εκ τούτου, τα δεδομένα αυτά έδειξαν την ποικιλία των κλώνων μορφολογίες σε πληθυσμό παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων.

(Α) Σχηματική απεικόνιση της διαδικασίας του απορρέει κλωνικών καλλιεργειών BxPC3 κυττάρων και λειτουργικές δοκιμασίες. Κάτω πάνελ παρουσιάζουν αντιπροσωπευτικά holoclones (Β), meroclones (C) και paraclones (D) από BxPC3 πολιτισμούς. Όλες οι φωτογραφίες που ελήφθησαν στις 2 εβδομάδες μετά την επίστρωση (Bar, 100 μικρά). Σε αυτό το χρονικό σημείο, κάθε τύπος των αποικιών μετρήθηκε (Ε). Τα αποτελέσματα από επαναλαμβανόμενα πειράματα (η = 4) παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± SEM σε ιστόγραμμα.

Η

Διαφορετικοί τύποι αποικιών κατέχουν διαφορική ικανότητες για την αυτο-ανανέωση και μακροχρόνιο πολλαπλασιασμό

δεδομένου ότι η κλωνική μορφολογική ποικιλία σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα είχαν ενδείκνυται, θα πρέπει να αξιολογηθεί η δευτερεύουσα ικανότητα σχηματισμού αποικιών. Για το σκοπό αυτό, τα κύτταρα από τους τρεις τύπους αποικίες απομονώθηκαν και ανακαλλιεργήθηκαν με χαμηλή πυκνότητα (κάτω από 200 κύτταρα ανά φρεάτιο της πλάκας 6 φρεατίων) για αρκετά περάσματα. Στο αρχικό πέρασμα, οι holoclones δημιουργούνται παρόμοιες αναλογίες του παραγώγου holoclones και meroclones (σχεδόν 50% το καθένα), με περιορισμένο αριθμό (λιγότερο από 10%) του paraclones (Εικ. 2Α, το Σχ. S2A). Παράλληλα προσδιορισμούς, κύτταρα που απομονώνονται από meroclones παρήγαγε μια σπάνια αριθμό δευτερευόντων holoclones αλλά ένα πολύ υψηλότερο ποσοστό paraclones (Εικ. 2C, Σχ. S2C). Ωστόσο, σπάνια κύτταρα paraclones κρατήθηκαν βιώσιμη μετά την εκ νέου επίστρωση και παράγεται μόνο δευτερεύουσα paraclones σε χαμηλή συχνότητα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για να ακολουθήσει την αναπτυξιακή μοίρα των αποικιών, επελέγησαν τυπικές αποικίες διακριτών τύπου για μακροχρόνια καλλιέργεια. Κύτταρα σε επιλεγμένες αποικίες περάστηκαν συνήθως σε κλωνική πυκνότητα κάτω από κοινή κατάσταση. Για αποικίες που προέρχονται από κυτταρική σειρά BxPC3, οι 12 holoclones ήταν βιώσιμα και πολλαπλασιάστηκαν σθεναρά, ενώ 12 από 18 meroclones και 13 15 paraclones σταδιακά ματαιώθηκε (Εικ. 3) κατά τη διάρκεια της παράλληλης καλλιέργειας 140 ημέρες. Ομοίως, κατά τη διάρκεια του περάσματος 60 ημερών των αποικιών που προέρχονται από PC3 κυτταρική γραμμή, 8 από 9 holoclones ήταν σε ισχυρή επέκταση, ενώ 4 από 8 meroclones και 6 από 8 paraclones μειώθηκε σε σύντομο χρονικό διάστημα (Εικ. S3). Είναι ενδιαφέρον, μόνο τα κύτταρα που προέρχονται από holoclones αναγεννηθεί το πλήρες φάσμα των φαινοτύπων συνταγματάρχη μορφολογικών και αποκατέστησε τις αναλογίες κάθε τύπου αποικίες (Εικ. 2Β, Σχ. S2B) παρόμοια με τα ποσοστά που παρατηρούνται σε μη ταξινομημένα γονικές κυτταρικές σειρές υπό καλλιέργεια χαμηλής πυκνότητας. Με βάση την διακριτή εμφάνιση εκτίθενται ανωτέρω, η ικανότητα των μακροπρόθεσμων αυτο-ανανέωση

in vitro

διέμεναν κυρίως σε holoclones, αλλά όχι meroclones ή paraclones.

