Αφηρημένο

Οι αλλαγές στην τετρασπανίνη CO-029 έκφρασης συνδέονται με την εξέλιξη και τη μετάσταση των καρκίνων στην πεπτικό σύστημα. Ωστόσο, πώς CO-029 προάγει την μετάσταση του καρκίνου εξακολουθεί να είναι ελάχιστα κατανοητή. Να καθορίζει τον μηχανισμό, θα σιγήσει CO-029 έκφρασης σε κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου ΗΤ29 και διαπίστωσε ότι το CO-029 νοκ ντάουν μειωθεί σημαντικά κυττάρων μεταναστευτικών ικανότητα. Η μειωμένη κυτταρική μετανάστευση συνοδεύτηκε από την προς τα πάνω ρύθμιση τόσο ιντεγκρίνης εξαρτώμενη προσκόλληση κυττάρου-μήτρας στις λαμινίνη και προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου ασβέστιο-εξαρτώμενη. Τα επίπεδα κυτταρικής επιφάνειας της λαμινίνης δέσμευσης ιντεγκρίνης α3β1 και φιμπρονεκτίνη-ιντεγρίνης α5β1 αυξήθηκαν ενώ το επίπεδο του CD44 μειώθηκε κατά CO-029 σίγηση. Οι αλλαγές αυτές συμβάλλουν στην αλλαγμένη προσκόλλησης κυττάρου-μήτρας. Τα αποτελέσματα απορυθμισμένη προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου, τουλάχιστον εν μέρει, από αυξημένη δραστηριότητα των καντερινών και μειωμένο επίπεδο MelCAM. Συμπερασματικά, CO-029 λειτουργεί ως ρυθμιστής τόσο κυττάρου-μήτρας και προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου. Κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου του παχέος εντέρου, CO-029 προάγει τον καρκίνο του κινήματος των κυττάρων από την απορύθμιση συμφύσεις κυττάρων

Παράθεση:. Guo Q, Xia Β, Zhang F, Richardson MM, Λι Μ, Zhang JS, et al. (2012) τετρασπανίνη CO-029 Αναστέλλει τον καρκίνο του παχέος Κίνημα κυττάρων από την απελευθέρωση του κυττάρου-μήτρας και συμφύσεις κυττάρων-κυττάρων. PLoS ONE 7 (6): e38464. doi: 10.1371 /journal.pone.0038464

Επιμέλεια: Pan-Chyr Γιανγκ, Εθνικό Πανεπιστήμιο της Ταϊβάν Νοσοκομείο, Ταϊβάν

Ελήφθη: 8 Ιουλ, 2011? Αποδεκτές: 6 Μαΐου, 2012? Δημοσιεύθηκε: 5, Ιουν 2012

Copyright: © 2012 Guo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας CA096991. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου, μία από τις πιο κοινές μορφές καρκίνου, έχει υψηλή θνησιμότητα [1]. Οι ασθενείς με μετάσταση σε απομακρυσμένα όργανα όπως το ήπαρ και τους πνεύμονες υποφέρουν εξαιρετικά φτωχή πρόγνωση. Ως εκ τούτου, η κατανόηση των κυτταρικών και μοριακών μηχανισμών ορθοκολικού εξέλιξης του καρκίνου είναι κρίσιμη για την ανάπτυξη νέων στρατηγικών για τη βελτίωση των ποσοστών πρόγνωση και την επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του παχέος.

τετρασπανίνη ρυθμίζουν μια ποικιλία φυσιολογικών και παθολογικών διαδικασιών, και μερικές τετρασπανίνη είναι που συνδέονται με την εξέλιξη του καρκίνου και τη μετάσταση [2] – [11]. Ανθρώπινη τετρασπανίνη CO-029 και ομόλογο αρουραίου του, D6.1A, αναφέρθηκαν αρχικά ως ένα συνδεόμενο με όγκο αντιγόνο που εκφράζεται σε γαστρικό, του παχέος εντέρου, και παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα και να ασκήσουν δραστικότητα εξέλιξη προώθηση του όγκου [12]. έκφραση CO-029 συχνά ρυθμίζεται αυξητικά σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [13]. Το επίπεδο έκφρασης του D6.1A είναι σημαντικά αυξημένη, σε σχέση με το ένα, σε ένα διαφοροποιημένο γονική γραμμή, σε ένα αποδιαφοροποιημένα ηπατώματος κυτταρική γραμμή αρουραίου [14]. Η ταυτόχρονη έκφραση της ιντεγκρίνης α6β4 και D6.1A σε nonmetastasizing παγκρέατος αρουραίου κυτταρική γραμμή αδενοκαρκινώματος BSp73AS διευκολύνει την μετάσταση στο ήπαρ αυτής της γραμμής [15]. CO-029 παρουσιάζει επίσης ένα υψηλότερο επίπεδο έκφρασης σε κύτταρα μεταστατικού καρκινώματος του κόλου, σε σύγκριση με το επίπεδο σε πρωτογενή καρκινικά κύτταρα κόλου [16]. Ένας πιθανός μηχανισμός για την prometastatic δραστηριότητα του CO-029 είναι η σύνδεσή της με ιντεγκρίνες ή τετρασπανίνη, τα οποία επηρεάζουν την κυτταρική κινητικότητα. D6.1A συνδέεται με ιντεγρίνες α3β1, α6β1, α6β4 και μετά C (PKC) ενεργοποίηση πρωτεϊνικής κινάσης [15], [17]. Σε μεταστατικές κυτταρικές γραμμές παγκρεατικού και ορθοκολικό καρκίνωμα, η ενεργοποίηση της PKC ενισχύει την συνεντόπισης του CO-029 και τετρασπανίνη CD151 με ιντεγκρίνη α6β4 σε κύτταρα όγκου, προωθεί την εσωτερικοποίηση αυτού του συμπλόκου ιντεγκρίνης-τετρασπανίνη, μειώνει προσκόλληση μήτρας-κυττάρων σε λαμινίνη 332, και αυξάνει κύτταρο μετανάστευση [18]. Επιπλέον, τα καρκινικά κύτταρα D6.1A υπερεκφράζουν απελευθερώνουν τις εξωσώματα που περιέχουν D6.1A, και αυτά τα εξωσώματα επάγουν αγγειογένεση για διευκόλυνση της διάδοσης του όγκου [19]. Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι η E-cadherin και ρ120-κατενίνης ανταγωνίζονται CO-029 προωθείται μετανάστευση των Isreco καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα [20]. Οι μελέτες αυτές υποδεικνύουν έντονα έναν σημαντικό ρόλο για το CO-029 στην εξέλιξη και τη μετάσταση των όγκων στο πεπτικό σύστημα. Να καθορίζει τον μηχανισμό με τον οποίο CO-029 προάγει την εξέλιξη του όγκου και των μεταστάσεων, θα σιγήσει την έκφραση του CO-029 σε κύτταρα αδενοκαρκινώματος ανθρώπινου κόλου ΗΤ29. Με το συνδυασμό in vitro και in vivo πειράματα, βρήκαμε ότι η απώλεια του CO-029 εξασθενημένα σημαντικά κυτταρική κινητικότητα και μεταβάλλεται η ισορροπία του κυττάρου-κυττάρου και κυττάρου-μήτρας συμφύσεις, που οδηγεί στην μειωμένη μεταστατικό δυναμικό των καρκινικών κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture, αντισώματα, Εξωκυττάρια Matrix Πρωτεΐνες, και άλλα αντιδραστήρια

