Αφηρημένο

Αν και με αντοχή πολυφαρμάκου πρωτεΐνη που συνδέεται-1 (MRP 1) είναι μια σημαντική συμβολή για την πολυ-φάρμακο αντίστασης (MDR), ο ρυθμιστικός μηχανισμός της MRP1 παραμένει ασαφής. Nrf2 είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας που ρυθμίζει την κυτταρική ανταπόκριση της άμυνας, μέσω της αντιοξειδωτικής στοιχεία απόκρισης (Άρη) σε φυσιολογικούς ιστούς. Πρόσφατα, Nrf2 έχει αναδειχθεί ως μια σημαντική συμβολή στην χημειο-αντίσταση σε ιστούς όγκων. Στην παρούσα μελέτη, ο ρόλος του Nrf2-ARE οδού για τη ρύθμιση της MRP1 διερευνήθηκε. Σε σύγκριση με τα καρκινικά κύτταρα Η69 πνεύμονα, τα κύτταρα H69AR με MDR έδειξε σημαντικά υψηλότερη Nrf2-ΕΙΝΑΙ οδού δραστηριότητα και την έκφραση της MRP1, καθώς και. Όταν Nrf2 χτυπήθηκε κάτω σε κύτταρα H69AR, έκφραση MRP1 μειώθηκε αναλόγως. Επιπλέον, αυτά τα κύτταρα H69AR με μειωμένο επίπεδο Nrf2 αποκατασταθεί ευαισθησία στην χημειο-φάρμακα. Για να διερευνήσουν πώς Nrf2-ARE μονοπάτι ρυθμίζει MRP1, ο υποκινητής του γονιδίου MRP1 αναζητήθηκε, και-οι ARE2 βρέθηκαν δύο υποθετικές Ares-ARE1 και. Χρησιμοποιώντας γονιδίου αναφοράς και προσδιορισμού ChIP, τόσο ARE1 και ARE2 έδειξαν ανταπόκριση και την αλληλεπίδραση με Nrf2. Σε 40 περιπτώσεις καρκινικούς ιστούς, η έκφραση του Nrf2 και MRP1 μετρήθηκε με ανοσοϊστοχημεία (IHC). Καθώς τα δεδομένα ποσοτική του IHC υποδεικνύεται, τόσο Nrf2 και MRP1 έδειξε σημαντικά υψηλότερη έκφραση σε καρκινικό ιστό από γειτονικό μη καρκινικό ιστό. Και πιο σημαντικό, η ανάλυση συσχέτισης των δύο γονιδίων απέδειξαν ότι η έκφραση τους ήταν συσχετικός. Στο σύνολό τους, διατριβές δεδομένα υποδηλώνουν ότι η Nrf2-ARE οδού απαιτείται για τη ρυθμιστική έκφραση της MRP1 και εμπλέκονται Nrf2 ως ένα νέο θεραπευτικό στόχο για MDR

Παράθεση:. Ji L, Li H, Gao P, Shang G, Zhang DD, Zhang N, et al. (2013) Nrf2 Pathway Ρυθμίζει με αντοχή πολυφαρμάκου Associated Protein 1 σε μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 8 (5): e63404. doi: 10.1371 /journal.pone.0063404

Επιμέλεια: Oliver Eickelberg, Helmholtz Zentrum München /Ludwig-Maximilians-Πανεπιστήμιο του Μονάχου, Γερμανία

Ελήφθη: 3 Φλεβάρη 2013? Αποδεκτές: 2 του Απρίλη 2013? Δημοσιεύθηκε: May 7, 2013

Copyright: © 2013 Ji et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η χρηματοδότηση που προβλέπεται από την Επιστήμη και την Τεχνολογία Επιτροπή του Δήμου Σαγκάης (11ZR1402400 σε TJ), https://www.stcsm.gov.cn/structure/index.htm? το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (30900538 έως HL), https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm? το Εθνικό Ινστιτούτο Περιβαλλοντικής Υγείας (2R01 ES015010 να Ddz), https://www.niehs.nih.gov/? και το Εθνικό Ίδρυμα Καρκίνου (R01 CA154377 να Ddz), https://www.nci.cu.edu.eg/. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η πολυανθεκτικότητα (MDR) είναι ένα σημαντικό εμπόδιο στη θεραπεία του κακοήθους καρκίνου. Είναι ένα φαινόμενο στο οποίο τα καρκινικά κύτταρα εμφανίζουν μειωμένη ευαισθησία σε μια μεγάλη ομάδα μη συναφών φαρμάκων με διαφορετικούς μηχανισμούς φαρμακολογική δράση αν αυτό συμβαίνει στην πρωτογενή θεραπεία (ενδογενές) ή αποκτάται κατά τη διάρκεια ή μετά τη θεραπεία [1]. Μηχανιστικά, τα φαινόμενα αντοχής μπορεί να εξηγηθεί από μια σειρά από ζητήματα, τα οποία περιλαμβάνουν μειωμένη συσσώρευση του φαρμάκου λόγω της υπερ-έκφραση των πρωτεϊνών μεταφοράς, αύξηση της αποτοξίνωσης, μεταβάλλεται στόχους και μειωμένη μονοπάτι της απόπτωσης [2]. Ένα από τα πιο ευρέως μελετηθεί πτυχές της MDR είναι η μείωση του ενδοκυτταρική συσσώρευση του φαρμάκου, στο οποίο δέσμευσης ΑΤΡ κασέτας (ABC) μεταφορείς που εκφράζονται στην πλασματική μεμβράνη είναι διαβόητη μεσολαβητές της MDR [3].

Η πολυφαρμακευτική-με αντοχή συναφείς proteints (MRPs) ανήκουν σε υποοικογένειας C του μεταφορέα υπερ ABC (ABCC). Στον άνθρωπο, η οικογένεια MRP αποτελείται από πολλά μέλη (MRP1-MRP9), εκ των οποίων, MRP1 διαδραματίζει πολύ σημαντικό ρόλο στην MDR. Ως ένα από τα μεταφορά πρωτεϊνών ABCC φάρμακο, MRP1 κλωνοποιήθηκε αρχικά υψηλά υπερ-εκφράζεται σε δοξορουβικίνη-επιλεγμένο αντοχής πολυφαρμάκου ανθρώπινη κυτταρική γραμμή καρκινώματος πνεύμονα H69AR [4]. Στα κύτταρα όγκου, ο 190 kDa MRP1 μπορεί να προσδώσει αντίσταση σε όχι μόνο δοξορουβικίνη, αλλά και πολλά άλλα ευρέως χρησιμοποιούμενο αντινεοπλασικό φάρμακο, όπως η μεθοτρεξάτη (ΜΤΧ), δαουνορουβικίνη, βινκριστίνη και ετοποσίδη [5].

