Αφηρημένο

Ιστορικό & amp? Στόχοι

Ο τρέχων στόχος της θεραπείας προς την προχωρημένη του παχέος εντέρου εστιάζεται κυρίως στον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) σηματοδότησης, αλλά αθροιστικές επιδράσεις της χημειοθεραπείας είναι ακόμη περιορισμένη. Μια αποσυνθετίνη και μεταλλοπρωτεϊνάσης (ADAM) διασπά το proheparin δέσμευσης του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα αυξητικού παράγοντα (proHB-EGF). Και διαλυτό HB-EGF ενεργοποιεί EGFR. Παράλληλα, η καρβοξυ-τερματικό θραύσμα του proHB-EGF (HB-EGF-CTF) μετατοπίζεται στον εσωτερική πυρηνική μεμβράνη, και στη συνέχεια ασκεί σχετικά με τη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων μέσω δέσμευσης προμυελοκυτταρική δακτύλου λευχαιμία ψευδαργύρου (PLZF) πρωτεΐνη πυρηνικής, έναν μεταγραφικό καταστολέα , προκαλώντας έτσι την πυρηνική εξαγωγή του. Υποθέσαμε ότι η αναστολή της HB-EGF-CTF πυρηνική μετατόπιση μπορεί να είναι μια νέα στρατηγική για την πρόληψη του πολλαπλασιασμού των κυττάρων.

Μέθοδοι

12

-Ο

tetradecanoylphorbor-13- οξικού (ΤΡΑ) υποβλήθηκε σε επεξεργασία για να ενεργοποιήσετε ADAM. Εννέα χιλιάδες χημικές ενώσεις υποβλήθηκαν σε διαλογή για αποτελεσματικότητες τους στον αποκλεισμό της σύνδεσης του ΗΒ-EGF-CTF να προμυελοκυτταρική λευχαιμία δακτύλου ψευδαργύρου (PLZF) με σύστημα AlphaScreen. Τα ληφθέντα υποψήφιοι στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν για να εμποδίσει τη δέσμευση του ΗΒ-EGF-CTF να PLZF σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου, ΗΤ29 και HCT116. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων διερευνήθηκε με μια δοκιμασία καμπύλη ανάπτυξης. Η ενδοκυτταρική εντόπιση, και σύνδεσης μεταξύ HB-EGF-CTF και PLZF, αξιολογήθηκε με ανοσοφθορισμού χρώση, και ανοσοκαταβύθιση και κηλίδωση Western, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα της λαμβάνονται υποψηφίων για φωσφορυλίωση του EGFR και την πυρηνική μετατόπιση της HB-EGF-CTF και την εξαγωγή των PLZF κατά τη διάρκεια του υποδοχέα της αγγειοτενσίνης ΙΙ Type1 (AT1R) νοκ ντάουν ερευνήθηκαν επίσης.

Αποτελέσματα

Η τελμισαρτάνη και candesartan βρέθηκαν να είναι εν δυνάμει υποψήφιες χώρες. Telmisartan ανέστειλε ΤΡΑ-επαγόμενο πολλαπλασιασμό κυττάρων ισχυρότερη από candesartan. Η τελμισαρτάνη, αλλά όχι candesartan μπλοκάρει την πυρηνική μετατόπιση της HB-EGF-CTF, και η σύνδεση του HB-EGF-CTF να PLZF, κατά τη διάρκεια της ΤΡΑ διέγερση. Τόσο η τελμισαρτάνη και candesartan δεν αναστέλλει την επαγόμενη με ΤΡΑ φωσφορυλίωση του EGFR, και telmisartan, αλλά όχι candesartan, ανέστειλε την επαγόμενη με ΤΡΑ πυρηνική μετατόπιση της HB-EGF-CTF μετά από νοκ ντάουν της AT1R.

Συμπεράσματα

η αναστολή της HB-EGF-CTF πυρηνική μετατόπιση με telmisartan μπορεί να είναι μια νέα στρατηγική για την πρόληψη του πολλαπλασιασμού των κυττάρων

Παράθεση:. Ozeki K, Tanida S, Morimoto C, Inoue Υ, Mizoshita Τ, Tsukamoto H, et al . (2013) Η τελμισαρτάνη αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων από Μπλόκο Πυρηνική Μετατόπιση της ProHB-EGF C-τερματικό θραύσμα στον Καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. PLoS ONE 8 (2): e56770. doi: 10.1371 /journal.pone.0056770

Επιμέλεια: Jian-Xin Gao, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, η Κίνα

Ελήφθη: 1 Αυγ του 2012? Αποδεκτές: 15 Γενάρη, 2013? Δημοσιεύθηκε: 22 Φεβρουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Ozeki et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση-in ενισχύσεις για την επιστημονική έρευνα C (KAKENHI 22590704) από την Ιαπωνία Εταιρείας για την Προώθηση της Επιστήμης (JSPs). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Έχουν την ακόλουθη ανταγωνιστικές ενδιαφέρον οι συγγραφείς: Γιοσιμάσα Inoue και Eiji Nishiwaki απασχολούνται από εμπορικές Η εταιρεία Carna Βιοεπιστημών Καταστατικού. Δεν υπάρχουν περαιτέρω διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς. Όλοι οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχει οικονομική υπάρχει σύγκρουση συμφερόντων σε σχέση με το περιεχόμενο του άρθρου.

Εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι η κύρια αιτία θανάτου από κακοήθεια του γαστρεντερικού [1]. Επί του παρόντος, οι θεραπευτικές αγωγές προς advanced παχέος εντέρου εστιάζεται κυρίως στο σχεδιασμό των θεραπευτικών παραγόντων που στοχεύουν στον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR), ο αντισώματα αποκλεισμού όπως cetuximab και panitumumab μονοκλωνικών [2], [3]. Τα αθροιστικά αποτελέσματα αυτών των θεραπευτικών αντισωμάτων συν χημειοθεραπεία συνδυασμού σε προχωρημένο καρκίνο του παχέος εντέρου που λαμβάνονται, αλλά περιορισμένη, διότι η μετάλλαξη KRAS καταργηθούν αυτά τα αποτελέσματα [3], [4].