ΗΤ29 ανθρώπινο ορθοκολικό αδενοκαρκίνωμα κυτταρική γραμμή ελήφθη από την ATCC (Manassas, VA) και καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% βόειο εμβρυϊκό ορό, 100 μονάδες /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη.

Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη intergrin α1 mAb TS2 /7, intergrin α2 mAb IIE10, intergrin α3 mAb A3X8, intergrin α5 mAb BIIG2, intergin α6 mAb A6BB, intergrin β1 mAb TS2 /16, intergrin β4 mAb 439-9B (BD Pharmingen, San Diego, CA), CD9 mAbs C9BB [21] και Mab7, CD63 mAb 6Η1 [22], CD81 mAb M38, CD82 mAb M104, CD151 mAbs 5C11 και TS151r [23], CO29 mAb NS1116 (ευγενική προσφορά του Dr. Dorothee ΗβΓίγη του Ινστιτούτου Wistar), E-cadherin mAb (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), EpCam mAb VU1D9 (Cell Signaling, Danvers, ΜΑ), EWI2 mAb 5Ε8 (ευγενώς από τον Dr. Τ Schweighoffer της Novartis Ίδρυμα Ιατροβιολογικών Ερευνών), και MelCam mAb P1H12 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Ένα IgG2b ποντικού χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός αντίσωμα ελέγχου (Sigma, Saint Louis, ΜΟ). Το δεύτερο αντισώματα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη ήταν χρένο κατσίκα-αντι-ποντικού IgG αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση (Sigma, Saint Louis, ΜΟ) και ισοθειοκυανική φθορεσκεΐνη-συζευγμένο κατσίκας-αντι-ποντικού ή -αρουραίου IgG αντίσωμα (Biosource International, Camarillo, CA) .

Οι πρωτεΐνες εξωκυττάριας μήτρας ανασύσταση υπόγειο του ποντικιού μεμβράνης Matrigel (BD Biosciences, Mountain View, CA), η λαμινίνη ποντικού 111 (Invitrogen, San Diego, CA), και την ανθρώπινη φιμπρονεκτίνη πλάσματος (Invitrogen, San Diego, CA ). Άλλα αντιδραστήρια ήταν από την Sigma, αν η πηγή δεν έχει καθοριστεί.

παρεμβολή RNA και Ρετροϊών Προετοιμασία και Μεταγωγή

Το CO-029 μικρή φουρκέτα RNA (shRNA) (TGCTGTTGACAGTGAGCGATGAATGAAACTCTCTATGAAATAGTGAAGCCACAGATGTATTTCATAGAGAGTTTCATTCACTGCCTACTGCCTCGGA), η οποία στοχεύει στην ακολουθία TGAATGAAACTCTCTATGAA του CO 029-mRNA ανθρώπινου, και τον έλεγχο shRNA (RHS1703) ελήφθησαν από OpenBiosystems (Huntsville, AL). Μια άλλη CO-029 shRNA που στοχεύει σε ένα διαφορετικό μέρος της ακολουθίας CO-029 mRNA ελήφθη από OpenBiosystems (Υλικά & amp? Μέθοδοι S1). Ο ιός της φυσαλιδώδους στοματίτιδας (VSV) φορέα -G έκφρασης πρωτεΐνης pVSV-G (ευγενώς από τον Dr. παρέχουν C. Stipp, Πανεπιστήμιο της Αϊόβα) και shRNA υπέστησαν μεταγωγή στα κύτταρα συσκευασίας GP293 με Lipofectamine 2000 (Invitrogen, San Diego, CA). Μετά από 48 ώρες, ο ιός υπερκείμενο καλλιέργειας που περιέχει σωματίδια συλλέχθηκε, και το απόρριμμα κυττάρου απομακρύνθηκε με πέρασμα του υπερκειμένου μέσα από ένα φίλτρο σύριγγας /L 0,45-μmol. Το καθαρισμένο ιικό απόθεμα επωάστηκε με κύτταρα ΗΤ29 για μεταγωγή, και τα κύτταρα ΗΤ29 μεταγωγή με έλεγχο ή CO-029 shRNA επιλέχθηκαν με πουρομυκίνη. Οι πουρομυκίνη-ανθεκτικά κύτταρα σε CO-029 shRNA μορφοτροπής ταξινομήθηκαν με κυτταρομετρία ροής για να εμπλουτίσουν το CO-029-σιγήσει κυτταρικό πληθυσμό.

κυτταρομετρίας ροής

Τα κύτταρα αποκολλήθηκαν με 0,5% θρυψίνη-EDTA , πλύθηκε με αλατούχο φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS) δύο φορές, αποκλείστηκαν με 5% ορό κατσίκας σε DMEM σε 4 ° C για 1 ώρα, επωάστηκαν με πρωτογενές mAb, και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με ΡΙΤΟ-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας-αντι-ποντικού IgG στους 4 ° C για 1 ώρα. Βαμμένα κύτταρα αναλύθηκαν επί FACScan κυτταρόμετρο ροής (BD Biosciences).