Αν και MRP1 έχει αναδείχθηκε ως μια σημαντική συμβολή στην χημειοαντίσταση, ο μοριακός μηχανισμός για την επαγωγή της MRP1 δεν έχει διευκρινιστεί. Πολλά ρυθμιστικά στοιχεία έχουν ήδη εντοπισθεί για τον έλεγχο της έκφρασης και επαγωγιμότητα της MRPs [6], [7], [8]. Ωστόσο, υπάρχουν σημαντικές ενδείξεις που δείχνουν την επαγωγή των ενζύμων φάσης ΙΙ και MRPs είναι παρόμοια. [9], [10], [11]. Δεδομένου ότι η επαγωγή της φάσης ενζύμων ΙΙ διαμεσολαβείται κυρίως μέσω στοιχείων αντιοξειδωτικής απόκρισης (ARE ή EpREs) [12], αυτό δείχνει ότι ο πιο πιθανός υποψήφιος για μια συντονισμένη ρύθμιση της έκφρασης των MRPs είναι, επίσης, είναι [13], η οποία έχει ένα κοινό 5 «- (G /A) TGACnnnGC (G./A) -3 ‘μοτίβου [14]. Πρόσφατα, στον ποντικό MRP2 [15], [16], Mrp3 και Mrp4 γονίδιο [16], ΟΙ-όπως ακολουθίες ταυτοποιήθηκαν, υποδηλώνοντας τον πιθανό ρόλο του ARE μοτίβο στη ρυθμιστική έκφραση της MRP1. Για παράδειγμα, και οι δύο γ-GCS, το γνωστό αντιοξειδωτικό ένζυμο και MRP1 όλα επάγεται από το οξειδωτικό στρες [17]. Απέδειξε ότι η έκφραση της MRP1 μπορεί να ρυθμίζεται προς τα πάνω με οξειδοαναγωγικά-δραστικές ενώσεις, quercetin σε MCF-7 κύτταρα [18]. Ωστόσο, η περαιτέρω προσδιορισμό γονιδίου αναφοράς έδειξε ότι ένας υποψήφιος ARE μοτίβο βρίσκεται στο εγγύς υποκινητή του γονιδίου MRP1 φάνηκε να είναι άνευ σημασίας για την επαγωγή. Αργότερα, ένα υποθετικό ΕΙΝΑΙ /ΑΡ-1 θέση σύνδεσης στο -511 -477 να ανοδικά της μεταγραφικής θέσης έναρξης στο ανθρώπινο γονίδιο MRP1 ταυτοποιήθηκε και λειτούργησε ως ένας μεταγραφικός ενισχυτής [19]. Ωστόσο, ακόμα δεν μεσολαβούν επαγωγή ενός γονιδίου ανταποκριτή της λουσιφεράσης κατά την αγωγή β-ναφθοφλαβόνη, γεγονός που υποδηλώνει ότι υπάρχει ίσως άλλο, είναι (α) υφίστανται [19]. Αν και η μελέτη με τη χρήση Nrf2 άγριου τύπου και knockout ποντικού ινοβλάστες εμβρύου επιβεβαίωσε ότι Nrf2 απαιτείται για την συστατική και την επαγώγιμη έκφραση MRP1 [20], πώς Nrf2 μεσολαβεί η μεταγραφική ενεργοποίηση των MRP1 παραμένει ασαφής, δεδομένου ότι η ακριβής ARE (ες) δεν είχε εντοπιστεί ακόμα.

Nrf2 αναγνωρίστηκε ως ο κύριος παράγοντας μεταγραφής που μεσολαβεί ARE με γνώμονα την μεταγραφή [12]. Ρυθμίζει την αντιοξειδωτική απόκριση με την εισαγωγή της έκφρασης των γονιδίων που φέρει σε ρυθμιστικές περιοχές τους, όπως NQO 1, GCS, και ΗΟ-1 [21], [22], [23], Ο ρυθμίζεται αρνητικά από Kelch-όπως ECH -associated πρωτεΐνη 1 (Keap 1), έναν προσαρμογέα υπόστρωμα για την εξαρτώμενη από Cul3 Ε3 ουμπικουιτίνης συγκρότημα λιγάση [24]. Η ενεργοποίηση της οδού της Nrf2 συνθέτει ένα κυψελοειδές σύστημα προστασίας που προάγει την κυτταρική επιβίωση υπό κακές περιβάλλοντα [25], [26]. Ωστόσο, πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι ιδιοσυστατικά υψηλό επίπεδο της Nrf2 προάγει σχηματισμό καρκίνου και συμβάλλει στην χημειοαντίσταση [27], [28], [29], [30], η οποία ονομάζεται σκοτεινή πλευρά του Nrf2 οδού. Down ρύθμιση του Nrf2 ευαισθητοποιεί κύτταρα σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες, ενώ επάνω ρύθμιση ενισχύει την αντίσταση σε ποικιλία καρκινικών κυττάρων [31], [32], [33], [34]. Σε περαιτέρω υποστήριξη ενός ρόλου για Nrf2 σε χημειοαντίσταση, η έκφραση της Nrf2 σε καρκινικά κύτταρα είναι αυξημένη κατά την διάρκεια απόκτηση αντίστασης στα φάρμακα [35], [36]. Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι Nrf2 συμβάλλει στην χημειοαντίσταση παρατηρείται σε πολλούς τύπους καρκίνου. Ωστόσο, πώς Nrf2 παίζει έναν τέτοιο ρόλο εξακολουθεί να παραμένει άγνωστη. Για παράδειγμα, το οποίο μοριακής που ρυθμίζεται αυστηρά από Nrf2 οδός είναι υπεύθυνη για χημειοαντίσταση; Είναι MRP1 ένας από τους υποψηφίους;

Σε αυτή τη μελέτη διερευνήσαμε την ρυθμιστικό ρόλο της Nrf2 στην έκφραση MRP1 όχι μόνο σε επίπεδο καλλιεργημένο κύτταρο, αλλά επίσης και σε ιστό ασθενών με καρκίνο ». Δείξαμε MRP1 είναι ένα από κατάντη γονίδια του Nrf2, όπως επιβεβαιώσαμε δύο είναι μοτίβα στην περιοχή προαγωγού του γονιδίου MRP1. Επιπλέον, υπάρχει ένας μεγάλος συσχετισμός μεταξύ της MRP1 και έκφραση Nrf2 σε διαφορετικούς τύπους κακοήθων όγκων. Με μια λέξη, καθώς όλο και περισσότερες προσοχή δόθηκε στο ρόλο της Nrf2 στην χημειοαντίσταση, η μελέτη μας έδειξε την λεπτομερή μηχανισμό για το πώς Nrf2 παίζει αρνητικό ρόλο της.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

λάβει άδεια να χρησιμοποιούν τα τμήματα του ιστού για ερευνητικούς σκοπούς έγινε και εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας από τη Σαγκάη Medical College, Πανεπιστήμιο Fudan, Κίνα, και μια γραπτή μορφή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς.

