Αφηρημένο

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι μια θανατηφόρα ασθένεια, και νέων θεραπευτικών στόχων χρειάζονται επειγόντως. Έχουμε προηγουμένως εντοπιστεί ενίσχυση DNA στο 7q21-q22 σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές. Τώρα, με υψηλής ανάλυσης γονιδιακό προφίλ του ανθρώπινου παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές και ανθρώπινους όγκους (εμφυτεύτηκαν σε ποντίκια με ανοσοανεπάρκεια να εμπλουτίσουν το κλάσμα του καρκίνου του επιθηλίου), ορίζουμε μια 325 Kb ελάχιστη αμπλικόνιο που εκτείνονται σε

SMURF1

, μια Ε3 λιγκάσης της ουμπικουϊτίνης και γνωστές αρνητικός ρυθμιστής του αυξητικού παράγοντα μεταμόρφωσης β σηματοδότηση αναστολής αύξησης (ΤΟΡβ).

SMURF1

ενίσχυση επιβεβαιώθηκε σε πρωτογενείς ανθρώπινους καρκίνους του παγκρέατος με φθορισμό

in situ

υβριδισμού (FISH), όπου 4 από 95 περιπτώσεις (4,2%) εμφάνισαν ενίσχυση. Με παρεμβολή RNA (RNAi), knockdown του SMURF1 σε ένα ανθρώπινο παγκρεατικό καρκίνο γραμμή με εστιακή ενίσχυσης (AsPC-1) δεν μετέβαλε την κυτταρική ανάπτυξη, αλλά οδήγησε σε μειωμένη κυτταρική εισβολή και ανεξάρτητο από αγκύρωση ανάπτυξη. Είναι ενδιαφέρον, αυτή η επίδραση δεν προκαλείται μέσω μεταβληθεί σηματοδότηση ΤΟΡβ, προσδιορίστηκε με μεταγραφική ανταποκριτή. Τέλος, η υπερέκφραση του SMURF1 (αλλά όχι καταλυτική μεταλλαγμένο) οδήγησε σε απώλεια της αναστολής επαφής σε ΝΙΗ-3Τ3 κύτταρα ινοβλαστών εμβρύου ποντικού. Μαζί, αυτά τα ευρήματα εντοπίζουν

SMURF1

ως ενισχυμένο ογκογονίδιο οδήγηση πολλαπλές ογκογόνο φαινότυπο στον καρκίνο του παγκρέατος, και να προσφέρει μια νέα druggable στόχο για μοριακά κατευθυνόμενη θεραπεία

Παράθεση:. Kwei KA, Shain AH, Bair R, Μοντγκόμερι Κ, Karikari CA, van de Rijn M, et al. (2011)

SMURF1

Ενίσχυση Προωθεί ικανότητα εισβολής σε καρκίνο του παγκρέατος. PLoS ONE 6 (8): e23924. doi: 10.1371 /journal.pone.0023924

Επιμέλεια: Hana Algul, Τεχνικό Πανεπιστήμιο του Μονάχου, Γερμανία

Ελήφθη: 14 Δεκεμβρίου 2010? Δεκτές: 1 Αυγ 2011? Δημοσιεύθηκε: 22 Αυγούστου 2011

Copyright: © 2011 Kwei et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το ΝΙΗ: CA112016 (JRP), CA09151 (KAK), GI Καρκίνου SPORE CA62924 (AM)? ΝΙΗ /NCRR CTSA χορηγήσει UL1 RR025744 στο Στάνφορντ Spectrum? και το Ίδρυμα Lustgarten (J.R.P.). M.D.B. υποστηρίχθηκε εν μέρει από μια Βιοτεχνολογία στο εξωτερικό associateship από το Τμήμα Βιοτεχνολογίας, Υπουργείο Επιστημών και Τεχνολογίας, κυβέρνηση της Ινδίας. Οι συγγραφείς επίσης να ευχαριστήσω την οικογένεια της Margaret Lee και το Sol Goldman καρκίνο του παγκρέατος Ερευνητικό Κέντρο για την υποστήριξη των προσπαθειών ξενομεταμόσχευση στο Johns Hopkins. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (εφεξής, του καρκίνου του παγκρέατος) είναι σχεδόν πάντα μοιραία, με ένα ποσοστό πενταετούς επιβίωσης λιγότερο από 5% [1]. Είναι συχνά διαδίδονται κατά τη διάγνωση, και μπορεί να κάνει μετάσταση σε μεγάλο βαθμό. Η έγκαιρη ανίχνευση μπορεί να βελτιώσει την επιβίωση, αλλά η χειρουργική εκτομή είναι σπάνια θεραπευτική [2]. Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι επίσης σε μεγάλο βαθμό ανθεκτικό σε συμβατική χημειοθεραπεία. Ως εκ τούτου, οι νέες θεραπείες χρειάζονται επειγόντως. Σε ιδιαίτερα, θα είναι σημαντικό να ανακαλύψουμε και την επικύρωση νέων στόχων για μοριακά-κατευθυνόμενη θεραπεία.

Η μοριακή γενετική του καρκίνου του παγκρέατος είναι εν μέρει γνωστό [3], [4]. Σωματικές μεταλλάξεις ενεργοποίησης του

KRAS

(μερικές φορές συμβαίνουν με ενίσχυση γονιδίου) βρίσκονται σε & gt? 90% των καρκίνων του παγκρέατος. Επίσης κοινά είναι αδρανοποίηση μεταλλάξεις /διαγραφές των καταστολείς των όγκων

CDKN2A

(& gt? 95% των καρκίνων),

TP53

(50-75%), και

Smad4

(επίσης γνωστή ως

DPC4

) (55%), ένα τελεστή του ΤΟΡβ μεσολάβηση αναστολή της ανάπτυξης. Άλλες γονιδιακές μεταλλάξεις, κάθε μια εμφανιζόμενη σε λιγότερο από το 5% των καρκίνων, των επιπτώσεων αυτών και άλλων βασικών καρκίνο σηματοδότηση μονοπατιών [5].