κύτταρα που απομονώνονται από μονές αποικίες απλώθηκαν σε χαμηλή πυκνότητα υπό κοινή κατάσταση. (Α) στο αρχικό πέρασμα, holoclones (n = 8) παράγεται κυρίως παρόμοιες συχνότητες των απόγονος holoclones και meroclones, ενώ δημιουργήθηκαν πολύ χαμηλότερα ποσοστά paraclones. (Β) Μετά από διόδους του έναν ακόμη μήνα, holoclones (n = 8) δημιουργείται το πλήρες φάσμα των αποικιών απογόνων σε συχνότητες παρόμοιες με εκείνες που διατηρούνται σε μη ταξινομημένα γονικές κυτταρικές σειρές. (C) Meroclones (n = 8), κυρίως παράγεται paraclones και meroclones, και λίγα holoclones παρήχθησαν.

Η

Holoclones (n = 12, κόκκινη γραμμή), meroclones (n = 18, πράσινη γραμμή) και paraclones (n = 15, μπλε γραμμή) καλλιεργήθηκαν σε κοινή κατάσταση για 20 εβδομάδες και καταγράφηκαν χρόνο ζωής του κάθε αποικία. Οι περισσότεροι από τους meroclones και paraclones ματαιώθηκαν σταδιακά, ενώ όλοι οι holoclones παρέμειναν βιώσιμα (p & lt? 0,01).

Η

Holoclones, αλλά δεν meroclones ή paraclones, κινεί το σχηματισμό όγκων και σειριακή μεταμόσχευση υποστήριξη όγκου σε NOD /SCID ποντίκια

για την ευρωστία της holoclones είχε δείξει

in vitro

, ήταν σημαντικό να αξιολογηθεί η

in vivo

tumorgenecity τριών τύπων αποικιών. Προκειμένου να εκτιμηθεί η ικανότητα σχηματισμού όγκου του κάθε τύπου αποικίας, διεξήχθησαν σειριακές δοκιμασίες μεταμόσχευση. Πρώτον, μη ταξινομημένα κύτταρα BxPC3 άρχισε σχηματισμός όγκου σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο. 100% των ποντικών που ενέθηκαν με 10

6 ή 10

5 BxPC3 κύτταρα ανέπτυξαν όγκους ξενομοσχεύματος μετά από 14 ημέρες, και τα ποντίκια ενέθηκαν με 10

4 ή 10

3 κύτταρα επίσης ανέπτυξαν όγκους ξενομοσχεύματος μετά από 21 ημέρες με 100% απόδοση (Πίνακας 1). Μετά από αυτό, τρία holoclones, τρεις meroclones, και δύο paraclones επιλέχθηκαν για μεταμόσχευση. 10

4 holoclone κύτταρα που σχηματίζονται ψηλαφητούς όγκους στο 100% των ποντικών (15 από 15 ποντίκια) εντός 18 ημερών. Αντιθέτως, καμία ορατή όγκοι αποτελούνται από κύτταρα από mero- ή paraclones (0 από 36 ποντικούς, 10

4~10

5 κύτταρα ανά ποντικό) εντός 2 μηνών (Πίνακας 1). Σε ένα περαιτέρω βήμα, τα κύτταρα σε όγκους ξενομοσχεύματος που προέρχονται από holoclones ήταν συνέχεια καθαρίζεται και εκ νέου μεταμοσχεύονται σε ποντίκια NOD /SCID (10

4 κύτταρα ανά ποντικό). Εντός 18 ημέρες, όλα τα ποντίκια λήπτη (18 από 18 ποντίκια) ανέπτυξαν ψηλαφητούς όγκους (Πίνακας 1). Serial δοκιμασίες μεταμόσχευση πραγματοποιήθηκαν επίσης σε PC3 κυτταρική γραμμή. Χωρίς διαλογή γονική κυτταρική γραμμή, 3 holoclones, 2 meroclones, και 2 paraclones απασχολήθηκαν. Όλα τα holoclones προέρχεται από PC3 κυτταρική σειρά ήταν σε θέση να αναπτύξει όγκο αποκλειστικά σε σύντομο λανθάνουσα κατάσταση (Πίνακας S3)

Η

Exnograft όγκους που προέρχονται από μη ταξινομημένα BxPC3 κυτταρική σειρά και το αντίστοιχο holoclones αναλύθηκαν με H & amp?. Χρώσης Ε. Τα ιστολογικά χαρακτηριστικά δοκίμια όγκου ξενομοσχεύματος οπτικοποιήθηκε και έδειξε υψηλό επίπεδο ομοιότητας μεταξύ των δειγμάτων όγκου από αδιαχώριστα κυτταρική σειρά (Σχ. S4A, Β) και οι αντίστοιχες holoclones (Εικ. S4C, D).

Με τη σημαντική διαφορά της ικανότητας σχηματισμού όγκων μεταξύ των τύπων distict αποικιών, προτάθηκε ότι η ικανότητα του όγκου έναρξη

in vivo

εμπλουτίστηκε με holoclones παρά meroclones ή paraclones.