αντιδραστήρια

τα πολύκλωνα αντισώματα, συμπεριλαμβανομένων αντι-Nrf2, MRP1, MRP2, τουμπουλίνης, β-ακτίνη ήταν όλα αγοραστεί από Σάντα Κρουζ Inc. (Καλιφόρνια, ΗΠΑ). Τριτ.-βουτυλυδροκινόνη (TBHQ), η σουλφοραφάνη (SFN) και όλα τα χημικά, συμπεριλαμβανομένων σισπλατίνη, η δοξορουβικίνη και ετοποσίδη ήταν αγορά από την Sigma Co. (St. Louis, ΜΟ, USA). Dual-Luciferase Assay System Reporter αγοράστηκε από την Promega (Madison, WI, USA). Όλα τα αντιδραστήρια ήταν αναλυτικής καθαρότητας.

Οι κυτταρικές σειρές, καλλιέργεια κυττάρων και η βιωσιμότητα των κυττάρων δοκιμασία

μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κυτταρική γραμμή Η69, πολυανθεκτική μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κυτταρική σειρά καρκίνου H69AR και MDA-MB -231 κυτταρική γραμμή αγοράστηκαν από την ATCC (Manassas, VA, USA). Η69 και H69AR κύτταρα διατηρήθηκαν σε ATCC-μορφοποιηθούν RPMI-1640, συμπληρωμένο με 10% και 20% (ν /ν) εμβρυϊκό βόειο ορό, αντίστοιχα. MDA-MB-231 καλλιεργήθηκε σε μέσον L-15 ATCC-τυποποιούνται Leibovitz με 10% (ν /ν) εμβρυϊκό βόειο ορό. Όλες οι καλλιέργειες αναπτύχθηκαν στους 37 ° C σε ατμόσφαιρα 5% CO2. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με την (4, 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2, 5-διφαινυλ τετραζόλιο (ΜΤΤ) 3- με βάση την λειτουργική αλλαγή των μιτοχονδρίων κατά τη διάρκεια του κυτταρικού θανάτου.

ανασυνδυασμένου DNA

Ένα ζεύγος εκκινητών σχεδιάστηκε περιέχουν θέσεις Xho Ι και Hind III για να ληφθεί η περιοχή του υποκινητή 992 bp από -817 έως +175 με αρίθμηση σε σχέση με τη θέση έναρξης της μεταγραφής (1), του ανθρώπινου MRP1 γονίδιο από το ανθρώπινο γενωμικό ϋΝΑ με PCR. Άλλα τέσσερα ζεύγη εκκινητές σχεδιάστηκαν για την κλωνοποίηση των δύο πιθανά στοιχεία είναι εντός της περιοχής του υποκινητή του γονιδίου MRP1 και μεταλλάκτες τους αναλόγως. Τα ενισχυμένα προϊόντα καθαρίστηκαν και πέψη με ενδονουκλεάση περιορισμού, και μετά κλωνοποιήθηκε σε pGL3-βασικό (Promega, Madison, WI). Οι ακολουθίες των εναύσματα που αναφέρονται στον πίνακα 1.

Η

siRNA επιμόλυνση και λουσιφεράσης

δοκιμασία γονιδιακής

Nrf2 siRNA και αντιδραστηρίου επιμόλυνσης Hiperfect αγοράστηκαν από την Qiagen (Valencia, CA) και επιμόλυνση του Nrf2 siRNA διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για προσδιορισμό γονιδίου αναφοράς λουσιφεράσης, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με πλασμίδια ανταποκριτές λουσιφεράσης για γονιδιακή MRP1 υποκινητή, AREs, μεταλλάκτες και λουσιφεράσης Renilla, μαζί με ένα φορέα έκφρασης για το ΗΑ-Nrf2. Firefly και λουσιφεράσης Renilla μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ανάλυσης γονίδιο διπλής λουσιφεράσης (Promega, Madison, WI) και αναλύθηκαν σε ένα GloMax 20/20 φωτόμετρο (Promega, Madison, WI).

χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση (ChIP )

ανάλυση ChIP διεξήχθη σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που παρέχονται από Upstate (ένα μέρος της Millipore, ΜΑ). Εν συντομία, MDA-MB-231 κύτταρα ή κύτταρα H69AR ή Η69 κύτταρα (περίπου 4 χ 10

7) ήταν διασυνδεδεμένη με φορμαλδεΰδη, συλλέγονται σε PBS, επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης SDS και υπερηχήθηκε σε πάγο. Τα προϊόντα λύσης στη συνέχεια αραιώνεται με ρυθμιστικό διάλυμα αραίωσης ChIP, προ-καθαρίζεται με πρωτεΐνη Αγαρόζης, και στη συνέχεια επωάστηκαν με υποδεικνυόμενα αντισώματα (4 μg /δείγμα) επί μία νύκτα. Τα ανοσοσύμπλοκα συλλέχθηκαν με πρωτεΐνη Α-αγαρόζη, πλένεται και εκλούεται. DNA-πρωτεΐνης διασυνδέσεις αντιστράφηκαν και ανακτήθηκε το DNA. Σχετική ποσότητες DNA στο σύμπλοκο ποσοτικοποιήθηκαν με πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας LightCycler 480 DNA SYBR Green Ι kit (Roche). Οι εκκινητές φαίνονται στον Πίνακα 2 σχεδιάστηκαν σύμφωνα με τις αλληλουχίες είναι εντός της περιοχής του υποκινητή του γονιδίου MRP1. Η επιβεβαιωμένη ΕΙΝΑΙ αλληλουχία του γονιδίου NQO1 χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για Nrf2 αλληλεπίδραση και την αλληλουχία προαγωγέα του γονιδίου τουμπουλίνης ως αρνητικός έλεγχος. Η δοκιμασία ChIP επαναλήφθηκε 3 φορές.