γονιδιακό προφίλ μελέτες, με σειρά που βασίζεται σε συγκριτική γονιδιωματική υβριδισμού (array CGH), έχουν αρχίσει στον κατάλογο ενισχύσεις DNA και διαγραφές, εντοπίζοντας και αποκαλύπτοντας νέα γονίδια του καρκίνου του παγκρέατος (π.χ. [6], [7]). Μεταξύ αλλαγμένη loci, εμείς και άλλοι προηγουμένως ταυτοποιηθεί 7q21-q22 ως θέση σε επαναλαμβανόμενη ενισχύεται σε καρκίνο του παγκρέατος [8] – [13]. Εδώ, μπορούμε να περιορίσετε ότι τόπο, και χαρακτηρίζουν SMURF1 ως προϊόν ογκογονίδιο προώθηση της κυτταρικής εισβολής και αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη.

Αποτελέσματα

SMURF1

είναι εστιακά ενισχύεται σε καρκίνο του παγκρέατος

Είχαμε προηγουμένως εντοπιστεί επαναλαμβανόμενα ενίσχυση στο 7q21-q22 στο παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές, χρησιμοποιώντας CGH στις μικροσυστοιχίες cDNA [12]. Να οριοθετήσει περαιτέρω το αμπλικόνιο, και να εντοπίσουν τον κάτοικο ογκογονίδιο (s), τώρα πραγματοποιούνται πρόσθετες γονιδιακό προφίλ του μια συλλογή από 22 παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές και 58 έγκαιρης πέρασμα του παγκρέατος ξενομοσχεύματα καρκίνου, χρησιμοποιώντας υψηλής ανάλυσης συστοιχίες 244K Agilent CGH. Ο τόπος 7q21-q22 ήταν εστιακά ενισχύεται (όγκος /κανονική αναλογίες & gt? 3 φορές) σε 1 από 22 κυτταρικές γραμμές (4,5%) (AsPC-1), και σε 1 από 58 (2%) ξενομοσχεύματα. Συμπεριλαμβανομένων των κερδών χαμηλότερου επιπέδου (αναλογίες & gt? 1,3 φορές)., Το κέρδος /ενίσχυσης που εκτείνονται 7q21-q22 βρέθηκε σε 6 των 22 κυτταρικών σειρών (27%), και σε 19 από 58 (33%) ξενομοσχεύματα

Τέσσερα δείγματα (η κυτταρική σειρά AsPC-1, και τρία ξενομοσχεύματα) είχαν γονιδιωματικές προφίλ, τα οποία ήταν ιδιαίτερα κατατοπιστική κατά την οριοθέτηση των ορίων amplicon εντός 7q21-q22 (Εικ. 1Α). Το μικρότερο κοινή περιοχή του κέρδους διευρυμένοι μόλις 325 Kb μέσα cytoband 7q22.1, και περιείχε μόνο δύο REFSEQ [14] γονίδια,

SMURF1

(SMAD συγκεκριμένες Ε3 ουμπικουιτίνης πρωτεΐνης λιγάση) και

KPNA7

( karyopherin άλφα 7). SMURF1 είναι ένας γνωστός αναστολέας του ΤΟΡβ σηματοδότησης (μέσω της προώθησης αποικοδόμηση του υποδοχέα του TGFβRI, και μεσολαβητής σηματοδότηση Smad4 [15], [16]), μία οδός συχνά διαταράσσεται στον καρκίνο του παγκρέατος. Λαμβάνοντας υπόψη μια προφανή σύνδεση με παγκρέατος καρκινογένεση, εμείς, ως εκ τούτου επικεντρώνεται μετέπειτα προσπάθειες για

SMURF1

.

(Α) Μια ελάχιστη αμπλικόνιο ορίζεται από τέσσερις παγκρέατος δείγματα καρκίνου (AsPC-1 και τρία ξενομοσχεύματα). Ξεκινώντας από κάτω: ΧΡ 7 ιδεόγραμμα? Θερμικός χάρτης του αριθμού αντιγράφων του DNA (κόκκινο δείχνει κέρδος) για τα τέσσερα δείγματα σε όλη την περιοχή 7q21-q22 (91-101 Mb)? Διάγραμμα διασποράς του DNA καταγραφής αριθμού αντιγράφων

2 αναλογίες σε όλη 7q21.3-q22.1 (96-100 Mb), επικαλύπτονται με την cghFLasso [34] που ονομάζεται αναλογίες (κόκκινη γραμμή)? Στιγμιότυπο οθόνης του αντίστοιχου τόπου από το πρόγραμμα περιήγησης γονιδίωμα UCSC. Οι διακεκομμένες γραμμές περικλείουν το 325 Kb ελάχιστη προϊόν ενίσχυσης, το οποίο εκτείνεται σε

SMURF1

. (Β)

SMURF1

υπερεκφράζεται όταν αποκτήθηκε /ενισχύονται. οικόπεδα κουτί δείχνουν 25

ου, 50

ου (διάμεσος) και 75

ο εκατοστημόριο επίπεδα μεταγραφής (δοκιμασία με σειρά Agilent 44K) για τα δείγματα με (κόκκινο) ή χωρίς (γκρι) κέρδος 7q21-q22, για

SMURF1

και κοντινότερους γείτονές του γονιδίου της. Σημείωση,

KPNA7

ήταν που δεν εκπροσωπούνται στη συστοιχία. *,

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01? ***

P

& lt? 0.001 (Mann-Whitney U-test). (C) FISH αποκαλύπτει

SMURF1

ενίσχυσης σε πρωτογενείς καρκίνους του παγκρέατος. Εμφανίζονται είναι δύο παγκρέατος με

SMURF1

ενίσχυσης (

κέντρο

, και

δεξιά

), μαζί με ένα μη ενισχυμένο έλεγχο (κύτταρα BxPC3,

αριστερά

).

SMURF1

θέση του αισθητήρα (κόκκινο)? chr ελέγχου 7 κεντρομερίδιο (CRP7) ανιχνευτής (πράσινο).

Η

Σύμφωνα με ογκογόνο ρόλο,

SMURF1

μεταγραφή (που μετράται από μικροσυστοιχιών) ήταν σημαντικά αυξημένα σε κυτταρικές σειρές /ξενομοσχεύματα με 7q22 .1 κέρδος /ενίσχυσης (όπως ήταν αρκετές συν-ενισχύεται γειτονικών γονιδίων) (Εικ. 1Β). Για την αξιολόγηση

SMURF1

ενίσχυσης σε πρωτογενείς όγκους του παγκρέατος, μπορούμε επίσης να διεξαχθεί FISH σε μια μικροσυστοιχία ιστού που περιέχει 105 παγκρέατος περιπτώσεων καρκίνου. Τέσσερις από 95 (4,2%) αξιολογήθηκαν περιπτώσεις εμφάνισαν

SMURF1

ενίσχυσης (locus λόγος /κεντρομερίδιο & gt? 2,5) (Σχήμα 1Γ.), Συγκρίσιμο με τα ευρήματά μας CGH για ξενομοσχεύματα νωρίς-πέρασμα. Ήμασταν σε θέση να προσδιορίσει ένα κατάλληλο συνθήκες αντισώματος και χρώση για την αξιολόγηση της έκφρασης SMURF1 με ανοσοϊστοχημεία.