ανοσοφθορισμού

Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 3% παραφορμαλδεΰδη σε θερμοκρασία δωματίου (RT) για 15 λεπτά, διαπερατά με 0,1% Brij 98 σε RT για 2-5 λεπτά, αποκλείστηκαν με 20% ορό κατσίκας σε 4 ° C για 1 ώρα, και επωάστηκαν με πρωτογενές mAbs στους 4 ° C για 1 ώρα, που ακολουθείται από χρώση με ένα δευτερεύον αντίσωμα σε 4 ° C για 1 ώρα. Μετά από κάθε επώαση αντισώματος, τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με PBS. Για την ανάλυση ανοσοφθορισμού, τα κύτταρα εξετάζονται με μικροσκόπιο φθορισμού Axiophot (Carl Zeiss, Thornwood, ΝΥ), και οι εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας μία ψηφιακή φωτογραφική μηχανή Optronics.

Ανοσοκαθίζηση και στύπωμα Western

ανοσοκαθιζήσεις διεξάγεται όπως περιγράφεται προηγουμένως [24]. Τα κύτταρα λύθηκαν με 1% ρυθμιστικό διάλυμα λύσης Nonidet Ρ-40 στους 4 ° C για 1 ώρα. Σε μερικά πειράματα, η κυτταρική επιφάνεια σημάνθηκε με 0,5 mg /ml EzLink σουλφο-ΝΗδ-LC βιοτίνη (Pierce) πριν από την λύση των κυττάρων. Μετά την αφαίρεση του αδιάλυτου υλικού με φυγοκέντρηση στα 14.000 χ g και δύο τρεξίματα προ-κάθαρσης, προϊόντα λύσης επωάστηκαν με πρωτογενές mAb-απορροφάται πρωτεΐνη Α- και χάντρες G-Sepharose (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) από 3 ώρες έως όλη τη νύκτα στους 4 ΝΤΟ. Τα ανοσοϊζήματα πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης τρεις φορές, διαλύθηκε σε ρυθμιστικό δείγματος Laemmli, θερμαίνεται στους 95 ° C για 5 λεπτά, διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE, και κατόπιν μεταφέρθηκαν ηλεκτρικά σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Bio-Rad, Hercules, CA). Οι μεμβράνες διαδοχικά στυπώθηκαν με πρωτογενή Ab και συζευγμένη με υπεροξειδάση χρόνου δευτερόλεπτα Ab (Sigma) για πειράματα ανοσοκηλίδας ή συζευγμένη με υπεροξειδάση χρόνου εξτραβιδίνη (Sigma) για πειράματα βιοτινυλίωση, ακολουθούμενο από χημική φωταύγεια (PerkinElmer Life Sciences, Waltham, ΜΑ).

πρόσφυση κυττάρων Δοκιμασίες

δοκιμασία προσκόλλησης κυττάρου-μήτρας διεξήχθη όπως περιγράφεται στην προηγούμενη μελέτη μας [25]. Εν συντομία, πλάκες μικροκαλλιέργειας 96-φρεατίων (Βϋ Bioscience) επικαλύφθηκαν με λαμινίνη ποντικού 111 ή ινωδονεκτίνη σε 4 ° C όλη τη νύχτα και μετά αποκλείστηκαν με αλβουμίνη 1% θερμο-απενεργοποιημένο βόειο ορό (Sigma) στους 37 ° C για 1 ώρα. Λαμινίνη 332 παρασκευάσθηκε με καλλιέργεια κυττάρων RAC-11Ρ κατά συρροή σε πλάκες 96-φρεατίων για 3 ημέρες όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Τα κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν και εναιωρήθηκαν σε μέσο DMEM ελεύθερο ορού σε πυκνότητα 1 × 10

4 κύτταρα /ml, και 0,1 ml του κυτταρικού εναιωρήματος προστέθηκε κατόπιν σε κάθε φρεάτιο. Μετά από επώαση για 1 ώρα στους 37 ° C, μη συνδεδεμένα κύτταρα απομακρύνονται με ξέπλυμα τέσσερις φορές με PBS. Οι συνημμένες κύτταρα οπτικά μετρήθηκαν.

Εξετάστηκε

προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου με την χρησιμοποίηση της δοκιμασίας συσσωμάτωσης κρέμεται-drop όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27]. Τα κύτταρα αποκολλήθηκαν με 0,5% τρυψίνη-ΕϋΤΑ και πλύθηκαν με PBS δύο φορές, στη συνέχεια μετατρέπονται μονού κυτταρικού εναιωρήματος από τρεις ήπια περάσματα μέσω μιας βελόνας 27-gauge. Η μονοκύτταροι εναιώρημα 1 × 10

4 κύτταρα σε 30 μΐ διαλύματος ανεστάλη σαν μία σταγόνα κρέμεται από το κάλυμμα ενός τρυβλίου καλλιέργειας 24-φρεατίων και αφέθηκαν να συσσωματωθούν όλη την νύχτα σε 37

oC σε 5% CO

2 με υγρασία. Πλήρης DMEM χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση της συνολικής συγκολλητικότητα κυττάρου-κυττάρου, ενώ χωρίς ασβέστιο DMEM ήταν για κυττάρου-κυττάρου συγκολλητικότητα ασβέστιο-ανεξάρτητη. Για να προσδιοριστεί η αντίσταση της προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου σε μηχανικές καταπονήσεις, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε διάτμηση δύναμη με διέλευση τους μέσα από ένα άκρο σωληνίσκου 200 μl 10 φορές. Ασβέστιο-ανεξάρτητη προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου μετρήθηκε επίσης υπό σχετικά ήπιες μηχανική καταπόνηση [28]. Εν συντομία, μετά από έκπλυση με φυσιολογικό ορό του Puck (5 mM ΚΟΙ, 140 mM NaCl, 8 mM NaHCO3, ρΗ 7,4), το εναιώρημα μονού κυττάρου (1 × 10

5 κύτταρα /ml) επωάστηκε σε 5% CO

2 στους 37 ° C όλη τη νύκτα με ανάδευση στους 80 rpm πάνω σε περιστροφικό αναδευτήρα. Τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν είτε πριν είτε μετά από μηχανική καταπόνηση. Κυττάρου-κυττάρου κολλητικότητα μετά διατμητικής τάσης ήταν ποσοτικά ως i) το ποσοστό των συγκεντρωτικών κυττάρων και /ή ii) στην περιοχή που καλύπτεται από αδρανή υλικά. Με βάση την καταμέτρηση των μεμονωμένων κυττάρων, το ποσοστό των συγκεντρωτικών κυττάρων υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο% συσσωμάτωση = [1- (αριθμός μεμονωμένων κυττάρων /αριθμός συνολικών κυττάρων)] × 100. Η επιφάνεια που καλύπτεται από τα αδρανή μετρήθηκε με τη χρήση του λογισμικού ImageJ να απεικονίσει το βαθμό της κυτταρικής συσσωμάτωσης. Κυτταρικού συσσωματώματος ορίζεται ως ένα κύτταρο που περιέχει συστάδα τεσσάρων ή περισσότερων κυττάρων.