Καρκίνος βλαστικά κύτταρα που σχετίζονται με δείκτες επιφάνειας, γονίδια και microRNAs εκφράζονται διαφορικά σε διαφορετικούς τύπους αποικιών

Με βάση τα χαρακτηριστικά του holoclones

in vitro

και

in vivo

, ήταν απαραίτητο με την ανάλυση της έκφρασης του κυττάρου -παραγαδιάρικα δείκτες και οι ρυθμιστικές αρχές που σχετίζονται με τον καρκίνο βλαστικών κυττάρων σε τρεις τύπους αποικιών. Ως εκ τούτου, κυτταρομετρία ροής και ποσοτική RT-PCR χρησιμοποιήθηκαν ταυτόχρονα. δοκιμασίες κυτταρομετρίας ροής έδειξε ότι CD133 ήταν αρνητική (Σχ. 4Α) και CD44 ήταν θετική (Εικ. 4C) σε holoclones, meroclones και paraclones. Όλοι οι τύποι των αποικιών που περιέχονται τόσο CXCR4

+ και CXCR4

– κύτταρα, ωστόσο, οι εκατοστιαίες αναλογίες των CXCR4

+ κυττάρων ήταν πολύ υψηλότερες σε σχέση με το holoclones meroclones και paraclones (Σχήμα 4Β).. Η ένταση CD24 (Εικ. 4D, Εικ. S5) ήταν σημαντικά ισχυρότερη σε paraclones από ό, τι στην holoclones. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με ποσοτική RT-PCR.

CD133

δεν ήταν ανιχνεύσιμη και

CD44

έδειξαν λιγότερο από 1,3 φορές έως ρύθμιση στο holoclones από ό, τι στο paraclones (Εικ. 4Ε). Ωστόσο, η έκφραση του

CD24

σε holoclones ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω για πάνω από 5-πλάσια από ό, τι σε paraclones (Σχ. 4F). επίπεδο έκφρασης του

CXCR4

ήταν περίπου 3 φορές υψηλότερη σε holoclones από ό, τι στο paraclones (Σχ. 4G). Επιπλέον, έκφραση του

ΔΜΣ-1

,

GLI1

,

GLI2

,

GLI3

και μια λίστα που σχετίζονται με τον καρκίνο microRNAs επίσης ποσοτικά.

ΔΜΣ-1

,

GLI1

και

GLI2

ήταν επάνω-ρυθμίζονται σε holoclones όχι σε paraclones, ενώ το επίπεδο έκφρασης του

GLI3

δεν ήταν σημαντικά άλλαξε μεταξύ των τριών τύπων αποικιών (Σχ. 5Α). Τα microRNAs έγιναν έδειξαν διαφορικά εκφρασμένων και συγκεντρωμένοι σε δύο ομάδες: μία ομάδα ήταν ρυθμισμένο σε holoclones, συμπεριλαμβανομένων των

miR-214

,

miR-21

,

miR-221

,

miR-222

, και

miR-155

(Σχήμα 5Β.)? η άλλη ομάδα ήταν κάτω-ρυθμίζονται σε holoclones, συμπεριλαμβανομένων των

Ας-7α

και

miR-30c

,

miR-30β

,

miR-30a

(Εικ. 5C). Η διαφορική έκφραση των δεικτών και οι ρυθμιστικές υποδηλώνουν επίσης την τάση που πηγάζουν ιδιότητες κυττάρων διακατέχεται από holoclones αντί άλλους δύο τύπους αποικιών.

κύτταρα που απομονώνονται από holoclones, meroclones και paraclones εξετάστηκαν με κυτταρομετρία ροής για τους δείκτες κυτταρικής επιφάνειας του καρκίνου του βλαστικών κυττάρων. CD133 (Α) ήταν εντελώς αρνητικό σε όλους τους τρεις τύπους αποικιών. Η CXCR4

+ κύτταρα (Β) ήταν ανιχνεύσιμα σε όλους τους τύπους των αποικιών αλλά σημαντικά εμπλουτισμένο σε holoclones. CD44 (C) ήταν έντονα θετικά και με μικρή διαφορά μεταξύ των διακριτών τύπων αποικιών, ενώ CD24 (D) εκφράστηκε σε υψηλότερο επίπεδο σε σχέση με το paraclones holoclones. επίπεδο του mRNA της

CD44

(Ε),

CD24

(F) και

CXCR4

(G) σε holo-, mero- και paraclones επίσης ποσοτικά με πραγματικό time PCR (

GAPDH

ως εσωτερική αναφορά) και παρόμοιες τάσεις έδειξαν (*, p & lt? 0,05).