SMURF1

ενίσχυση προωθεί την κυτταρική εισβολή και αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη

Για να αξιολογήσει τις πιθανές ογκογόνο λειτουργίες των SMURF1, χρησιμοποιήσαμε πρώτα RNAi για knockdown έκφραση SMURF1 στο κατάλληλο πλαίσιο γονιδιακής ενίσχυσης, χρησιμοποιώντας κύτταρα AsPC-1. Η επιμόλυνση των τεσσάρων διαφορετικών μικρών RNAs παρεμβολής (siRNAs) ή μια ομάδα των τεσσάρων μαζί, κάθε οδήγησε σε μειωμένα επίπεδα πρωτεΐνης SMURF1 (με κηλίδα Western), σε σύγκριση με ένα μη-στόχευσης πισίνα siRNA (Σχ. 2Α). Εξόντωση SMURF1 δεν μετέβαλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, μετράται με WST-1 προσδιορισμό (Σχ. 2Β, C), και με BrdU ενσωμάτωση (Εικ. 2D), αλλά οδήγησε σε σημαντικά μειωμένη κυτταρική εισβολή μέσω Matrigel, που μετράται με τη δοκιμασία θαλάμου Boyden (Εικ . 2Ε). Μειωμένη εισβολή παρατηρήθηκε με κάθε μία από τις τέσσερις siRNAs που στοχεύουν διακριτές

SMURF1

ακολουθίες, ενώ ο ρυθμός αύξησης των κυττάρων παρέμειναν αμετάβλητα κατά το ίδιο χρονικό διάστημα (Σχ. 2C), υποστηρίζοντας σθεναρά τον ειδικό ρόλο των SMURF1 στην φαινότυπο εισβολής.

(α) τέσσερις διαφορετικές siRNAs που στοχεύουν

SMURF1

, και μια πισίνα των τεσσάρων, να οδηγήσει σε μειωμένα επίπεδα SMURF1 (με Western blot) σε σύγκριση με μη-στόχευσης πισίνα siRNA ελέγχου ). Οι υπολειμματικές επίπεδα SMURF1, εδώ ρυθμίζεται σύμφωνα με GAPDH, ανέφερε. (Β) SMURF1 νοκ ντάουν (με τη χρήση siRNA πισίνα) δεν μειώνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων /η βιωσιμότητα, μετρήθηκαν με τη δοκιμασία WST1, και γίνεται εις τριπλούν (μέση +/- 1 SD φαίνεται). (Γ) SMURF1 knockdown χρησιμοποιώντας τέσσερις διαφορετικές siRNAs δεν μεταβάλλει σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων /βιωσιμότητα, μετρήθηκαν τρεις ημέρες μετά την επιμόλυνση. Έγινε εις τριπλούν (μέση τιμή +/- 1 SD φαίνεται). (D) SMURF1 νοκ ντάουν δεν μειώνει την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου (S-φάση), μετρούμενη με ενσωμάτωση BrdU (1,5 ώρα και την επισήμανση των παλμών 4 ώρες), που έγινε εις τριπλούν (μέση τιμή +/- 1 SD φαίνεται). (Ε) SMURF1 νοκ ντάουν (με τη χρήση της πισίνας siRNA και ατομική siRNAs) αναστέλλει τον κυτταρικό εισβολής μέσω Matrigel. δοκιμασία θαλάμου Boyden γίνεται εις τριπλούν και η συγκομιδή τρεις ημέρες μετά την επιμόλυνση (μέση τιμή +/- 1 SD φαίνεται)? *,

P

& lt? 0,05 (έλεγχος τ). (F) SMURF1 νοκ ντάουν δεν ενισχύει TGFβ μονοπάτι με τη μεσολάβηση της μεταγραφής. AsPC-1 κύτταρα συν-επιμολυσμένα με siRNAs και p3TP-Lux δημοσιογράφος, γίνεται εις τριπλούν, και πυγολαμπίδα /Renilla αναλογίες λουσιφεράσης φαίνεται (που φαίνεται να σημαίνει +/- 1 SD). κύτταρα PANC1 (με άγριου τύπου

Smad4

) +/- TGFβ χρησιμεύσει ως θετικός μάρτυρας.

Η

Δεδομένου γνωστά, ανταγωνιστική λειτουργία της στην οδό TGFβ, προσπαθήσαμε επίσης να αξιολογήσουν την επίδραση του SMURF1 knockdown στον ΤΟΡβ σηματοδότηση, χρησιμοποιώντας ένα ΤΟΡβ αποκρίνεται ρεπόρτερ μεταγραφική (p3TP-Lux) [17]. Εξόντωση SMURF1 δεν ενίσχυσε ΤΟΡβ οδό διαμεσολαβούμενη μεταγραφή στο AsPC-1 κύτταρα (Σχ. 2F). Αξίζει να σημειωθεί, ωστόσο, τα κύτταρα AsPC-1 (όπως και οι περισσότεροι καρκίνοι του παγκρέατος) φιλοξενούν ένα μεταλλαγμένο

Smad4

, εδώ Smad4 (R100T) [18], η οποία χαρακτηρίζεται να αδρανοποιεί [19], [20]. Ως εκ τούτου, τα κύτταρα AsPC-1 είναι πιθανόν ανίκανος ενός TGFβ μονοπατιού μεταγραφική απόκριση. Γενικότερα, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι το κύριο αποτέλεσμα (ες) του

SMURF1

ενίσχυση /υπερέκφραση είναι πιθανό διαμεσολαβείται μέσω οδών διαφορετικές από TGFβ σηματοδότησης.