Κυττάρων Η μετανάστευση Δοκιμασίες

Οι επουλωτικές των πληγών δοκιμασία πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στην προηγούμενη μελέτη μας [29]. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε ατομικά φρεάτια μιας πλάκας καλλιέργειας 24 φρεατίων. Όταν τα κύτταρα έφθασαν σε συρροή, μια κυτταρική μονοστιβάδα πρώτα σε επεξεργασία με 10 μg /ml μιτομυκίνης Ο για 30 λεπτά για να εμποδίσει τη μίτωση και έτσι επιτρέπουν την ανάλυση της κυτταρικής μετανάστευσης απουσία του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Στη συνέχεια, η κυτταρική μονοστιβάδα τραυματίστηκε με ένα αποστειρωμένο, 200- ρύγχος πιπέτας μl. Το μέσο και τα κυτταρικά υπολείμματα απομακρύνθηκαν και αναπληρώνονται με 2 ml νωπού μέσου. Τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν με μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης κάθε 24 ώρες μετά τον τραυματισμό. Για να αξιολογηθεί «κλείσιμο του τραύματος», πέντε περιοχές κατά μήκος του τραύματος επελέγησαν τυχαία για τον υπολογισμό του μέσου όρου πλάτος για κάθε φρεάτιο. Φωτογραφίες τραβήχτηκαν σε διαφορετικά χρονικά σημεία από ένα μικροσκόπιο Olympus αντίθεσης ανεστραμμένης φάσης.

δοκιμασία μετανάστευσης κυττάρων Transwell διεξήχθη όπως περιγράφεται στην προηγούμενη μελέτη μας [30]. Εν συντομία, το μέγεθος πόρου 8-μm, 24 φρεατίων ένθετα Transwell (BD Bioscience, Bedford, ΜΑ) προεπικαλύφθηκαν με 10 μg /ml λαμινίνης 111 ή ινωδονεκτίνη επάνω στην κάτω πλευρά των ενθέτων στους 4 ° C όλη τη νύχτα και φράχθηκαν με 0,1% αλβουμίνη βόειου ορού απενεργοποιημένου με θερμότητα (BSA) στους 37 ° C για 1 ώρα. Ένα σύνολο 2 × 10

4 κύτταρα σε DMEM άνευ ορού που περιέχει 0.1% θερμο-απενεργοποιημένο BSA σε ένα όγκο 300 μΐ προστέθηκαν στον άνω θάλαμο και 500 μΙ ϋΜΕΜ που περιέχει 1% FBS προστέθηκαν στον κάτω θάλαμο . Τα κύτταρα στο transwells επωάστηκαν για 24 ώρες στους 37 ° C. Τα κύτταρα που παραμένουν στην άνω επιφάνεια των ενθέτων απομακρύνθηκαν με σκούπισμα με ένα κομμάτι βαμβάκι και τα κύτταρα που transmigrated μέσω των πόρων μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με Diff-Quik Stain Kit (Dade Behring, Inc., Newark, DE). Η μετανάστευση ποσοτικοποιήθηκε μετρώντας τα κύτταρα στην κάτω επιφάνεια του ενθέματος.

Στατιστικές Αναλύσεις

Όλα τα πειράματα εκτελέστηκαν τουλάχιστον τέσσερις φορές. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD. Η στατιστική ανάλυση έγινε με Μαθητή

t-test

, και

P

& lt? .05 Θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Η σιωπή του CO. -029 έκφραση στον καρκίνο του κόλου ΗΤ29 κύτταρα

Για τον προσδιορισμό των μηχανιστική ρόλους των τετρασπανίνη CO-029 στην εξέλιξη του όγκου, έχουμε δημιουργήσει ένα σταθερό μορφοτροπής στα κύτταρα αδενοκαρκινώματος ανθρώπινου κόλον ΗΤ29 [31], στην οποία ήταν CO-029 έκφρασης γκρέμισε από shRNA. Οι φίμωση αποτελέσματα επί της συνολικής έκφρασης πρωτεΐνης κυτταρικής επιφανείας κυττάρου και CO-029 αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας Western blot και κυτταρομετρία ροής, αντίστοιχα (Εικόνα 1). Σε σύγκριση με το προϊόν μορφοτροπής εκφράζουν ελέγχου ή nonsilencing (NS) shRNA, το προϊόν μορφοτροπής εκφράζουν CO-029 shRNA (KD) παρουσίασαν σημαντική μείωση του CO-029 έκφραση στην κυτταρική επιφάνεια (Σχήμα 1Α), που κυμαίνονται από περίπου 60% έως 90%, ανάλογα με την κατάσταση των κυττάρων συρροή σε κάθε επιμέρους πείραμα, και μια μεγάλη απώλεια του συνολικού κυτταρικών πρωτεϊνών CO-029 (Εικόνα 1Β), τυπικά περίπου 90%. Η σιωπή που προκύπτει από το CO-029 shRNA ήταν ειδικά για CO-029, επειδή η έκφραση πολλών άλλων πρωτεϊνών επιφανείας, ιδιαίτερα τα άλλα μέλη της υπερ-οικογένειας τετρασπανίνη, δεν μειώθηκε (βλέπε παρακάτω).