Η

Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qRT-PCR), δοκιμασία ανοσοστυπώματος

Όταν συλλέχθηκαν τα κύτταρα, το συνολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας διάλυμα ΤπζοΙ ( Invitrogen, Carlsbad, CA). Ίσες ποσότητες RNA (2 μα) αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιώντας τη σύνθεση Transcriptor First Strand cDNA Kit (Roche, ΙΝ, USA). Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν στην επόμενη δοκιμασία της PCR παρατίθενται στον πίνακα 2. Το συνθήκες qPCR ήταν ως εξής: ένας κύκλος αρχική μετουσίωση (95 ° C για 30 s), 40 κύκλους ενίσχυσης (μετουσίωση στους 95 ° C για 5 s, ανόπτηση στους 60 ° C για 30 s, και επέκταση στους 72 ° C για 30 s), ακολουθούμενη από μια περίοδο ψύξης (50 ° C για 5 s). Σχετική έκφραση mRNA προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το Rotor-Gene 3000 η οποία χρησιμοποιεί μία τροποποίηση της δέλτα-δέλτα μέθοδος Ct που προσαρμόζεται για την ενίσχυση της αποτελεσματικότητας μεταξύ των γονιδίων-στόχων και καθαριότητας. Τα δεδομένα PCR εκφράστηκαν ως σχετική μεταβολή φορές του γονιδίου στόχου μεταξύ θεραπεία και έλεγχο ομάδες. Το σημείο κύκλος τιμές (Cp) αναλύθηκαν με t-test του Student για να καθορίσουν μια τιμή Ρ.

Για προσδιορισμό ανοσοστυπώματος, τα κύτταρα ομογενοποιήθηκαν σε βούτυρο λύσης (0,1 Μ ρυθμιστικού διαλύματος Tris (ρΗ 7,4), 0,1 mM EDTA) υπό την παρουσία 1 mM διθειοθρεϊτόλη (DTT), 1 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο, και κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche, ΙΝ, USA). Η ίση ποσότητα δείγματος φορτώθηκε σε κάθε φρεάτιο μιας γέλης 7,5% και υποβλήθηκε σε SDS-PAGE. Τα πηκτώματα μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Η μεμβράνη στη συνέχεια επωάστηκε με πρωτεύοντα αντισώματα για 4 ° C όλη τη νύκτα έναντι Nrf2 (110 Κο), MRP1 (190 Κο), και MRP2 (~170 KD). Μετά από πλύσιμο με TBS-T, η μεμβράνη επωάστηκε με δευτερογενές αντίσωμα έναντι κουνελιού και IgG ποντικού και τα σήματα οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ECL plus western αποτύπωση του συστήματος. Όλα τα πειράματα που αναφέρονται παραπάνω έγιναν εις τριπλούν εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά.

Ασθενείς και ανοσοϊστοχημική ανάλυση

Οι ιστοί (n = 40), συμπεριλαμβανομένου του γαστρικού καρκίνου (n = 10), ο καρκίνος του μαστού (η = 10 ), καρκίνο του παχέος εντέρου (n = 10) και μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (n = 10) ελήφθησαν από το Τμήμα Παθολογίας, Σαγκάη Huashan Νοσοκομείο, την Κίνα, εντός του 2007. Όλες οι περιπτώσεις διαγνώστηκαν με 2 παθολόγους μεμονωμένα σε διπλά τυφλό τρόπο . Οι τομές παραφίνης χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε). Για ανοσοϊστοχημικές δοκιμασία, οι τομές αποπαραφινωθείσες διεξήχθησαν ανάκτηση αντιγόνου με θέρμανση σε ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικού νατρίου, ρΗ 6.0. Το πρωτογενές αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1:100 (NQO1 και Nrf2) και 1/50 (MRP1) για 1 ώρα στους 37 ° C και 4 ° C όλη τη νύκτα. Αντι-Nrf2 πολυκλωνικό αντίσωμα (ab76026) και αντι-MRP 1 μονοκλωνικό αντίσωμα (ab24102) αγοράστηκαν από την Abcam. Μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι NQO1 (SC-271116) αγοράστηκε από Santa Cruz. Οι χρωματισμένες τομές φωτογραφήθηκαν κάτω από οπτικό μικροσκόπιο σε μεγέθυνση 400χ, και αναλύθηκαν με το λογισμικό i-Solution (ΙΜΤ i-Διάλυμα INC., Vancouver, BC, Canada). Επιλέχθηκαν πέντε τυχαία οπτικά πεδία σε κάθε τμήματα και αναλύεται, και η θετική περιοχή υπολογίστηκαν, η οποία έδειξε σε ποσοστό (αναλογία των θετικών περιοχή σε ολόκληρο τον οπτικό πεδίο).

Η στατιστική ανάλυση

τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέσο ± SD. Στατιστική δοκιμές πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση t τεστ SPSS Statistics 19. Αζευγάρωτη Student χρησιμοποιήθηκαν για να συγκριθούν τα μέσα δύο ομάδες. Η μονόδρομη ANOVA εφαρμόστηκε σε σύγκριση των μέσων τρεις ή περισσότερες ομάδες. Η ανάλυση συσχέτισης Pearson έγιναν για να συγκρίνουν το επίπεδο έκφρασης της Nrf2, MRP1 και NQO1 από δυάρια. Οι πειραματικές διαφορές προσδιορίστηκαν με t-test και ρ & lt δύο ουρών του Student? 0.05 ελήφθη ως σημαντική διαφορά σε όλες τις περιπτώσεις

Αποτελέσματα

Σε αντίθεση με Η69 κύτταρα, κύτταρα H69AR έχει υψηλότερη Nrf2. ενεργοποίηση της οδού και το επίπεδο έκφρασης MRP1