Για την αξιολόγηση της μακροπρόθεσμης φαινοτύπων, έχουμε επίσης σταθερά επιμολυσμένα με RNA μικρή φουρκέτα (shRNA) που στοχεύουν

SMURF1

. Σταθερό knockdown του SMURF1 σε AsPC-1 κύτταρα, που επιβεβαιώθηκε με κηλίδα Western (Εικ. 3Α), μείωσε σημαντικά αγκύρωση ανάπτυξη ανεξάρτητη (μαλακό αποικίες άγαρ), σε σύγκριση με ένα μη-στόχευσης ελέγχου shRNA (Σχ. 3Β).

(Α) σταθερά μεταγόμενα shRNA SMURF1 στόχευση οδηγεί σε μειωμένα επίπεδα SMURF1 (με στύπωμα Western) σε σύγκριση με έναν έλεγχο μη-στόχευσης shRNA. Οι υπολειμματικές επίπεδα SMURF1, εδώ ρυθμίζεται σύμφωνα με GAPDH, ανέφερε. (Β) Σταθερό SMURF1 knockdown μειώνει αγκύρωση ανάπτυξη ανεξάρτητη (δηλαδή μαλακά αποικίες άγαρ). Δοκιμασία γίνεται εις τριπλούν (μέσο +/- 1 SD φαίνεται)? *,

P

& lt?. 0.05 (t-test του Student)

Η

Θα επιδιωχθεί επίσης να αξιολογηθεί η επίδραση των siRNA νοκ ντάουν σε άλλες παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές. Επιλέξαμε δύο κυτταρικές σειρές, BxPC-3 κύτταρα τα οποία (όπως AsPC-1 κύτταρα και τα περισσότερα παγκρεατικών όγκων) έχουν μεταλλαχθεί

Smad4

(εδώ με ομόζυγη διαγραφή) [21], και τα κύτταρα τα οποία είναι HS700T άγριου τύπου για

Smad4

και έχουν μια άθικτη ΤΟΡβ ανασταλτική της ανάπτυξης οδού (Εικ. S1). Αξίζει να σημειωθεί ότι, καμία από αυτές τις γραμμές φιλοξενεί εστιακό ενίσχυση του

SMURF1

(κύτταρα AsPC-1 είναι ο μόνος συσταθεί σύμφωνα με εστιακή ενίσχυση), ούτε αυξημένα επίπεδα της πρωτεΐνης SMURF1 (Σχ. 4Α). Εξόντωση SMURF1 (επικυρωμένη με κηλίδα Western? Εικ. 4Β) οδήγησε σε μείωση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού συγκρατημένα σε BxPC-3 κύτταρα (Σχ 4C.), Και πολύ περισσότερο στην ανασταλτική ΤΟΡβ-ανάπτυξη μονοπάτι ανέπαφο HS700T κύτταρα (Σχ 4D.). SMURF1 knockdown είχε επίσης ως αποτέλεσμα μειωμένη εισβολή των κυττάρων σε BxPC-3 κύτταρα (Εικ. 4Ε), αν και όχι σε σημαντικό βαθμό. Ωστόσο, δεδομένου ότι

SMURF1

είναι ούτε εστιακά ενισχύεται ούτε υπερεκφράζεται σε αυτές τις γραμμές, μια απλή εξήγηση για τα ασύμφωνα φαινοτύπους (σε σύγκριση με AsPC-1) είναι ότι SMURF1 δεν μπορεί να λειτουργήσει ως οδηγός ογκογόνο σε αυτές τις κυτταρικές πλαίσια. ανάλυση

(Α) Western στύπωμα της ενδογενούς επιπέδων πρωτεΐνης SMURF1 σε ένα πάνελ του παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές. Σημειώστε ότι SMURF1 εκφράζεται έντονα μόνο στο 7q22.1-ενισχυμένο κυτταρική γραμμή AsPC-1. Οι δύο διαφορετικές εκθέσεις της κηλίδας SMURF1 φαίνεται? GAPDH χρησιμεύει ως μάρτυρας φόρτωσης. (Β) τον έλεγχο στυπώματος Western SMURF1 knockdown (με SMURF1 στόχευσης πισίνα siRNA, συγκριτικά με μη στόχευση πισίνα siRNA ελέγχου) σε BxPC-3 και HS700T κύτταρα. (C) Cell πολλαπλασιασμός /βιωσιμότητα προσδιορίστηκε (από WST-1) σε BxPC-3 κύτταρα μετά SMURF1 siRNA μεσολάβηση knockdown (σε σύγκριση με μη-στόχευση ελέγχου). Δοκιμασία γίνεται εις τριπλούν (μέσο +/- 1 SD φαίνεται)? *,

P

& lt? 0,05 (έλεγχος τ). (Δ) Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων /βιωσιμότητα προσδιορίστηκε σε κύτταρα HS700T, όπως παραπάνω. (Ε) Η εισβολή των κυττάρων προσδιορίστηκαν (με Boyden θάλαμο) σε BxPC-3 κυττάρων μετά SMURF1 νοκ ντάουν (σε σύγκριση με τον έλεγχο μη-στόχευση). Δοκιμασία γίνεται εις τριπλούν (μέσο +/- 1 SD φαίνεται). Σημείωση, η μειωμένη πολλαπλασιασμός που παρατηρήθηκε με SMURF1 knockdown σε κύτταρα HS700T αποκλείεται μία δοκιμασία του κυττάρου εισβολής (όπου εισέβαλαν οι αριθμοί των κυττάρων σε 72 ώρες επηρεάζεται από διπλασιασμού φορές).

Η

Τέλος, σε συμπληρωματικές μελέτες υπερέκφρασης, επιμολύναμε

SMURF1

cDNA (που εκφράζεται από έναν προαγωγό CMV) σε ΝΙΗ-3Τ3 ινοβλάστες ποντικού. Η υπερέκφραση του SMURF1, επιβεβαιώθηκε με κηλίδα Western (Εικ. 5Α), οδήγησε σε σημαντική απώλεια της αναστολής επαφής (δηλαδή αυξημένη εστίες), σε σύγκριση με έναν φορέα ελέγχου (Εικ. 5Β). Αξίζει να σημειωθεί ότι, η επιμόλυνση ενός καταλυτικά ανενεργό μεταλλαγμένη του SMURF1 (C699A) [22] δεν μείωσε αναστολή επαφής (Σχ. 4Β), υποδεικνύοντας ότι αυτή ογκογόνο δράση εξαρτάται από την ουμπικιτίνης δραστηριότητα πρωτεΐνη λιγάσης Ε3 του SMURF1.