η

BMI1

,

GLI1

και

GLI2

ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω σε holoclones, ενώ η έκφραση του

GLI3

δεν έδειξε καμία σημαντική αλλαγή στους διαφορετικούς τύπους των αποικιών (Α). Τα microRNAs ήταν συγκεντρωμένα σε δύο ομάδες, οι οποίες ήταν αυξημένα (Β) και καταπιεσμένες (C) σε holoclones αντίστοιχα. Όλες οι τιμές έκφραση σε διαφορετικούς τύπους αποικιών ομαλοποιήθηκαν κατά εκείνων των paraclones (*, p & lt? 0,05).

Η

Holoclones εμφανίζουν πολύ υψηλότερο από ό, τι χημειοαντίσταση meroclones και paraclones

Είναι γνωστό ότι χημειοαντίσταση είναι μία από τις σημαντικότερες ιδιότητες των καρκινικών βλαστικών κυττάρων, τόσο εδώ ζητήσαμε αν οι holocoloes διαθέτουν αυτή την ικανότητα. Ως εκ τούτου, τα κύτταρα που απομονώθηκαν από αυτούς τους τρεις τύπους αποικίες και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με γεμκιταβίνη και 5-FU κάτω από αυξανόμενη συγκέντρωση. Μεταξύ όλο το εύρος συγκέντρωσης που εξετάστηκε, τα ποσοστά επιβίωσης των κυττάρων που προέρχονται από holoclones ήταν σημαντικά υψηλότερες από εκείνες από meroclones και paraclones (Σχ. 6Α, Β). Το IC

50 αξία των 5-FU ήταν 2,59 × 10

3 nM σε holoclones, η οποία ήταν πολύ υψηλότερες από εκείνες των meroclones (1,24 × 10

2 nM) και paraclones (15.10 nM). Για την ανάλυση της αλλαγής γονιδιακής έκφρασης που προκαλείται από φαρμακευτική αγωγή, ποσοτική RT-PCR διεξήχθη με το κύτταρο σε θεραπεία με φάρμακα. Μετά τη θεραπεία με 50 nM 5-FU για 12 ώρες, η έκφραση των μεταφορέων ναρκωτικά πρόσληψη (

SLC28A1

,

SLC28A2

,

SLC28A3

,

SLC29A1

,

SLC29A2

,

SLC29A3

) ήταν όλα πάνω ρυθμισμένα σε paraclones με καμία επίδραση στην holoclones ως επί το πλείστον (μόνο

SLC28A1

ήταν κάτω-ρυθμίζονται περίπου 2-φορές) (Εικ. 6C) .Με την παράλληλη θεραπεία της γεμσιταβίνης, ανιχνεύθηκαν παρόμοιες απαντήσεις αυτών των γονιδίων (Εικ. 6C). Στο σύνολό τους,

SLC28A1 /Α2

και

SLC29A1 /A3

ήταν συνήθως πάνω ρυθμισμένα πιο δραματικά σε paraclones από ό, τι στο holoclones μετά από θεραπείες γεμσιταβίνης ή 5-FU. Αυτή η διαφορική απόκριση θα μπορούσε να είναι, τουλάχιστον εν μέρει, invovled στην παραλλαγή του χημειοαντίσταση μεταξύ τριών τύπων αποικιών

κύτταρα που απομονώνονται από holoclones, meroclones και paraclones υποβλήθηκαν σε θεραπεία με χημειοθεραπευτικά φάρμακα αυξανόμενης συγκέντρωσης:. 1, 5, 10 , 50, 100 ηΜ γεμκιταβίνης (Α) ή 5, 10, 50, 100, 500 ηΜ 5-FU (Β). Για κάθε τιμή συγκέντρωσης, τρία φρεάτια οριστεί ως επανάληψη σε ένα μόνο πείραμα και τρεις φορές αντιπροσωπευτικών πειράματα. Οι αλλαγές έκφραση των μεταφορέων εισαγωγής χημειο-φαρμάκου προσδιορίστηκαν ποσοτικά σε holoclones και paraclones αντίστοιχα μετά σε επεξεργασία με 50 ηΜ χημειο-φάρμακο για 12 ώρες. (C) (*, p & lt? 0,05).

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, αποδείξαμε τις ιδιότητες των βλαστικών κυττάρων του holoclones και ανέφερε ότι μια ομάδα που συνδέεται γονιδίων βλαστικών κυττάρων και microRNAs έχουν κατά προτίμηση εκφράζεται σε holoclones. Επιπλέον, αποκάλυψε ένα χημειοαντίσταση υψηλό επίπεδο holoclones και πρότεινε την πιθανή αξία των holoclones στη μελέτη των βλαστικών κυττάρων του καρκίνου.