Ν-τερματικά θραύσματα των υποκαταστατών EGFR, συμπεριλαμβανομένων ηπαρίνης δεσμευτική επιδερμικού αυξητικού παράγοντα, όπως αυξητικό παράγοντα (ΗΒ-EGF) που θεωρείται ότι εμπλέκεται στην κυρίως κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου δεσμεύονται με EGFR και επάγει την φωσφορυλίωση του [5], [6], [7], [8], [ ,,,0],9]. συζευγμένο υποδοχέα G-πρωτεΐνη (GPCR) αγωνιστές (π.χ. ιντερλευκίνη-8) και 12-

O

τετραδεκανοϋλοφορβολο-13-οξικό (ΤΡΑ) που προκαλείται από μετενεργοποίηση EGFR μέσω disintegrin και μεταλλοπρωτεϊνασών (ADAM) – διασπάστηκε proHB-EGF [10], [11]. Τα καρβοξυ-τερματικών θραυσμάτων proHB-EGF (HB-EGF-CTF) που παράγεται από εξωτομέα ρίχνοντας μετατοπίζονται στην εσωτερική πυρηνική μεμβράνη, στη συνέχεια ασκήσει επί της ρύθμισης πολλαπλασιασμού κυττάρου με δέσμευση προμυελοκυτταρική λευχαιμία δακτύλου ψευδαργύρου (PLZF) πρωτεΐνη πυρηνικής, ένας μεταγραφικός καταστολέας , προκαλώντας έτσι την πυρηνική εξαγωγή του [12], [13]. Ως εκ τούτου, η αναστολή της μετατόπισης σηματοδότηση του HB-EGF-CTF πυρηνικών θεωρείται ότι είναι μια νέα στρατηγική έναντι της ανάπτυξης του καρκίνου του παχέος εντέρου. Ωστόσο, δεν υπάρχει καμία απόδειξη των θεραπευτικών παραγόντων που μπλοκάρουν συγκεκριμένα πυρηνική μετατόπιση της HB-EGF-CTF και δέσμευση του ότι για να PLZF

Έτσι, οι στόχοι της παρούσας μελέτης ήταν να:. I) οθόνη για την ισχυρή χημική ενώσεις οι οποίες είναι ικανές να αναστέλλουν τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ HB-EGF-CTF και PLZF μέσω GST-τραβήξει προς τα κάτω τον προσδιορισμό, συντονισμού επιφανειακών πλασμονίων (SPR) φασματοσκοπία και AlphaScreen τεχνολογία, ii) την επικύρωση τα ανασταλτικά αποτελέσματα αυτών των ισχυρών ενώσεων επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, και iii ) πιστοποιούν τη σημασία της αναστολής της πυρηνική μετατόπιση της HB-EGF-CTF στον πολλαπλασιασμό του παχέος εντέρου καρκινικών κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

ΤΡΑ αγοράστηκε από την Cell Signaling Technology (Berverly, MA, USA). Αντι-ΕΟΡΚ πολυκλωνικό αντίσωμα, αντι-φωσφοτυροσίνης μονοκλωνικό αντίσωμα (4G10) και φυσιολογική IgG αγοράσθηκαν από την Millipore (Billerica, ΜΑ, USA). Ο αναστολέας τυροσίνης κινάσης του EGFR AG1478 και αντίσωμα αντι-PLZF αγοράσθηκαν από την Calbiochem (La Jolla, CA, USA). Το candesartan λήφθηκε από την Takeda Pharmaceutical Company Limited (Osaka, Ιαπωνία) και telmisartan ήταν ένα είδος προικισμένος από τη Boehringer Ingelheim (Ingelheim, Γερμανία). Ολμεσαρτάνης και λοσαρτάνη αγοράστηκαν από την Daiichi Sankyo Εταιρεία Λίμιτεδ (Τόκιο, Ιαπωνία) και η Merck Sharp & amp? Dohme (Whitehouse Station, NJ, USA), αντίστοιχα. Το πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-HB-EGF-CTF [12] και ο αναστολέας μεταλλοπρωτεϊνάσης, ΚΒ-R7785 [14], παρασκευάστηκαν. Το μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-ΡΕΑΟ Μ2 και το ενεργοποιείται από πολλαπλασιαστή περοξυσώματος υποδοχέα (PPAR) γ ανταγωνιστής, GW9662 [15], [16], αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, USA).

Παρασκεύασμα πλασμιδίου

Ένα πλασμίδιο που κωδικοποιεί FLAG-tagged PLZF δημιουργήθηκε με υποκλωνοποίηση της αλληλουχίας FLAG και ανθρώπινου cDNA PLZF σε pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Τα πλασμίδια για την ανασυνδυασμένη έκφραση των παραγώγων PLZF FLAG-tagged, GST-συντηγμένο EGFR συνδετήρες-CTF, και CFP (πρωτεΐνη φλουορεσκεΐνη κυανό) ταμπέλα σήμα PLZF παρασκευάστηκαν [12]. δακτύλους ψευδαργύρου (ZNF) 5-8, και, EGFR-CTF κλωνοποιήθηκαν σε pGEX6P-1 (GE Healthcare, Little Chalfont, UK).

Cell Culture

κυτταρικές σειρές καρκίνου του Ανθρώπου του παχέος εντέρου, ΗΤ29 και HCT116 (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA), καλλιεργήθηκαν με McCoy’s5A (Sigma), CaCo2 (American Type Culture Collection) καλλιεργήθηκαν με τροποποιημένο μέσο Eagle του Dulbecco (DMEM) με 20% ορό εμβρύου μόσχου ( FBS). Και SW480 (American Type Culture Collection) καλλιεργήθηκε ϋΜΕΜ με 10% FBS. κύτταρα ΗΤ1080 και πρωτογενή ανθρώπινα κερατινοκύτταρα καλλιεργήθηκαν [12], [17].

GST pull-down Δοκιμασία

GST και GST-λιωμένο proHB-EGF-CTF, GST-μετασχηματισμού παράγοντα ανάπτυξης α (ΤΟΡ-α) -CTF, ΟδΤ αμφιρεγουλίνη (AR) -CTF, και ΟδΤ επιρεγουλίνη (EPR) -CTF παρασκευάστηκαν [12]. Μετά δεσμευτικός GST και GST-EGFR συνδετήρες-CTF στα σφαιρίδια γλουταθειόνης-Sepharose, προϊόντα λύσης που περιέχουν διάφορα FLAG-tagged παράγωγα PLZF επωάστηκαν με 20 μL σφαιριδίων για 2 ώρες στους 4 ° C. Μετά την πλύση, οι δεσμευμένες πρωτεΐνες αναλύθηκαν με ανοσοαποτύπωση χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-ΡΕΑΟ.