Στο βασικό επίπεδο, η ενεργοποίηση του Nrf2 οδού συγκρίθηκε μεταξύ των κυττάρων Η69 και H69AR. Οι κατάντη γονίδια της Nrf2, όπως NQO 1, ΗΟ-1 και GST έδειξαν αυξημένη έκφραση mRNA σε κύτταρα H69AR, αλλά δεν υπήρξε καμία σημαντική διαφορά στην έκφραση του mRNA TXN (σχήμα 1, πλαίσιο Α, * Ρ & lt? 0,05 vs. Η69 κύτταρα). Είναι ενδιαφέρον, υπήρχε ένα υψηλότερο επίπεδο Nrf2 mRNA σε κύτταρα H69AR από Η69 κύτταρα, χωρίς διαφορά στη γονιδιακή Keap1 (σχήμα 1, πλαίσιο Α, * Ρ & lt? 0,05 vs. Η69 κύτταρα). Τόσο MRP1 και γονίδιο MRP2 έδειξε υψηλότερο επίπεδο mRNA σε κύτταρα H69AR, ειδικά MRP1 είχαν περισσότερο από 70 φορές σε κύτταρα H69AR να Η69 κύτταρα (Σχήμα 1, πλαίσιο Α, * Ρ & lt? 0,05 vs. Η69 κύτταρα). Στη συνέχεια το πρωτεϊνικό επίπεδο του Nrf2 μετρήθηκε στις δύο κυτταρικές σειρές. Συνεπής με τις αλλαγές στο επίπεδο mRNA, τα κύτταρα H69AR είχαν υψηλότερα ενεργοποίηση μονοπατιού Nrf2 από Η69 κύτταρα (Σχήμα 1, πλαίσιο Β) σε επίπεδο πρωτεΐνης. Επιπλέον, MRP1 και MRP2 έδειξε επίσης αυξημένη έκφραση σε κύτταρα H69AR (Σχήμα 1, πλαίσιο Β). Είναι ενδιαφέρον ότι η μείζων αρνητικός ρυθμιστής της Nrf2, Keap1 δεν έδειξε καμία διαφορά μεταξύ των δύο κυτταρικές γραμμές (σχήμα 1, πλαίσιο Β). Λαμβάνοντας υπόψη τον σημαντικό ρόλο που MRP1 και MRP2 παίζουν, τα κύτταρα H69AR έχουν αντοχή πολυ-χημειο φάρμακα, λόγω του υψηλού επιπέδου της MRP1 και MRP2. Όπως υποδεικνύεται δεδομένα ΜΤΤ μας, τα κύτταρα H69AR είχε περισσότερο ποσοστό βιωσιμότητας με τη θεραπεία φάρμακα χημειο, όπως δοξορουβικίνη, σισπλατίνη και ετοποσίδη (σχήμα 1, πλαίσιο C, D και Ε, Ρ * & lt? 0,05 vs. Η69 κύτταρα).

(Α) Σχετικό επίπεδο mRNA του Nrf2, Keap1, MRP1, MRP2, μαζί με NQO 1, ΗΟ-1, GST και TXN συγκρίθηκε σε κύτταρα Η69 και H69AR με πραγματικού χρόνου RT-PCR χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ΔΔCt με ΟΑΡϋΗ ως εσωτερικό έλεγχος. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα. (Β) επίπεδο πρωτεΐνης Keap1, Nrf2, MRP1, MRP2 συγκρίθηκε σε κύτταρα Η69 και H69AR με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας τουμπουλίνης ως εσωτερικός έλεγχος. Τα πειράματα διεξήχθησαν τρεις φορές και ένα αντιπροσωπευτικό ανοσοστύπωμα δείχθηκε εδώ. (Γ), (Δ) και (Ε) Η βιωσιμότητα των κυττάρων Η69 και H69AR με τη θεραπεία του Dox, σισπλατίνη και ετοποσίδη σε διαφορετικές δόσεις για 24 ώρες προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ. Οι πειραματικές διαφορές προσδιορίστηκαν με t-test και ρ & lt δύο ουρών του Student? 0.05 ελήφθη ως σημαντική διαφορά σε όλες τις περιπτώσεις

Η

εξόντωση Nrf2 οδηγεί σε μειωμένη MRP1 έκφρασης και ευαισθητοποιημένα κύτταρα H69AR για την πολυ. -chemo φάρμακα

για να αναλυθεί η ρύθμιση της MRP1 από Nrf2, ειδικά siRNA χρησιμοποιήθηκε για να γκρεμίσουμε την έκφραση Nrf2. Καθώς τα δεδομένα έδειξαν, η έκφραση του Nrf2 μειώθηκε περισσότερο από 50% σε αντίθεση με την ψευδο ομάδα (Εικόνα 2, πλαίσιο Α). Το πιο σημαντικό, το επίπεδο πρωτεΐνης MRP1 επίσης μειωθεί αναλόγως (Εικόνα 2, πλαίσιο Α), το οποίο σημαίνει MRP1 μπορεί να ρυθμίζεται από Nrf2 μονοπάτι. Όπως H69AR έδειξε αντοχή πολυ-χημειο φάρμακα, δίπλα η αντίσταση μετρήθηκε και πάλι όταν η έκφραση της Nrf2 χτυπήθηκε κάτω. Όπως ήταν αναμενόμενο, τα κύτταρα H69AR αποκατέστησε την ευαισθησία σε όλα τα τρία φάρμακα χημειο συμπεριλαμβανομένων δοξορουβικίνη, σισπλατίνη και ετοποσίδη, όταν το ειδικό siRNA χρησιμοποιήθηκε για να μειώσει σημαντικά την έκφραση του Nrf2 (Εικόνα 2, πλαίσιο Β, C και D, * Ρ & lt? 0,05 vs. μακέτα της ομάδας). Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα έδειξαν τον πιθανό ρόλο του Nrf2 σχετικά με τη ρύθμιση της MRP1 και επιβεβαίωσε το ρόλο του Nrf2 σε χημειο-αντίσταση.

(Α) κύτταρα H69AR διεξήχθησαν επιμόλυνση Nrf2 siRNA (10 ηΜ και 50 ηΜ) για 72 ώρες. Πρωτεΐνη έκφραση του Nrf2 και MRP1 προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας β-ακτίνης ως εσωτερικό έλεγχο. Τα πειράματα διεξήχθησαν τρεις φορές και ένα αντιπροσωπευτικό ανοσοστύπωμα δείχθηκε εδώ. (Β), (Γ) και (Δ) κύτταρα H69AR υποβλήθηκαν σε knockdown του Nrf2 με siRNA διαμόλυνση. Σαράντα οκτώ ώρες αργότερα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Dox, σισπλατίνη και ετοποσίδη σε διαφορετικές δόσεις για άλλες 24 ώρες, και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε δοκιμασία ΜΤΤ για να μετρηθεί η βιωσιμότητα των κυττάρων. Οι πειραματικές διαφορές προσδιορίστηκαν με t-test και ρ & lt δύο ουρών του Student? 0.05 ελήφθη ως σημαντική διαφορά σε όλες τις περιπτώσεις

Η

Το 5′-πλευρική περιοχή του γονιδίου της ανθρώπινης MRP1 περιέχει δύο είναι. αλληλουχίες