(α) η επιμόλυνση των SMURF1 cDNA, ή μια καταλυτική μετάλλαξη του SMURF1 (C699A) (SMURF1

m), οδηγεί σε υπερέκφραση (με Western blot) σε σύγκριση με το κενό φορέα ελέγχου. επίπεδα υπερέκφρασης SMURF1, κανονικοποιημένη σε GAPDH, υποδεικνύονται. (Β) SMURF1 (αλλά όχι SMURF1

m) υπερέκφραση σε κύτταρα ΝΙΗ-3Τ3 οδηγεί σε απώλεια της αναστολής επαφής (δηλαδή αυξημένο σχηματισμό εστιών). Δοκιμασίες γίνεται εις τριπλούν (μέσο +/- 1 SD φαίνεται)? *,

P

& lt?. 0.05 (t-test του Student)

Η

Συζήτηση

Εδώ, έθεσε ως στόχο να εντοπίσει και να ανακαλύψετε την οδήγηση ογκογονίδιο 7q21-q22 ενίσχυση σε καρκίνο του παγκρέατος. Υψηλής ανάλυσης γονιδιακό προφίλ του παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές και ξενομοσχεύματα έγκαιρης πέρασμα ορίζεται ένα 325 Kb ελάχιστη αμπλικόνιο που εκτείνονται σε

SMURF1

. επίπεδα Απομαγνητοφώνηση του

SMURF1

ήταν αυξημένα σε δείγματα με κέρδος /ενίσχυσης, και με FISH επιβεβαιώσαμε

SMURF1

ενίσχυσης σε πρωτογενείς καρκίνους του παγκρέατος. Χρησιμοποιώντας συμπληρωματικές προσεγγίσεις του knockdown (σε εστιακά-ενισχυμένο AsPC-1 κύτταρα) και την υπερέκφραση (σε κύτταρα ΝΙΗ-3Τ3), διαπιστώσαμε ότι

SMURF1

ενίσχυση /υπερέκφραση δεν μεταβάλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αλλά προάγει κυτταρική εισβολή, αγκυροβόλιο ανεξάρτητη από την ανάπτυξη, και την απώλεια της αναστολής επαφής, εκ των οποίων τουλάχιστον το τελευταίο εξαρτάται από την καταλυτική του δράση.

SMURF1 ήταν αρχικά μια ενδιαφέρουσα ογκογονίδιο υποψήφιος λόγω των γνωστών σύνδεσή της με ΤΟΡβ σηματοδότηση. Η οδός ΤΟΡβ, τουλάχιστον νωρίς στην ανάπτυξη του όγκου, είναι κατασταλτικός ανάπτυξη [23]. Κανονικά, ΤΟΡβ συνδέεται με υποδοχείς της (TGFβRI, ΤΟΡβΚΙΙ), που οδηγεί στην φωσφορυλίωση των μετατροπέων σήματος SMAD2 /Smad3, το οποίο στη συνέχεια μεταφοράς προς τον πυρήνα και σε σύμπλοκο με Smad4 διαμεσολαβούν μεταγραφή. Βασικά μεταγραφική απαντήσεις περιλαμβάνουν την επαγωγή του

CDKN2B

(p15INK4b) και

CDKN1A

(p21Cip1), και την καταστολή των

MYC

, μαζί οδηγώντας σε G

κυτταρικού κύκλου 1 σύλληψη. Το μονοπάτι κατασταλτική ανάπτυξη TGFβ συνήθως διαταράσσεται στον καρκίνο του παγκρέατος, τις περισσότερες φορές μέσω μετάλλαξης /διαγραφή

Smad4

, αλλά και μέσω της αδρανοποίησης /απώλεια

TGFβRI

και

ΤΟΡβΚΙΙ

[ ,,,0],4].

SMURF1 είναι ένα HECT-τομέα Ε3 λιγκάσης της ουμπικουϊτίνης (Ε3 λιγάσες ουβικιτίνης πραγματοποιήσει την τρίτη και υποστρώματος συγκεκριμένο βήμα σε πρωτεΐνες ουβικιτίνωσης). SMURF1 προωθεί την πυρηνική εξαγωγή του αναστολέα οδού ΤΟΡβ Smad7 (αύξηση της διαθεσιμότητας του), και την καταστροφή των TGFβRI και Smad4 (μέσω αποικοδόμησης ουβικιτινίωση μεσολάβηση) [15], [16]. Όλες αυτές οι δραστηριότητες θα πρέπει να χρησιμεύσει για να ανταγωνιστεί TGFβ σηματοδότηση, και μαζί παρέχουν μια ισχυρή λογική για

SMURF1

ενίσχυση /υπερέκφραση στον καρκίνο του παγκρέατος. Ήταν αξιοσημείωτο λοιπόν, ότι SMURF1 νοκ ντάουν στα κύτταρα AsPC-1 δεν ενίσχυσε τη μεταγραφή TGFβ-μονοπατιού (αν και ίσως δεν αποτελεί έκπληξη, δεδομένης της απενεργοποίησης μετάλλαξη του

Smad4

). Ως εκ τούτου, οι ογκογόνο δραστηριότητες SMURF1 πρέπει να δράσει τουλάχιστον εν μέρει ανεξάρτητα από τις λειτουργίες του σε TGFβ σηματοδότησης (τουλάχιστον σε επίπεδο οδού της Smad4). Για το σκοπό αυτό, SMURF1 έχει επίσης δειχθεί να διαλυθεί σφικτών συνδέσμων (με αποικοδόμηση του RhoA) κατά τη διάρκεια επιθηλιακής-μεσεγχυματικής μετάβασης [24], και εστιακές συμφύσεις (με αποικοδόμηση των κεφαλών ταλίνη) να ενισχύουν την κυτταρική μετανάστευση [25]. Πρόσθετες μελέτες θα πρέπει να αποσαφηνίσει τις βασικές υποστρώματα SMURF1 συνδέονται με εισβολής και αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη σε καρκίνους του παγκρέατος με 7q22 ενίσχυση.

Κατά τη διάρκεια της προόδου του έργου αυτού, δύο άλλες μελέτες που χαρακτηρίζεται ενισχυόνιου 7q21-q22 στον καρκίνο του παγκρέατος. Suzuki

et al.