συντονισμού επιφανειακών πλασμονίων (SPR) Φασματοσκοπία

Ένας πυρήνας ΒΙΑ S51 SPR System® (GE υγειονομική περίθαλψη) χρησιμοποιήθηκε για την ποιοτικά και ποσοτικά αναλύουν οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των τεσσάρων ακινητοποιημένου EGFR-συνδετήρα-CTFS (δηλαδή HB-EGF-CTF, ΤΟΡ-α-CTF, AR-CTF, και EPR-CTF) και GST-Ζη 5-8 του PLZF, οι οποίες ήταν μετριέται σε μονάδες συντονισμού (RU). Το ανασυνδυασμένο βιοτίνης-EGFR- συνδέτη CTFS (Institute Peptide, Inc., Osaka, Japan) μεμονωμένα ακινητοποιημένα (περίπου 1000 RU) μέσω σύζευξης αμινο ομάδα πάνω στρεπταβιδίνη (SA) πιστοποιημένη μάρκες. Διάφορα συγκέντρωση της GST-Zn5-8 προστέθηκαν σε ρέον ρυθμιστικό HEPES (10 mM HEPES, ρΗ 7,4, 150 mM NaCl, 0,005% Surfactant Ρ20) με ρυθμό ροής 30 μL /λεπτό για 2 λεπτά. Τα chips αισθητήρα διαχωρίστηκαν με ένεση 30 sec από 10 mM γλυκίνης-ΗΟΙ, ρΗ 1.5. Οι διαγραμμάτων αισθητήρα αναλύθηκαν με BIA Λογισμικό αξιολόγησης (έκδοση 4.1? BIAcore). Οι σταθερές διάστασης ισορροπίας ( «σταθερά πρόσδεσης»? KD) της κάθε αντίδρασης υπολογίζεται διαιρώντας τα ποσοστά διαχωρισμού ( «εκτός ρυθμού»? Kd) από τα ποσοστά σύνδεσης ( «στο ρυθμό»? Ka) (δηλαδή Kd = kd /ka) .

Απεικόνιση της ΚΑΠ Fusion Πρωτεΐνες και ποσοτικός προσδιορισμός των κυτταρικά κλάσματα με τη Nuclear Μεταφρασμένη ΚΑΠ-PLZF

παροδικά επιμολυσμένα ΗΤ1080 κύτταρα, και σταθερή ΗΤ1080 /HB-EGF, ΗΤ1080 /TGF-α, ΗΤ1080 /AR, και ΗΤ1080 /EPR κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες και στη συνέχεια τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με 10 μΜ ΚΒ-R7785 σε μέσο ελεύθερο ορού για 30 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού με 100 ηΜ ΤΡΑ για 1 ώρα. Υποκυτταρικός εντοπισμός της πρωτεΐνης σύντηξης ΚΑΠ εξετάστηκε κάτω από μικροσκόπιο επιφθορισμού (Eclipse TE3000, Nikon, Τόκιο, Ιαπωνία) [12].

AlphaScreen Αναλύσεις

Μια AlphaScreen system® (PerkinElmer, Shelton, CT , USA) χρησιμοποιήθηκε για τη διαλογή μιας βιβλιοθήκης 9000 χημικών ενώσεων (Carna Bioscience Inc., Kobe, Japan) cyclopaedically για την αποτελεσματικότητά τους στον αποκλεισμό της αλληλεπίδρασης μεταξύ βιοτινυλιωμένο-EGFR συνδετήρες-CTF και GST-Zn5-8 του PLZF. 5 μΐ 1,25 μg /mL ανασυνδυασμένης GST-ZnF5-8 επωάστηκε με 2.5 μί 1,25 μg /mL βιοτίνης-EGFR συνδετήρες-CTF για 30 λεπτά, και 2.5 μί αντισώματος αντι-GST (1,8 μg /mL) προστέθηκε για επί 1 ώρα. Στη συνέχεια, 5 μL επικαλυμμένα με στρεπταβιδίνη σφαιρίδια δότη και δέκτη συζευγμένο αντι-GST IgG (1:01 μίγμα) επωάστηκαν για 2 ώρες στο σκοτάδι. σήματα AlphaScreen (κρούσεις ανά δευτερόλεπτο) αναλύθηκαν με έναν αναγνώστη μικροπλάκας EnVision (Perkin-Elmer). Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν στους 23 ° C σε ρυθμιστικό που περιέχει 25 mM HEPES, 1 mM MgCl

2, 20 mM NaCl, ρΗ 7,4, 0,1% BSA.

δοκιμασία πολλαπλασιασμού κυττάρων (CCK-8 κιτ δοκιμασίας)

Ένα τηλέφωνο Μετρώντας Kit8 (CCK-8) (Dojindo Laboratories, Κουμαμότο, Ιαπωνία) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Εν συντομία, 2 χ 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία καλλιέργειας 96 φρεατίων με 10% FBS για 24 ώρες. Στη συνέχεια, FBS αντικαταστάθηκε με μέσο χωρίς ορό για 72 ώρες με ή χωρίς 30 μΜ των 12 υποψηφίων ενώσεων και τελμισαρτάνη ή κανδεσαρτάνη (0,3, 3 και 30 μΜ), και 30 μΜ του GW9662 κατά τη διέγερση με 100 ηΜ ΤΡΑ. 10 μL του CCK-8 διάλυμα προστέθηκε στη συνέχεια σε κάθε φρεάτιο, και επωάζονται στους 37 ° C για επιπλέον 2 ώρες. Οπτική πυκνότητα (OD) εξετάστηκε σε μήκος κύματος 450 nm.

Παρακολούθηση Ενιαία πρηξίματα τηλέφωνα

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 5 × 10

2 κύτταρα ανά 10 εκατοστά ενός πιάτου κατά την ημέρα 0 σε 10% FBS μέσο φυσιολογική ανάπτυξη. Μετά από 24 ώρες (για day1), αρκετά απομονωμένη και μορφολογικά υγιή κύτταρα σημειώνονται με μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης. Το μέσο αντικαταστάθηκε με 5% μέσον FBS (έλεγχος) με ή χωρίς 100 ηΜ ΤΡΑ, 10 μΜ του ΚΒ-R7785, 100 ηΜ AG1478, 30 μΜ του telmisartan και candesartan, και 50 ng /mL ανασυνδυασμένης ΗΒ-EGF ( Sigma). Το μέσο αλλάχθηκε κάθε 48 ώρες με φρέσκο ​​μέσο. μορφολογία των κυττάρων και μετρήσεις βαθμολογήθηκαν κάθε 24 ώρες [18].