για να προσδιοριστεί η παρουσία αλληλουχίας βρίσκονται στην 5′-πλευρική περιοχή του γονιδίου της ανθρώπινης MRP1, ένα 992-bp μακρύ θραύσμα κλωνοποιήθηκε και προσδιορίστηκε η αλληλουχία από τα νουκλεοτίδια -817 έως +175 με αρίθμηση σε σχέση με τη μεταγραφή θέση έναρξης (υποδεικνύεται ως 1 στο Σχήμα 3). Η αλληλουχία νουκλεοτιδίων του 5′-πλευρική περιοχή του γονιδίου της ανθρώπινης MRP1 δείχθηκε στο Σχήμα 3. θέση έναρξης μεταγραφής ορίστηκε να είναι στο 5′-άκρο της αλληλουχίας MRP1 mRNA με τη μεγαλύτερη 5′-αμετάφραστη περιοχή, και εντοπισμένη 175 ζεύγη βάσεων ανοδικά της θέσης έναρξης μετάφρασης (υποδεικνύονται με έντονους χαρακτήρες στην Εικόνα 3). Εντοπίστηκαν μια σειρά ακολουθιών cis-δράσης. Είναι ενδιαφέρον ότι, δύο είναι-όπως ακολουθίες βρέθηκαν σε απομονωμένες περιοχές: η μία στις θέσεις -499 – -490 (ARE-1? GTGActcaGC, με πεζά γράμματα που υποδηλώνουν μη συντηρημένες βάσεις) και το άλλο στις θέσεις -66 έως -57 (ARE-2? gTGAgcggGC). Οι δύο είναι αλληλουχίες ήταν ταυτόσημες με την προηγουμένως αναφερόμενη ελάχιστη αλληλουχία ενισχυτή είναι (α /α) TGA (C /T /G) nnnGC [37]. Τα νουκλεοτίδια που πρόκειται να μεταλλαχθεί τονίστηκαν σε έντονα πλαγιαστά στο Σχήμα 3.

νουκλεοτίδια αριθμημένα σε σχέση με τη θέση έναρξης μεταγραφής (+1). Το κωδικόνιο έναρξης της μετάφρασης (ATG) ήταν με έντονους χαρακτήρες. Εγκλωβιστούμε περιοχή ενδείκνυται ARE1 και ARE2 αντίστοιχα. Τα νουκλεοτίδια που πρόκειται να μεταλλαχθεί σε αυτή τη μελέτη ήταν σε έντονα πλαγιαστά.

Η

Nrf2 μεσολάβηση επαγωγή της δραστηριότητας υποκινητή MRP1 εξαρτάται τόσο από ARE1 και ARE2

Για να διερευνηθεί η ανταπόκριση του 5 ‘ -flanking περιοχή του MRP1 να Nrf2, διπλή δοκιμασία γονίδιο αναφοράς λουσιφεράσης εκτελέστηκε. Πρώτον, η 992-bp ενισχύθηκε με PCR από ανθρώπινο γονιδιωματικό DNA με εκκινητές που παρατίθενται στον Πίνακα 1, και στη συνέχεια το προϊόν PCR κλωνοποιήθηκε σε pGL3-βασικό φορέα και ονομάσθηκε pGL3-wt. Δεύτερον, με βάση την pGL3-wt, οι δύο υποθετικές AREs και μεταλλαγμένων AREs ενισχύθηκαν και κλωνοποιήθηκε σε pGL3-βασικό φορέα, οι οποίες ονομάστηκαν pGL3-ARE1, pGL3-ARE2, pGL3-ΔARE1 και pGL3-ΔARE2 (η μεταλλαγμένη νουκλεοτίδια επισημαίνονται με έντονα πλαγιαστά στον πίνακα 1). Η δοκιμασία ρεπόρτερ απέδειξε ότι Nrf2 επάγεται την δραστικότητα προαγωγέα του γονιδίου MRP1 μετά συν-επιμόλυνση του pGL3-wt με Nrf2 εκφράζουν πλασμίδιο (Σχήμα 4, ομάδα Α, * Ρ & lt? 0,05 vs. μάρτυρα). Ανέφερε επίσης ότι η επαγωγή της δραστικότητας υποκινητή MRP1 συνδέθηκε με τα δύο υποθετικές άρια, αφού και οι δύο από αυτούς είχαν πάνω ρυθμισμένα με υπερέκφραση του Nrf2. Επιπλέον, η μετάλλαξη των οποίων αποκόπτεται την επαγωγή αναλόγως (Σχήμα 4, ομάδα Α, ** Ρ & lt? 0,05 ενάντια στον έλεγχο, *** Ρ & lt? 0,05 vs. μάρτυρα). Ωστόσο, δεν υπήρξε σημαντική διαφορά επαγωγής μεταξύ των δύο ares. Επιπλέον, NQO1 ΕΙΝΑΙ-Luc χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για να εξασφαλιστεί η εγκυρότητα της όλης δοκιμασίας, και η δοκιμασία ανοσοστυπώματος εκτελέστηκε για να βεβαιωθείτε ότι η υπερέκφραση του Nrf2 ήταν αρκετά ισοδύναμα (Σχήμα 4, Α, άνω πίνακας).

(Α) 231 κύτταρα επιμολύνθηκαν με πέντε λουσιφεράσης κατασκευάσματα αναφοράς (wt-Luc, ARE1-Luc, ARE2-Luc, ΔARE1-Luc και ΔARE2-Luc), και υποκινητή pGL3-βασικό (pGL3-Luc), NQO1-ARE-Luc και ρΡΙ_-ΤΚ χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικός έλεγχος, θετικός έλεγχος και του εσωτερικού ελέγχου, αντίστοιχα. Τα προαναφερθέντα πλασμίδια συν-επιμολύνθηκαν με ή χωρίς πλασμίδιο Nrf2-έκφρασης. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και οι δραστηριότητες της λουσιφεράσης μετρήθηκαν με ένα σύστημα δοκιμασίας διπλής λουσιφεράσης (κάτω πίνακας). Τα δεδομένα μέσα ± SD των τιμών από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Η ίση ποσότητα επιμόλυνσης των Nrf2 εξασφαλίστηκε από δυτικές Blot (άνω πάνελ). (Β) 231 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 40 μΜ tBHQ για τον ενδεικνυόμενο χρονικό σημείο, και στη συνέχεια συλλέχθηκαν για να υποβληθούν σε κηλίδα του ανοσοποιητικού για να μετρηθεί το επίπεδο πρωτείνης Nrf2. Τα πειράματα διεξήχθησαν τρεις φορές και ένα αντιπροσωπευτικό ανοσοστύπωμα δείχθηκε εδώ. (Γ), (Δ), (Ε) και (F) 231 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία ή όχι με 40 μΜ tBHQ για 24 ώρες και ήταν διασυνδεδεμένη με φορμαλδεΰδη. Επεξεργασία με υπερήχους χρωματίνη υποβλήθηκε σε ανοσοκαθίζηση με αντισώματα έναντι Nrf2 ή φυσιολογική IgG. Το καταβυθισμένο DNA ακολουθήθηκε από πραγματικό χρόνο PCR ανάλυσης με εναρκτήρες κατά MRP1 ARE1 (πάνελ C), MRP1 ARE2 (πάνελ D), NQO1 ARE (πίνακας Ε) και τουμπουλίνης προαγωγό (πάνελ F). Τα πειράματα διεξήχθησαν τρεις φορές και ένας εκπρόσωπος των τριών πειραμάτων που παρουσιάζονται εδώ.