Είμαστε η πρώτη που δείχνει την ετερογένεια στην clonoal μορφολογίες των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος. Παρόμοια με την συμπεριφορά του κερατινοκυττάρων [21] και πολλαπλές καρκινικές κυτταρικές γραμμές [18] – [20], όταν τα κύτταρα του BxPC3 και PC3 κυτταρική σειρά καλλιεργήθηκαν μονοκλωνικά, αναπτύχθηκαν μια σειριακή αποικιών με διαφορετικές μορφολογίες (Εικόνα 1Α).. Με βάση την μορφολογική ποικιλία, holoclones (Εικ. 1Β, Εικ. S1 Α), meroclones (Σχ. 1C, το Σχ. S1B) και parclones (Εικ. 1 D, Εικ. S1c) μπορούν να αναγνωρίζονται εύκολα.

Επιπλέον , τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι τα βλαστικά-όπως τα καρκινικά κύτταρα εμπλουτίστηκαν σε holoclones παρά mero- ή paraclones. Κατά τη διάρκεια του

in vitro

πολλαπλασιασμό, τα κύτταρα σε holoclones δημιουργείται ένα υψηλό ποσοστό των holoclones απογόνους κατά τον πρώτο γύρο της διόδου (Σχ. 2Α, το Σχ. S2A). Μετά από περισσότερα περάσματα, τα κύτταρα στο holoclones δημιουργούνται αποικίες με πλήρη γκάμα μορφολογικά χαρακτηριστικά παρόμοια με εκείνη που προέρχεται από μη ταξινομημένα γονικές κυτταρικές σειρές (Εικ. 2Β, Σχ. S2B). Ωστόσο, meroclones δημιουργήσει ένα περιορισμένο επίπεδο holoclones και πολύ υψηλότερα ποσοστά paraclones (Σχ. 2C, Σχ. S2C). Κατά τη διάρκεια της μακράς διάρκειας των αποσπασμάτων

in vitro

, holoclones έδειξε περισσότερο την ευρωστία και τη συνεχή πολλαπλασιασμό, ενώ mero- και paraclones μειώθηκε γρήγορα (Εικ. 3, Εικ. S3). Με τις διαφορές που φαίνεται παραπάνω, διαφορετικοί τύποι αποικιών διέθετε διαφορική ικανότητα της αυτο-ανανέωση και την ικανότητα πολλαπλασιασμού. Το πιο σημαντικό, holoclones σειριακά ξεκίνησε την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

ενώ mero- και paraclones δεν το έκανε (Πίνακας 1, Πίνακας S3), η οποία θεωρείται ως το ευρέως χρησιμοποιούμενο χρυσό πρότυπο για την ταυτοποίηση των καρκινικών βλαστικών κυττάρων. Ως απαραίτητο συμπλήρωμα, οι όγκοι ξενομοσχεύματος που προέρχονται από BxPC3 holoclones έδειξε παρόμοια ιστολογικά χαρακτηριστικά με αυτά του ιστού του όγκου που προέρχεται από μη ταξινομημένα BxPC3 κυτταρική σειρά (Εικ. S4). Σε καρκίνο του προστάτη κυτταρικές γραμμές PC3 [19] και DU145 [24], παρόμοια χαρακτηριστικά του holoclones

in vitro

και

in vivo

είχαν υποδεικνύεται και υπηρέτησε ως αποδείξεις για να υποστηρίξει την ιδιότητα των βλαστικών κυττάρων του holoclones.

Επιπλέον, η έκφραση δεικτών κυτταρικής επιφάνειας, τα γονίδια και τα microRNAs μεταξύ διακριτούς τύπους αποικιών πρότεινε επίσης την ιδιότητα των βλαστοκυττάρων του holoclones. Πρώτον, οι δείκτες κυτταρικής επιφάνειας των βλαστικών κυττάρων καρκίνου του παγκρέατος, CD44, CD24, και CD133, αξιολογήθηκαν. Βασίζεται σε δύο ανεξάρτητες εκθέσεις, παγκρεατικά καρκινικά βλαστικά κύτταρα εντοπίστηκαν ως πληθυσμός των CD44

+ CD24

+ ESA

+ ή CD133

+, ωστόσο, αυτές οι δύο πληθυσμοί έδειξαν μικρή επικάλυψη μεταξύ τους [10 ], [11]. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα του κυτταρομετρία ροής (Σχ. 4Α, C) και ποσοτική RT-PCR (Σχ. 4Ε) δοκιμασίες, η έκφραση του

CD133

(μη ανιχνεύσιμη) και

CD44

(υψηλής έκφρασης) ήταν τόσο undistinguishable μεταξύ τριών τύπων αποικιών. Η έκφραση του

CD24

ήταν προς τα κάτω σε holoclones από ό, τι στο paraclones (Σχ. 4F, Εικ. S5), η οποία είναι δυνητικά κυμαινόταν από πρώην έκθεση [10]. Παρόμοια με την απροσδόκητη κατάσταση έκφρασης του