μικροσκοπία ανοσοφθορισμού

Κύτταρα που σχηματίστηκε μια αποικία μεταφέρθηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού για 48 ώρες και στη συνέχεια επωάζονται για 60 λεπτά σε 5 % FBS ρυθμισμένα μέσα με ή χωρίς 10 μΜ ΚΒ-R7785, 100 ηΜ AG1478, 50 ng /mL ανασυνδυασμένης ΗΒ-ΕΟΡ, 30 μΜ του telmisartan, και 30 μΜ του candesartan. Ακολούθως, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 ηΜ ΤΡΑ για 90 λεπτά, και στη συνέχεια μονιμοποιήθηκαν με αιθανόλη και ακετόνη. Η υποκυτταρική εντόπιση της HB-EGF-CTF και PLZF αναλύθηκε με ανοσοφθορισμό. Πρωτογενή αντισώματα έναντι HB-EGF-CTF ή PLZF χρησιμοποιήθηκαν. Τα δευτερεύοντα αντισώματα ήταν Alexa Fluor 594 αντι-κουνελιού IgG ή Alexa Fluor αντι-ποντικού IgG (Invitrogen). Εικόνες ελήφθησαν σε Eclipse μικροσκόπιο φθορισμού 80i (Nikon).

Ανοσοκαθίζηση και κηλίδωση Western

κύτταρα

σε κατάσταση υποσυμβάλλουσες άλλαξαν σε μέσο ελεύθερο ορού για 48 ώρες και αντιμετωπίζονται με ΤΡΑ κατά τη υποδεικνυόμενους χρόνους. Η τελμισαρτάνη και candesartan προστέθηκαν στα κύτταρα για 60 λεπτά, πριν από τις ερεθίσματα. Τα κύτταρα λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης, και τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν και επωάστηκαν με 1 μα ανθρώπινου αντι-EGFR ή αντι-HB-EGF-CTF πολύκλωνα αντισώματα για 2 ώρες στους 4 ° C με από άκρου σε άκρο περιστροφή. Ανοσοκαθίζηση και στύπωμα Western πραγματοποιήθηκαν [11]. Τα πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν 4G10 ή αντι-PLZF, και αντι-HB-EGF-CTF. Τα δευτερεύοντα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αντι-ποντικού IgG HRP-συνδεδεμένη ή αντι-κουνελιού IgG HRP-συνδεδεμένη αντισώματα (Cell Signaling Technology). Οι μεμβράνες αναπτύχθηκαν σε ένα σύστημα ECL κηλίδωση Western ανίχνευση (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, England).

σιωπή στο αγγειοτενσίνη τύπου ΙΙ 1 υποδοχέα (AT1R) και Adam-12

Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 30 μΜ της AT1R και siRNAs αγωνίζομαι (Santa Cruz, Delaware, CA, USA), και με 10 μΜ του Adam-12 και siRNAs αγωνίζομαι (Invitrogen) χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο λιποφεκταμίνης (Invitrogen). 72 ώρες μετά τα κύτταρα επιμολύνθηκαν, η έκφραση του AT1R και Adam-12 (Santa Cruz Biotechnology) αναλύθηκαν με κηλίδωση Western.

Στατιστικά

Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM. Η μονόδρομη ANOVA και τεστ πολλαπλών διαδικασία σύγκρισης Τουρκίας-Kramer που χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί στατιστικά σημαντικές διαφορές (P & lt? 0,05)

Αποτελέσματα

Διπλή μονοπάτια σηματοδότησης του EGFR φωσφορυλίωση και HB-EGF C. τερματική θραύσμα Πυρηνική μετατόπιση κατά τη διάρκεια του κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Απόσπασμα από Αναφοράς [19] και Τροποποιημένο).

12

O

-tetradecanoylphorbor-13-οξικό (ΤΡΑ) υποδοχέα που προκαλείται επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) διαενεργοποίησης μέσω disintegrin και μεταλλοπρωτεϊνασών (ADAM) – διασπασμένου proheparin δέσμευσης EGF αυξητικό παράγοντα (proHB-EGF) και ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [10]. Παράλληλα, οι καρβοξυ-τερματικών θραυσμάτων (CTF) του proHB-EGF (HB-EGF-CTF) μετατοπίζονται στην εσωτερική πυρηνική μεμβράνη, στη συνέχεια ασκούν σχετικά με τη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων μέσω δέσμευσης προμυελοκυτταρική δακτύλου λευχαιμία ψευδαργύρου (PLZF) πρωτεΐνη πυρηνικής, μια μεταγραφικός καταστολέας, προκαλώντας έτσι την πυρηνική εξαγωγή του (Εικ. 1) [19].

Που προέρχεται από [19] και τροποποιήθηκε. ΤΡΑ επάγει μία ADAM Διάσπαση με την μεσολάβηση του proHB-EGF, και τα αποτελέσματα στον εξωτερικό τομέα απόπτωση Ν-τερματικό θραύσμα και την παραγωγή του ενός ενδοκυτταρικού C-τερματικό θραύσμα (CTF). Το διαλυτό HB-EGF δεσμεύεται στο EGFR και επάγει μια ταχεία παροδική φωσφορυλίωση του EGFR. Αυτή η φωσφορυλίωση έχει ως αποτέλεσμα την μεταγραφή διαφόρων γονιδίων. Εν τω μεταξύ, το HB-EGF-CTF μετατοπίζεται στον πυρήνα, όπου στη συνέχεια επάγει την πυρηνική εξαγωγή του PLZF. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Τα ισχυρά μπλοκ αναστολέα η πυρηνική μετατόπιση της HB-EGF-CTF. Ρ υποδεικνύει φωσφορυλίωση. Συντομογραφίες: EGFR? υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα, ΤΡΑ? 12-

O

τετραδεκανοϋλοφορβολο-13-οξικό άλας, ΡΚΟδ? πρωτεϊνική κινάση οδ, ADAM? ένα disintegrin και μεταλλοπρωτεϊνασών, ΗΒ-ΕΟΡ? σύνδεσης με ηπαρίνη EGF αυξητικό παράγοντα, CTF? C-τερματικό θραύσμα, ΜΑΡΚ? που ενεργοποιείται από μιτογόνο πρωτεΐνη κινάση, PLZF? προμυελοκυτταρική λευχαιμία δακτύλου ψευδαργύρου.

Η

Υποθέσαμε ότι η αναστολή της πυρηνικής μετατόπισης της HB-EGF-CTF θα μπορούσε να οδηγήσει σε μια νέα στρατηγική για την πρόληψη του πολλαπλασιασμού των κυττάρων κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του καρκίνου του παχέος εντέρου.