Η

Στη συνέχεια, για να επιβεβαιώσει την πραγματική δέσμευση της Nrf2 με τις δύο υποθετικών Άρη, δοκιμασία ChIP πραγματοποιήθηκε τόσο σε 231 κύτταρα και μικρά κυττάρων καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων. Σύμφωνα με τον προσδιορισμό ανοσοστυπώματος του Nrf2 κατεργάζεται με tBHQ σε 231 κύτταρα, η γνωστή επαγωγέα Nrf2 μονοπάτι, ένας κατάλληλος χρόνος κατεργασίας του tBHQ 24 ώρες καθορίστηκε (Σχήμα 4, πίνακας Β). Έτσι 231 κύτταρα (4 χ 107) υποβλήθηκαν σε αγωγή με 40 μΜ tBHQ για 24 ώρες, και στη συνέχεια συλλέχθηκαν για υπόκεινται σε δοκιμασία chip. Σε σύγκριση με τον αρνητικό έλεγχο, η σύνδεση με ARE1 από Nrf2 αυξήθηκε σημαντικά (Σχήμα 4, πλαίσιο C, * Ρ & lt? 0,05). Επιπλέον, η θεραπεία με tBHQ γίνει η σύνδεση αυξήθηκε πολύ περισσότερο υψηλότερη (Σχήμα 4, πλαίσιο C,

# Ρ & lt? 0,05). Ομοίως, ARE2 έδειξε επίσης δέσμευση με Nrf2 με ή χωρίς επεξεργασία tBHQ (Σχήμα 4, πάνελ D, * P & lt? 0,05,

# P & lt? 0,05). Ωστόσο, η δέσμευση της Nrf2 με ARE2 ήταν χαμηλότερη από ό, τι ARE1 τόσο βασικό επίπεδο και σε επίπεδο θεραπείας tBHQ. Καθώς η έκφραση της Nrf2 ήταν πολύ υψηλότερο στα κύτταρα H69AR από Η69 κύτταρα (Εικόνα 1, πίνακας Β), έχουμε την επόμενη πραγματοποιηθεί μια συγκριτική ανάλυση τσιπ για να ελέγξετε αν αυξηθεί Nrf2 στα κύτταρα H69AR ήταν υποχρεωμένη να ARE1 και ARE2 στοιχεία MRP1 υποκινητή. Συνεπής με την προσδοκία μας, η σύνδεση με ARE1 από Nrf2 αυξήθηκε σημαντικά σε κύτταρα H69AR σύγκριση με Η69 κύτταρα (Σχήμα 5, πλαίσιο Α, * Ρ & lt? 0,05). Παρόμοια δεσμευτικά αποτελέσματα με ARE2 βρέθηκε επίσης (Σχήμα 5, πλαίσιο Β, * Ρ & lt? 0,05). Αυτό μπορεί να υποδηλώνει ένα μοριακό εξήγηση για την αυξημένη έκφραση MRP1 σε κύτταρα H69AR. Επιπλέον, η δέσμευση του Nrf2 με ARE2 ήταν χαμηλότερη από ό, τι ARE1 τόσο Η69 και H69AR κύτταρα, τα οποία ήταν σύμφωνη με τα αποτελέσματα σε 231 κύτταρα. Οι θετικοί και αρνητικοί έλεγχοι δοκιμασίας ChIP εξασφαλίσει το πείραμα ήταν πιστευτό και τα δεδομένα ήταν σταθερή (σχήμα 4, πάνελ Ε και F και το Σχήμα 5, πάνελ C και D). Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι οι δύο υποθετικές αρ για γονιδιακή περιοχή προαγωγού MRP1 ήταν πραγματικές AREs που θα μπορούσαν να ρυθμίζονται από Nrf2.

Η69 και τα κύτταρα H69AR ήταν διασυνδεδεμένη με φορμαλδεΰδη. Επεξεργασία με υπερήχους χρωματίνη υποβλήθηκε σε ανοσοκαθίζηση με αντισώματα έναντι Nrf2 ή φυσιολογική IgG. Το καταβυθισμένο DNA ακολουθήθηκε από πραγματικό χρόνο PCR ανάλυσης με εναρκτήρες κατά MRP1 ARE1 (πίνακας Α), MRP1 ARE2 (πίνακας Β), NQO1 ARE (πάνελ C) και τουμπουλίνης προαγωγό (πάνελ D). Τα πειράματα διεξήχθησαν τρεις φορές και ένας εκπρόσωπος των τριών πειραμάτων που παρουσιάζονται εδώ.

Η

Η έκφραση της Nrf2 και MRP1 ήταν διασυνδέσεων και υψηλότερη σε κακοήθεις όγκους από το γειτονικό μη καρκινικών ιστών

Εντελώς , 40 περιπτώσεις των κακοήθων όγκων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα, ο καρκίνος του μαστού, ο καρκίνος του στομάχου και του καρκίνου του παχέος εντέρου, επιλέχθηκαν για να μετρηθεί η