Το CO-029 shRNA και nonsilencing shRNA ήταν σταθερά εκφράζονται σε κύτταρα ΗΤ29. (Α) Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του CO-029 έκφραση στην επιφάνεια των κυττάρων ΗΤ29 που επιμολύνθηκαν με nonsilencing (NS) ή CO-029 shRNA (KD) κατασκευάσματα. Ο αρνητικός μάρτυρας mAb ήταν IgG ποντικού, και CO-029 mAb ήταν NS1116. Μέση ένταση φθορισμού (MFI) του CO-029 σε κύτταρα KD ήταν 62% λιγότερο σε σύγκριση με εκείνη σε κύτταρα NS. (Β) ανάλυση κηλίδας Western των CO-029 πρωτεϊνών σε κύτταρα NS και KD ΗΤ29. κύτταρα KD εμφάνισε το 90% της μείωσης των εκπομπών CO-029 πρωτεΐνες. β-ακτίνης:. έλεγχο φόρτωσης

Η

Η σιωπή του CO-029 Έκφραση μείωσε τη μετανάστευση των ΗΤ29 κύτταρα

Θα αξιολογούνται πρώτα την επίδραση του CO-029 αποσιώπηση σχετικά με τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων. Για να συγκριθεί η μεταναστευτική ικανότητα των κυττάρων του NS και KD μεταχθέντα, πραγματοποιήσαμε 1) επούλωσης τραυμάτων δοκιμασία για να αναλύει τις συλλογικές κυτταρική μετανάστευση, δηλαδή, κύτταρο-κύτταρο προσκόλληση εξαρτώμενη κυτταρική μετανάστευση, και 2) δοκιμασία μετανάστευσης transwell να αναλύσει μοναχικό κυτταρική μετανάστευση, δηλαδή, κυττάρου-κυττάρου προσκόλληση ανεξάρτητη κυτταρική μετανάστευση. Στην επούλωση των πληγών πειράματα, το ποσοστό εμπλουτισμού πληθυσμών ή διαδικασία επούλωσης των τραυματιών μονοστιβάδας ήταν σημαντικά μειωμένη σε κύτταρα μορφοτροπής CO-029 KD, και η μείωση αυτή διήρκεσε αρκετές ημέρες (Εικόνα 2Α και Σχήμα S1 Α). Η μειωμένη επούλωση τραύματος δεν προέκυψε από βραδύτερη κυτταρικός πολλαπλασιασμός των κυττάρων KD επειδή τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν με την παρουσία μιτομυκίνης. Η μειωμένη ικανότητα των κυττάρων KD στη μετανάστευση των κυττάρων θα μπορούσε επίσης να παρατηρηθεί στη δοκιμασία μετανάστευσης φρεατίων. Η μετανάστευση κυττάρων μέσω του φίλτρου Λέπια μεμβράνη επάνω σε πρωτεΐνες εξωκυτταρικής μήτρας όπως λαμινίνη και φιμπρονεκτίνη 111 μειώθηκε σημαντικά από την αποσιώπηση του CO-029 έκφρασης (Σχήμα 2Β και Σχήμα S1B). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η σιωπή του CO-029 εξασθενεί την γενική ικανότητα της κυτταρικής μετανάστευσης και ότι η έκφραση του CO-029 απαιτείται για την ισχυρή ή ισχυρή κυτταρική μετανάστευση.

(Α) Οι επουλωτικές των πληγών δοκιμασίας. Σε σύγκριση με τα κύτταρα NS, το κλείσιμο της πληγής ήταν σημαντικά μειωμένη στα κύτταρα KD στις 72 ώρες μετά τη δημιουργία πληγών στο συρρέουσες κυτταρικές μονοστιβάδες. δοκιμασία μετανάστευσης (Β) Transwell. Τα κύτταρα KD εμφανίζεται εξασθενημένη κινητικότητα στην επικοινωνούντα πειράματα μετανάστευσης. Τα δεδομένα που εμφανίζονται ως μέση τιμή ± SD, η = 4. *

P

& lt?. .05

Η

Εκτός από τη μετανάστευση των κυττάρων σε 2-διαστάσεων μήτρα, κελί εισβολή είναι ένας σημαντικός παράμετρος για τη μέτρηση της κυτταρικής κινητικότητας μέσω 3-διαστάσεων (3D) μικροπεριβάλλον για επεμβατικές και μεταστατικών καρκινικών κυττάρων. Cellular διηθητικότητα μετρήθηκε με την ικανότητα των κυττάρων ΗΤ29 μορφοτροπής να εισβάλλουν μέσω Matrigel, ένα 3D μήτρα παρόμοια με της βασικής μεμβράνης, ή κολλαγόνο τύπου Ι γέλη, ένα 3D μήτρα παρόμοια με του συνδετικού ιστού. Βρήκαμε καμία σημαντική εισβολή είτε ομάδα κυττάρων ΗΤ29-KD είτε μέσω αυτών των περιβαλλόντων 3D μήτρα (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), υποδεικνύοντας ότι τα κύτταρα ΗΤ29 δεν είναι επεμβατικές, τουλάχιστον σε αυτή τη δοκιμασία εισβολής και υπό το

in vitro

συνθήκη δοκιμής.

CO-029 Ρυθμιζόμενης κυττάρων-μήτρας και κυττάρου-κυττάρου Πρόσφυση

οι όγκου των κυττάρων-μήτρας και κυττάρου-κυττάρου συμφύσεων θεωρείται ότι είναι τα βασικά γεγονότα που ρυθμίζουν την μεταστατικού καταρράκτη [ ,,,0],32] – [34]. Για να αξιολογηθεί η επίδραση του CO-029 σίγηση στην προσκόλληση κυττάρου-μήτρας, αναλύσαμε και συγκρίθηκε η συγκολλητικότητα κυττάρου-μήτρας της KD και NS μεταχθέντα επί λαμινίνη και φιμπρονεκτίνη. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, ΗΤ29-NS και -KD κύτταρα εμφανίζονται διαφορετικές ικανότητες πρόσφυσης. Τα κύτταρα KD παρουσίασαν αυξημένη ικανότητα προσκόλλησης σε πρωτεΐνες εξωκυτταρικής μήτρας λαμινίνης 111 και λαμινίνη 332, γεγονός που υποδηλώνει ότι το CO-029 συγκρατεί κυτταρική προσκόλληση σε μεμβράνη, το οποίο είναι το περιβάλλον μήτρα εμπλουτισμένο σε λαμινίνες. Η κυτταρική προσκόλληση σε ινονεκτίνη, ωστόσο, δεν εμφάνισαν διαφορές μεταξύ NS και κυττάρων KD (Σχήμα 3Α). Εξετάσαμε επίσης την κυτταρική προσκόλληση σε υαλουρονάνη, ένα σημαντικό πρωτεογλυκάνη του εξωκυττάριου περιβάλλοντος και το πρόσδεμα του CD44, λόγω της μειωμένης έκφρασης CD44 στην επιφάνεια των κυττάρων ΗΤ29-KD. Ωστόσο, ΗΤ29 κύτταρα φαίνεται να μην συμμορφώνονται με υαλουρονικό, αν και ένα καθιερωμένο πρωτόκολλο που ακολουθήθηκε για την ανάλυση αυτή [35].