[26] από το γονιδιακό προφίλ των κυτταρικών σειρών που προσδιορίζονται το amplicon σε κύτταρα AsPC-1, με την κορυφή αμπλικόνιο που εκτείνονται σε 11 γονίδια. Περαιτέρω προσπάθειες επικεντρώθηκαν σε δύο γονίδια,

TRRAP

και

SMURF1

, με σημαντικά αυξημένα έκφραση όταν ενισχύονται. Ωστόσο, σε αντίθεση με τη μελέτη μας, ανέφεραν ότι knockdown του SMURF1 ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό AsPC-1. Αξίζει να σημειωθεί, όμως, αξιολογείται μόνο ένα siRNA. Δεδομένου αποτελέσματα μας ότι τέσσερις ανεξάρτητες siRNA που γκρέμισε τα επίπεδα SMURF1 συγκριτικά και μειωμένη εισβολή χωρίς να επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, προτείνουμε ότι τα ευρήματά τους μπορεί να αντανακλά μια μη ειδική ή ειδικές off-στόχο RNAi αποτέλεσμα. Πράγματι, η αναστολή της ανάπτυξης είναι μια κοινή μη-ειδική επίδραση, ενεργοποιείται από μια απόκριση ιντερφερόνης τύπου Ι siRNA [27]. Suzuki

et al.

Πήγε για να δείξει ότι SMURF1 υπερέκφραση σε δύο παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές αυξημένη ανάπτυξη αποικιών σε πλαστικό καλλιέργειας ιστού. Παρ ‘όλα αυτά, τα ευρήματά μας με βάση την νοκ ντάουν στον φυσιολογικά σχετικό πλαίσιο εστίασης

SMURF1

ενίσχυσης δείχνουν ότι η κύρια ογκογόνων λειτουργία του SMURF1 σχετίζεται με την προώθηση των κυττάρων εισβολής αντί για τον πολλαπλασιασμό.

Σε μια άλλη πρόσφατη μελέτη , Laurila

et al.

[28] με ανάλυση FISH των κυτταρικών σειρών που οριοθετείται το amplicon 7q21-q22 σε 0,77 Mb εκτείνονται σε 10 γονίδια (συμπεριλαμβανομένων των

SMURF1

), αλλά επικεντρώνουν τις προσπάθειές τους στο

ARPC1A

και

ARPC1B

, υπομονάδες της ARP2 /3 πολύπλοκη λειτουργία στον πολυμερισμό της ακτίνης. Χρησιμοποιώντας RNAi, διαπίστωσαν ότι νοκ ντάουν είτε μειωμένη κινητικότητα των κυττάρων, και νοκ ντάουν του

ARPC1A

επίσης μειωμένη κυτταρική εισβολή. Αν εξαιρεθούν ελάχιστη αμπλικόνιο μας

ARPC1A

και

ARPC1B

, είναι ωστόσο πιθανό ότι η ενίσχυση τους συμβάλλει στην κινητικότητα /εισβολή σε όγκους όπου ενισχύονται. Δεν είναι ασυνήθιστο να βρει πολλαπλές ογκογονίδια μηχανοδηγό εντός αμπλικόνια όγκου (π.χ. αναφ. [29]). Πράγματι, το δικό μας μελέτες δεν επιλυθεί εάν

KPNA7

, εντός 325 Kb ελάχιστη αμπλικόνιο μας, θα μπορούσε επίσης να έχει ογκογόνο ρόλο (μαζί με το

SMURF1

).

Για να συνοψίσουμε , από γονιδιακό προφίλ και λειτουργική ανάλυση εντοπίσαμε

SMURF1

ως ενισχυμένο ογκογονίδιο οδήγηση κυττάρων εισβολής στον καρκίνο του παγκρέατος. Ίσως τη μεγαλύτερη σημασία, όπως ένα ένζυμο SMURF1 αντιπροσωπεύει έναν προσιτό στόχο ναρκωτικών. Άλλες λιγάσες ουβικιτίνης Ε3 έχουν συνδεθεί με τον καρκίνο, και λόγω της ειδικότητας υποστρώματος τους λιγάσες ουβικιτίνης Ε3 φαίνεται να είναι ελκυστικοί στόχοι για θεραπεία [30]. Πράγματι, πολλά μικρά μόρια αναστολείς (συμπεριλαμβανομένων εναντίον MDM2, ρυθμιστής της TP53) είναι επί του παρόντος στο στάδιο της αξιολόγησης [31]. Τα ευρήματά μας προσδιορίσει SMURF1 ως πιθανό νέο στόχο για μοριακά-κατευθυνόμενη θεραπεία ενάντια στην καταστροφική ασθένεια του καρκίνου του παγκρέατος.

Υλικά και Μέθοδοι

Δείγματα

Ο καρκίνος του παγκρέατος κυτταρικές σειρές, περιγράφονται προηγουμένως [12], και κύτταρα ΝΙΗ-3Τ3 αποκτήθηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA). Παγκρέατος ξενομοσχεύματα καρκίνου, που εμπλουτίζουν ουσιαστικά το κλάσμα επιθηλιακών όγκων για την ανάλυση του DNA, δημιουργήθηκαν όπως περιγράφεται [32] στο Johns Hopkins Hospital, με την έγκριση από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review (IRB) (ID πρωτόκολλο 05-04-14-02) και Animal Care και της Επιτροπής Χρήση (πρωτόκολλο ID MO05M466). Εν συντομία, ένα 1 mm

3 κομμάτι του πρωτογενούς όγκου εμποτισμένο με Matrigel (Collaborative Biomedical Research), στη συνέχεια εμφυτεύονται υποδορίως σε έναν ποντικό ηυ /ηυ. Τα μεταμοσχευμένα όγκοι συλλέχθηκαν όταν έφθασαν 1-2 εκατοστά σε διάμετρο, και των καρκινικών κυττάρων εμπλουτισμού επιβεβαιώθηκε με Η &? Ε-χρώση κατεψυγμένων τμήμα. DNA και RNA απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας το Qiagen (Valencia, CA) κιτ AllPrep. Έντεκα από τα 48 ξενομοσχευμάτων προηγουμένως προφίλ με χαμηλότερης ανάλυσης CGH στις συστοιχίες cDNA [6].

array CGH

CGH έγινε χρησιμοποιώντας Agilent (Santa Clara, CA) Κατάλογος 244K συστοιχίες CGH. DNAs σημάνθηκαν όπως περιγράφεται [33], τότε υβριδίστηκαν (

vs.