CD133

[11], [25] και

CD24

[10] του παγκρέατος κυτταρικές σειρές BxPC3 και PC3, αποκλίνουσα έκφραση του

CD133

σε έναν ορισμένο κυτταρική γραμμή επίσης αναφερθεί σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών OVCAR3 και SKOV3 [26] – [28], η οποία μπορεί, τουλάχιστον εν μέρει, οφείλεται σε κάποια απροσδιόριστο μεταβολές που προκαλούνται κατά τη διάρκεια μακροχρόνιας καλλιέργειας

in vitro

. Επιπλέον, έχουν CD133- καρκινικά βλαστικά κύτταρα εντοπίστηκαν σε γλοίωμα και πρότεινε ως πιο αρχέγονη οδηγείται δύναμη της ανάπτυξης του όγκου από τον πληθυσμό των κυττάρων CD133 + [29]. Για περαιτέρω εκτίμηση των ιδιοτήτων των βλαστικών κυττάρων του holoclones, ποσοτικοποιήθηκαν μια σειρά των γονιδίων και mciroRNAs σχετίζονται με τον καρκίνο βλαστικά κύτταρα. Μεταξύ των γονιδίων τα πάνω ρυθμισμένα σε holoclones,

BMI1

(Εικ. 5Α) έχει δειχθεί ότι παίζουν σημαντικό ρυθμιστικό ρόλο στην αυτο-ανανέωση των νευρικών [30], του μαστού [31], αιμοποιητικά [32] βλαστικά κύτταρα και πολυ τύποι καρκίνου βλαστικών κυττάρων [31], [33], [34]. Τι περισσότερο,

BMI1

υποκινητής έχει χρησιμοποιηθεί για να οδηγήσει EGFP σαν ένα ενδοκυτταρικό δείκτη για τον εμπλουτισμό αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων [35]. Παρόμοια με τα αποτελέσματά μας,

BMI1

είχε πρόσφατα ανέφεραν κατά προτίμηση εκφράζεται σε holoclones προέρχεται από κυτταρική σειρά γλοιώματος [20]. Η ανύψωση του

GLI1

και

GLI2

σε holoclones (Εικ. 5Α) υποδηλώνει υψηλότερη δραστηριότητα της Hedgehog σηματοδότησης, η οποία ήταν σύμφωνη με το υψηλότερο επίπεδο του

ΕΛΕΡΠΕ

έκφρασης σε CD44

+ CD24

+ ESA

+ καρκινικά βλαστικά κύτταρα που απομονώνονται από ανθρώπινα πρωτογενή παγκρέατος δείγματα καρκίνου [20]. Το σηματοδοτικό μονοπάτι Hedgehog παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στη διατήρηση καρκινικά βλαστικά κύτταρα του μαζικού [31] και του εγκεφάλου [36].

CXCR4

, ο κεντρικός μεσολαβητής της μετάστασης, ήταν ρυθμισμένη σε holoclones (Σχ. 4Β, G) πάρα πολύ. Σε CD133

+ παγκρεατικά καρκινικά βλαστικά κύτταρα, ο CXCR4

+ υποπληθυσμός είναι πιο επεμβατική από αυτόλογη CXCR4

– υποπληθυσμό [11]. Μεταξύ των microRNAs up-ρυθμίζονται σε holoclones,

miR-214

,

miR-221

,

miR-222

και

miR-155

(Εικ. 5Β) έχουν συνήθως υπερεκφράζεται στον καρκίνο του μαστού βλαστικά κύτταρα [37]. Ωστόσο,

Let-7a

(Σχ. 5C), η οποία ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα κάτω σε holoclones, παίζει αρνητικό ρόλο στην αυτο-revewal, ογκογονικότητα, και χημειοαντίσταση των βλαστικών κυττάρων του καρκίνου του μαστού [12]. Παρομοίως, miR-30a /b /c (Εικ. 5C) επίσης υπερεκφράζονται σε paraclones. Στον καρκίνο του μαστού, αυτό το οικογενειακά microRNA αναστέλλει αυτο-ανανέωση των βλαστικών κυττάρων, προκαλεί απόπτωση, και μειώνει την μετάσταση στον πνεύμονα [38].