(Α) προσκόλληση κυττάρων-μήτρας. Η προσκόλληση επάνω σε λαμινίνη 111, λαμινίνη 332, και φιμπρονεκτίνη του ΗΤ29-NS και -KD κυττάρων προσδιορίστηκε μετά από επώαση στους 37

oC σε 5% CO

2 για 1 ώρα. Η προσκόλληση των κυττάρων KD για λαμινίνη 111 και λαμινίνη 332 ήταν σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με τα κύτταρα NS (

P

= 0,042 για την λαμινίνη 111 και = 0.048 σε λαμινίνη 332). (Β) Συνολική προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου. συσσωμάτωση των κυττάρων μετρήθηκε στο Ca

++ – μέσα που περιέχουν μετά εφαρμόστηκε μια σχετικά ισχυρή μηχανική δύναμη. (Γ) Ca

++ – ανεξάρτητο προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου. συνάθροιση κυττάρων μετρήθηκε στο Ca

++ – τα ελεύθερα μέσα ενημέρωσης, μετά εφαρμόστηκαν σχετικά έντονη ή ήπια μηχανικές δυνάμεις, αντίστοιχα. Η συσσωμάτωση των κυττάρων NS και KD μετά διατμητικής τάσης προσδιορίστηκαν ποσοτικά όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι.

P

τιμές είναι 0,03 για τα συγκεντρωτικά κύτταρα παρουσία του Ca

++, 0.001 για την περιοχή των αδρανών υλικών με την παρουσία του Ca

++, και 0,0004 για ήπιου στρες σε περίπτωση απουσίας του Ca

++. Εικόνες των κυτταρικών συσσωματωμάτων μετά την κατεργασία διάτμησης στρες ελήφθησαν υπό μικροσκοπία αντίθεσης φάσης. Όλα τα δεδομένα προβάλλονται ως μέση τιμή ± SEM (n = 4). *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt?. .01

Η

Για να αξιολογηθεί η επίδραση του CO-029 αποσιώπηση για προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου , πραγματοποιήσαμε ποσοτικό προσδιορισμό κυτταρικής συσσωμάτωσης. Πρώτον, εξετάσαμε κυτταρικής συσσωμάτωσης παρουσία Ca

++ [28], η οποία αντικατοπτρίζει τη συνολική συγκολλητικότητα κυττάρου-κυττάρου συμπεριλαμβανομένων τόσο καντερίνη-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη από συγκολλητικότητα κυττάρου-κυττάρου. Σίγαση CO-029 οδήγησε σε αυξημένη ικανότητα να σχηματίζουν τα συσσωματώματα κυττάρων που είναι ανθεκτικά σε σχετικά ισχυρή μηχανική καταπόνηση, σε σύγκριση με τα κύτταρα NS (Σχήμα 3Β). Στη συνέχεια, εξετάσαμε συσσωμάτωση κυττάρου-κυττάρου εν απουσία Ca

++, η οποία αντανακλά την καντερίνη-ανεξάρτητο κυττάρου-κυττάρου κολλητικότητα όπως αυτή που προκαλείται από τις πρωτεΐνες IgSF. Ca

++ – ανεξάρτητο προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου δεν έδειξε διαφορά μετά από σχετικά ισχυρή μηχανική καταπόνηση εφαρμόστηκε αλλά μειωτικά σε κύτταρα KD μετά σχετικά ήπια μηχανική δύναμη εφαρμόστηκε (Σχήμα 3Β). Σε κύτταρα ΗΤ29, Ca

++ – εξαρτώμενη από προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου κάνει μια σημαντική συμβολή στη συνολική προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου, με βάση τη σύγκριση μεταξύ του μεγέθους του Ca

++ – εξαρτώμενη και ανεξάρτητη από αδρανή υλικά μετά από ισχυρή μηχανική θεραπεία στρες (Σχήμα 3Β). Μαζί, CO-029 περιορίζεται συνολική και Ca

++ -. Πρόσφυση εξαρτάται κυττάρου-κυττάρου

CO-029 Σίγαση Altered τηλέφωνα επιφανειακή έκφραση Προφίλ της πρόσφυσης μόρια

Οι αλλαγές στην επιφάνεια έκφραση του τετρασπανίνη, ιντεγκρίνες, και πρωτεΐνες κυτταρικής προσκόλλησης εμπλέκονται στην πρόοδο του όγκου και τη μετάσταση [17], [36] – [42]. Για τον προσδιορισμό της μηχανισμό με τον οποίο CO-029 ρυθμίζει κυττάρου-κυττάρου και -matrix συμφύσεις, μετρήσαμε και συγκρίθηκαν τα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών κυτταρικής προσκόλλησης στην επιφάνεια των ΗΤ29-NS και -KD κύτταρα. Για τις πρωτεΐνες προσκόλλησης κυττάρου-μήτρας, υποδοχέα λαμινίνη ιντεγκρίνης α3 και ινωδονεκτίνη υποδοχέα ιντεγκρίνης α5 ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω μετά την φίμωση CO-029. Οι ιντεγκρίνες β1, β4, α1, α2, και α6 παρέμεινε αμετάβλητη, ενώ η υαλουρονάνη υποδοχέα CD44 ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα κάτω στην επιφάνεια των κυττάρων (Σχήμα 4Α). Για να προσδιορίσετε αν το CO-029 φίμωση επηρεάζει την ενεργοποίηση ιντεγκρίνης, μετρήσαμε και σε σύγκριση με τα επίπεδα σταθερής κατάστασης των ενεργών ιντεγκρίνες β1 σε ΗΤ29-NS και -KD κυττάρων με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας β1 ΟΕ89 ιντεγκρίνης mAb. Η β1 ιντεγκρίνης mAb ΟΕ89 αναγνωρίζει μόνο τις β1 ιντεγκρίνες σε ενεργή κατάσταση [43]. Αν και το επίπεδο του δραστικού ιντεγκρινών β1 ήταν σημαντικά αυξημένη στην κυτταρική επιφάνεια των κυττάρων ΗΤ29-KD (Σχήμα 4Β αριστερά ιστόγραμμα), παρέμεινε αμετάβλητος μετά την βαθμονομείται με το επίπεδο της συνολικής ιντεγκρινών β1 στην κυτταρική επιφάνεια (Σχήμα 4Β δεξιά ιστόγραμμα). Για μόρια προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου, το επίπεδο της Ε-καδερίνης πρωτεϊνών δεν επηρεάσθηκε στην κυτταρική επιφάνεια (Σχήμα 4C). Εξετάσαμε επίσης και άλλα μόρια προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου που σχετίζονται με CO-029 και /ή τετρασπανίνη όπως EpCAM, MelCAM και EWI2, οι οποίες λαμβάνουν μέρος στο Ca