Μια πισίνα οκτώ φύλο-συμφωνημένα κανονική λευκοκυττάρων DNAs) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Συστοιχίες σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σαρωτή Agilent G2505B, και εξάγεται και κανονικοποιημένα δεδομένα χρησιμοποιώντας Agilent λογισμικού Χαρακτηριστικό Extraction (έκδοση 9.1) με τις προεπιλεγμένες ρυθμίσεις. Αντιγραφή αριθμού μεταβολές αυτές ονομάζονται χρησιμοποιώντας cghFLasso [34], και τα κέρδη χαμηλού επιπέδου και ενισχύσεις υψηλότερου επιπέδου που ορίζεται από cghFLasso όγκου /φυσιολογικό αναλογίες & gt? 1.3 και & gt? 3.0, αντίστοιχα. δεδομένων CGH λεπτομερώς στο παρόν είναι διαθέσιμα σε GEO (GSE19852)? μια πλήρης περιγραφή του συνόλου δεδομένων είναι στο πλαίσιο της προετοιμασίας.

Έκφραση προφίλ

Η έκφραση των χαρακτηριστικών έγινε με τη χρήση Κατάλογος Agilent συστοιχίες 44K ολόκληρου του ανθρώπινου γονιδιώματος. RNAs σημάνθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ Quick Amp Labeling (Agilent) και, στη συνέχεια υβριδοποιήθηκε (

vs.

Μια καθολική πισίνα αναφοράς RNA από 11 κυτταρικές γραμμές καρκίνου [35]) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά τη σάρωση και την εξόρυξη δεδομένων (όπως παραπάνω), τα δεδομένα έκφρασης ομαλοποιήθηκαν (μέση επίκεντρο) με συστοιχία και από το γονίδιο, και σημαίνει επίκεντρο ημερολόγιο

2 αναλογίες που αναφέρθηκαν.

FISH

Μια μικροσυστοιχία ιστό που περιέχει 105 παγκρεατικού πόρου περιπτώσεις αδενοκαρκινώματος (αρχειοθετούνται στο Πανεπιστήμιο του Στάνφορντ, και χρησιμοποιείται με IRB έγκριση) περιγράφηκε προηγουμένως [6]. επισήμανση Probe και FISH πραγματοποιήθηκαν με χρήση Vysis (Downers Grove, Illinois) Αντιδραστήρια σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Μια θέση-ειδική χαρτογράφηση BAC στο

SMURF1

σε 7q22.1 (RP11-62N3? Bacpac Πόρων Κέντρο, Oakland, CA) σημάνθηκε με SpectrumOrange, και συν-υβριδοποιήθηκαν με SpectrumGreen-επισημασμένο CHR 7 ανιχνευτή κεντρομεριδίου (CEP7 ? Vysis). Τα πλακίδια επιχρωματίστηκαν με DAPI, και απεικονίζεται χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού της Olympus BX51 με Applied Imaging (San Jose, CA) Cytovision 3,0 λογισμικού. Είκοσι πέντε καρκινικών κυττάρων βαθμολογήθηκαν ανά περίπτωση, και ενίσχυση ορίζεται ως ο μέσος όρος

SMURF1

/CEP7 αναλογία & gt?. 2.5

siRNA επιμολύνσεων

On-TARGETplus siRNAs που στοχεύουν

SMURF1

, μαζί με ένα αρνητικό πισίνα siRNA ελέγχου (ON-TARGETplus siCONTROL πισίνα μη-στόχευση), ελήφθησαν από Dharmacon (Lafayette, CO). Οι αλληλουχίες των siRNAs που παρατίθενται στον Πίνακα S1. κύτταρα AsPC-1 αναπτύχθηκαν στους 37 ° C σε πλήρες μέσο RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA), 10% FBS, 50 U /ml πενικιλίνη, και 50 U /ml στρεπτομυκίνη. Για την επιμόλυνση, 150.000 κύτταρα σπάρθηκαν ανά πλάκα 6 φρεατίων καλά, και επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με μια τελική συγκέντρωση 50 ηΜ siRNA επί 6 ώρες.

Western blot

Τα κύτταρα λύθηκαν σε 1 × RIPA ρυθμιστικό συμπληρωμένο όπως περιγράφεται [6]. Σαράντα μg λύματος συνολικής πρωτεΐνης σε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου 4-15%, στη συνέχεια μεταφέρονται σε μεμβράνη PVDF και αποκλείστηκαν σε TBST-Τ με 5% ξηρό γάλα. Τα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν ως εξής: αντι-SMURF1 πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (H-60? Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) σε αραίωση 1:500? αντι-GAPDH πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (Santa Cruz Biotechnology) σε αραίωση 1:5,000? HRP-συζευγμένο IgG αντι-κουνελιού (Pierce, Rockford, IL) σε 1:20,000 αραίωση. Η ανίχνευση έγινε χρησιμοποιώντας ένα κιτ ECL (GE Healthcare, Piscataway, NJ), και οι εντάσεις ποσοτικά με πυκνομετρία χρησιμοποιώντας Scion λογισμικό Image (Scion Corporation, Fredrick, MD).

Δοκιμασίες

Η ανάπτυξη των κυττάρων και εισβολή

ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων /βιωσιμότητα προσδιορίστηκε ποσοτικά με χρωματομετρία με βάση την μεταβολική διάσπαση του άλατος τετραζολίου WST-1 σε βιώσιμα κύτταρα, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Roche, Indianapolis, ΙΝ). ενσωμάτωσης BrdU προσδιορίστηκε με χρωματομετρική ELISA χρησιμοποιώντας το BrdU κυττάρων Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ). Εισβολή ποσοτικοποιήθηκε με δοκιμασία θαλάμου Boyden (BD Biosciences, San Jose, CA). Εν συντομία, 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, 50000 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 24 φρεατίων επικαλυμμένα με Matrigel ένθετα με ένα 0,5% έως 10% κλίση FBS. Εβδομήντα δύο ώρες αργότερα, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν, χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες, και τα κύτταρα που διέρχονται από τη μεμβράνη μετρήθηκαν. Όλες οι δοκιμασίες διεξήχθησαν όπως τριπλούν επιμολύνσεις, και όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον μία φορά με παρόμοια αποτελέσματα.