Ωστόσο, δεν υπάρχει σήμερα καμία απόδειξη των ισχυρών υποψηφίων που μπλοκάρουν ειδικά τη σηματοδότηση πυρηνική μετατόπιση της HB-EGF-CTF.

Η CTF των υποκαταστατών EGFR αλληλεπιδράσει με το συγκεκριμένο τμήμα του PLZF (ZnF5-8) Χρησιμοποιήσαμε το κύτταρο ΗΤ1080 γραμμές, επειδή τα κύτταρα ΗΤ1080 εκφράζουν λίγο ενδογενή πρόδρομοι HB-EGF, και είναι χρήσιμο να αναλύσει τις θέσεις δέσμευσης μεταξύ HB-EGF-CTF και PLZF, και την πυρηνική εξαγωγή PLZF μετά υπερεκφράζουν πρόδρομοι HB-EGF και παράγωγα PLZF [12]. Πρέπει πρώτα πιστοποίησε την αλληλεπίδραση μεταξύ των κυτταροπλασματικών περιοχών των υποκαταστατών EGFR και PLZF στα κύτταρα ΗΤ1080 που εκφράζουν τις τέσσερις proEGFR-συνδετήρες και PLZF πριν από τη διαλογή των ισχυρών υποψηφίων. Δεδομένου ότι PLZF coimmunoprecipitates με ένα αντίσωμα έναντι του CTF του proHB-EGF σε κύτταρα ΗΤ1080 υπερεκφράζουν proHB-EGF και FLAG-tagged PLZF [12], ένα Συνανοσοκατακρήμνιση του PLZF εκτελέστηκε με αντισώματα έναντι της CTF των τεσσάρων συνδετήρων EGFR (HB-EGF , ΤΟΡ-α, AR, EPR), σε κύτταρα ΗΤ1080. Το γονίδιο πλήρους μήκους PLZF FLAG-tagged διαμολύνθηκε παροδικά σε κύτταρα που εκφράζουν σταθερά proHB-EGF, proTGF-α, proAR ή proEPR (Εικ. 2Α). PLZF εκφράστηκε σε αυτά τα κύτταρα (Σχ. 2Β, λωρίδα 1). Μετά ΤΡΑ διέγερση για 1 ώρα, FLAG-tagged PLZF πρωτεΐνη η οποία ανοσοκατακρημνίστηκε με κάθε αντίσωμα ανιχνεύθηκε με ανοσοστύπωμα με αντίσωμα αντι-ΡΕΑΟ (Σχήμα 2Β, λωρίδα 2).

(Α) Schema του FLAG-tagged όλο το μήκος PLZF που αποτελείται από FLAG, BTB, Κέντρο, και εννέα ZnFs. κύτταρα (Β) ΗΤ1080 που εκφράζουν σταθερά προ-HB-EGF, προ-ΤΟΡ-α, προ-AR και pro-EPR επιμολύνθηκαν παροδικά με μια έκφραση φορέα που κωδικοποιεί FLAG-tagged PLZF. πρωτεΐνη έκφραση PLZF των προϊόντων λύσης κυττάρου (διαδρομή 1), καθώς και κύτταρα επεξεργασμένα με 100 ηΜ ΤΡΑ για 1 ώρα, και ανιχνεύθηκαν με αντισώματα αντι-FLAG ακόλουθη ανοσοκατακρήμνιση με αντι-EGFR συνδετήρες-CTF αντισώματα (Λωρίδα 2) και ενός αντι-κανονικό κουνελιού IgG (Λωρίδα 3). (C) GST pull-down ανάλυση. Τα κυτταρολύματα που περιέχουν FLAG-tagged παράγωγα PLZF επωάστηκαν με GST (λωρίδα 2), GST-HB-EGF-CTF (λωρίδα 3), GST-ΤΟΡ-α-CTF (lane4), GST-AR-CTF (λωρίδα 5), και GST-EPR-CTF (λωρίδα 6) σφαιρίδια για 2 ώρες, και οι δεσμευμένες πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με ανοσοκηλίδωση με ένα αντίσωμα αντι-ΡΕΑΟ. (D) Schema παραγώγων PLZF FLAG-tagged. Οι δεσμευτικές ιδιότητες των παραγώγων PLZF σε GST-fused- HB-EGF-CTF, TGF-α-CTF, AR-CTF και EPR-CTF GST σε μία δοκιμασία pull-down, όπως συνοψίζονται στα δεξιά λωρίδες της κάθε δομής. Οι ιδιότητες δέσμευσης με βάση την εκτίμηση της έντασης μπάντα με είναι σε σχέση με τη ζώνη ελέγχου και υποδεικνύεται από ++ (& gt? 50%), + (50-10%), και – (& lt? 10%)

Η.

στη συνέχεια, προσδιορίσαμε τις δεσμευτικές περιοχές του PLZF στις κυτταροπλασματικές περιοχές των προ-EGFR συνδετών ΗΤ1080 στην δοκιμασία pull-down GST. Μια δοκιμασία pull-down GST έδειξε την αλληλεπίδραση μεταξύ του EGFR συνδετήρα-CTFS και ZNF 5-8 του PLZF. Κάθε ανασυνδυασμένη GST-συντηγμένο CTF (GST-CTF) έλκεται προς τα κάτω FLAG-επισημασμένη PLZF εξίσου στα κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν από κύτταρα ΗΤ1080 που εκφράζουν FLAG-tagged PLZF (Σχ. 2C, πίνακας 1). Ερευνήσαμε περαιτέρω τις περιοχές πρόσδεσης του CTFS σε PLZF. Διάφορα FLAG-tagged παράγωγα PLZF (Σχ. 2D) παρασκευάστηκαν και επωάστηκαν με ανασυνδυασμένη GST-EGFR συνδετήρα-CTFS. Το δάχτυλο περιοχή ολόκληρη ψευδαργύρου (ZnF1-9) και ZnF5-8 κατεδαφίστηκαν εξίσου από την GST-TGF-α-CTF, GST-AR-CTF και GST-EPR-CTF καθώς και HB-EGF-CTF, αλλά όχι GST μόνο (Σχ. 2C, πάνελ 3 και 4). Καμία από τις τέσσερις GST-CTFS γκρέμισαν το μεταλλαγμένο διαγραφή λείπει μια περιοχή δακτύλου ψευδαργύρου (ΤΔΕ + Κέντρο) (Εικ. 2C, πίνακας 2). Στη συνέχεια εξετάστηκε εάν οι μεταλλάξεις διαγραφής του ZnF6-7 (PLZF /ΔZnF6-7) και ZnF5-8 (PLZF /ΔZnF5-8) δεσμεύουν το GST-CTFS. Η διαγραφή του ZnF6-7 καταργηθεί η δέσμευση του PLZF σε GST-ΤΟΡ-α-CTF και GST-HB-EGF-CTF, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο ΤΟΡ-α-CTF και ΗΒ-EGF-CTF αλληλεπιδρούν με PLZF μέσω ZnF6-7. Σε αντίθεση, PLZF /ΔZF6-7 δεσμεύεται ασθενώς με GST-AR-CTF και GST-EPR-CTF (Σχ. 2C, πίνακας 5). Τέλος, ελέγξαμε εάν ZF5-8 είναι μια κρίσιμη περιοχή για την αλληλεπίδραση με το AR-CTF ή EPR-CTF. PLZF /ΔZnF5-8 δεσμεύεται κανένα από τα GST-CTFS (Σχ. 2C, πίνακας 6). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η περιοχή ZnF5-8 είναι κρίσιμη για τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ PLZF και CTFS.