++ – ανεξάρτητο προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου και μερικά από τα οποία ανήκουν σε IgSF . Μόνο MelCAM ήταν αξιοσημείωτα μειωτικά στην κυτταρική επιφάνεια (Σχήμα 4C). Τετρασπανίνη CD9, CD63, CD81, CD82, CD151 και παρουσίασαν καμία σημαντική μεταβολή στην επιφάνεια του κυττάρου κατά CO-029 σίγηση (Εικόνα 4D).

Τα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών προσκόλλησης κυττάρου-μήτρας (Α), ενεργό β1 ιντεγκρίνες (Β), πρωτεΐνες προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου (C), και τετρασπανίνη (D) στην επιφάνεια του ΗΤ29-NS και -KD επιμόλυνσης τα κύτταρα μετρήθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Τα σχετικά επίπεδα αυτών των πρωτεϊνών σε κύτταρα KD σε κύτταρα NS παρουσιάζονται ως ιστογράμματα (μέση ± SD, η = 4~8). *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? .01. Στο (Β), μετά κανονικοποιήθηκαν από τα αντίστοιχα σχετικά επίπεδα συνολικής β1 ιντεγκρίνης, τα επίπεδα του δραστικού ιντεγκρίνης β1 σε σχέση με κύτταρα NS που παρουσιάζεται στο ιστόγραμμα στα δεξιά.

Η

CO-029 και η σχηματισμός των εστιακών πρόσφυσης, άγχος ινών, και adherens Junction

για να αξιολογηθεί περαιτέρω η επίδραση του CO-029 σίγηση σε κυτταρική προσκόλληση, εξετάσαμε εστιακή πρόσφυση και adherens διασταύρωση των κυττάρων ΗΤ29 επιμόλυνσης με χρώση i) βινκουλίνης, ένα δείκτης της εστιακής προσκόλλησης, και ii) Ε-καδερίνης και β-κατενίνης, δείκτες adherens διασταύρωση, αντίστοιχα. Βρήκαμε ότι CO-029 σίγηση οδήγησε σε μειωμένο σχηματισμό εστιακών πρόσφυσης, όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α. Εν τω μεταξύ, ο σχηματισμός ινιδίων του στρες κοντά στην βασική επιφάνεια των κυττάρων ΗΤ29-KD έγινε επίσης λιγότερο ισχυρή σε σύγκριση με εκείνη στα κύτταρα ΗΤ29-NS (Σχήμα 5Α). Σε αντίθεση, CO-029 σίγησης φαίνεται να μην έχει καταστρεπτικό αποτέλεσμα επί του σχηματισμού διασταύρωση adherens, με βάση την Ε-καδερίνη και χρώση β-κατενίνης (Σχήμα 5Β). Το φλοιώδες πλέγμα ακτίνης κατά μήκος πλευρικής επιφάνειας ή adherens διασταύρωση δεν παρουσίασαν σημαντική διαφορά μεταξύ NS και κυττάρων επιμόλυνσης KD (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

ΗΤ29 μορφομετατροπείς απλώθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες και καλλιεργήθηκαν σε πλήρες μέσο για 2 ημέρες (για βινκουλίνης και F-ακτίνης χρώση, Α) ή μέχρι τη συρροή (για Ε-καδερίνη και χρώση β-κατενίνης, Β). Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν, κατέστησαν διαπερατά, και επωάστηκαν με πρωτογενές mAbs στους 4 ° C όλη τη νύκτα, ακολουθούμενο από Alex Fluor 594-συζευγμένο δευτερεύον χρώση Αβ. F-ακτίνη χρωματίστηκε από τον Alex Fluor 594 συζευγμένο phalloidin. Οι εικόνες που έχουν ληφθεί με συνεστιακή μικροσκοπία. Bar = 20 μm.

Η

Η Επίδραση του CO-029 κατασιγάσει επί του Σχηματισμού τετρασπανίνη εμπλουτισμένο μικροπεριοχή (ΤΕΜ)

Από το CO-029 συνεργάτες με τετρασπανίνη όπως CD9 και CD151 και ιντεγκρίνες λαμινίνη δέσμευσης [11], εξετάσαμε την επίδραση της CO-029 σίγηση σχετικά με τη σταθερότητα του ΤΕΜ. Οι ενώσεις του CD151 με λαμινίνη-δεσμευτική ιντεγκρινών α3β1, α6β1 και α6β4 παρέμειναν σταθερά κάτω από αυστηρές συνθήκες λύσης, δηλαδή, 1% Triton Χ100 μεσολάβηση λύση των κυττάρων, ενώ οι ενώσεις των CD151 με άλλα τετρασπανίνη παρέμεινε σταθερά κάτω από μόνο μια σχετικά ήπια λύση κατάσταση, δηλαδή, 1% Brij 97 μεσολάβηση κυτταρικής λύσης [3]. CO-029 σίγηση δεν επηρέασε το προφίλ άνοσο CD151 είτε βάσει όρο λύσεως (Εικόνα 6Α). Πιο ιντεγκρίνες λαμινίνης δέσμευσης συν-καταβυθίστηκαν με CD151 κάτω από το 1% ΝΡ40 προϋπόθεση λύσης κατόπιν CO-029 σίγηση. Τόσο CD151 και CD9 που σχετίζονται με CO-029 κάτω από το 1% Brij 97 κατάσταση λύσης, όπως αποκαλύπτεται από CD151 και CD9 προφίλ ανοσοκατακρήμνιση, ενώ αυτές οι ενώσεις είχαν διαταραχθεί κάτω του 1% Triton Χ100 κατάσταση λύσης, όπως αναμενόταν. Κάτω από το 1% Brij 97 κατάσταση λύσης, CO-029 ανοσοκαθιζήματα αποκάλυψε επίσης συνδέσμου CD9-CO-029, αλλά όχι CD151-CO-029 σύνδεσης λόγω των λιγότερο βιοτινυλίωσης του CD151 και συν-μετανάστευση του CD151 με CO-029 (Σχήμα 6Α).