ΤΟΡβ μεταγραφική ρεπόρτερ δοκιμασία

Τα κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με 4 μg p3TP-Lux (Addgene, Cambridge, μΑ), ένα TGFβ αποκρίνεται λουσιφεράση πυγολαμπίδας ανταποκριτή που περιέχει τρία συνεχόμενα στοιχεία απόκρισης ΤΡΑ (TREs) και ένα τμήμα του αναστολέα του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου 1 (περιοχή προαγωγού ΡΑΙ-1) [17], μαζί με 0,4 μg ρΡΙ_-ΤΚ (Promega, Madison, WI) που εκφράζουν λουσιφεράση της Renilla ως εσωτερικός έλεγχος κανονικοποίηση. Η δράση φωτοφεράσης προσδιορίστηκε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση (με Lipofectamine 2000) χρησιμοποιώντας το διπλό σύστημα Δοκιμασίας Λουσιφεράσης ανταποκριτή (Promega, Madison, WI). δραστηριότητα Reporter εκφράζεται ως ο λόγος του πυγολαμπίδας /Renilla. Οι δοκιμασίες έγιναν όπως τριπλούν επιμολύνσεις, και επαναλαμβάνεται τουλάχιστον μία φορά με παρόμοια αποτελέσματα.

Anchorage-ανεξάρτητη ανάπτυξη

Μια δομή pGIPZ shRNAmir στόχευση

SMURF1

(V2LHS_229724), μαζί με μια μη-στόχευσης ελέγχου pGIPZ shRNAmir, ελήφθησαν από Open Biosystems (Huntsville, AL). Για τη δημιουργία σταθερώς μεταγωγή πισίνες κύτταρο AsPC-1, βραδέος ιού κατασκευάσματα (μαζί με Trans-βραδέος πλασμίδια μείγμα συσκευασιών) διαμολύνθηκαν σε 293TN παραγωγών κυττάρων (Σύστημα Biosciences, Mountain View, CA), και το υπερκείμενο συσκευάζονται ιός μετάγονται σε AsPC-1 κυττάρων μετά από τις οδηγίες του κατασκευαστή (Trans-βραδέος πρωτόκολλο συσκευασία GIPZ Open Biosystems). Δύο ημέρες μετά τη μόλυνση, 1 μg /ml πουρομυκίνη (Invitrogen) προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας, και τα κύτταρα επιλέγονται για 14 ημέρες. Anchorage ανεξάρτητη ανάπτυξη προσδιορίστηκε με σχηματισμό αποικιών σε μαλακό άγαρ. Εν συντομία, 10000 κύτταρα ενσωματωμένα σε ένα πλακίδιο 6 φρεάτων και σε ένα άνω στρώμα 0,36% αγαρόζης σε πλήρες μέσο, ​​πάνω από ένα στρώμα 0,48% αγαρόζη σε πλήρες μέσο. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν για 14-21 ημέρες, στη συνέχεια ορατές αποικίες μετρήθηκαν μετά από χρώση με 0,015% Neutral Red διάλυμα. Οι δοκιμασίες έγιναν όπως τριπλούν μεταγωγές, και επαναλήφθηκαν τουλάχιστον μία φορά με παρόμοια αποτελέσματα.

ΝΙΗ-3Τ3 σχηματισμός εστίασης δοκιμασία

πλήρους μήκους ανθρώπινο

διάνυσμα SMURF1

cDNA έκφρασης, pcDNA3 0,1-SMURF1 ήταν ένα είδος δώρο από Di Chen (University of Rochester Medical Center, Rochester, ΝΥ), και ο γονικός φορέας pcDNA3.1 αγοράστηκε από την Invitrogen (Carlsbad, CA). Μία καταλυτική μεταλλαγμένο SMURF1 (C699A) [22] κατασκευάστηκε χρησιμοποιώντας το QuickChange XL II τοπο-Directed Mutagenesis Kit από Stratagene (La Jolla, CA), με τις ακόλουθες μεταλλαξιογόνα εναύσματα: 5′-CGTGGAGGAGACCGCCGGGTTTGCTGTGG -3 ‘(εκφυλισμένος, μεταλλαγμένες βάσεις συμβολίζεται με έντονο κείμενο) και 5’-CCACAGCAAACCCGGCGGTCTCCTCCACG-3 ‘. Πενήντα χιλιάδες κύτταρα σπάρθηκαν ανά πλάκα 60 mm και 8 μα πλασμιδίου επιμολύνθηκε με αντιδραστήριο Lipofectamine 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Δύο ημέρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα από κάθε πλάκα 60 πιπί εκ νέου επιστρώθηκαν σε δύο πλάκες 10 cm και αναπτύχθηκαν προς συρροή επί 28 ημέρες. Ορατό εστίες μετρήθηκαν μετά στερέωση μεθανόλη και χρώση Giemsa. Οι δοκιμασίες έγιναν όπως τριπλούν επιμολύνσεις, και επαναλαμβάνεται τουλάχιστον μία φορά με παρόμοια αποτελέσματα.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1.

siRNA αλληλουχίες στόχευσης SMURF1.

doi: 10.1371 /journal.pone.0023924.s001

(PDF)

Εικόνα S1. κύτταρα

HS700T εμφανίζουν ΤΟΡβ-επαγόμενη αναστολή της ανάπτυξης. κύτταρα HS700T καλλιεργήθηκαν, και στη συνέχεια, 2 ng /ml ΤΟΡβ (ή ελέγχου του οχήματος) προστέθηκε και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων /βιωσιμότητα προσδιορίστηκε (από WST-1) ημερησίως. Οι δοκιμασίες έγιναν εις τριπλούν (μέσο +/- 1 SD φαίνεται)? *,

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01? ***

P

& lt? 0.001 (έλεγχος τ). Συνεπής με άθικτη την αναστολή της ανάπτυξης ΤΟΡβ, δεν υπάρχουν διαγραφές που εκτείνονται σε

Smad4

(244K Agilent CGH δεδομένα συστοιχία? Δεν φαίνονται) και δεν υπάρχουν σημειακές μεταλλάξεις του

Smad4

(Illumina RNAseq ανάλυση? Δεν φαίνεται) ταυτοποιήθηκαν.

doi: 10.1371 /journal.pone.0023924.s002

(EPS)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Ilana Galperin (Stanford Κυτταρογενετικής Εργαστήριο) για βοήθεια σχετικά με την ανάλυση FISH, και η μέλη του εργαστηρίου Pollack για τις χρήσιμες συζητήσεις.