Ασθενής συγγένεια δέσμευσης της HB-EGF-CTF και PLZF ήταν σημαντικό για την πυρηνική εξαγωγή του PLZF

Για να διευκρινιστεί περαιτέρω κατά πόσον οι τέσσερις CTFS αλληλεπιδρούν άμεσα με PLZF, αναλύσαμε τη σύνδεση μεταξύ του CTFS και ανασυνδυασμένου GST-tagged ZnF5-8 (GST-ZnF5-8) χρησιμοποιώντας SPR συστήματος. GST-ZnF5-8 δεσμεύονται με ακινητοποιημένο βιοτίνη-AR-CTF και βιοτίνη-EPR-CTF (Σχ. 3Α) σε μία συγκέντρωση 0,03 έως 1,0 μΜ. Η

K

D για την αλληλεπίδραση μεταξύ GST-ZnF5-8 και βιοτίνη-AR-CTF ήταν 76,5 nM, και για GST-ZnF5-8 και βιοτίνη-EPR-CTF ήταν 146 nM (Πίνακας 1 ). Σε αντίθεση, η

K

τιμή D για την αλληλεπίδραση μεταξύ GST-ZnF5-8 και βιοτίνη-HB-EGF-CTF δεν ήταν υπολογίζονται λόγω της ταχείας διάσπασης τους. Η σύνδεση του σήματος του GST-ZnF5-8 σε ακινητοποιημένο βιοτίνη-ΤΟΡ-α-CTF παρατηρήθηκε, αλλά ήταν χαμηλότερη από εκείνη των βιοτίνη-AR-CTF ή βιοτίνη-EPR-CTF. Έτσι, η σταθερά διάστασης δεν θα μπορούσε να υπολογιστεί λόγω της απουσίας του δοσοεξαρτώμενη πρόσδεση της GST-ZF5-8 σε συγκέντρωση ≤0.5 μΜ και παρεμβολή με τις ελεύθερες κατάλοιπα SH των επτά κυστεϊνών στο ΤΟΡ-α-CTF (Σχ . 3Α).

(α) άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ του EGFR-συνδέτη-CTF και PLZF (GST-tagged-ZnF5-8) με το σύστημα SPR. Το ανασυνδυασμένο βιοτίνης-EGFR- συνδετήρα-CTFS μεμονωμένα ακινητοποιημένο, με τσιπ αισθητήρα SA. GST-Zn5-8 με συγκεντρώσεις εύρους από 0,03 ως 1,0 μΜ ακολούθως ένεση με τρεχούμενο ρυθμιστικό διάλυμα στους 25 ° C και ένα ρυθμό ροής 30 μL /λεπτό για 2 λεπτά. (Β) Η έκφραση φορέα που κωδικοποιεί CFP-PLZF συν-διαμολύνθηκε σε κύτταρα ΗΤ1080 άγριου τύπου και των κυττάρων ΗΤ1080 που εκφράζουν σταθερά είτε proHB-EGF, proTGF-α, proAR ή proEPR. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες και στη συνέχεια προκατεργασία σε μέσο ελεύθερο ορού με ΚΒ-R7785. Τα κύτταρα στη συνέχεια επεξεργασία με τον ελεύθερο ορού ρυθμισμένο μέσο με ΤΡΑ, και παρατηρήθηκε η υποκυτταρική εντόπιση της πρωτεΐνης σύντηξης ΚΑΠ. Για να προσδιοριστεί το ποσοστό των κυττάρων (μέσος όρος ± SD) καταδεικνύοντας πυρηνικό εντοπισμό του ΚΑΠ-PLZF, τα κύτταρα μετρήθηκαν σε δύο τουλάχιστον επιμολύνσεις, και τουλάχιστον 200 κύτταρα τα οποία εκφράζουν CFP-PLZF εξετάστηκαν σε κάθε πείραμα. * Ρ & lt? 0,05 για το φαινόμενο του ερεθίσματος κατά τη θεραπεία με ΤΡΑ vs. χωρίς θεραπεία, και ** Ρ & lt? 0,05 για την ανασταλτική δράση κατά τη διάρκεια θεραπείας ΚΒ-R7785 εναντίον θεραπεία ΤΡΑ. (Γ) Ένα σχηματικό της υψηλής απόδοσης σύστημα AlphaScreen. Κατά τη διέγερση στα 680 nm, ατμοσφαιρικό οξυγόνο μετατρέπεται σε μονήρες οξυγόνο (

1Ο

2) μέσω ενός φωτοευαισθητοποιητή που υπάρχουν στα σφαιρίδια δότη. Εάν οι χάντρες δέκτης βρίσκονται σε κοντινή απόσταση (& lt? 200 nm),

1Ο

2 μεταβιβάσεις ενέργεια του να θειοξένιου παράγωγα παρούσα στις χάντρες δέκτη που οδηγούν στην εκπομπή φωτός στα 520 – 620 nm. Ένα συγκρότημα αποτελείται από σφαιρίδια δότη επικαλυμμένα με στρεπταβιδίνη και βιοτινυλιωμένη EGFR συνδέτες-CTF. Ένα άλλο αποτελείται από σφαιρίδια αποδέκτη αντισώματος-συζευγμένο αντι-GST και GST-ZF5-8. Εάν παρουσιαστεί η σχέση μεταξύ του EGFR συνδετήρα-CTF και ZnF5-8, τα σφαιρίδια είναι αρκετά κοντά για να επιτρέψει την ανίχνευση ενός σήματος. Οποιεσδήποτε αναστολείς αυτής της αλληλεπίδρασης θα αύξανε την απόσταση μεταξύ των σφαιριδίων, και το σήμα θα χανόταν. (D) σήματα AlphaScreen της GST ή GST-Zn5-8 επωάζονται με διάφορες συγκεντρώσεις βιοτίνης-HB-EGF-CTF. (Ε) σήματα AlphaScreen βιοτίνης-HB-EGF-CTF επωάζονται με διάφορες συγκεντρώσεις GST ή GST-Zn5-8. (Ε) Οι ικανότητες σύνδεσης της HB-EGF, ΤΟΡ-α, αμφιρεγουλίνη (AR), και επιρεγουλίνη (EPR), για να PLZF με το σύστημα AlphaScreen.