Υψηλότερο επίπεδο χημειοαντίσταση επισημάνθηκε στην holoclones όχι σε meroclones και paraclones (Εικ . 6Α, Β), η οποία είναι συνεπής με την υποστηρικτικό ρόλο των καρκινικών βλαστικών κυττάρων σε χημειοαντίσταση ήδη αναφερθεί [11], [13]. Σύμφωνα με την ισχυρή χημειοαντίσταση στο holoclones, γονίδια και microRNAs που στηρίζουν χημειοαντίσταση, συμπεριλαμβανομένων των

BMI1

[39],

GLI1 /2

[40],

CXCR4

[41 ],

miR-214

[42],

miR-21

[43], και

mir-155

[44] (Σχ. 4G, Σχ. 5Α, Β) πάνω ρυθμισμένα σε holoclones. Σε απάντηση προς φαρμακευτικές αγωγές, η έκφραση των μεταφορέων φαρμάκου-πρόσληψης, της οποίας το υψηλότερο επίπεδο έκφρασης συσχετίστηκε με μεγαλύτερη επιβίωση των ασθενών [45] – [48], προκλήθηκε σε paraclones προτίμηση (Σχήμα 6C).. Αυτό σημαίνει ότι το φάρμακο στην υιοθέτηση θα αυξηθεί ταχύτερα στην paraclones από ό, τι στην holoclones. Αυτό θα μπορούσε να είναι μία από τις πιθανές προελεύσεις του προτιμησιακού επιβίωση των καρκινικών βλαστικών κυττάρων έναντι μη-βλαστικών καρκινικών κυττάρων στη χημειοθεραπεία.

Στο σύνολό τους, οι αποικίες με διακριτές μορφολογίες και σε διαφορετικά στάδια της διαφοροποίησης μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα δυνητικό μοντέλο για την ανάλυση του καρκίνου του βλαστικά κύτταρα (Εικ. 7). Με αυτό το μοντέλο, μπορεί να προσδιοριστεί γονίδια και microRNAs δυνητικά συσχετίζονται με καρκινικά βλαστικά κύτταρα. Το πιο σημαντικό, παράλληλα αξιολόγηση χημειοθεραπευτικούς φάρμακα μπορούν να διεξάγονται σε καρκινικά βλαστικά κύτταρα και αυτόλογα καρκινικά κύτταρα μη-στελέχους. Αυτό σημαίνει ότι η κλωνική μορφολογίες που βασίζεται μοντέλο καρκίνου των βλαστικών κυττάρων θα είναι χρήσιμος για να οδηγήσει στη νεότερη κατανόηση του χημειοαντίσταση, η οποία θα πρέπει να είναι αρκετά διαφορετικές από εκείνες που λαμβάνονται από ετερογενείς καρκίνο κυτταρικούς πληθυσμούς, και θα είναι χρήσιμο να ξεπεραστεί η χημειοαντίσταση στη θεραπεία του καρκίνου.

Τα παγκρεατικά καρκινικά βλαστικά κύτταρα και απογόνων τους στη διαφοροποίηση μπορεί να αναπτυχθεί σε μεμονωμένες αποικίες με διαφορετικές μορφολογίες. Με βάση την in vivo και in vitro χαρακτηριστικά, Holoclones αντιστοιχούν στα καρκινικά βλαστικά /προγονικά κύτταρα, ενώ paraclones αντιστοιχούν στα πλήρως διαφοροποιημένα κύτταρα και meroclones αντιστοιχούν στα κύτταρα στο ενδιάμεσο στάδιο. Τα γονίδια και τα microRNAs που συνδέουν με τον καρκίνο βλαστικών κυττάρων και να υποστηρίξουν χημειοαντίσταση, συμπεριλαμβανομένων των

BMI1

,

GLI1 /2

,

CXCR4

,

mir-21/214 /221/222/155

, είναι εμπλουτισμένα σε holoclones. Ωστόσο, η

Ας-7

και

mir-30a /b /c

είναι εμπλουτισμένα σε paraclones.

Η

Υλικά και Μέθοδοι

τηλέφωνα γραμμές

Ανθρώπινο παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος κυτταρική σειρά BxPC3 (που αγοράζονται από τη Cell Τράπεζα της Κίνας Ακαδημίας Επιστημών, Σαγκάη, Κίνα) και PC3 ήταν (που αγοράζονται από την Κίνα Ένωση Ιατρική Κολάζ, Πεκίνο, Κίνα) καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 (Hyclone ) με 10% θερμοαπενεργοποιημένο βόειο εμβρυϊκό ορό (Hyclone) και ανακαλλιεργήθηκε ως 1:10 με 0,25% θρυψίνη /ΕϋΤΑ (Hyclone). Αυτά κυτταρική γραμμή καθιερώθηκαν από την πρωτογενή παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα και με χαρακτηριστική μορφολογία επιθήλιο [22], [23]. BxPC3 [22] προήλθε από την ευρωπαϊκή καταγωγή και PC3 [23] προήλθε από την κινεζική.

χημικά φάρμακα

λυοφιλοποιημένη σκόνη της γεμσιταβίνης (Lilly) διαλύθηκε σε Calsium /μαγνήσιο απαλλαγμένο PBS (Hyclone ) και αποθηκεύτηκε στους -20 ° C με συγκέντρωση 4 mg /ml. διάλυμα 5-FU (Roche) αποθηκεύθηκε στους -20 ° C με συγκέντρωση 25 mg /ml. Πριν από τη χρήση, τα αποθέματα αραιώθηκαν σε συγκεντρώσεις εργασίας (5, 10, 50, 100, και 500 ηΜ για 5-FU, και 1, 5, 10, 50, και 100 ηΜ για γεμσιταβίνη) με μέσο καλλιέργειας.