(Α) Η επιφάνεια βιοτινυλιωμένος ΗΤ29-NS και -KD επιμόλυνσης τα κύτταρα λύθηκαν με ενδεικνυόμενη απορρυπαντικό προσκρουστήρες. Τετρασπανίνη CD9, CD151, και CO-029 ανοσοκαταβυθίστηκαν από τα προϊόντα λύσης, διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE, και ανιχνεύθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια. Τα επίπεδα του β-ακτίνης πρωτεϊνών σε προϊόντα λύσης εξετάστηκαν με κηλίδα Western και χρησίμευσε ως έλεγχος εισόδου λύματος. (Β) Τα επίπεδα έκφρασης ιντεγκρίνης α3β1-μη δεσμευμένο CD151, CD151 σύνολο, homoclustered CD9, και συνολική CD9 στην επιφάνεια των ΗΤ29-NS και -KD κύτταρα επιμόλυνσης μετρήθηκαν με mAb TS151r, 5C11, C9BB, και Mab7, αντίστοιχα, χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Τα σχετικά επίπεδα του CD151 και CD9 σε κύτταρα KD σε κύτταρα NS παρουσιάζονται ως ιστογράμματα (μέση ± SD, η = 3~5).

Η

Μερικές από τις πρωτεΐνες CD151 στην επιφάνεια του κυττάρου συνδέονται ιντεγκρίνης α3β1 σε μια αλληλεπίδραση τρόπο άμεσο πρωτεΐνης-πρωτεΐνης [3]. Αναλύσαμε το επίπεδο της ιντεγκρίνης α3β1-μη δεσμευμένο ή «δωρεάν» πρωτεΐνες CD151, οι οποίες αναγνωρίζονται από CD151 mAb TS151r [23]. Στην επιφάνεια του κυττάρου, ούτε το επίπεδο του ελεύθερου CD151 ούτε το συνολικό CD151 κανονικοποιημένη επίπεδο της ελεύθερης CD151 άλλαξε κατόπιν CO-029 σίγηση (Σχήμα 6Β). Παρομοίως, CD9 πρωτεΐνες στην κυτταρική επιφάνεια είτε homoclustered ή συνδέεται με ματα [21]. Βρήκαμε ότι ούτε το επίπεδο της homoclustered CD9 ούτε το συνολικό CD9-κανονικοποιημένο επίπεδο homoclustered CD9 άλλαξε κατά CO-029 σίγηση (Εικόνα 6Β). Μαζί, αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι το CO-029 δεν απαιτείται για την αλληλεπίδραση CD151 και CD9 με ματα.

Συζήτηση

τετρασπανίνη ρυθμίζουν την εξέλιξη του όγκου και των μεταστάσεων. Αλλά οι μηχανισμοί παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστες. Στο κυτταρικό επίπεδο, τετρασπανίνη ρυθμίζουν κυτταρική πρόσφυση, μετανάστευση, πολλαπλασιασμό και σύντηξης. Η συγκολλητικότητα και την κινητικότητα των κυττάρων του όγκου προσδιοριστεί μερικώς όγκου μεταστατικό δυναμικό. Ως εκ τούτου, σε κυτταρικό επίπεδο, τετρασπανίνη πιθανώς ρυθμίζουν μετάσταση όγκου με διαμόρφωση των ικανοτήτων των καρκινικών κυττάρων να προσκολλώνται και να προχωρήσουμε. Στο μοριακό επίπεδο, τετρασπανίνη συνεργάτης με ιντεγκρίνες, πρωτεΐνες IgSF, αυξητικούς παράγοντες και τους υποδοχείς τους, πρωτεάσες, και οι πρωτεΐνες σηματοδότησης ενδοκυτταρικά για να σχηματίσουν ΤΕΜ [44] – [47]. Ως εκ τούτου, σε μοριακό επίπεδο, τετρασπανίνη ρυθμίζουν την εξέλιξη του όγκου και τη μετάσταση πιθανώς μεταβάλλοντας τις λειτουργίες των πρωτεϊνών που συνδέονται [48] – [51].

Η έκφραση του τετρασπανίνη CO-029 είναι συνήθως συνδέεται με κακή πρόγνωση του πεπτικό καρκίνους σύστημα [12], [16], [18], [46], [52], [53], CO-029 ρυθμίζεται αυξητικά από την πορεία του ορθοκολικού, του ήπατος, του παγκρέατος, και του οισοφάγου καρκίνων [11], [ ,,,0],46], [54], και η αυξημένη έκφραση του CO-029 προάγει την ήπατος ή πνεύμονα μετάστασης αυτών των καρκίνων [17], [52], [53], [55]. Όγκου κυτταρική μετανάστευση και εισβολή είναι απαραίτητες για τη μετάσταση. Η κίνηση των καρκινικών κυττάρων εμπλέκεται σε τουλάχιστον δύο φάσεις στον καταρράκτη μετάσταση [52]. Η πρώτη φάση είναι ότι τα καρκινικά κύτταρα μεταναστεύουν μακριά από τον πρωτογενή όγκο και εισβάλουν στο κυκλοφορικό σύστημα? η δεύτερη φάση είναι ότι τα καρκινικά κύτταρα μεταναστεύουν από τα αιμοφόρα αγγεία και στους ιστούς-στόχους. Η μειωμένη κίνηση κυττάρων κατά την CO-029 σίγηση υποδεικνύει ότι CO-029 απαιτείται για την αποτελεσματική μετανάστευση και την εισβολή του ορθοκολικού καρκίνου κυττάρων και υποδηλώνει ότι το CO-029 πιθανόν προάγει τα στάδια της μετάστασης του όγκου.

Εμφανίζεται

CO-029 για την προώθηση της κυκλοφορίας των κυττάρων τροποποιώντας κυττάρου-μήτρας και των β-κυττάρων συμφύσεων. Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι κυττάρου-κυττάρου και προσκόλληση -matrix καθορίζει άμεσα την κυτταρική κινητικότητα. Για παράδειγμα, η απώλεια ή η μείωση της έκφρασης ή /και της δραστηριότητας Ε-καδερίνης σε καρκινικά κύτταρα οδηγεί στην αποστολή καρκινικών κυττάρων από πρωτογενείς μάζα του όγκου [56].