Η

Στη συνέχεια, να διευκρινίσει την πυρηνική εξαγωγών του PLZF προκλήθηκε από την ΤΡΑ-διεγέρσιμο απόπτωση προσδεμάτων EGFR, ο υποκυτταρικός εντοπισμός της πρωτεΐνης PLZF εξετάστηκε κατά τη διάρκεια της ενδοκυτταρικής μετατόπισης των τεσσάρων CTFS. Ο φορέας έκφρασης που κωδικοποιεί CFP-PLZF επιμολύνθηκε σε κύτταρα ΗΤ1080 και τα σταθερώς επιμολυσμένα κύτταρα ΗΤ1080 που εκφράζουν είτε proHB-EGF, proTGF-α, proAR ή proEPR. Είναι γνωστό ότι τα κύτταρα άγριου τύπου ΗΤ1080 ιδιοσυστατικά εκφράζουν λιγότερο ΗΒ-EGF και έτσι η πυρηνική μετατόπιση του HB-EGF-CTF δεν παρατηρείται [14]. ΚΑΠ-PLZF ήταν κυρίως εντοπισμένη στον πυρήνα των κυττάρων ΗΤ1080 και στα τέσσερα προϊόντα επιμόλυνσης. θεραπεία με ΤΡΑ για 1 h προκάλεσε μια κατανομή των CFP-PLZF σε όλο το κυτταρόπλασμα των ΗΤ1080 /ΗΒ-ΕΟΡ, ΗΤ1080 /ΤΟΡ-α, και EPR κύτταρα ΗΤ1080 /. Ωστόσο, ΤΡΑ δεν μετέβαλε το υποκυτταρικό εντοπισμό της ΚΑΠ-PLZF στα ΗΤ1080 και των κυττάρων ΗΤ1080 /AR. Οι αναλογίες των CFP-PLZF εντοπισμό στον πυρήνα μετά ΤΡΑ-διεγέρσιμο απόπτωση ήταν σημαντικά χαμηλότερο σε ΗΤ1080 /ΗΒ-ΕΟΡ, ΗΤ1080 /ΤΟΡ-α και ΗΤ1080 EPR κύτταρα /(Σχ. 3Β). Προ-θεραπεία με 10 μΜ της ΚΒ-R7785, ενός αναστολέα μεταλλοπρωτεϊνάσης, κατήργησε αποτελεσματικά την συχνότητα της ΚΑΠ-PLZF πυρηνικής εξαγωγής μετά από ΤΡΑ διέγερση σε ΗΤ1080 /HB-EGF, ΗΤ1080 /TGF-α και ΗΤ1080 EPR κύτταρα /(Εικ. 3Β) . Περιέργως, η συχνότητα του πυρηνική εξαγωγή του PLZF συσχετίζεται αντίστροφα με τη συγγένειά του. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η συγγένεια της αλληλεπίδρασης CTF-PLZF επηρεάζει τον ενδοκυτταρικό εντοπισμό και τη λειτουργία των PLZF.

υψηλής απόδοσης Screening System Δοκιμασία για τους αναστολείς που μπλοκάρουν την αλληλεπίδραση μεταξύ των ZnF5-8 των PLZF και AR-ή ΗΒ -EGF-CTF Περιορισμένη 12 υποψήφιοι και οι τέσσερις ARBs

μια δοκιμασία διαλογής υψηλής απόδοσης αναπτύχθηκε σε Alphascreen® για διαλογή αναστολέα που μπλοκάρουν την αλληλεπίδραση μεταξύ ZnF5-8 και CTFS. Ο σχεδιασμός δοκιμασία AlphaScreen βασίζεται στο γεγονός ότι ένα σήμα μπορεί να ανιχνευθεί μόνο όταν επικαλυμμένα με στρεπταβιδίνη δότη και αντι-GST σφαιρίδια δέκτη αντίσωμα συζευγμένο με κλείνονται σε απόσταση 200 nm. Τα σφαιρίδια φέρονται σε στενή γειτνίαση για την αντίδραση αυτή μέσω ειδικών αλληλεπιδράσεων του ZnF5-8 και CTFS σύμπλοκα συζευγμένο με τους (Σχ. 3C). Αυξανόμενες συγκεντρώσεις βιοτίνης-HB-EGF-CTF δοσοεξαρτώμενο αύξησε το σήμα AlphaScreen, όταν επωάστηκαν με GST-ZnF5-8 (Σχ. 3D). Αυξανόμενες συγκεντρώσεις GST-ZnF5-8 επίσης εξαρτώμενο από τη δόση αύξησε το σήμα όταν επωάστηκαν με βιοτίνη-HB-EGF-CTF (Σχ. 3Ε). Τα σήματα AlphaScreen για την αλληλεπίδραση μεταξύ βιοτίνης-AR-CTF, βιοτίνη-EPR-CTF, βιοτίνη-ΤΟΡ-α-CTF, και βιοτίνη-HB-EGF-CTF με GST-ZnF5-8 ήταν συγκρίσιμες με τις συγγένειες δέσμευσης προσδιορίζονται με SPR σύστημα (Εικ. 3F).