Ζώα

Όλα τα πειράματα έχουν εγκριθεί από την Επιτροπή Φροντίδας ζώων και Χρήση του Πανεπιστημίου του Πεκίνου (αριθμός έγκρισης ήταν IRB00001052-09051). NOD /SCID ποντίκια αγοράστηκαν από Πειραματικό Κέντρο Ζώων Επιστημών του Πανεπιστημίου του Πεκίνου και διατηρούνται σε πρότυπες συνθήκες, σύμφωνα με τις οδηγίες του ιδρύματος.

Ενιαία κελί

κλωνοποίηση

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε 70% -80% των συμβολή με Accumax (Chemicon) και επαναιωρήθηκαν σε μέσο χωρίς ορό. Ενιαία κύτταρο σπάρθηκε σε κάθε φρεάτιο πλακών 96 φρεατίων με κυτταρομετρία ροής MOFLO (DakoCytomation). Δύο ημέρες μετά την επίστρωση, πλάκες 96-φρεατίων ελέγχθηκαν με μικροσκοπία. Wells περιέχουν μόνο ένα βιώσιμων κυττάρων σημάνθηκαν. Και στη συνέχεια, το μέσο ανανεώνεται ανά 3 ημέρες. Αποικίες ταξινομήθηκαν ως holo-, mero- και paraclones σύμφωνα με μορφολογίες τους. 14 ημέρες μετά κυτταρομετρίας ροής διαλογή, επιλέχθηκαν τυπικές αποικίες για περαιτέρω πειράματα.

όγκου εμφύτευση κυττάρων

Επιλεγμένα αποικίες επεκτάθηκαν και συλλέγονται με Accumax (Chemicon), υπολογίζονται και επαναιωρείται σε 1:01 μίγμα από RPMI-1640 και Matrigel (BD). Δείγματα του κυτταρικού εναιωρήματος ενέθηκαν υποδορίως σε dorsolateral μέρος του NOD ποντίκια /SCID. Λανθάνουσα περίοδος εμφάνισης όγκου (δηλαδή, ο χρόνος από την ένεση για την ανίχνευση των ψηλαφητών όγκων) προσδιορίστηκε. Εντός 9 εβδομάδες μετά την εμφύτευση, τα ποντίκια που φέρουν όγκους θανατώθηκαν. Εν τω μεταξύ, οι όγκοι ξενομοσχεύματος αποκόπηκαν χειρουργικά και ζυγίστηκαν. Τα ποντίκια χωρίς καμία ένδειξη του βάρους του όγκου διατηρήθηκαν για τουλάχιστον 9 εβδομάδες από την εμφύτευση και στη συνέχεια εξετάζονται για necroscopy να επιβεβαιώσει ότι ήταν χωρίς όγκο.

Για σειριακή μεταμόσχευση, ξενομοσχεύματος όγκοι κόβονται σε μικρά κομμάτια με ψαλίδι, αιωρούνται σε μέσο Μ199, και χωνεύεται στους 37 ° C για περίπου 3 ώρες με 200units /ml ulturapure collagenas IV (Worthington Biochemicals). Περαιτέρω μηχανικές πέψη πραγματοποιήθηκε με μια 25-ml σιφώνιο ανά 15 λεπτά. Μετά την πέψη, το κυτταρικό εναιώρημα διηθείται μέσω νάιλον πλέγματος 40 μm και απαλά φορτώνονται στο ανώτερο στρώμα του Histopaque-1077 κλίση (Sigma-Aldrich) (1~3 × 10

6 κύτταρα /ml Histopaque χρησιμοποιούνται σε συνολικό όγκο 3 mL) και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στα 400 χ g για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Βιώσιμα εμπύρηνα κύτταρα συλλέχθηκαν στη διεπαφή, ενώ τα ερυθρά αιμοσφαίρια, τα νεκρά κύτταρα και τα θραύσματα είχαν εξαλειφθεί. Το συγκομίζονται εναιώρημα μονού κυττάρου χρησιμοποιήθηκε για μεταμόσχευση, όπως περιγράφεται παραπάνω.

Συλλέχθηκαν

χημειοθεραπεία

δοκιμασία

Τα κύτταρα από τον ίδιο τύπο των αποικιών, ομαδοποιήθηκαν μαζί και σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων πλάκες με πυκνότητα 5000 κύτταρα /φρεάτιο. 24 ώρες αργότερα, το μέσο ανανεώνεται και προστέθηκαν φάρμακα (gemcitabine ή 5-FU).