in vivo

έκφραση του Nrf2, MRP1, και NQO 1 καθώς και από την IHC. Για τον καρκίνο του πνεύμονα, επελέγησαν μόνο οι υποθέσεις που είχαν διαγνωστεί με μικροκυτταρικό καρκίνωμα του πνεύμονα (SCLC), όπου και οι δύο κύτταρα Η69 και H69AR προήλθε μορφή. Σε σύγκριση με το γειτονικό μη καρκινικό ιστό, ο ιστός καρκίνου του πνεύμονα έδειξαν δραματικά υψηλότερη έκφραση του Nrf2, MRP1 και NQO1 (Σχήμα 6, σύγκριση b2 πάνελ σε Α2, Β3 σε Α3, β4 να α4). Η χρώση HE στον πίνακα της αριστερής πλέον αποκάλυψε την κακοήθη υπερπλασία και των παρακείμενων μη καρκινικό ιστό, η οποία είναι χρήσιμη για τον εντοπισμό της θετικό σήμα σε IHC-χρωματισμένων τομών. Σε παρακείμενο μη καρκινικό ιστό, Nrf2 εκφράζεται κυρίως στους πυρήνες των επιθηλιακών κυττάρων (Σχήμα 6, πάνελ α2), και η έκφραση του MRP1 έγινε έδειξε τόσο στην κυτταρική μεμβράνη και κυτόπλασμα (Σχήμα 6, πάνελ α3). Για να εμφανίσετε το πυρηνικό εντοπισμό της Nrf2, μια επιλεγμένη περιοχή μέσα σε κάθε φωτογραφία της χρώσης Nrf2 ήταν διευρυμένη και συγχωνεύονται στην αρχική φωτογραφία στην πάνω αριστερή γωνία (Σχήμα 6, πάνελ α2-Η2, μαύρο βέλος). Ήταν δύσκολο να δούμε καμία προφανή έκφραση NQO1 εκτός αχνό θετικό σήμα σε διάσπαρτα κύτταρα σε παρακείμενες μη καρκινικό ιστό (Σχήμα 6, πάνελ α4). Σε ιστό καρκίνου του πνεύμονα, η έκφραση του Nrf2 περιορίστηκε σε καρκινικές κυτταρικές οζίδια εκτός από τα νεκρωτικά κέντρο κύτταρα. Τόσο κυτταρόπλασμα και πυρήνες έδειξε Nrf2 έκφραση, η οποία ήταν πολύ ισχυρότερη από ό γειτονικό μη καρκινικό ιστό (Σχήμα 6, πάνελ β2). Σε μια παρόμοια εκφράζουν μοτίβο με Nrf2, MRP1 εξέφρασε επίσης προφανώς και διάχυτα στους οζίδια του καρκίνου του πνεύμονα (Σχήμα 6, πάνελ β3). Ως ένα κατάντη γονίδιο Nrf2, η έκφραση μοτίβο NQO ήταν παρόμοιο με Nrf2 (Σχήμα 6, πάνελ Β4). Ήταν δύσκολο να δούμε οποιαδήποτε έκφραση της Nrf2, MRP1 και NQO1 στο διάμεσο ιστό. Σε ιστό καρκίνου του μαστού, η έκφραση του Nrf2, MRP1 και NQO1 ήταν σημαντικά υψηλή (Εικόνα 6, d2 πάνελ, D3 και D4), αν και ήπια έκφραση από αυτούς θα μπορούσε να φανεί σε παρακείμενες μη καρκινικό ιστό (Σχήμα 6, c2 πάνελ, c3 και C4). Τα τρία γονίδια σε καρκίνο του στομάχου και του παχέος εντέρου ήταν ομοειδή στην έκφραση μοτίβο, δηλαδή η έκφραση τους σε ιστό όγκου ήταν πολύ υψηλότερο από ό, τι σε παρακείμενες μη καρκινικό ιστό (Σχήμα 6, πάνελ e1 να Η4). Επιπλέον, τα δεδομένα χρώση IHC έδειξε την πιθανή συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης Nrf2 και MRP1.

Τα μη χρωματισμένα πλακίδια ιστών από μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, γαστρικό καρκίνο, καρκίνο του μαστού και καρκίνο του παχέος εντέρου υπέκειντο σε HE χρώση (Α1 έως Η1) και IHC χρώση με αντισώματα εναντίον Nrf2 (Α2 Η2), MRP1 (α3 να Η3) και NQO1 (Α4 Η4). Οι κλίμακες μπαρ είχαν επισημανθεί στην κάτω δεξιά γωνία κάθε εικόνων.

Η

Στη συνέχεια, τα τμήματα κηλίδωσης αναλύθηκαν και να μετρηθεί από το λογισμικό, i-Λύση για την ποσοτικοποίηση της έκφρασης της Nrf2, MRP1 και NQO1 στην σε όλες τις περιπτώσεις. Η έκφραση παρουσιάστηκε ως ο λόγος των θετικών περιοχή σε ολόκληρη την περιοχή. Σε όλες τις τέσσερις καρκινικούς ιστούς, Nrf2, MRP1 και NQO1 έδειξε σημαντικά υψηλότερη έκφραση σε αντίθεση με το γειτονικό μη καρκινικό ιστό (Σχήμα 7, πάνελ Α, * Ρ & lt? 0,05 vs φυσιολογικού ιστού, αντίστοιχα). Για να επιβεβαιώσετε τη συσχέτιση της έκφρασης τους από δυάρια, το τεστ συσχέτισης Pearson ήταν επόμενο πραγματοποιήθηκε. Σε πνευμονικού ιστού, συμπεριλαμβανομένων τόσο ιστού όγκου και των παρακείμενων μη καρκινικό ιστό, ο συντελεστής συσχέτισης Pearson (r) μεταξύ Nrf2 και MRP1 ισούται με 0.899 (Εικόνα 7, πλαίσιο Β, πάνω αριστερά, ** Ρ & lt? 0.001), πράγμα που σημαίνει την έκφραση των δύο γονιδίων ήταν συσχετικός. Ως ένα από τα κατάντη γονίδια της Nrf2, η έκφραση του NQO1 ρυθμίζεται από Nrf2, έτσι ώστε το r ισούται με 0.820 (Εικόνα 7, πλαίσιο Β, πάνω αριστερά, ** Ρ & lt? 0.005), η οποία επιβεβαίωσε τη ρύθμιση του NQO 1 με Nrf2. Όπως και η συσχέτιση της Nrf2 και MRP1 σε ιστό πνεύμονα, όλες οι άλλες 3 ιστών έδειξε αυτό σημαντική συσχέτιση πάρα πολύ, όπως στομαχικό ιστό (Εικόνα 7, πλαίσιο Β, άνω δεξιά), μαστικό ιστό (Εικόνα 7, πλαίσιο Β, κάτω αριστερά) και του παχέος εντέρου ιστού (Εικόνα 7, πλαίσιο Β, κάτω δεξιά). Ως εκ τούτου, τα δεδομένα αυτά χρώσης και στατιστική ανάλυση κατέδειξε τόσο Nrf2 και MRP1 εκφράστηκαν πολύ υψηλότερο σε ιστό όγκου από γειτονικό μη καρκινικό ιστό, και πιο σημαντικό, η έκφραση των δύο γονιδίων ήταν αλληλένδετες.

Πέντε τυχαία οπτικά πεδία