Μια ανάλυση με βιοτίνη-AR-CTF και GST-Zn5-8 των PLZF μπορούσε σαφώς δείχνουν ανασταλτικές επιδράσεις της λαμβάνονται οι υποψήφιοι για την αλληλεπίδραση της βιοτίνης-AR-CTF με GST-Zn5- 8 του PLZF επειδή AlphaScreen σήμα βιοτίνης-AR-CTF ήταν υψηλότερη από βιοτίνη-HB-EGF-CTF. Με βάση την αποτελεσματικότητα τους να μπλοκάρουν την σύνδεση του AR-CTF καθώς και ΗΒ-EGF-CTF και να Zn5-8 του PLZF, δώδεκα υποψήφιοι, συμπεριλαμβανομένων no.8016, 7701 και 7804 λήφθηκαν με διαλογή 9000 χημικές ενώσεις (Εικ. 4Α ). Η% αναστολή του 10 μΜ όχι. 8016, 7701 και 7804 για την αλληλεπίδραση μεταξύ βιοτίνης-AR-CTF και GST-Zn5-8 του PLZF ήταν 30,4, 60,5 και 49,9, αντίστοιχα. Η ανασταλτική δράση της ένωσης no.8016 στην αλληλεπίδραση δεν ήταν το υψηλότερο (Πίνακας 2). Ωστόσο, No.8016 ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό ισχυρότερο μεταξύ δώδεκα υποψηφίων σε δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Σχ. 4Β). Με βάση τα αποτελέσματα του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, επιλέξαμε όχι. 8016 ως υποψήφιος. Η μισή μέγιστη ανασταλτική συγκέντρωση (IC

50) που λαμβάνεται με την ένωση αρ. 8016 ήταν 29,9 μΜ (Εικ. 4C).

δομικό τύπο (Α) Δώδεκα υποψήφιας ένωσης με βάση την αποτελεσματικότητα για το μπλοκάρισμα δέσμευσης του HB-EGF-CTF ή AR-CTF να Zn5-8 του PLZF με σύστημα AlphaScreen. (Β) Ανασταλτικά αποτελέσματα των δώδεκα υποψηφίων ενώσεων επί του πολλαπλασιασμού που προκαλείται από ΤΡΑ κυττάρων σε κερατινοκύτταρα με μια δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων. 2 × 10

4 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία στο ρυθμισμένο μέσο, ​​με ή χωρίς τις δώδεκα υποψήφιες ενώσεις κατά τη διάρκεια της ΤΡΑ διέγερση, και η απορρόφηση στα 450 nm προσδιορίστηκε κάθε 12 h έως 60 h. ** P & lt? 0,05 για τις ανασταλτικές επιδράσεις κατά τη διάρκεια 12 υποψήφιοι θεραπείας εναντίον της θεραπείας ΤΡΑ. (C, D) Τα ανασταλτικά αποτελέσματα των υποψηφίων, ειδικά ένωση no.8016 και telmisartan, σχετικά με την σύνδεση του AR-CTF να PLZF. Οικόπεδα με την επί τοις εκατό αναστολή έναντι διαφόρων συγκεντρώσεων της ένωσης no.8016 και telmisartan παρουσιάζονται με τα IC

50 τιμές που παρατηρούνται από το σύστημα AlphaScreen. (Ε) Ανασταλτικά αποτελέσματα των τριών υποψηφίων ARB για τη σύνδεση του AR-CTF να PLZF. Οικόπεδα με την επί τοις εκατό αναστολή έναντι διαφόρων συγκεντρώσεων του κάθε αναστολέα και αναστολή παρουσιάζονται με IC

50 τιμές.

Η

Στη συνέχεια, επικεντρώθηκε στο συγκεκριμένο συντακτικό τύπο της τετραζόλης διφαινυλίου στην υποψήφια ένωση και σε περαιτέρω διαλογή χημικών ενώσεων, συμπεριλαμβανομένων των ARB (δηλαδή τελμισαρτάνη, καντεσαρτάνη, ολμεσαρτάνη, και λοσαρτάνη). Με βάση την αποτελεσματικότητα του αποκλεισμού της δέσμευσης του AR-CTF να PLZF, το IC

50 του telmisartan, candesartan, ολμεσαρτάνη, και λοσαρτάνη ήταν 27,8, 21,9, 87,7 και 28,4 μΜ, αντίστοιχα, και χημικό δομικό τύπο τους παρουσιάζονται ( Το Σχ. 4D και Ε). Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η τελμισαρτάνη και candesartan είναι ικανοποιητικές οι υποψήφιοι στον αποκλεισμό τόσο HB-EGF-CTF και AR-CTF από την αλληλεπίδραση με PLZF.

No.8016 των δώδεκα υποψήφιες Ενώσεων και τελμισαρτάνη Σαθεροποιημένο

κυτταρικού πολλαπλασιασμού

κερατινοκυττάρων έχουν πολλά ενδογενή προδρόμων ΗΒ-EGF, και είναι χρήσιμη για την ανάλυση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού μέσω HB-EGF-CTF σηματοδότηση. Χρησιμοποιήσαμε τις κυτταρικές σειρές ΗΤ1080 όταν οι αναστολείς εξετάστηκαν [17]. Να εξετάσει κατά πόσον οι υποψήφιοι ενώσεις που μπλοκάρει την αλληλεπίδραση μεταξύ του CTFS και PLZF επίσης ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, εξετάσαμε τις ανασταλτικές επιδράσεις αυτών των δώδεκα υποψηφίων και τέσσερις αγγειοτενσίνης II τύπου 1 υποδοχέα (AT1R) αποκλειστές (ARB) σε ΤΡΑ που προκαλείται από κυτταρικό πολλαπλασιασμό των κερατινοκυττάρων με έναν προσδιορισμό πολλαπλασιασμού κυττάρων. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σε ρυθμισμένα μέσα με ή χωρίς 30 μΜ από τις δώδεκα υποψήφιες ενώσεις και 30 μΜ ARBs για μέχρι 60 ώρες με την παρουσία ΤΡΑ και η απορρόφηση μετρήθηκε κάθε 12 ώρες. Ενωση no.8016 και telmisartan βρέθηκαν να αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Σχ. 4Β, 5Β και D). Επιπλέον, οι τιμές απορρόφησης ανακτήθηκαν σταδιακά εκείνες του ΤΡΑ-προκαλούμενη επίπεδα (δηλαδή χωρίς ένωση no.8016 και telmisartan), όταν τα κύτταρα πλύθηκαν 12 ώρες μετά την επώαση με την ένωση no.8016 και τελμισαρτάνη (Σχ. 5Α και C).

(AD) Ανασταλτικά αποτελέσματα της ένωσης no.8016 (Α) και τέσσερα ARBs (Β) επί του πολλαπλασιασμού που προκαλείται από ΤΡΑ κυττάρων σε κερατινοκύτταρα με μια δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων. 2 × 10

4 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σε ρυθμισμένα μέσα με ή χωρίς την no.8016 ή τέσσερις ARBs διάρκεια ΤΡΑ διέγερση, και η απορρόφηση στα 450 nm προσδιορίστηκε κάθε 12 ώρες μέχρι 60 ώρες. (A, C) Αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων με no.8016 και telmisartan επαληθεύθηκε μετά από μια πλύση σε 12 ώρες.